HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM VI THỊ THU HÒA ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG GIỐNG CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN LACTOBACILLUS TRONG ĐIỀU KIỆN BẢO QUẢN Chuyên ngành: Mã số: Người hướng dẫn khoa học: Chăn nuôi 60.62.01.05 TS Nguyễn Thị Tuyết Lê NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng tôi, kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa dùng để bảo vệ lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cám ơn, thông tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận văn Vi Thị Thu Hòa i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn, nhận hướng dẫn, bảo tận tình thầy cô giáo, giúp đỡ, động viên bạn bè, đồng nghiệp gia đình Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc đến cô Nguyễn Thị Tuyết Lê tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian tạo điều kiện cho suốt trình học tập thực đề tài Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Dinh dưỡng - Thức ăn, Khoa Chăn nuôi - Học viện Nông nghiệp Việt Nam tận tình giúp đỡ trình học tập, thực đề tài hoàn thành luận văn Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ mặt, động viên khuyến khích hoàn thành luận văn./ Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận văn Vi Thị Thu Hòa ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt v Danh mục bảng vi Danh mục biểu đồ vii Danh mục hình vii Trích yếu luận văn viii Thesis abstract x Phần Mở đầu 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích – yêu cầu 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Tổng quan Lactobacillus 2.1.1 Đặc điểm vi khuẩn Lactobacillus 2.1.2 Lên men lactic Lactobacillus 2.1.3 Một số đặc tính probiotic Lactobacillus 2.1.4 Vai trò vi khuẩn Lactobacillus chăn nuôi 2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh trưởng vi sinh vật 2.2.1 Yếu tố dinh dưỡng 2.2.2 Yếu tố vật lý 11 2.2.3 Yếu tố hóa học 14 2.3 Biến dị vi sinh vật 15 2.3.1 Khái niệm 15 2.3.2 Các dạng biến dị 16 2.4 Các phương pháp bảo quản vi sinh vật 17 2.4.1 Phương pháp cấy truyền vi sinh vật 17 2.4.2 Giữ giống vi sinh vật môi trường đất, cát, hạt 19 2.4.3 Phương pháp đông khô đông khô dịch thể trực tiếp 20 2.4.4 Bảo quản lạnh 21 2.4.5 Phương pháp bảo quản lạnh sâu 21 2.5 Vai trò sinh khối vi khuẩn lactic chăn nuôi 22 Phần Vật liệu phương pháp nghiên cứu 23 iii 3.1 3.2 3.2.1 3.2.2 3.3 3.3.1 3.3.2 3.3.3 3.3.4 3.3.5 3.3.6 3.3.7 3.3.8 3.3.9 3.4 Đối tượng – địa điểm – thời gian nghiên cứu 23 Nội dung nghiên cứu 23 Đánh giá biến đổi mặt hình thái vi khuẩn Lactobacillus thời gian giữ giống: 23 Đánh giá biến đổi đặc tính sinh học chủng Lactobacillus 23 Phương pháp nghiên cứu 23 Nguyên vật liệu 23 Phương pháp bảo quản, giữ giống 24 Phương pháp xác định hình thái 24 Các phản ứng sinh hóa – Catalase Test 24 Phương pháp đánh giá khả phân giải protein 25 Phương pháp xác định khả sinh axit lactic đông vón sữa 25 Phương pháp đánh giá sức sống giống 26 Phương pháp đánh giá khả sinh trưởng điều kiện nhiệt độ khác 26 Phương pháp xác định số lượng tế bào 26 Xử lý số liệu 27 Phần Kết thảo luận 28 4.1 Đánh giá biến đổi hình thái vi khuẩn Lactobacillus trình giữ giống 28 4.1.1 Sự biến đổi hình thái khuẩn lạc 28 4.1.2 Sự biến đổi hình thái vi khuẩn 30 4.2 Đánh giá biến đổi đặc tính sinh học chủng Lactobacillus thời gian bảo quản giữ giống 32 4.2.1 Khả phân giải protein 32 4.2.2 Khả đông vón sữa sinh axit lactic chủng Lactobacillus 35 4.2.3 Đánh giá sức sống chủng giống Lactobacillus thời gian bảo quản 38 4.2.4 Khả sinh trưởng mức nhiệt độ khác 39 Phần Kết luận kiến nghị 50 5.1 Kết luận 50 5.1.1 Về biến đổi hình thái Lactobacillus thời gian bảo quản 50 5.1.2 Về biến đổi đặc tính sinh học Lactobacillus thời gian bảo quản 50 5.2 Kiến nghị 51 5.2.1 Tồn 51 5.2.2 Kiến nghị 51 Tài liệu tham khảo 52 iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt cs C o h NXB ST TB VK VSV Nghĩa tiếng Việt : Cộng : Độ C : Giờ : Nhà xuất : Sinh trưởng : Tế bào : Vi khuẩn : Vi sinh vật v DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Hoạt độ nước số giống vi sinh vật 12 Bảng 4.1 Đặc điểm khuẩn lạc chủng Lactobacillus thời gian bảo quản giữ giống 29 Bảng 4.2 Hình thái vi khuẩn Lactobacillus thời gian bảo quản 31 Bảng 4.3 Khả phân giải protein chủng vi khuẩn Lactobacillus thời gian bảo quản 32 Bảng 4.4 Khả sinh axit lactic chủng vi khuẩn Lactobacillus thời gian bảo quản 35 Bảng 4.5 Khả đông vón sữa thời điểm 24h chủng Lactobacillus thời gian bảo quản giữ giống 37 Bảng 4.6 Số lượng tế bào sống (TB/ml) chủng Lactobacillus thời gian bảo quản giữ giống 38 Bảng 4.7 Khả sinh trưởng chủng Lactobacillus 30oC 41 Bảng 4.8 Khả sinh trưởng chủng Lactobacillus 35oC 43 Bảng 4.9 Khả sinh trưởng chủng Lactobacillus 40oC 45 Bảng 4.10 Khả sinh trưởng chủng Lactobacillus 45oC 47 vi DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 2.1 Giới hạn nhiệt độ nhóm vi sinh vật 13 Biểu đồ 4.1 Khả phân giải protein chủng Lactobacillus thời gian bảo quản 34 Biểu đồ 4.2 Khả sinh axit lactic chủng Lactobacillus thời gian bảo quản giữ giống 36 Biểu đồ 4.3 Khả sinh trưởng Lactobacillus nhiệt độ 30oC 42 Biểu đồ 4.4 Khả sinh trưởng Lactobacillus nhiệt độ 35oC 44 Biểu đồ 4.5 Khả sinh trưởng Lactobacillus nhiệt độ 40oC 46 Biểu đồ 4.6 Khả sinh trưởng Lactobacillus nhiệt độ 45oC 48 DANH MỤC HÌNH Hình 4.1 Đĩa petri nuôi cấy NCb 31 Hình 4.2 Khuẩn lạc NCb 31 Hình 4.3 NCb qua ba lần cấy chuyển 31 Hình 4.4 Hình thái số chủng giống Lactobacillus 32 Hình 4.5 Khả phân giải protein chủng Lactobacillus 34 Hình 4.6 Khả đông vón sữa vi khuẩn Lactobacillus 38 Hình 4.7 Đánh giá sinh trưởng môi trường MRS dịch thể 40 vii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Vi Thị Thu Hòa Tên Luận văn: Đánh giá chất lượng giống số chủng vi khuẩn Lactobacillus điều kiện bảo quản Ngành: Chăn Nuôi Mã số: 60.62.01.05 Tên sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Đánh giá biến đổi hình thái, đặc điểm sinh trưởng số đặc tính sinh học chủng vi khuẩn Lactobacillus bảo quản, giữ giống môi trường thạch nghiêng tủ lạnh (4oC) 90 ngày để từ đánh giá phẩm chất giống đưa quy trình bảo quản giống phù hợp điều kiện phòng thí nghiệm Phương pháp nghiên cứu Đề tài có nội dung - Đánh giá biến đổi mặt hình thái vi khuẩn Lactobacillus thời gian giữ giống - Đánh giá khả sống sót chủng Lactobacillus thời gian bảo quản - Đánh giá khả sinh trưởng chủng Lactobacillus điều kiện nhiệt độ khác thời gian bảo quản - Đánh giá số đặc tính sinh học giống: + Đánh giá khả phân giải protein + Đánh giá khả sinh axit lactic đông vón sữa Nguyên vật liệu Các chủng Lactobacillus sử dụng nghiên cứu: + 01 chủng Lactobacillus bulgaricus: Proc + 02 Lactobacillus acidophilus: LA, NCb + 03 Lactobacillus plantarum: LP, ND1, ND2 Tất chủng giống phân lập chọn lọc từ mẫu sản phẩm lên men Sử dụng môi trường MRS để giữ giống Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp bảo quản, giữ giống: Giống Lactobacillus nuôi cấy môi trường thạch nghiêng MRS 37oC/48h sau giữ giống tủ lạnh (4oC) viii - Phương pháp xác định hình thái: Vi khuẩn nhuộm Gram quan sát kính hiển vi quang học - Các phản ứng sinh hóa: gồm phản ứng lên men đường, Catalase Test - Phương pháp đánh giá khả phân giải protein: sử dụng phương pháp khuếch tán thạch, đo đường kính vòng phân giải - Xác định khả sinh axit lactic phương pháp chuẩn độ đông vón sữa - Phương pháp đánh giá sức sống giống: Đếm số lượng tế bào sống phương pháp pha loãng nồng độ - Phương pháp đánh giá khả sinh trưởng điều kiện nhiệt độ khác nhau: xác định số lượng tế bào nuôi cấy mức nhiệt độ 30, 35, 40 45oC 24-48h Kết kết luận - Với phương pháp bảo quản giữ giống môi trường thạch nghiêng 4oC 90 ngày với thời gian cấy truyền tháng/lần khuẩn lạc hình thái tế bào chủng giống nghiên cứu biến đổi so với ban đầu - Trong số chủng giống kiểm tra có chủng LA, LP Proc trì chất lượng giống ổn định suốt 90 ngày bảo quản - Ở mức nhiệt độ thường (30-35oC): Các chủng giống có tốc độ sinh trưởng lớn gồm LA, LP, NCb, Proc Ở nhiệt độ cao (40-45oC): Các chủng giống có tốc độ sinh trưởng lớn gồm LA LP - Chủng Lactobacillus LA chủng giống có sức sống đặc tính sinh học ổn định suốt trình bảo quản ix Bảng 4.7 Khả sinh trưởng chủng Lactobacillus 30oC Số lượng tế bào (triệu/ml) Thời gian Chủng bảo quản 0h 24h Tốc độ ST (lần) 48h Tốc độ ST (lần) 30 10,7±0,8 15,8±0,7 1,5 32,9±0,8 3,1 60 11,1±1,1 16,0±1,3 1,4 30,9±0,8 2,8 90 12,0±0,7 12,2±0,9 1,0 31,8±1,3 2,6 30 10,2±0,7 22,0±0,7 2,2 32,9±0,8 3,2 60 11,8±0,9 19,3±1,3 1,6 32,9±0,5 2,8 90 13,1±0,9 20,9±0,6 1,6 32,7±0,8 2,5 30 10,4±0,7 20,9±1,0 2,0 35,8±0,9 3,4 60 10,7±0,9 18,7±1,4 1,8 35,8±1,5 3,4 90 12,2±0,6 21,6±1,8 1,8 34,9±1,3 2,9 30 14,4±0,5 26,7±1,4 1,8 43,8±1,0 3,0 60 14,0±1,3 24,7±1,7 1,8 45,6±1,2 3,3 90 14,2±0,9 25,8±1,5 1,8 44,0±1,6 3,1 30 21,8±1,5 28,2±0,9 1,3 47,3±1,4 2,2 60 21,3±1,6 25,8±1,4 1,2 46,4±1,2 2,2 90 17,6±1,2 29,1±1,6 1,7 46,7±1,4 2,7 30 14,9±0,8 28,9±1,1 1,9 81,1±1,0 5,4 60 16,0±1,5 29,1±1,2 1,8 79,1±1,2 4,9 90 16,2±0,5 32,4±1,4 2,0 78,9±1,7 4,9 (ngày) ND1 ND2 NCb Proc LA LP 41 Biểu đồ 4.3 Khả sinh trưởng Lactobacillus nhiệt độ 30oC Như vậy, thấy thời gian bảo quản giữ giống không ảnh hưởng tới khả sinh trưởng chủng Lactobacillus kiểm tra Số lượng tế bào không thay đổi nhiều suốt thời gian bảo quản Tốc độ tăng trưởng tế bào thời điểm 24h sau nuôi cấy dao động từ 1,0 – 2,2 lần so với ban đầu Ở thời điểm 48h sau nuôi cấy tốc độ tăng số lượng tế bào đạt từ 2,2 – 5,4 lần so với thời điểm ban đầu Điều cho thấy, pha sinh trưởng logarith chủng Lactobacillus kiểm tra diễn thời điểm 48h, tức thời gian nuôi cấy bị kéo dài Các chủng kiểm tra thời điểm phân lập, chọn lọc có pha sinh trưởng logarith thời điểm 24h sau nuôi cấy Mặc dù tốc độ tăng trưởng tế bào lớn, điều ảnh hưởng thời gian bảo quản mà mức nhiệt độ 30oC chưa phải mức nhiệt độ tối thích cho Lactobacillus phát triển 4.2.4.2 Khả sinh trưởng 35oC Mức nhiệt độ 35 – 37oC coi mức nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng chủng Lactobacillus Kết đánh giá khả sinh trưởng chủng vi khuẩn kiểm tra mức nhiệt độ 35oC trình bày bảng 4.8 biểu đồ 4.4 42 Bảng 4.8 Khả sinh trưởng chủng Lactobacillus 35oC Chủn g Thời gian bảo quản (ngày) 30 ND1 60 90 30 ND2 60 90 30 NCb 60 90 30 Proc 60 90 30 LA 60 90 30 LP 60 90 Số lượng tế bào (triệu/ml) 0h 10,7±0, 11,1±1, 12,0±0, 10,2±0, 11,8±0, 13,1±1, 10,4±0, 10,7±0, 12,2±0, 14,4±0, 14,0±1, 14,2±0, 21,8±1, 21,3±1, 17,6±1, 14,9±0, 16,0±1, 16,2±0, 24h 21,1±1, 21,1±0, 18,4±1, 23,3±1, 23,3±1, 19,8±1, 31,6±1, 31,6±1, 30,7±1, 26,9±1, 26,9±1, 24,2±1, 42,2±1, 41,6±1, 34,4±1, 55,3±0, 59,3±1, 52,0±1, Tốc độ ST (lần) Tốc độ ST (lần) 2,0 26,0±0,8 1,9 26,0±1,2 2,3 1,5 26,4±1,2 2,2 2,3 36,4±0,9 3,6 2,0 36,4±1,5 3,1 1,5 36,4±1,3 2,8 3,0 48,0±1,1 4,6 3,0 48,0±1,0 4,5 2,5 52,9±1,2 4,3 1,9 43,1±0,5 3,0 1,9 43,1±1,6 3,1 1,7 40,4±1,2 2,8 1,9 92,9±1,9 4,3 1,9 96,2±1,9 4,5 2,0 3,7 3,7 3,2 43 48h 106,9±1, 120,2±0, 119,1±1, 122,1±1, 2,4 6,1 10,1 8,1 8,2 Kết bảng 4.8 cho thấy, chủng vi khuẩn sinh trưởng tốt điều kiện nhiệt độ 35oC Tốc độ sinh trưởng lớn LP, LA NCb, thấp chủng ND1, ND2 Proc Sau 24 đầu nuôi cấy, số lượng TB tăng từ 1,5 – 3,7 lần so với ban đầu, dao động khoảng từ 18,4 – 59,3 triệu/ml ba lần quan sát Ở thời điểm phân lập, sau 48h nuôi cấy, số lượng tế bào vi khuẩn bắt đầu giảm dần Như vậy, với mức nhiệt độ nuôi cấy thích hợp, pha sinh trưởng logarith diễn sớm Số lượng tế bào tăng nhanh sau 24h nuôi cấy sau chuyển sang giai đoạn cân giảm dần Tuy nhiên, sau 90 ngày bảo quản, thấy, số lượng tế bào thời điểm 24h tăng từ 1,5 – 3,7 lần so với ban đầu nuôi cấy, thời điểm 48h tốc độ tăng số lượng tế bào tăng lên từ 2,2 – 10,1 lần so với ban đầu Điều cho thấy, pha sinh trưởng logarith chủng Lactobacillus kiểm tra diễn thời điểm 48h, tức thời gian nuôi cấy bị kéo dài Như vậy, thời gian bảo quản giữ giống 90 ngày không ảnh hưởng đến khả sinh trưởng tất chủng Lactobacillus kiểm tra, ảnh hưởng rõ rệt đến pha sinh trưởng logarith chúng So sánh tốc độ sinh trưởng chủng Lactobacillus trình bảo quản giữ giống trình bày biểu đồ 4.4 Biểu đồ 4.4 Khả sinh trưởng Lactobacillus nhiệt độ 35oC 44 4.2.4.3 Khả sinh trưởng nhiệt độ cao chủng Lactobacillus Khả chịu nhiệt tiêu quan trọng để lựa chọn chủng vi khuẩn làm giống khởi động Để đánh giá đặc tính chịu nhiệt chủng vi khuẩn có bị biến đổi thời gian bảo quản giữ giống hay không, tiến hành nuôi cấy chủng vi khuẩn kiểm tra môi trường MRS dịch thể mức nhiệt độ 40 45oC a Sinh trưởng 40oC Kết đánh giá khả sinh trưởng mức nhiệt độ 40oC trình bày bảng 4.9 biểu đồ 4.6 Bảng 4.9 Khả sinh trưởng chủng Lactobacillus 40oC Chủng ND1 ND2 NCb Proc LA LP Thời gian bảo quản (ngày) 0h Số lượng tế bào (triệu/ml) Tốc độ ST 24h 48h (lần) 30 10,7±0,8 17,8±1,9 1,7 28,4±1,5 90 12,0±0,7 14,4±1,8 1,2 22,4±0,9 60 30 60 90 30 60 90 30 60 90 30 60 90 30 60 90 11,1±1,1 10,2±0,7 11,8±0,9 13,1±1,0 10,4±0,7 10,7±0,9 12,2±0,5 14,4±0,4 14,0±1,5 14,2±0,9 21,8±1,5 21,3±1,6 17,6±2,2 14,9±0,7 16,0±1,5 16,2±0,5 17,6±1,7 20,9±1,4 20,7±0,8 19,6±0,9 26,7±1,3 28,7±1,6 26,0±1,4 26,9±1,4 28,0±1,5 26,0±0,9 60,4±1,8 56,2±2,6 52,4±1,0 52,2±2,7 53,6±2,8 52,2±0,9 45 1,6 2,0 1,8 1,5 2,6 2,7 2,1 1,9 2,0 1,8 2,8 2,6 28,2±1,1 36,4±1,3 39,1±1,8 32,7±1,6 44,0±1,9 39,6±1,5 40,4±1,8 43,8±1,7 44,9±1,7 45,1±1,4 91,3±2,7 96,4±2,7 3,0 108,9±2,2 3,3 105,1±2,8 3,5 3,2 100,7±2,9 106,2±1,3 Tốc độ ST (lần) 2,7 2,5 1,9 3,6 3,3 2,5 4,2 3,7 3,3 3,0 3,2 3,2 4,2 4,5 6,2 6,8 6,6 6,5 Kết cho thấy chủng Lactobacillus có khả phát triển tốt điều kiện nhiệt độ 40oC Sau 24 đầu nuôi cấy, chủng LA có số lượng tế bào lớn nhất, đạt khoảng 60 triệu/ml, tốc độ tăng trưởng chậm so với chủng LP Sở dĩ số lượng tế bào LA sử dụng nuôi cấy ban đầu nhiều so với LP Sau 48h nuôi cấy, tốc độ tăng trưởng chủng Lactobacillus đạt từ 1,9 – 6,8 lần, cao so với thời điểm 24h Như vậy, sau 90 ngày bảo quản, chủng Lactobacillus có pha tăng trưởng logarith 48h So sánh sinh trưởng chủng vi khuẩn kiểm tra qua biểu đồ 4.5 Biểu đồ 4.5 Khả sinh trưởng Lactobacillus nhiệt độ 40oC Như vậy, mức nhiệt độ 40oC, khả sinh trưởng chủng Lactobacillus giữ làm giống khởi động ổn định, biến động rõ rệt b Khả sinh trưởng 45oC Theo lý thuyết, mức nhiệt độ 45oC, nhiều chủng vi khuẩn lactic không sinh trưởng sinh trưởng Tuy nhiên, qua trình chọn lọc từ tự nhiên, lựa chọn chủng có khả chịu nhiệt sinh trưởng mức nhiệt độ Các chủng vi khuẩn kiểm tra chủng có khả sinh trưởng mức nhiệt độ 45oC Đặc tính chịu nhiệt biến đổi thời gian bảo quản giữ giống Kết nuôi cấy chủng lactic theo dõi điều kiện 45oC trình bày bảng 4.10 46 Bảng 4.10 Khả sinh trưởng chủng Lactobacillus 45oC Chủng ND1 ND2 NCb Proc LA LP Số lượng tế bào (triệu/ml) Thời gian bảo quản 0h 24h 30 10,7±0,8 18,0±1,8 90 12,0±0,7 10,9±0,7 (ngày) 60 30 60 90 30 60 90 30 60 90 30 60 90 30 60 90 11,1±1,1 10,2±0,7 11,8±0,9 13,1±1,0 10,4±0,7 10,7±0,9 12,2±0,5 14,4±0,5 14,0±1,2 14,2±0,9 21,8±1,5 21,3±1,6 17,6±2,2 14,9±0,7 16,0±1,5 16,2±0,5 14,0±1,3 14,2±1,0 14,9±1,0 12,0±0,7 10,4±0,7 11,1±1,0 10,0±0,5 12,4±1,0 12,0±0,7 11,6±1,2 28,7±0,8 32,4±1,5 28,9±1,7 17,8±0,9 15,8±1,4 16,0±0,7 Tốc độ ST (lần) 48h 1,7 23,3±1,5 0,9 10,2±0,4 1,3 1,4 1,3 0,9 1,0 1,0 0,8 23,1±1,2 20,2±1,6 20,4±1,2 10,4±0,5 14,9±0,7 13,8±0,8 9,1±0,7 Tốc độ ST (lần) 2,2 2,1 0,9 2,0 1,7 0,8 1,4 1,3 0,7 0,9 10,4±0,7 0,7 0,8 11,1±0,5 0,8 0,9 1,3 1,5 1,6 1,2 1,0 1,0 11,3±0,5 37,1±0,7 43,6±1,0 43,6±1,2 20,9±0,7 12,9±0,5 14,9±0,9 0,8 1,7 2,0 2,5 1,4 0,8 0,9 Kết cho thấy, chủng vi khuẩn bắt đầu giảm sinh trưởng rõ rệt Trong tất chủng sử dụng nghiên cứu, LA chủng có khả sinh trưởng tốt nhiệt độ 45oC Tuy nhiên, so sánh với nuôi cấy điều kiện 35oC 40oC, thấy số lượng vi khuẩn giảm cách rõ rệt Trong lần cấy truyền thứ nhất, sau 24 nuôi cấy 40oC, số lượng tế bào LA khoảng 60,4 triệu/ml Trong đó, nuôi cấy lượng tế bào 45oC có khoảng 28,7 triệu/ml Sau 48 nuôi cấy, tốc độ sinh trưởng LA dao động từ 1,3 – 1,5 lần 47 Biểu đồ 4.6 Khả sinh trưởng Lactobacillus nhiệt độ 45oC Như vậy, mức nhiệt độ 45oC, chủng vi khuẩn kiểm tra có khả sinh trưởng tốt Điều cho thấy, thời gian bảo quản giữ giống định kỳ cấy truyền tháng/lần không ảnh hưởng tới đặc tính chịu nhiệt chủng vi khuẩn giữ giống Zahoor et al (2003) tiến hành đánh giá ảnh hưởng phương pháp giữ giống thạch nghiêng, giữ giống lớp dầu khoáng giữ dạng lỏng đến sinh trưởng chủng Lactobacillus Các tác giả cho biết, tất chủng Lactobacillus spp giữ giống phương pháp có khả sinh trưởng nhiệt độ 45oC sau 60 ngày bảo quản Tuy nhiên, số lượng tế bào vi khuẩn giảm dần theo thời gian bảo quản Kết luận: Dựa tiêu đánh giá chất lượng chủng giống trên, có nhận xét: Trong số chủng giống kiểm tra có chủng LA, LP Proc trì chất lượng giống ổn định Chủng Lp không phân giải protein giống trì sức sống ổn định, khả sinh trưởng khả sinh axit lactic tốt nên sử dụng làm giống khởi động cho trình lên men chế biến thức ăn chăn nuôi ủ chua 48 Chủng lại ND1, ND2 NCb có khả phân giải protein tốt nhiên sức sống khả sinh trưởng mức nhiệt độ cao không ổn định Vì cần phải đánh giá lại tiêu với phương pháp bảo quản khác đông sâu bảo quản với dầu paraffin Với kỹ thuật giữ giống thạch nghiêng MRS bảo quản tủ lạnh thời gian bảo quản dài làm suy giảm chất lượng giống Vì để đảm bảo chất lượng giống ổn định, cần phải bảo quản giống với phương pháp đại đông khô, đông sâu 49 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN 5.1.1 Về biến đổi hình thái Lactobacillus thời gian bảo quản - Khuẩn lạc chủng Lactobacillus kiểm tra biến đổi mặt hình thái so với ban đầu - Với phương pháp bảo quản giữ giống môi trường thạch nghiêng 4oC 90 ngày với thời gian cấy truyền tháng/lần hình thái tế bào chủng giống nghiên cứu biến đổi so với ban đầu 5.1.2 Về biến đổi đặc tính sinh học Lactobacillus thời gian bảo quản 5.1.2.1 Khả phân giải protein Trong thời gian bảo quản giữ giống, có chủng LP bị khả phân giải Protein Các chủng có khả phân giải Protein ổn định Proc, NCb, ND1, ND2 LA 5.1.2.2 Khả đông vón sữa sinh axit lactic - Tất chủng Lactobacillus giữ đặc tính sinh axit lactic đông vón sữa suốt trình bảo quản 90 ngày Tuy nhiên, khả sinh axit lactic làm giảm so với ban đầu Các chủng có đặc tính sinh axit lactic đông vón sữa ổn định ND1, Proc, LA LP 5.1.2.3 Sức sống giống - Sức sống chủng giống Lactobacillus kiểm tra giảm dần theo thời gian bảo quản Các chủng giống có sức sống ổn định với số lượng tế bào >106/ml gồm LA, LP Proc 5.1.2.4 Khả sinh trưởng điều kiện nhiệt độ - Ở mức nhiệt độ thường (30-35oC): Các chủng giống có tốc độ sinh trưởng lớn gồm LA, LP, NCb, Proc - Ở nhiệt độ cao (40-45oC): Các chủng giống có tốc độ sinh trưởng lớn gồm LA LP 50 Kết cho thấy, có chủng Lactobacillus LA chủng giống có sức sống đặc tính sinh học ổn định suốt trình bảo quản 5.2 KIẾN NGHỊ 5.2.1 Tồn - Do điều kiện thời gian nghiên cứu hạn chế nên chưa đánh giá biến đổi chủng vi khuẩn Lactobacillus thời gian bảo quản kéo dài - Chưa có điều kiện để đánh giá biến đổi đặc tính sinh học sức sống chủng vi khuẩn Lactobacillus bảo quản với phương pháp bảo quản khác đông khô, đông sâu… 5.2.2 Kiến nghị Đối với chủng có khả biến đổi đặc tính sinh học chọn lọc làm giống sản xuất nên phân lập chọn lọc lại môi trường tự nhiên để nâng cao phẩm chất giống Tiếp tục nghiên cứu đánh giá biến đổi phẩm chất giống vi khuẩn Lactobacillus nuôi cấy môi trường thạch nghiêng điều kiện bảo quản kéo dài để có đánh giá xác mức độ biến đổi nguy phát sinh đột biến không mong muốn trình bảo quản 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt 10 11 12 13 Biền Văn Minh (2008) Vi sinh vật học Giáo trình điện tử tr 132-134 Lê Tấn Hưng, Võ Thị Hạnh, Lê Thị Bích Phượng Trương Thị Hồng Vân (2003) Nghiên cứu sản xuất chế phẩm Probiotic BIO II kết thử nghiệm ao nuôi tôm Tuyển tập báo cáo khoa học Hội nghị công nghệ sinh học toàn Quốc 2003, Hà Nội, 16-17/12/2003 Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật tr 75-79 Lương Đức Phẩm (2004) Công nghệ vi sinh vật NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Mai Đàm Linh, Đỗ Minh Phương, Phạm Thị Tuyết, Kiều Hữu Ảnh Nguyễn Thị Giang (2008) Đặc điểm sinh học chủng vi sinh vật lactic phân lập địa bàn thành phố Hà Nội Tạp chí Khoa học ĐHQGHN (24) tr 221-226 Nguyễn Khắc Tuấn (1996) Giáo trình Vi sinh vật học NXB Nông nghiệp Hà Nội Nguyễn La Anh, Đinh Mỹ Hằng, Vũ Quỳnh Hương, Nguyễn Hương Giang Nguyễn Thị Lộc (2003) Đặc điểm chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum có ứng dụng công nghệ sản xuất nước CVAS Tuyển tập báo cáo Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc năm 2003 tr 159-161 Nguyễn Lân Dũng (1978) Phương pháp nghiên cứu vi sinh vật, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Lân Dũng, Bùi Thị Việt Hà, Nguyễn Đình Quyển, Phạm Văn Ty, Phạm Thành Hổ, Lê Văn Hiệp, Chung Chí Thành Lê Thị Hòa (2002) Vi sinh vật học phần II NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội tr 63-168 Nguyễn Thị Hồng Hà, Lê Thiên Minh Nguyễn Thuỳ Châu (2003) Nghiên cứu công nghệ sản xuất chế phẩm vi khuẩn lactic probiotic Tuyển tập báo cáo Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc năm 2003 tr 75-255 Nguyễn Văn Uyển Ngô Kế Sương (1994) Công nghệ sinh học số ứng dụng Việt Nam tập II NXB Nông nghiệp Hà Nội tr 122 Phạm Thị Ngọc Lan Lê Thanh Bình (2003) Đặc điểm phân loại chủng Lactobacillus probiotic CH123 CH 126 phân lập từ đường ruột gà Tuyển tập báo cáo Hội nghị Công nghệ Sinh học Toàn quốc năm 2003 tr.101-105 Trần Liên Hà (2007) Đại cương vi sinh vật thực phẩm, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội tr 119-120 Võ Nhân Hậu cs (2005) Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa số chủng vi khuẩn lactic lựa chọn chủng thích hợp chế biến cải bẹ muối chua Tạp chí Khoa học ĐH Nông lâm Hồ Chí Minh 52 Tiếng anh 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 Abee T., G Beldman, B Broek, J Houben, R Nout., F Rombouts, S Schoustra, F Voragen, J Wouters, A Noomen and P Walstra (1999) Food fermentation part 1, Department of Food Technology and Nutritional Sciences, Wageningen Agriculture University Adesokan I A., B B Odetoyinbo and A O Olubamiwa (2008) Biopreservative activity of lactic acid bacteria on suya produced from poultry meat Afr J.Biotech Vol (20) pp 3799-3803 Afolabi O R., O M Bankole and O J Olaitan (2008) Production and characterization of antimicrobial agents by Lactic Acid Bacteria Isolated from Fermented Foods The Internet J Microbiol Vol pp Ahmed and Kanwal (2004) Biochemical characteristics of lactic acid producing bacteria and preparation of camel milk cheese by using starter culture, Parkistan Vet.J Ali H J., F M A Abbas, C J Ogugbue, M E Azhar and N.A Nik Norulainid (2012) Production of the lactic acid from mango peel waste – Factorial experiment Journal of King Saud University – Science Vol 25 (1) pp 39–45 Axelsson and Lars (2004) Acid lactic Bacteria: Classification and Physiology Acid lactic Bacteria microbiological and Functional Aspects Third Edition, Revised and Expanded MATFORSK, Norwegian Food Research Institute, A°s, Norway pp 19-67 Bayane A., D Roblain, R D Dauphin, J Destain, B Diawara and P Thonart (2006) Assessment of the physiological and biochemical characterization of a Lactic acid bacterium isolated from chicken faeces in sahelian region Afr J Biotechnol Vol (8) pp 629-634 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology 2nd Edition Vol (2005) Springer, NewYork Carvalho, A S Silva, Ho P Teixeia and F X Gibbs (2004) Relevant factor for the preparation of freeze-died lactic acid bacteria, International Dairy Journal, Elsrer Science B.V Chopin A (1993) Organization and regulation of genes for amino acid biosynthesis in lactic acid bacteria FEMS microbiological Reviews Fuller R (1989) Probiotic in man and animals, Journal of applied bacteriology Vol 66, pp 365-378 Gunawan S., T Widjaja, S Zullaikah, L Ernawati, N Istianah, H W Aparamarta and D Prasetyoko (2015) Effect of fermenting cassava with Lactobacillus plantarum, Saccharomyces cereviseae and Rhizopus oryzae on the chemical composition of their flour International Food Research Journal Vol 22 (3) pp 1280-1287 53 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 Ho Phu Ha and Michelle Cartherine Adams (2007) Selection and identifinication of a novel probiotic strns of Lactobacillus fermentum isolated from Vietnamese fermented food, Scholl of Enviromental and Life Science Faculty of Science and Information Technology The University of Newcastle, Australia Hollang K T., J S Knapp and J G Shoesmith (1987) Anaerobic Bacteria CVM6202: Microbiology, 1st ed Blackie and Son, Ltd., London Mishra C and J Lambert (1996) Production of anti-microbial substances by probiotic Asia Pacific J Clin Nutr Vol pp 20–24 Nair P S and P K Surendran (2005) Biochemical characterization of lactic acid bacteria isolated from fish and prawn, J Cult Collect pp 448-52 Obadina A O., O B Oyewole, L O Sanni and K I Tomlins (2006) Biopreservative activities of Lactobacillus plantarum strains in fermenting cassava ‘fufu’ Afr J Biotech Vol 5(8) pp 620-623 Oboh G (2006) Nutrient enrichment of cassava peels using a mixed culture of Saccharomyces cerevisiae and Lactobacillus spp Solid media fermentation techniques Electronic Journal of Biotechnology Vol (1) pp 46-49 Olaoye and Onilude (2009) Isolation and Biochemical Profiles of Numerous Strains of Lactic Acid Bacteria from Various Parts of a Domestic West African Goat, Australia Journal of Basic and Applied Sciences Vol Patricia N., M Winy and D V Luc (2003) Effect of sodiumchloride on growth and bacteriocin production by Lactobacillus amylovorus DCE 471 International Journal of Food Microbiology Vol 88 pp 29- 39 Raimbault M (1995) Importance of lactic bacteria in cassava fermentation In: Cassava food processing T A Egbe, A Branmar, D Griffon and S Treche ORSTEM France pp 256-275 Rolfe R D (2000) The role of probiotic cultures in the control of gastrointestinal health J Nutr Vol 130 pp 396S–402S Shoeib H K., A N Syed, S A Sotohy and S K Abdel-Ghaffer (1997) Response of broiler chicks to probiotic (pronifer) supplementation Assiut Veterinary Medical Journal Vol 36 (71) pp.103-116 Silva M., C T De, M A Tessi and M A Moguilevsky (1983) Preservation of lactic acid bacteria on anhydrous silica gel for three years J Food Protec Vol 46 pp 699–701 Srikanjana K., V Helmut, S Jakkapan and O Siriporn (2008) Probiotic Properties of Lactobacilli Isolated from Thai Traditional Food Scientia Pharmaceutica Vol 76 pp 485–503 54 39 40 41 42 Standbury P.F and A Whitaker (1990) Principles of Fermentation Biotechnology Pergamon Press, Oxford Williams and Wilkins (1984) Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, Krieg NR, Holt JG, Baltimore Yazid A.M., M Suhaimi, A M Ali, M H Ghazali, J Normah, A B Fatimah, N A Nur and A Reezal (1999) Survival of bifidobacteria in simulated gastric pH and growth in the presence of bile Journal of Molecular Biology and Biotechnology Vol 7(2) pp 185-190 Zahoor T., S U Rahman and F Umar (2003) Viability of Lactobacillus bulgaricus as Yoghurt Culture Under Different Preservation Methods Int J Agri Biol Vol (1) 55 ... giống, tiến hành đề tài: Đánh giá chất lượng giống số chủng vi khuẩn Lactobacillus điều kiện bảo quản 1.2 MỤC ĐÍCH – YÊU CẦU 1.2.1 Mục đích Theo dõi chủng vi khuẩn Lactobacillus trình bảo quản, ... thời gian giữ giống - Đánh giá khả sống sót chủng Lactobacillus thời gian bảo quản - Đánh giá khả sinh trưởng chủng Lactobacillus điều kiện nhiệt độ khác thời gian bảo quản - Đánh giá số đặc tính... dịch thể 40 vii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Vi Thị Thu Hòa Tên Luận văn: Đánh giá chất lượng giống số chủng vi khuẩn Lactobacillus điều kiện bảo quản Ngành: Chăn Nuôi Mã số: 60.62.01.05