TRƯỜNG ĐH NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI KHOA: THÚ Y THỰC TẬP VI SINH VẬT THÚ Y Bài 1: Pasteurella multocida – Staphylococcus aureus – Bacillus anthracis I Quan sát tính chất mọc : a Pasteurella multocida: ( Tụ huyết trùng) - Hình thái: loại cầu trực khuẩn nhỏ, hình trứng hình bầu dục, đầu tròn, kích thước 0,25 – 0,4 X 0,4 – 1,5 µm, lông, không di động, nha bào hình thành lớp giáp mô mỏng thể vật bệnh, khó thấy - Bắt màu Gram – - Tiêu làm từ bệnh phẩm thấy VK bắt màu xẫm đầu ( tốc độ sinh sản lớn) nên gọi VK lưỡng cực - Tiêu từ canh trùng thấy VK đứng riêng lẻ thành chuỗi ngắn - P.multocida loại VK khí yếm khí tùy tiện, nhiệt độ thích hợp 370C, pH: 7,2 – 7,4 Mọc yếu môi trường thông thường, môi trường có bổ sung huyết máu VK mọc tốt + Môi trường nước thịt: sau cấy 24h, môi trường đục vừa, lắc có vẩn sương mù lại mất, đáy ống nghiệm có cặn nhầy, mặt môi trường có lớp màng mỏng Môi trường có mùi đặc biệt giống mùi nước dãi khô + Môi trường thạch thường: hình thái khuẩn lạc dạng S nhỏ, suốt long lanh hạt sương, mặt khuẩn lạc vồng Trong môi trường P.multocida phát triển thành dạng khuẩn lạc sau: ++ Dạng S: Khuẩn lạc dạng trơn, bóng láng, long lanh, mặt vồng, có dung quanh sắc cầu vồng, dạng khuẩn lạc có độc lực mạnh, tạo thành lớp giáp mô nhiều loại khuẩn lạc dạng xù xì ++ Dạng R: Khuẩn lạc thường dẹt, có rìa nhám xù xì, trơn nhám, có dung quanh màu xanh, dạng khuẩn lạc có độc lực yếu ++ Dạng M: Khuẩn lạc nhày ướt, có kích thước to nhất, có rìa nhẵn, dung quanh sắc cầu vồng yếu dạng S + Môi trường thạch máu: VK không dung huyết, phát triển tốt, khuẩn lạc to thạch thường Thường dùng để nhân giữ giống VK + Môi trường nước thịt pepton: Sau 24h VK làm đục môi trường, vài ngày sau môi trường trở nên trong, đáy có cặn nhày, lắc khó tan + Môi trường thạch có huyết huyết cầu tố: (Gồm: thạch martin: 100ml, huyết cầu tố cừu dê 1/10: 1ml, huyết bò, cừu dê: 4ml) Sau 24h, quan sát khuẩn lạc KHV thị giác có hệ số giác X20 góc chiếu ánh sáng đèn 450, khuẩn lạc có tượng phát huỳnh quang, tùy theo độc lực VK mà màu sắc huỳnh quang khuẩn lạc khác nhau: ++ Nếu VK có độc lực cao: màu xanh mạ chiếm 2/3 diện tích khuẩn lạc phía đèn, 1/3 lại có màu vàng cam Khuẩn lạc gọi dạng Fg ( Fluorescent green) ++ Nếu VK có độc lực vừa: khuẩn lạc có 1/3 diện tích có màu xanh mạ, 2/3 màu vàng cam Gọi dạng Fo (F orange) ++ Nếu VK có độc lực yếu: khuẩn lạc không phát huỳnh quang, dạng Fn (No Fluorescent) Hiện tượng phát huỳnh quang xem rõ sau nuôi cấy 24h, để lâu sau 72h huỳnh quang Chỉ áp dụng với P.boviseptica P.suiseptica Với P.aviseptica, chủng có độc lực cao khuẩn lạc phát huỳnh quang dạng Fo + Môi trường gelatin: Dọc theo đường cấy trích sâu, VK mọc thành khuẩn lạc mịn, hình hạt, không làm tan chảy gelatin b Staphylococcus aureus : - Vi khuẩn hình cầu, đường kính 0,7 - μm - Không sinh nha bào giáp mô, lông, không di động - Trong bệnh phẩm VK xếp thành đôi, đám nhỏ hình chùm nho - VK bắt màu Gram + - Sống hiếu khí kỵ khí tùy tiện - Nhiệt độ thích hợp : 32 – 370C, pH : 7,2 – 7,6 - Dễ mọc môi trường nuôi cấy thông thường : Môi trường Đặc điểm thu Sau 5-6h VK làm đục, sau 24h môi trường đục , lắng cặn nhiều, không Môi trường nước thịt SV: Lương Quốc Hưng Email: lqhungtyak53@gmail.com TRƯỜNG ĐH NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI KHOA: THÚ Y có màng Sau 24h khuẩn lạc to dạng S, mặt ướt, bờ nhẵn, VK sinh sắc tố nên khuẩn Môi trường thạch thường lạc có màu trắng( albus) vàng thẫm( aureus) vàng chanh( citreus) Sau 24h vi khuẩn mọc tốt, khuẩn lạc dạng S Tụ cầu loại gây bệnh gây Môi trường thạch máu tượng dung huyết Dùng phân lập kiểm tra độc lực tụ cầu Môi trường từ màu đỏ (pH= 8,4) Môi trường Sapman sang màu vàng (pH= 6,8) tụ cầu gây bệnh Môi trường ko đổi màu ko gây bệnh Cấy VK theo đường chích sâu, nuôi nhiệt độ 200C, sau 2-3 ngày gelatin bị tan Môi trường Gelatin chảy trông giống dạng hình phễu c Bacillus anthracis - Trực khuẩn to, đầu bằng, kích thước: – 1,5 X – µm - Không có lông, khả di động - Bắt màu gram + màu tím xếp thành chuỗi - Khả sinh nha bào hình thành gia súc bệnh Sinh nha bào không làm thay đổi kích thước - VK có khả sinh giáp mô: Có thể bao bọc 1,2 tế bào đứng cạnh - Hiếu khí, dễ nuôi cấy, nhiệt độ thích hợp : 370C, (12 – 420C), pH : 7,2 – 7,4, ( – 9) - Môi trường nước thịt : 18 – 24h có sợi lơ lửng dọc ống nghiệm, lắng xuống đáy thành cặn, có mùi thơm bánh bích quy bơ - Môi trường thạch thường : khuẩn lạc dạng R, to, nhám, xù xì, đường kính – mm - Môi trường thạch máu : VK không gây dung huyết, mọc tốt môi trường thạch thường, khuẩn lạc dạng S nhiều dạng R - Môi trường gelatin : Cấy chích sâu, nuôi 280C sau – ngày, VK mọc thành nhánh ngang trông giống tùng lộn ngược II Quan sát hình thái VK : Làm tiêu : - Dụng cụ : Lam kính mỏng vô trùng, que cấy, đèn cồn, lamen, bút viết kính, cồn sát trùng - Nguồn VSV : lấy VSV môi trường nuôi cấy - Cố định tiêu hóa chất nhiệt độ Tiến hành : Bước : Chuẩn bị lam kính hơ lửa đèn cồn Dùng bút khoanh lại phiến kính tạo diện tích phết VSV Ghi tên VSV mặt lam kính Bước : Phiết kính : - Đốt que cấy lửa đèn cồn - Lấy VSV từ môi trường : + Từ môi trường lỏng : Dùng que cấy vô trùng lấy giọt canh khuẩn nhỏ lên chỗ đánh dấu, dàn mỏng Lưu ý : trước lấy canh khuẩn phải lắc môi trường + Từ môi trường đặc : Dùng que cấy vô trùng lấy giọt nước sinh lý ( NaCl 0,9%) nhỏ lên vị trí đánh dấu, sau lấy khuẩn lạc hòa với nước sinh lý dàn mỏng vị trí đánh dấu +) Lấy từ bệnh phẩm : máu gà : + lấy lam kính vô trùng + Nhỏ giọt máu lên lam kính + Đặt lam kính lên trước giọt máu nghiêng góc 45 + Lướt nhẹ lam kính phía trước lam kính Bước : Cố định tiêu : - Mục đích : giết chết VSV, VSV chết bắt màu tốt hơn, gắn chặt vào tiêu - Có phương pháp : + Dùng hóa chất : cồn 960 để cố định + Dùng nhiệt độ : hơ lửa đèn cồn Nhuộm tiêu : 2.1 Phương pháp nhuộm đơn : SV: Lương Quốc Hưng Email: lqhungtyak53@gmail.com TRƯỜNG ĐH NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI KHOA: THÚ Y - Nguyên lý : dùng loại thuốc nhuộm VSV bắt màu thuốc nhuộm VD : đỏ fucsin, xanh metylen, tím gentian - Cách nhuộm : + Nhuộm đơn tiêu nấm men thuốc nhuộm đỏ fucsin + Nhỏ dung dịch thuốc nhuộm ngập tiêu để – phút đổ thuốc nhuộm đi, rửa nước (để nghiêng phiến kính, vảy khô) 2.2 Phương pháp nhuộm kép : - ĐN : phương pháp nhuộm mà trình làm sử dụng từ loại thuốc nhuộm trở lên - Có phương pháp nhuộm : a Nhuộm Gram : + Bước 1: Nhỏ dung dịch tím Gientian lên chỗ cố định vi khuẩn, để - phút, rửa nước, vẩy khô + Bước 2: Nhỏ dung dịch lugol để - phút, rửa nước, vẩy khô + Bước 3: Tẩy màu cồn axeton 960 20 – 30 s chảy qua thật nhanh chỗ phết vi khuẩn đến không nhuộm màu nữa, rửa nước, vẩy khô + Bước 4: Nhỏ dung dịch đỏ fucsin loãng để – phút, rửa nước, vẩy khô Kết : - VK gram + bắt màu tím vách tế bào, có iod thành phần nguyên sinh chất nên cố định lugol - VK gram – bắt màu hồng, đỏ vách tế bào mỏng Ứng dụng : staphylococcus, salmonella, Bacillus anthracis, … b Nhuộm giemsa: - Nhuộm tiêu máu gà: - Tiêu máu để khô - Cố định cồn để 10 phút, rửa nước, vảy khô - Nhỏ dung dịch giemsa để 30 phút, rửa nước, vảy khô - Đem soi kính hiển vi ta thấy: Hồng cầu: NSC bắt màu hồng, nhân bắt màu tím Bạch cầu: NSC bắt màu xanh, nhân bắt màu tím III Phản ứng sinh indol: a Nguyên lý: - Một số loại VK có chứa men tryptophanaza có khả phân giải tryptophan thành indol - Để kiểm tra có mặt indol nhỏ vài giọt thuốc thử kowas vào môi trường, thuốc thử kowas có chất para dimetyl aminobenzandehyt phản ứng với indol tạo thành rosindol tạo màu hồng đỏ b Tiến hành: - Nuôi cấy VK vào môi trường trypton, pepton, nước thịt 370 C – ngày Sau lấy môi trường nhỏ vào kovas - Phản ứng dương tính: xuất vòng tròn màu đỏ IV Phương pháp mổ khám gà: - Mục đích: + Nắm phương pháp mổ khám gà + Quan sát bệnh tích + Làm tiêu từ bệnh phẩm - Tiến hành: + Cố định gà + Cắt lông vùng bụng, ngực + Dùng cồn 700C iod sát trùng toàn vùng da + Dùng kéo cắt đường thẳng từ hậu môn đến mỏm xương ức sau lột sang bên bộc lộ lớp ngực + Dùng cồn để sát trùng + Dùng kéo vô trùng cắt dọc theo vòng cung sụn sườn bộc lộ toàn xoang bụng xoang ngực ra, sau quan sát bệnh tích tiến hành cấy bệnh phẩm, làm tiêu SV: Lương Quốc Hưng Email: lqhungtyak53@gmail.com TRƯỜNG ĐH NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI KHOA: THÚ Y Bài 2: Erysipelothrix rhusiopathiae – E Coli – Salmonella I Quan sát tính chất mọc: Erysipelothrix rhusiopathiae: Trực khuẩn đóng dấu lợn - Trực khuẩn nhỏ, thẳng, có cong, kích thước – 1,5 X 0,2 – 0,4 µm - VK lông, không di động, không hình thành nha bào giáp mô, sinh sản trực phân, sống hiếu khí - Bắt màu Gram + - VK hiếu khí( sinh trưởng môi trường yếm khí), nhiệt độ thích hợp 370C, pH: 7,2 – 7,6 - Môi trường nước thịt: sau 24h, môi trường đục trong, lắc có vẩn mây bay trở lại cũ, đáy ống có cặn trắng nhày màu tro Nếu cho thêm đường glucozo 10% huyết vào môi trường VK mọc tốt Chú ý: nuôi lâu nước thịt ra, có giống lại làm môi trường vẩn đục có mùi thối - Thạch thường: sau 24h, VK hình thành khuẩn lạc nhỏ, bóng láng( dạng S) hình tròn, rìa gọn, giọt sương - Thạch máu: không dung huyết Sau 24 – 48h, thấy xuất khuẩn lạc nhỏ, tròn, óng ánh hạt sương - Thạch huyết 10%: khuẩn lạc nhỏ li ti, giống hạt sương, màu xanh lơ nhạt, nhìn qua ánh sáng thấy khuẩn lạc to có màu xanh lơ rõ, khuẩn lạc nhỏ có màu lơ nhạt - Môi trường Packe( Parker) hình thành khuẩn lạc nhỏ mịn, dạng S khuẩn lạc dạng R, to hơn, bề mặt không đục - Thạch lỏng: VK phát triển tốt, ko di động - Gelatin: Cấy sâu nuôi 280C sau ngày đường cấy chích sâu thấy VK mọc ngang lông nhỏ màu xanh tro giống hình bàn chải rửa ống nghiệm Gelatin ko tan chảy, để lâu, mặt gelatin xung quanh vết cấy khô E Coli: - Trực khuẩn hình gậy ngắn, kích thước – X 0,6 µm Cơ thể hình cầu trực khuẩn, đứng riêng lẻ xếp thành chuỗi ngắn Có có trực khuẩn – µm, gặp canh khuẩn già - Di động có lông xung quanh thân, số không thấy di động - VK không sinh nha bào, có giáp mô - Gram -, bắt màu sẫm hai đầu, khoảng nhạt - Trực khuẩn hiếu khí yếm khí tùy tiện, sinh trưởng – 400C, nhiệt độ thích hợp 370C, pH: 7,2 – 7,4; phát triển 5,5 – - Nước thịt: phát triển tốt, môi trường đục, có cặn màu tro nhạt lắng xuống đáy, có màu xám nhạt mặt môi trường, môi trường có mùi phân thối - Thạch thường: sau 24h, hình thành khuẩn lạc tròn, ướt, không suốt, màu tro trắng nhạt, lồi đường kính – mm Nuôi lâu khuẩn lạc trở thành gần nâu nhạt mọc rộng ra, quan sát dạng R M - Môi trường Mule Kopman ( Muller Kauffman), môi trường lục Malasit E.Coli không mọc, môi trường Endo E.Coli có khuẩn lạc màu đỏ, môi trường EMB có khuẩn lạc tím đen, môi trường thạch SS E Coli có khuẩn lạc đỏ, E Coli bị ức chế môi trường Vinson-Blai - Chuyển hóa đường: fructoz, glucoz, levuloz, galactoz, xyloz, ramnoz, maniton, mannit, lactoz - Không lên men: andonit, inozit - Các phản ứng khác: + Sữa: đông sau 24 – 72h 370C + Gelatin, huyết đông, lòng trắng trứng đông: không tan chảy + H2S: + VP: + MR: + SV: Lương Quốc Hưng Email: lqhungtyak53@gmail.com TRƯỜNG ĐH NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI KHOA: THÚ Y + Indon: + + Khử nitrat thành nitrit + Các men decacboxylaz với lyzin, denitin, acginin glutamic Salmonella - Vk hình gậy ngắn, hai đầu tròn, kích thước 0,4 – 0,6 X – µm, ko hình thành giáp mô nha bào - Di động có – 12 lông xung quanh thân - Gram -, nhuộm VK bắt màu toàn thân đậm hai đầu - Salmonella vừa hiếu khí vừa kỵ khí không bắt buộc, dễ nuôi cấy, nhiệt độ 370C, – 420C, pH= 7,6, phát triển pH: – Salmonella gây bệnh gia súc, sinh trưởng tốt điều kiện hiếu khí, điều kiện kỵ khí - Môi trường nước thịt: cấy vài đục nhẹ, sau 18h đục đều, nuôi lâu đáy ống nghiệm có cặn, môi trường có màng mỏng - Môi trường thạch thường: Vk mọc thành khuẩn lạc tròn, sáng xám, nhẵn bóng, lồi lên giữa, nhỏ trắng khuẩn lạc E Coli ( đường kính: – 1,5 mm) Thỉnh thoảng có thấy khuẩn lạc dạng R, nhám, mặt mờ - Chuyển hóa đường: glucoz, mannit, mantoz, galactoz, levuloz, arabinoz - Ko lên men: lactoz, saccarroz - khử cacboxyn: lyzyn, octinin, acginin - Không làm tan chảy gelatin - Không phân giải ure - Indon: - Phân giải xanh metylen - MR, Catalaz: + - H2S: + II Quan sát tính chất mọc VK E Coli Salmonella môi trường đặc biệt: - Môi trường Marconkey: Gồm: Hoặc: + Nước dày 300S: 1000ml + Pepton: 20g + Thạch: 15 – 25g + Lactozo: 15g + Lactozo: 10g + Muối mật( Oxioid): 5g + Natri clorua: 5g + Natri clorua: 5g + Mật bò: 35g + Đỏ trung tính: 0,075g + Muối mật: 3g + Thạch: 12g + Đỏ trung tính: – 5ml + pH: 7,4 E Coli: sau nuôi cấy 24h tủ ấm 370C, hình thành khuẩn lạc màu hồng, tròn nhỏ, lồi, không nhầy, rìa gọn, không làm chuyển màu môi trường Salmonella: sau cấy 24h tủ ấm 370C, hình thành khuẩn lạc màu trắng, không lên men lactozo hình thành khuẩn lạc không màu - Môi trường Brilliant green: + Peptone 10g + Lactoza 10g + NaCl 5g + Muối mật 20g + Xanh lục sáng 1,3% + (Brilliant Green) 1ml + Nước cất 1.000ml pH = 7,2 – 7,3 Phân chia vào ống nghiệm có ống Durham, ống 10ml Hấp 1100C 20 phút E Coli: sau 24h nuôi cấy 370C hình thành khuẩn lạc dạng S (Smooth), màu vàng chanh Samonella: đỏ hồng, khuẩn lạc sáng ko màu - Môi trường thạch-sắt-ba đường TSA( Tripe – Sugar – Agar): Gồm: + Cao thịt bò: 3g SV: Lương Quốc Hưng Email: lqhungtyak53@gmail.com TRƯỜNG ĐH NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI KHOA: THÚ Y + Cao nấm men( Difco): 3g + Pepton( Difco): 15g + Pepton proteoz( Difco): 5g + Natri clorua: 5g + Lactoz: 10g + Saccarozo: 10g + Dechtrin: 1g + Sắt sunfat( FeSO4.7H2O): 0,2g + Natri thiosunfat pentahydrat: 0,2g + Thạch( Difco): 12g + Đỏ phenon: 0,024g + Nước cất: 1250ml - Dùng NaOH điều chỉnh pH=7,4 Khử trùng 1000C 15 phút, môi trường có màu đỏ Sau cấy VK vào môi trường để tủ ấm từ 24 – 48h E Coli: Màu vàng Salmonella: màu đỏ, vàng, đen Bài 3: Mycobacterium tubercullosis – Phản ứng huyết học I Quan sát hình thái VK M tubercullosis: - Trực khuẩn hình gậy mảnh, cong, có kích thước 0,2 – 0,5 X 1,5 – µm - Đầu tròn, ko có lông, ko có nha bào, ko có giáp mô - Canh khuẩn non Vk lao xếp thành chuỗi cong chữ S, canh khuẩn già có hình sợi, có nhánh - Trực khuẩn lao loại hiếu khí, yếm khí mọc thưa cằn, nhiệt độ 370C, pH: 6,7 – - Môi trường nuôi cấy VK lao phải giàu chất dinh dưỡng, nhiều muối khoáng có glyxerin VK lao sinh trưởng chậm, sớm sau – tuần mọc - Môi trường nước thịt glyxerin: sau cấy 10 – 15 ngày, VK mọc, mặt có màng mỏng dính lại với nhau, nước thịt suốt, lắc có mảnh nhỏ chìm xuống đáy thành hình đậu trắng - Môi trường thạch glyxerin ( – 3%): sau cấy – 10 ngày hình thành khuẩn lạc khô hình hạt nhỏ, hay vảy khô trắng xám, thành cục bướu thô dính chặt vào môi trường - Môi trường khoai tây glyxerin (5%): VK mọc hình thành khuẩn lạc hình vảy khô, hình hạt, đông lại thành lớp dày không đều, hình bướu, màu xám nhạt - Môi trường Lovensten ( Loweinstein): VK mọc sau khoảng tháng tạo thành khuẩn lạc khô, nhăn nheo trông giống hình súp lơ - Khi VK lao kháng thuốc, khuẩn lạc bóng hơn, nhẵn hơn, có sinh sắc tố VK bị biến dị Phương pháp nhuộm Ziehl – Nielsen: a Nguyên lý: - Do cấu tạo VK lao có nhiều lipid, phức hợp lipid, axit béo chất sáp, làm cho VK khó thấm nước, có tính kháng cồn, kháng axit nên khó nhuộm màu nên phải dùng phương pháp nhuộm Khi nhuộm vi khuẩn lao bắt màu đỏ xanh b Tiến hành: - Làm tiêu bản, cố định VK - Nhỏ fucsin đặc – 5’ - Hơ lửa đèn cồn đến bốc đừng lại đợi nguội - Sau hơ tiêu lửa đèn cồn lần - Đổ thuốc nhuộm đi, vảy tiêu - Axit loãng H2SO4 5% - Nhúng nhanh vào dung dịch cồn rửa nước, vảy khô - Nhỏ vài giọt xanh metylen để phút, đổ thuốc nhuộm vảy khô, soi kính Kết quả: VK lao bắt màu đỏ xanh II Phản ứng huyết học: SV: Lương Quốc Hưng Email: lqhungtyak53@gmail.com TRƯỜNG ĐH NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI KHOA: THÚ Y Phản ứng ngưng kết nhanh phiến kính: - Chuẩn bị: + phiến kính sáng + Huyết nghi: lấy máu chắt huyết - Tiến hành: + Chia phiến kính thành ô: bên thí nghiệm, bên đối chứng + Bên thí nghiệm nhỏ vài giọt huyết nghi + Bên đối chứng nhỏ giọt nước sinh lý + Sau nhỏ bên giọt kháng nguyên chuẩn biết + Trộn đợi sau phút - Kết quả: + Phản ứng dương tính làm ngưng kết lấm quan sát mắt thường + Phản ứng âm tính nước sinh lý kháng nguyên chuẩn hòa tan Xác định type vi khuẩn E.coli phân lập Xác định phản ứng ngưng kết nhanh phiến kính Vi khuẩn E.coli có nhiều Serotype O khác nhau, bước quan trọng xác định nhóm Serotype O, sau tiến hành phản ứng ngưng kết với kháng huyết đơn giá nhóm cần xác định Những nguyên liệu cho việc định tuýpe gồm: + Các chủng vi khuẩn E.coli cần định type giữ thạch máu + Các kháng huyết O chuẩn (đa giá đơn giá) * Phương pháp tiến hành sau: Trên phiến kính sạch, nhỏ giọt nước muối sinh lý hai vị trí riêng rẽ, dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc vi khuẩn E.coli cần định type từ thạch đĩa nuôi cấy, trộn khuẩn lạc vào nước sinh lý phiến kính tạo thành huyễn dịch vô trùng Dùng que cấy vô trùng lấy giọt kháng huyết đa giá hoà vào huyễn dịch vi khuẩn phiến kính, huyễn dịch lại không nhỏ kháng huyết thanh, đọc kết sau vài giây Phản ứng dương tính: huyễn dịch vi khuẩn kháng huyết tạo hạt ngưng kết phiến kính, huyễn dịch trở nên trong, mức độ dương tính tính từ mức (+) (+) Phản ứng âm tính: huyễn dịch vi khuẩn kháng huyết đục đều, hạt ngưng kết - Phản ứng dương tính hình thành ngưng kết kháng nguyên vi khuẩn với kháng huyết thanh, tạo thành hạt nhỏ trắng lấm tấm, huyễn dịch tách làm phần hạt ngưng kết phần nước Với phản ứng ngưng kết sảy nhanh, rõ rệt đánh giá mức (+), trình diễn chậm ngưng kết không nhiều tùy theo khả ngưng kết để dánh giá mức độ ngưng kết khác - Với chủng có ngưng kết với kháng huyết nhóm để định type Trong trường hợp chủng có tượng ngưng kết chéo với nhiều nhóm ngưng kết với nhiều đơn giá khác nhau, ta phải thực pha loãng kháng huyết theo cấp số 2, kết lấy ngưng kết cấp số pha loãng cao Phản ứng kết tủa Ascoli: a Nguyên lý: - Trong giáp mô VK có kháng nguyên gọi kết tủa tố nguyên có khả kích thích thể động vật sản sinh kháng thể đặc hiệu gọi kết tủa tố Khi kết tủa tố nguyên gặp kết tủa tố tạo phức hợp kháng nguyên kháng thể chất cặn không tan - Ứng dụng: với loài VK có nha bào b Các bước chuẩn bị: - Chuẩn bị kháng nguyên nghi: + bệnh phẩm lách, đem nghiền nhỏ, cho vào 10 phần nước sinh lý, đun sôi cách thủy 15 – 20 phút, để nguội, lọc kỹ, ly tâm lấy nước + Bệnh phẩm da, lông, xương, đem hấp ướt 1200C 30 phút để khử trùng, cắt nhỏ, cho vào 10 phần nước sinh lý, để tủ lạnh 50C 24h, lọc kỹ, lấy nước - Chuẩn bị kháng nguyên âm: + lấy gan, lách gia súc khỏe để chế kháng nguyên âm, cách làm tương tự kháng nguyên nghi - Chuẩn bị kháng thể: kháng thể huyết kháng nhiệt thán chế cách gây tối miễn dịch cho ngựa SV: Lương Quốc Hưng Email: lqhungtyak53@gmail.com TRƯỜNG ĐH NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI KHOA: THÚ Y c Tiến hành: - Dùng ống nghiệm nhỏ, ống làm thí nghiệm, ống làm đối chứng - Cho 0,5ml kháng nguyên nghi vào ống thứ 1, 0,5ml kháng nguyên âm vào ống thứ - Dùng ống hút có đầu nhỏ dài hút huyết kháng nhiệt thán cho vào ống 0,5ml, ý phải cho đầu hút sát đáy ống nghiệm từ từ thả huyết kháng nhiệt thán xuống, huyết đội kháng nguyên lên Để yên 10 – 15 phút phòng thí nghiệm đọc kết + Phản ứng dương tính: nơi tiếp xúc hai lớp kháng nguyên kháng thể xuất vòng kết tủa màu trắng, chứng tỏ bệnh bệnh phẩm có mặt kháng nguyên + Phản ứng âm tính: không xuất vòng kết tủa màu trắng Có thể làm phản ứng kết tủa khuếch tán đĩa thạch phiến kính thạch để chẩn đoán nhiệt thán SV: Lương Quốc Hưng Email: lqhungtyak53@gmail.com ... đĩa nuôi c y, trộn khuẩn lạc vào nước sinh lý phiến kính tạo thành huyễn dịch vô trùng Dùng que c y vô trùng l y giọt kháng huyết đa giá hoà vào huyễn dịch vi khuẩn phiến kính, huyễn dịch lại... Dùng que c y vô trùng l y giọt nước sinh lý ( NaCl 0,9%) nhỏ lên vị trí đánh dấu, sau l y khuẩn lạc hòa với nước sinh lý dàn mỏng vị trí đánh dấu +) L y từ bệnh phẩm : máu gà : + l y lam kính... tính: huyễn dịch vi khuẩn kháng huyết đục đều, hạt ngưng kết - Phản ứng dương tính hình thành ngưng kết kháng nguyên vi khuẩn với kháng huyết thanh, tạo thành hạt nhỏ trắng lấm tấm, huyễn dịch