Đang tải... (xem toàn văn)
Xây dựng mã vạch DNA của cây Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum) (LV thạc sĩ)Xây dựng mã vạch DNA của cây Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum) (LV thạc sĩ)Xây dựng mã vạch DNA của cây Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum) (LV thạc sĩ)Xây dựng mã vạch DNA của cây Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum) (LV thạc sĩ)Xây dựng mã vạch DNA của cây Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum) (LV thạc sĩ)Xây dựng mã vạch DNA của cây Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum) (LV thạc sĩ)Xây dựng mã vạch DNA của cây Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum) (LV thạc sĩ)Xây dựng mã vạch DNA của cây Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum) (LV thạc sĩ)Xây dựng mã vạch DNA của cây Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum) (LV thạc sĩ)Xây dựng mã vạch DNA của cây Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum) (LV thạc sĩ)Xây dựng mã vạch DNA của cây Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum) (LV thạc sĩ)
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM VŨ HOÀI SƠN XÂY DỰNG MÃ VẠCH DNA CỦA CÂY GIẢO CỔ LAM (Gynostemma pentaphyllum) Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60 42 01 21 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên, 4- 2016 i LỜI CAM ĐOAN ghi rõ nguồn gốc Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chƣa công bố công trình khác Thái Nguyên, tháng 04 năm 2016 Tác giả Vũ Hoài Sơn ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Tác giả Vũ Hoài Sơn iii MỤC LỤC Trang Trang bìa phụ Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục từ chữ viết tắt iv Danh mục bảng v Danh mục hình vi MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 NGUỒN GỐC, PHÂN LOẠI VÀ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CÂY GIẢO CỔ LAM 1.1.1 Nguồn gốc phân loại 1.1.2 Đặc điểm sinh học 1.1.3 Đặc điểm sinh thái học 1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ GIÁ TRỊ SỬ DỤNG 1.2.1 Thành phần hóa học 1.3 DNA LỤC LẠP, MÃ VẠCH DNA VÀ GEN matK 1.3.1 DNA lục lạp iv 1.3.2 Mã vạch DNA (DNA barcoding) 10 1.3.3 Gen matK 16 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 22 22 22 22 22 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 22 2.2.2 Các phƣơng pháp sinh học phân tử 23 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 27 3.1.1 Đặc điểm thực vật học mẫu Giảo cổ lam Chợ Đồn, Bắc Kạn 27 3.1.2 Đặc điểm thực vật học mẫu Giảo cổ lam Ngọc Đƣờng, Hà Giang 28 30 3.1.4 Đặc điểm thực vật học mẫu Giảo cổ lam Sapa, Lào Cai 31 matK 32 3.2.1 Kết tách chiết DNA từ Giảo cổ lam 32 3.2.2 Kết nhân gen matK phản ứng PCR 33 matK 34 matK 39 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 iv DANH MỤC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT CTAB: Cetyl trimethyl ammonium bromide Cs: Cộ DNA: Deoxyribonucleic acid EDTA: Ethylenediamine tetraacetate matK: PCR: Polymerase chain reaction ( RNA: Ribonucleic acid TAE: - – v DANH MỤC BẢNG Trang 25 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR nhân gen matK 25 –SP 37 39 40 Bảng 3.4 Hệ số tƣơng đồng hệ số sai khác trình tự nucleotide mẫu Giảo cổ lam 40 Bảng 3.5 Hệ số tƣơng đồng hệ số sai khác trình tự amino acid suy diễn mẫu Giảo cổ lam 42 vi DANH MỤC HÌNH Trang Đồn, Bắc Kạn 27 H 29 30 (A, D, F: 32 33 – – – CD) 33 34 – 36 cổ lam 38 Hình 3.10 Mối quan hệ di truyền mẫu Giảo cổ lam 41 42 MỞ ĐẦU Đối với nƣớc ta dƣợc liệu có vị trí quan trọng Nƣớc ta nằm vùng nhiệt đới, chịu ảnh hƣởng gió mùa Nhiệt độ trung bình hàng năm 250C, độ ẩm cao tạo điều kiện thuận lợi cho cối phát triển Diện tích rừng chiếm 2/3 diện tích đất Hệ thực vật phong phú đa dạng, nƣớc có khoảng 20.000 loài có 1.000 loài thuốc Về mặt kinh tế, nhà nƣớc xếp thuốc vào loại công nghiệp cao cấp cần đƣợc phát triển nhƣ công nghiệp khác Hàng năm công ty Dƣợc liệu cấp I cấp II gần công ty tƣ nhân biết khai thác nhiều mặt hàng dƣợc liệu để xuất nhƣ giảo cổ lam, quế, sa nhân, dừa cạn, loại tinh dầu hồi, quế, tràm… flavonoid saponin , có thành phần hóa học thành phần giống nhƣ nhân sâm song hàm lƣợng saponin có giảo cổ lam lại nhiều gấp – lần so với nhân sâm Saponin đóng vai trò quan trọng ngành công nghiệp dƣợc phẩm việc sản xuất loại thuốc có giá trị, số quan trọng điều trị ung thƣ Dù Giảo cổ lam hoàn toàn thay nhân sâm, song xét số phƣơng diện, hiệu mà giảo cổ lam mang lại tốt nhân sâm Ở Việt Nam chủ yếu nghiên cứu, phân loại dựa hình thái nghiên cứu tác dụng dƣợc liệu Giảo cổ lam Đến nay, mẫu hƣớng dẫn định danh có sẵn Tuy nhiên, nhiều trƣờng hợp, mẫu vật chƣa phát triển đầy đủ đặc tính hình thái, chúng bị hƣ hỏng phận ngoài, mẫu vật chết khiến trình nhận diện mẫu vật trở nên khó khăn chí Trong trƣờng hợp mã vạch DNA giúp giải toán trình tự DNA dễ dàng thu nhận từ mẫu mô “Xây dựng mã vạch DNA Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum)” matK (Gynostemma pentaphyllum) lam thu phân tích gen matK DNA nucleotide matK matK matK ban đ 37 matK mẫu Giảo cổ lam có độ tƣơng đồng cao Các vị trí nucleotide sai khác đƣợc thể bảng 3.1 Bảng 3.1 trí nucleotide matK mẫu Giảo cổ lam KF269170 Vị trí KF269170.1 GCL - CD GCL - HG GCL - SP 73 T T T A 75 T T T A 76 T T T G 116 C T C C 125 C T C C 128 C C A C 145 G G T G 151 T T C T 170 T T A T 474 G G T G 516 G G A G 38 suy matK protein suy KF269170 Hình 3.9 matK matK 39 mẫu Giảo cổ lam có độ tƣơng đồng cao Các vị trí amino acid sai khác đƣợc thể bảng 3.2 Bảng 3.2 trí amino acid sai khác KF269170.1 Vị trí KF269170.1 GCL - CD GCL - HG GCL - SP 25 Tyr Tyr Tyr Lys 26 Cys Cys Cys Gly 39 Ser Phe Ser Ser 42 Ser Leu Ser Ser 43 Thr Thr Lys Thr 49 Val Val Phe Val 51 Phe Phe Ser Phe 57 Val Val Glu Val 158 Arg Arg Ser Arg matK matK 40 matK matK đa dạng trình tự nucleotid trình tự amino acid su matK Bảng 3.3 gen matK STT Mã số Năm Quốc gia Tác giả GCL - CD 2015 Việt Nam Chu et al GCL - HG 2015 Việt Nam Chu et al GCL - SP 2015 Việt Nam Chu et al KF269170 2014 Yu et al KF269162 2014 Yu et al KF269159 2014 Yu et al KF269157 2014 Yu et al KF269156 2014 Yu et al AY968451 2014 Zhang et al matK, trình tự nucleotid 41 Bảng 3.4 Hệ số tƣơng đồng hệ số sai khác trình tự nucleotide mẫu Giảo cổ lam matK ảo cổ lam sở matK đƣợc thể sơ đồ hình hình 3.10 Hình 3.10 Mối quan hệ di truyền mẫu Giảo cổ lam matK 42 KF26 1,3% (nhánh phụ 1, 2, 3, 4) Mẫu N GCL – CD, GCL – HG, GCL – SP % matK thể bảng 3.5 Bảng 3.5 Hệ số tƣơng đồng hệ số sai khác trình tự amino acid suy diễn mẫu Giảo cổ lam matK 95,5 % mẫu Giảo cổ lam sở phân tích trình tự amino acid suy diễn từ gen matK đƣợc thể sơ đồ hình hình 3.11 43 Hình 3.11 Mối quan hệ di truyển matK % ) Mẫu GCL – SP, GCL – CD, GCL – HG (n Khoảng cách % 44 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ - - - G Pentaphyllum), Giảo cổ lam (G Pubescens 1.2 Đoạn gen matK matK 1.3 D chín – – – matK, – khoản – – ó % Đ ITS, ropC1 cổ lam Việt Nam 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Vũ Thị Thu Hiền, Trần Thị Việt Thanh, Nguyễn Khắc Khôi, Đinh Thị Phòng (2012), Làm sáng tỏ tên khoa học cho số loài thuộc chi tre (bambusa sCHREB) Việt Nam biến đổi hình thái sở giải mã trình tự gen trnL – trnF, psbA – trnH Và matK, Tạp chí Khoa học Công nghệ 50 (4): 463 – 473 Hà Văn Huân, Nguyễn Văn Phong (2015), “Xác định đoạn mã vạch ADN cho Trà hoa vàng Tam Đảo (Camellia tamdaoensis): Loài đặc hữu Việt Nam”, Tạp chí Nông nghiệp PTNT, 5: 123 – 130 Huỳnh Thị Thu Huệ, Nguyễn Đăng Tôn, Cao Xuân Hiếu, Nguyễn Thùy Dƣơng, Lê Thị Thu Hiền, Trần Thị Phƣơng Liên, Đặng Văn Hạnh, Lã Đình Mỡi, Lê Trần Bình, Nông Văn Hải (2003), “Tách dòng xác định trình tự gen 18S rRNA Bình vôi”, Tạp chí Công nghệ Sinh học (1): 203 – 209 Phạm Thanh Kỳ, Vũ Đức Cảnh, Phạm Thanh Hƣơng, Nguyễn Kim Phƣợng (2007), “Nghiên cứu tác dụng hạ cholesterol máu dƣợc liệu Giảo cổ lam - Gynostemma pentaphyllum (Thunb) Makino”, Tạp chí dược học: – 10 Đỗ Tất Lợi (1999), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nxb Y học Chu Hoàng Mậu (2005), Cơ sở phương pháp sinh học phân tử Nguyễn Thị Thanh Nga (2012), Đánh giá đa dạng di truyền số loài dược liệu Việt Nam thuộc chi Đảng Sâm (Codonopsis sp) kỹ thuật 46 ADN mã vạch, Luận văn thạc sĩ khoa học, Đại học khoa học tự nhiên – Đại học quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Lê Thị Huyền Thanh (2003), Đa dạng di truyền họ gừng (Zingiberaceae) vùng Bảy Núi – An Giang, Luận văn thạc sĩ Khoa học Sinh học, Đại học khoa học tự nhiên – Đại học quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Đức Thành, Nguyễn Thúy Hạnh, Trần Quốc Trọng (2007), “Kết sử dụng số chuỗi gen lục lạp nghiên cứu đa dạng di truyền xuất xứ lâm nghiệp”, Tạp chí Công nghệ Sinh học (5): 77 – 83 10 Ngô Văn Thu (2011), “Bài giảng dƣợc liệu”, tập I Trƣờng đại học Dƣợc Hà Nội 11 Nguyễn Thị Phƣơng Trang, Tạ Thi Nhung, Hà Minh Tâm, Nguyễn Văn Thành (2013): “Trình tự gen matK loài gai (hopea hongayensis) Việt Nam”, Hội nghị Khoa học toàn quốc Sinh thái Tài nguyên sinh vật lần thứ 5: 319 – 322 12 Viện dƣợc liệu (2010), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam tập1, Tiếng Anh 13 Ayşe Gül İNCE, Mehmet KARACA, A Naci ONUS, Mehmet BiLGEN (2005) “Chloroplast matK gene phylogeny of some important species of plants” AKDENİZ ÜNİVERSİTESİ ZİRAAT FAKÜLTESİ DERGİSİ, 18(2): 157 – 162 14 Baldwin B G., Sanderson M, Porterz J., Wojciechowski M F et al (1995), “The ITS region of nuclear ribosomal DNA: a valuable source 47 of evidence on angiosperm phylogeny” Annals of the Missouri Botanical Garden (82): 247 – 277 15 Beivy Jonathan Kolondam (2015), “Applying matk gene for identification of liliopsida plant species from north sulawesi through bold systems”, International Journal of Applied Biology and Pharmaceutical Technology 6(2): 242 – 246 16 Chiou S J., Y.J.H., Fang C L., Chen H L., Lin T Y (2007), “Authentication of medicinal herbs using PCR-amplified ITS2 with specific primers”, Planta Medica: 1421 – 1426 17 Chun-Feng Qiao, Q.-B.H., Zhi-Li Zhao, Zheng-Tao Wang, Luo-Shan Xu and HongXi Xu (2009), “Sequence Analysis Based on ITS1 Region of Nuclear Ribosomal DNA of Amomum villosum and Ten Species of Alpinia”, Journal of Food and Drug Analysis, 17: 142 – 145 18 Cuenoud P., S.V., Chatrou L W., Et Al (2002), “Molecular phylogenetics of Caryophyllales based on nuclear 18S rDNA and plastid rbcL, atpB, and matK DNA sequences”, American Journal of Botany, 89: 132 - 144 19 Cui X, Matsuura M, Wang Q, Ma H, Lambowitz AM (2004), “A group II intron-encoded maturase functions preferentially in cis and requires both the reverse transcriptase and X domains to promote RNA splicing” J Mol Biol: 211 – 231 20 DNA Barcoding (2015), Water quality assessment, http://dna- barcoding.blogspot.com/2015/08/water-quality-assessment.html, ngày 05/04/2016 21 Han Yan, Xiaobing Wang, Junfeng Niu, Yaqin Wang, and Quanhong Liu (2014), Anti-Cancer Effect and the Underlying Mechanisms of Gypenosides on Human Colorectal Cancer SW-480 Cells, Nukhet 48 Aykin – Burns, University of Arkansas for Medical Sciences; College of Pharmacy, United States of America 22 Hao D.C., Chen S.L., Xiao P.G (2010), “Sequence characteristics and divergent evolution of the chloroplast psbA – trnH noncoding region in gymnosperms”, Journal of applied genetics, 50: 259 – 273 23 Hilu K W., (1997), “The matK gene: sequence variation and application in plant systematics”, American Journal of Botany, 84: 830 – 839 24 Hollingsworth ML, Clark A, Forrest LL, Richardson JR, Pennington RT, et al (2009), “Selecting barcoding loci for plants: evaluation of seven candidate loci with species-level sampling in three divergent groups of land plants”, Molecular Ecology Resources 9: 439 – 457 25 Jing YU, Jian-Hua XUE, Shi-Liang ZHOU (2011), “New universal matK primers for DNA barcoding angiosperms”, Journal of Systematics and Evolution 49 (3): 176 – 181 26 K.F.Armstrong (2005), “DNA barcodes for biosecurity: invasive species identification”, Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci: 1813–1823 27 Li B, Zhang X, Wang M, Jiao L (2015), “Characterization and antioxidant activities of acidic polysaccharides from Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Markino”, Carbohydrate Polymers: 209 – 214 28 Masahiro Nagai, Izawa K., Nagumo S., Sakurai N., and Inoue T (1981), “Two glycosides of a novel dammarane alcohol from Gynostemma pentaphyllum”, Chemical and Pharmaceutical Bulletin 29 No3: 779 – 783 49 29 Michelle M.Barthet and Khidir W.Hilu (2007), “Expression of MatK: Funtion and evolutionary implications”, A JB 94 (8): 1402 – 1412 30 Moran JV, Mecklenburg KL, Sass P, Belcher SM, Mahnke D, Lewin A, Perlman P (1999), “Splicing defective mutants of the COXI gene of yeast mitochondrial DNA: initial definition of the maturase domain of the group II intron aI2”, Oxford Journal 22: 2057 – 2064 31 Mort ME, Soltis DE, Soltis PS, Francisco – Ortega J, Santons – guerra A (2001), “Phylogenetics relationships and evolution of Crassulaceae inferred from matK sequence data”, American Journal of Botany 88: 76 - 91 32 Mort ME, Levsen N, Randle RP, Jaarseld EV, Palmer A (2005), “Phylogenetics and diversification of Cotyledon (Crassulaceae) inferred from nuclear and chloroplast DNA sequences data”, American Journal of Botany 92 (7): 1170 – 1176 33 Paul D N Hebert (2003), Alina Cywinska, Shelley L Ball and Jeremy R deWaard (2003), “Biological identifications through DNA barcodes”, Proceeding Of The Royal Society: 313 – 321 34 Petersen G., Seberg O (1996), “ITS regions highly conserved in cultivated barleys”, Euphytica, 90: 233 – 234 35 Qin R, Zhang J, Li C, Zhang X, Xiong A, Huang F, Yin Z, Li K, Qin W, Chen M, Zhang S, Liang L, Zhang H, Nie H, Ye W (2012), “Protective effects of gypenosides against fatty liver disease induced by high fat and cholesterol diet and alcohol in rats”, Archives of Pharmacal Research 35: 1241 – 1250 50 36 Reuter (2010), DNA barcoding aims to protect species, food, http://www.reuters.com/article/us-dna-idUSTRE69S57G20101029, ngày 05/01/2016 37 Shneer VS (2009), DNA barcoding of animal and plant species as an approach for their molecular identification and describing of diversity, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19799325, ngày 5/4/2016 38 Smith et al (2012), Wolbachia and DNA Barcoding Insects: Patterns, Potential, and Problems, http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0036514, ngày 05/04/2016 39 Tagir Kh Samigullin, William F Martin, Aleksey V Troitsky, Andrey S Antonov (1999), “Molecular Data from the Chloroplast rpoC1 Gene Suggest a Deep and Distinct Dichotomy of Contemporary Spermatophytes into Two Monophyla: Gymnosperms (Including Gnetales) and Angiosperms”, Journal Of Molecula Evolution 49: 310 – 315 40 Vadivalagan et al, (2015), Genetic deviation in geographically close populations of the dengue vector Aedes aegypti (Diptera: Culicidae): influence of environmental barriers in South India, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26627691, ngày 05/04/2016 41 Ward RD et al (2009), The campaign to DNA barcode all fishes, FISHBOL, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20735564, ngày 20/04/2016 42 Yu et al (2014), Gynostemma laxum isolate PT5205MT01 internal transcribed spacer 1, partial sequence; 5.8S ribosomal RNA gene, complete sequence; and internal transcribed spacer 2, partial sequence, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KF269126, ngày 15/4/2016 51 43 Yu et al (2014), Gynostemma pentaphyllum var pentaphyllum isolate PT5204MT03 maturase K (matK) gene, partial cds; chloroplast, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KF269157, ngày 15/04/2016 44 Yu et al (2014), Gynostemma pentaphyllum var pentaphyllum isolate PT5204MT05 maturase K (matK) gene, partial cds; chloroplast, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KF269159, ngày 15/04/2016 45 Yu et al (2014), Gynostemma pentaphyllum var pentaphyllum isolate PT5204MT08 maturase K (matK) gene, partial cds; chloroplast, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KF269162, ngày 15/04/2016 46 Yu et al (2014), Gynostemma pentaphyllum var dasycarpum isolate PT5207MT03 maturase K (matK) gene, partial cds; chloroplast, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KF269170, ngày 15/4/2016 47 Zhang et al (2014), Gynostemma pentaphyllum maturase K (matK) gene, partial cds; plastid, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AY968451, ngày 15/4/2016 ... hợp mã vạch DNA giúp giải toán trình tự DNA dễ dàng thu nhận từ mẫu mô Xây dựng mã vạch DNA Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum) matK (Gynostemma pentaphyllum) lam thu phân tích gen matK DNA. .. Việt Nam có ba loại giảo cổ lam là: (1) Giảo cổ lam ba (G Laxum), (2) Giảo cổ lam năm (G Pentaphyllum), (3) Giảo cổ lam bảy (G Pubescens) [122] 1.1.2 Đặc điểm sinh học Giảo cổ lam loài thảo có thân... chiết xuất, ứng dụng 6 Giảo cổ lam có vị đắng, tính hàn [5] Các thử nghiệm Giảo cổ lam chuột thỏ áu (Triglicerid Cholesterol) Giảo cổ lam làm tăng lực 214,2%, Giảo cổ lam bảo vệ tế bào gan mạnh