Đang tải... (xem toàn văn)
ĐẶT VẤN ĐỀ Tiêu chảy là bệnh thường gặp ở trẻ em có tỷ lệ mắc, tỷ lệ tử vong cao, chỉ sau bệnh nhiễm đường hô hấp. Theo tổ chức y tế thế giới (TCYTTG) hàng năm trên thế giới có khoảng 1,5 tỷ lượt trẻ bị mắc tiêu chảy, trong đó 1,5-2,5 triệu trẻ em dưới 5 tuổi tử vong. Ở trẻ em tiêu chảy do vi rút thường chiếm ưu thế, trong đó norovirus (NoV) là nguyên nhân gây tiêu chảy đứng thứ hai sau rotavirus (RV). Trên thế giới như Nhật Bản trẻ tiêu chảy phát hiện NoV trong phân 33,8%, Hàn Quốc là 35,8%, còn ở Ý chiếm tới 48,4%. Tại Việt Nam nhiễm NoV ở trẻ em được phát hiện bằng kỹ thuật real-time RT-PCR đã xác định tỷ lệ nhiễm NoV ở trẻ tiêu chảy nhập bệnh viện Nhi Trung ương chiếm tới 36,3%, tương tự như tỷ lệ nhiễm NoV ở các nước trên thế giới. Nghiên cứu cho thấy NoV sử dụng kháng nguyên nhóm máu có trên niêm mạc và trong dịch tiết của cơ thể để xâm nhập vào tế bào ở biểu mô ruột. Do vậy, có sự liên quan giữa tình trạng tiết kháng nguyên nhóm máu và khả năng cảm nhiễm đối vi rút này. Nghiên cứu đánh giá về mặt dịch tễ học lâm sàng, một số yếu tố ảnh hưởng đến tỷ lệ nhiễm NoV cũng như phân tích sâu sự liên quan giữa kháng nguyên nhóm máu với tình trạng nhiễm NoV ở trẻ em Việt Nam còn hạn chế. Từ thực tế đó chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài này nhằm các mục tiêu: 1. Mô tả thực trạng và một số yếu tố liên quan đến nhiễm Norovirus ở bệnh nhi dưới 5 tuổi có/không có triệu chứng tiêu chảy cấp điều trị tại bệnh viện đa khoa Hà Nam 12/2012-11/2013. 2. Xác định mối liên quan giữa kháng nguyên hệ nhóm máu ABO và Lewis với tình trạng nhiễm Norovirus. Những đóng góp mới của luận án Luận án đã cung cấp thực trạng nhiễm NoV, trong đó nhấn mạnh một số đặc điểm dịch tễ và yếu tố liên quan đến tỷ lệ nhiễm NoV ở bệnh nhi dưới 5 tuổi. Đồng thời cũng đánh giá đặc điểm lâm sàng tiêu chảy cấp do NoV giúp cho các nhà lâm sàng trong việc chẩn đoán, điều trị, tiên lượng và phòng bệnh tiêu chảy cấp do NoV. Các kiểu gen phát hiện được trong nghiên cứu này khá đa dạng, trong đó GII.4 chiếm chủ yếu. Kháng nguyên nhóm máu Le a+b- /Le x+y- , đại diện cho kiểu hình tiết không hoàn toàn ở người Việt Nam có nguy cơ nhiễm NoV thấp hơn các kiểu hình tiết không hoàn toàn khác. Vai trò kháng nguyên Lewis xy bên cạnh kháng nguyên Lewis ab được khẳng định và cần thiết để đánh giá tình trạng tiết kháng nguyên nhóm máu. Đây có lẽ là một trong các nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam về đánh giá mối liên quan giữa kháng nguyên nhóm và tình trạng nhiễm NoV. Như vậy nghiên cứu đã góp phần đưa ra những luận chứng cho chiến lược phát triển vắc xin và thuốc kháng NoV trong tương lai. Cấu trúc của luận án Luận án gồm 125 trang, 4 chương, đặt vấn đề 2 trang, tổng quan 42 trang, đối tượng và phương pháp nghiên cứu 19 trang, kết quả 26 trang, bàn luận 32 trang, kết luận 2 trang, kiến nghị 1 trang, 57 bảng, 5 biểu đồ, 9 hình, 217 tài liệu tham khảo, 3 bài báo liên quan luận án đã được công bố.
1 ĐẶT VẤN ĐỀ Tiêu chảy bệnh thường gặp trẻ em có tỷ lệ mắc, tỷ lệ tử vong cao, sau bệnh nhiễm đường hô hấp Theo tổ chức y tế giới (TCYTTG) hàng năm giới có khoảng 1,5 tỷ lượt trẻ bị mắc tiêu chảy, 1,5-2,5 triệu trẻ em tuổi tử vong Ở trẻ em tiêu chảy vi rút thường chiếm ưu thế, norovirus (NoV) nguyên nhân gây tiêu chảy đứng thứ hai sau rotavirus (RV) Trên giới Nhật Bản trẻ tiêu chảy phát NoV phân 33,8%, Hàn Quốc 35,8%, Ý chiếm tới 48,4% Tại Việt Nam nhiễm NoV trẻ em phát kỹ thuật real-time RT-PCR xác định tỷ lệ nhiễm NoV trẻ tiêu chảy nhập bệnh viện Nhi Trung ương chiếm tới 36,3%, tương tự tỷ lệ nhiễm NoV nước giới Nghiên cứu cho thấy NoV sử dụng kháng nguyên nhóm máu có niêm mạc dịch tiết thể để xâm nhập vào tế bào biểu mơ ruột Do vậy, có liên quan tình trạng tiết kháng ngun nhóm máu khả cảm nhiễm đối vi rút Nghiên cứu đánh giá mặt dịch tễ học lâm sàng, số yếu tố ảnh hưởng đến tỷ lệ nhiễm NoV phân tích sâu liên quan kháng ngun nhóm máu với tình trạng nhiễm NoV trẻ em Việt Nam hạn chế Từ thực tế chúng tơi tiến hành thực đề tài nhằm mục tiêu: Mô tả thực trạng số yếu tố liên quan đến nhiễm Norovirus bệnh nhi tuổi có/khơng có triệu chứng tiêu chảy cấp điều trị bệnh viện đa khoa Hà Nam 12/2012-11/2013 Xác định mối liên quan kháng ngun hệ nhóm máu ABO Lewis với tình trạng nhiễm Norovirus Những đóng góp luận án Luận án cung cấp thực trạng nhiễm NoV, nhấn mạnh số đặc điểm dịch tễ yếu tố liên quan đến tỷ lệ nhiễm NoV bệnh nhi tuổi Đồng thời đánh giá đặc điểm lâm sàng tiêu chảy cấp NoV giúp cho nhà lâm sàng việc chẩn đoán, điều trị, tiên lượng phòng bệnh tiêu chảy cấp NoV Các kiểu gen phát nghiên cứu đa dạng, GII.4 chiếm chủ yếu Kháng ngun nhóm máu Lea+b-/Lex+y-, đại diện cho kiểu hình tiết khơng hồn tồn người Việt Nam có nguy nhiễm NoV thấp kiểu hình tiết khơng hồn tồn khác Vai trị kháng ngun Lewis xy bên cạnh kháng nguyên Lewis ab khẳng định cần thiết để đánh giá tình trạng tiết kháng ngun nhóm máu Đây có lẽ nghiên cứu Việt Nam đánh giá mối liên quan kháng ngun nhóm tình trạng nhiễm NoV Như nghiên cứu góp phần đưa luận chứng cho chiến lược phát triển vắc xin thuốc kháng NoV tương lai Cấu trúc luận án Luận án gồm 125 trang, chương, đặt vấn đề trang, tổng quan 42 trang, đối tượng phương pháp nghiên cứu 19 trang, kết 26 trang, bàn luận 32 trang, kết luận trang, kiến nghị trang, 57 bảng, biểu đồ, hình, 217 tài liệu tham khảo, báo liên quan luận án công bố CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Tình hình nghiên cứu nhiễm NoV trẻ tuổi giới Việt Nam 1.1.1.Tình hình nghiên cứu nhiễm NoV trẻ em mắc tiêu chảy NoV tác nhân gây tiêu chảy tất lứa tuổi, trẻ em chiếm tỷ lệ chủ yếu Ở Brazil, 33% trẻ mắc tiêu chảy cấp nhiễm NoV, GI chiếm 6,1% GII chiếm 78,7%, lại bội nhiễm genogroup Một nghiên cứu khác Tokyo Osaka Nhật Bản cho thấy 29% nhiễm NoV trẻ mắc tiêu chảy Tỷ lệ mắc cao đến 48,4% Ý lần đánh giá tầm quan trọng vi rút tiêu chảy trẻ em Ở Ấn Độ Thái Lan, tỷ lệ nhiễm vi rút dao động từ 12 - 44% tuỳ theo phương pháp phát tác nhân gây tiêu chảy Ở nước ta, Nguyễn Vân Trang cs nghiên cứu trẻ em bị viêm dày ruột cấp tính bệnh viện Nhi Trung ương (2006-2007) kỹ thuật Real time RT-PCR xác định tỷ lệ nhiễm NoV 36,3% Kết giải trình tự gen chủng NoV phân lập cho thấy NoV GII.4 genotype phổ biến thuộc cluster Minerva GII.42006b, khác với cluster chủng GII.4 phân lập năm 1998-1999 bệnh viện Tác giả Tamura T cs đưa tỷ lệ nhiễm NoV 6,0% trẻ tiêu chảy bệnh viện Đa khoa tỉnh Khánh Hịa (2005-2006) với GII tác giả sử dụng phương pháp khuếch đại chuỗi axit nucleic (NASBA) định genotype NoV Khi nghiên cứu tỷ lệ nhiễm NoV trẻ tiêu chảy bệnh viện Nhi Đồng 1, Nguyễn Anh Tuấn cs kỹ thuật RT-PCR xác định tỷ lệ nhiễm NoV có 7,1% 1.2.2 Tình hình nghiên cứu nhiễm NoV trẻ em không mắc tiêu chảy NoV gây tiêu chảy cấp cho trẻ, mà cịn mối nguy hiểm cho cộng đồng, nghiên cứu Ấn Độ cho thấy trẻ lành mang NoV chiếm tới 6,6%, nguồn lây lan mạnh cộng đồng đặc biệt nhà trẻ, trường học nguy bùng phát dịch lớn Trên giới có số nghiên cứu tình trạng nhiễm NoV khơng có biểu lâm sàng tiêu chảy nghiên cứu 198 trẻ Chile (2009) nhận thấy tỷ lệ nhiễm NoV khơng có biểu triệu chứng lâm sàng 8% Ở Mexico (2006) tỷ lệ nhiễm NoV khơng có biểu tiêu chảy 19,8% Trung Quốc tỷ lệ nhiễm NoV không biểu triệu chứng 9% Tại Anh (2010) tỷ lệ nhiễm NoV khơng có triệu chứng lâm sàng 10% Ở thành phố Vitoria, Brazil (2010) thấy tỷ lệ nhiễm NoV 13% bệnh nhân khơng có triệu chứng tiêu chảy Tại Hàn Quốc năm 2010 nghiên cứu thực Cheon cs phân tích tỷ lệ nhiễm NoV khơng biểu triệu chứng có khác theo mùa, mùa đơng 5,5%, mùa hè 3,5% Barreira cộng chủng NoV GII.4 chủng phổ biến trẻ mắc tiêu chảy, cịn chủng GII.3 thường tìm thấy trẻ khơng có triệu chứng 1.2 Dịch tễ học tiêu chảy NoV 1.2.1 Nguồn bệnh Ổ chứa vi rút người bệnh, vi rút có phân bệnh nhân, có nhiều ngày trước sau bệnh nhân có biểu lâm sàng, vi rút thải với số lượng lớn thời kỳ tiêu chảy Số lượng vi rút đào thải ngồi tới 1011 vi rút /ml phân Sau đào thải ngoài, vi rút tồn phân mơi trường lâu để lây nhiễm cho người khác 1.2.2 Đường lây truyền Bệnh lây truyền qua đường phân - miệng, phương thức chứng minh người tình nguyện động vật thực nghiệm Vi rút lây truyền từ người sang người khác bị nhiễm phân chứa vi rút qua đường ăn uống, thức ăn, nước uống bị nhiễm bẩn phân người súc vật mang mầm bệnh nguồn gây bệnh cho cộng đồng Một đường lây truyền khác không phần quan trọng đường giao tiếp thành viên gia đình gia đình có trẻ mắc tiêu chảy lây thành viên tập thể trường học, nhà trẻ 1.2.3 Yếu tố nguy Nguồn truyền nhiễm Tuổi: Trẻ từ tháng đến tuổi hay bị mắc bệnh tiêu chảy trẻ tập ăn sam, giảm kháng thể mẹ truyền, kháng thể chủ động chưa có (nếu không sử dụng vắc xin phòng bệnh), nguy tiếp xúc mầm bệnh tăng lên trẻ biết bò tăng hoạt động cá nhân Tại Nhật Bản trẻ tiêu chảy NoV gặp chủ yếu trẻ tuổi Giới: Trẻ trai thường mắc cao trẻ gái Chương trình giám sát bệnh tiêu chảy bệnh viện miền Bắc, tỷ lệ mắc tiêu chảy trẻ trai cao 1,9 lần số trẻ gái, Miền Nam số trẻ trai bị tiêu chảy cao trẻ gái 1,4 lần Suy dinh dưỡng: Trẻ suy dinh dưỡng dễ bị mắc tiêu chảy, đặc biệt trẻ suy dinh dưỡng nặng bị tiêu chảy có tỷ lệ tử vong cao Nguyên nhân gây tử vong trẻ bị tiêu chảy nước điện giải, suy dinh dưỡng Suy dinh dưỡng tiêu chảy tạo thành vòng xoắn bệnh lý Suy giảm miễn dịch: Trẻ suy giảm miễn dịch tạm thời hay gặp sau sởi, đợt nhiễm vi rút khác thủy đậu, quai bị, viêm gan suy giảm miễn dịch kéo dài dễ mắc tiêu chảy Mùa, khí hậu, thời tiết Theo nghiên cứu bệnh hay gặp vùng khí hậu ơn đới chiếm tới 50% trường hợp mắc tiêu chảy, bệnh thường xảy vào mùa đơng có khí hậu thời tiết lạnh, khô vào khoảng tháng 11 đến tháng Nghiên cứu Nhật Bản cho thấy trẻ tiêu chảy NoV gặp chủ yếu vào mùa đông Ở nước nhiệt đới nước phát triển yếu tố mùa rõ rệt, bệnh gặp quanh năm có xu hướng tăng mùa lạnh, mùa khơ Bangladesh, Ấn Độ Một nghiên cứu Nhật Bản (2004-2005) cho thấy nhiễm NoV xảy quanh năm cao vào tháng giêng Tập quán, điều kiện, mơi trường sống Trẻ bú sữa bình, khơng đảm bảo vệ sinh, nguy tiêu chảy vi rút cao gấp khoảng 10 lần so với trẻ bú mẹ hồn tồn khơng bú bình Thức ăn bị ô nhiễm Nước uống không nguồn nước sinh hoạt bị ô nhiễm Dụng cụ, tay người chế biến thức ăn bị nhiễm NoV Xử lý chất thải nhiễm vi rút không cách, Không rửa tay sau vệ sinh, chế biến thức ăn, trước cho trẻ ăn 1.2.4 Tiêu chảy có khả gây thành vụ dịch NoV nguyên quan trọng gây vụ dịch tiêu chảy nhóm tuổi Giữa năm 1990, chủng GII.4 xuất trở thành chủng phổ biến nhất, tác nhân 80% vụ dịch tiêu chảy nhiều nước giới Từ 1999-2004 xảy nhiều vụ dịch tiêu chảy NoV quân đội Israel 1.3.5 Tình hình nghiên cứu phát triển vắc xin phịng NoV Các vắc xin phòng tiêu chảy NoV phát triển Một số nước giới nghiên cứu như: Vắc xin hạt giả vi rút (VLP) tái tổ hợp dựa protein capsid vi rút, Vắc xin kết hợp NoV- VLP RVVP6, vắc xin chế tạo từ hạt P NoV, Vắc xin kết hợp VLPs NoV-GII.4 EV71 (nguyên nhân gây bệnh tay-chân-miệng) thể (bảng 1.7) Bảng 1.7 Tình hình phát triển số vắc xin Nhà phát Giai đoạn tiền triển lâm sàng GI.1/GII.4 Takeda VLP Vaccines GI.1/GII.4 ĐHTH Bang X VLP Arizona Tổ hợp ĐHTH X NoV-VLP Tampere; MN protein VP6 Pharma rotavirus ĐHTH X NoV hạt P Cincinnati Viện Pasteur X Tổ hợp VLP Shanghai; NoV Viện Hà Lâm EV71 Trung Quốc Tên vắc xin Pha I Pha II POC Pha III X Các vắc xin thử nghiệm giai đoạn tiền lâm sàng thử nghiệm lâm sàng Hiện chưa có vắc xin phịng tiêu chảy NoV 1.3 Đặc điểm lâm sàng tiêu chảy vi rút (nói chung) NoV (nói riêng) Nơn thường xuất đầu tiên, lúc đầu trẻ buồn nôn, nơn khan sau nơn thức ăn Nơn thường xuất đến ngày đầu Số lần nơn từ vài lần ngày, chí nôn nhiều lần Tiêu chảy thường xảy sau nôn đến ngày xảy dấu hiệu tiêu chảy Phân lúc đầu tiêu chảy dạng bột đậu màu vàng, tiếp đến phân lỏng dần tới tóe tồn nước, phân có mùi Số lần tiêu chảy thường khoảng lần trong/ngày, trí 10 đến 15 lần/ngày Sốt triệu chứng khởi đầu đợt bệnh, kèm theo triệu chứng nôn tiêu chảy, trẻ sốt nhẹ vừa chủ yếu 1.4 Cấu trúc di truyền NoV NoV thuộc họ Caliciviridae NoV phát lần kính hiển vi điện tử vào năm 1972 phân người bệnh NoV vi rút khơng vỏ, hình cầu 20 mặt, đường kính hạt vi rút khoảng 27nm–40nm, có vật liệu di truyền ARN sợi đơn, dương Bộ gen NoV khoảng 7,3–7,6kb Dựa trình tự gen mã hóa protein capsid VP1, NoV chia thành genogroup (I, II, III, IV, V) Các genogroup (Nhóm gen) chia thành genotypes (Kiểu gen), phát 14 genotypes (GI.1–GI.14) thuộc nhóm GI 17 genotypes (GII.1–GII.17) thuộc nhóm GII 1.5 Xác định NoV kỹ thuật real time RT-PCR Real time RT-PCR phương pháp kiểm soát lượng huỳnh quang giải phóng phản ứng, từ biết lượng sản phẩm PCR chu kỳ trình khuếch đại, trái ngược với PCR truyền thống biết lượng sản phẩm khuếch đại thời điểm cuối sản phẩm khuếch đại Real time RT-PCR phản ứng động, cho phép phát “chất huỳnh quang phát nhờ phản ứng khuếch đại sản phẩm PCR”, nên chu kỳ sản phẩm PCR, phân tích kết mà không cần qua bước điện di gel phản ứng PCR truyền thống Kết phản ứng phân tích thơng qua tín hiệu huỳnh quang phát theo thời gian chu kỳ phản ứng PCR Kỹ thuật real time RT-PCR qua hai bước giống RT-PCR, tạo cDNA sau sử dụng cDNA để thực phản ứng real time PCR Real time RT-PCR kỹ thuật phát NoV mẫu có độ nhạy độ đặc hiệu cao nhờ cặp mồi đầu dò thiết kế từ vùng gen ổn định NoV 1.6 Kháng ngun nhóm máu tình trạng nhiễm NoV Trên bề mặt hồng cầu người có nhiều loại kháng nguyên nhóm máu: ABO, Rh, Lewis…Trong số nhóm máu kháng ngun hệ ABO, Lewis có vai trò quan trọng đối xâm nhập NoV 1.6.1 Kháng nguyên hệ nhóm máu ABO Lewis Đặc điểm nhóm máu hệ ABO Việt Nam: nhóm máu A chiếm 21,2%, B chiếm 30,1%, AB chiếm 6,6% O chiếm chủ yếu 42,1% Kháng nguyên hệ nhóm máu Lewis gồm kháng nguyên: Lewisa , Lewisb, Lewisx Lewisy tạo kết hợp hoạt động enzyme fucosyltransferase (FUT) FUT3 Kháng nguyên nhóm máu (HBGA) phức hợp carbohydrate liên kết với glycoprotein glycolipid có mặt bề mặt tế bào hồng cầu tế bào nội biểu mô dịch thể nước bọt, dịch ruột, sữa Những kháng nguyên tổng hợp kết hoạt động số enzyme glycosyltransferase H (tiền kháng nguyên) để hình thành kháng nguyên thuộc họ ABO, Lewis Enzyme FUT2 FUT3 xác định kiểu hình kháng nguyên Lewis Khi FUT2 hoạt động, tiền kháng nguyên H typ biểu kiểu hình kháng nguyên Lewis Lea-b+ (trạng thái tiết), enzyme FUT2 khơng hoạt động, kiểu hình kháng ngun Lewis Lea+b(trạng thái khơng tiết) Kiểu hình Lea+b+ (trạng thái tiết khơng hồn tồn) xuất gen FUT2 bị đột biến làm giảm mức độ hoạt động enzyme dẫn tới giảm biểu kháng nguyên H q trình fucosylation khơng hồn tồn tiền kháng nguyên H Quá trình hình tháng kháng nguyên Lex,y tương tự Lea,b, nhiên Lex,y tạo từ tiền kháng nguyên H type tác động sản phẩm gen FUT3 Lea,b tạo từ tiền kháng nguyên H typ Như vậy, đánh giá khả tiết hay khơng dựa đột biến gen FUT2, có mặt tiền kháng nguyên H sản phẩm FUT3 (Lewis ab xy) 1.6.2 Mối liên quan kháng ngun nhóm máu với tình trạng nhiễm NoV NoV nhận biết bám vào thụ thể HBGA có bề mặt hồng cầu, niêm mạc đường hô hấp, đường tiêu hóa HBGA cịn dạng oligosaccharit tự do, có mặt dịch tiết nước bọt, dịch ruột sữa NoV có khả nhận biết HBGA kháng nguyên hệ nhóm máu ABO, Lewis kháng nguyên dạng tiết (secretor) kháng nguyên Tuy nhiên, khả bám vi rút với thụ thể phụ thuộc vào genotype vi rút Cho đến xác định có đến kiểu nhận biết genotype NoV với HBGA thuộc hệ thống ABO, kháng nguyên tiết kháng nguyên Lewis tìm Một số nghiên cứu đưa chứng người mang nhóm máu B thường khơng bị nhiễm genotype vi rút thuộc genogroup GI thường không tạo kháng thể Tỷ lệ người nhóm máu B khơng có kháng thể đặc hiệu NoV (6,9%) cao nhóm máu khác (0,8 - 3,4%) Trong nhóm máu O lại hay bị nhiễm genotype NoV nhóm máu B (62,5% 49,1%) Do vậy, nghiên cứu giám sát cộng đồng bệnh viện đưa chứng để giải đáp cho vấn đề CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Gồm nhóm đối tượng nghiên cứu: - Bệnh nhân tuổi chẩn đoán xác định tiêu chảy theo tiêu chuẩn nghiên cứu vào điều trị Bệnh viên Đa khoa tỉnh Hà Nam 12/2012-11/2013 - Bệnh nhân tuổi không mắc tiêu chảy theo tiêu chuẩn nghiên cứu vào điều trị Bệnh viên Đa khoa tỉnh Hà Nam 12/2012-11/2013 Tiêu chuẩn xác định tiêu chảy: Trẻ có từ lần phân lỏng trở lên 24 (TCYTTG) Tiêu chuẩn lựa chọn loại trừ bệnh nhân tiêu chảy + Tiêu chuẩn lựa chọn: Trẻ 60 tháng tuổi, nhập viện bệnh tiêu chảy, nhập viện vòng 14 ngày kể từ bắt đầu tiêu chảy, mẫu phân thu thập vòng 48h kể từ nhập viện, cha mẹ đồng ý, có khả tuân thủ quy trình nghiên cứu + Tiêu chuẩn loại trừ: nhập viện nguyên nhân khác, trường hợp tiêu chảy nhiễm trùng bệnh viện, khoảng cách từ bắt đầu tiêu chảy đến vào viện 14 ngày, mẫu phân thu thập trẻ nằm viện 48h Tiêu chuẩn lựa chọn loại trừ bệnh nhân không tiêu chảy + Tiêu chuẩn chọn lựa: Trẻ có tháng sinh với trẻ bị bệnh, nằm bệnh viện, vòng 14 ngày trước nhập viện khơng bị tiêu chảy +Tiêu chuẩn loại trừ: Khơng có khả liên lạc với cha mẹ, có triệu chứng tiêu chảy vòng 14 ngày trước nhập viện, trẻ nằm tầng với trẻ bị tiêu chảy 2.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 2.2.1 Địa điểm Lấy mẫu trẻ bệnh viện Đa khoa tỉnh Hà Nam Các xét nghiệm NoV, xác định kháng nguyên nhóm máu ABO, Lewis tiến hành phịng thí nghiệm Miễn dịch Vắc xin Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương 2.2.2 Thời gian nghiên cứu Nghiên cứu năm (2012 - 2015) 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu mô tả cắt ngang xác định thực trạng nhiễm NoV nghiên cứu mơ tả kết hợp phân tích để xác định yếu tố liên quan tới tình trạng nhiễm NoV 2.3.2 Cỡ mẫu nghiên cứu, cách chọn mẫu: Cỡ mẫu nghiên cứu Cỡ mẫu với bệnh nhân tiêu chảy Cỡ mẫu nghiên cứu tính theo cơng thức sau: p.q n Z 21 / ( p. ) Trong đó: n : Cỡ mẫu; Z : Hệ số tin cậy, với ngưỡng = 5%, ta có: Z (1 / ) = 1,96; ε : Sai số tương đối ( chọn ε = 0,1); p : Tỷ lệ nghiên cứu tính từ nghiên cứu bệnh viện p= 0,4; q = – p Theo tính tốn số lượng mẫu tối thiểu cần n=577 bệnh nhân tiêu chảy Trên thực tế, đưa vào nghiên cứu 641 trẻ mắc tiêu chảy (dư 10% so với dự kiến), đề phòng trường hợp gia đình trẻ thay đổi ý kiến, không thu thập loại mẫu (phân nước bọt), mẫu thu thập không qui cách Cỡ mẫu với bệnh nhân không tiêu chảy: Áp dụng công thức với ε = 0,4 p Tỷ lệ nghiên cứu tính từ nghiên cứu bệnh viện p= 0,1 Tính cỡ mấu tối thiểu n=216 bệnh nhân Trên thực tế chọn 219 bệnh nhân không tiêu chảy đáp ứng đủ tiêu chuẩn nghiên cứu - Xác định yếu tố liên quan tới tình trạng nhiễm NoV cách so sánh nhiễm NoV khơng nhiễm NoV tồn trẻ có khơng có triệu chứng tiêu chảy Bảng 2.1 Cơng thức tính yếu tố liên quan nhiễm NoV Yếu tố nguy (+) Yếu tố nguy (-) Tổng cộng Nhiễm NoV Không nhiễm NoV A C a+c B D B+d + Tính tỷ lệ nhóm có nguy nhiễm NoV = a ab + Tính tỷ lệ nhóm khơng nguy nhiễm NoV = c cd + Ước lượng tỷ suất chênh OR= ad bc + Tính khoảng tin cậy 95% giá trị OR (95% CI) + (ad bc) n Tính = (a c)(b d )( a b)(c d ) Tổng cộng a+b c+d n=a+b+c+d + Nếu OR >1; 95% CI không bao hàm giá trị 1,0 và/hoặc >3,814; p< 0,05: liên quan yếu tố nguy tỷ lệ nhiễm NoV tiêu chảy có ý nghĩa thống kê Phương pháp chọn mẫu - Với bệnh nhân tiêu chảy: Trên sở xác định tiêu chuẩn lựa chọn đưa trên, toàn trẻ tuổi mắc tiêu chảy cấp điều trị nội trú Bệnh viện Đa khoa Hà Nam thời gian từ 01/12/2012 tới hết 30/11/ 2013 tiếp cận Cha/mẹ/người bảo trợ hợp pháp trẻ tư vấn mục tiêu, nội dung ý nghĩa nghiên cứu Khi cha/mẹ/người bảo trợ hợp pháp đồng ý cho trẻ tham gia nghiên cứu, cán y tế bệnh viện thu thập thông tin nhân chủng học thơng tin gia đình theo câu hỏi thiết kế sẵn Đồng thời, bác sỹ khám ghi lại vào phiếu điều tra thông tin lâm sàng (số lần tiêu chảy/nơn, số ngày tiêu chảy/nơn, tình trạng sốt nước, phương pháp điều trị tình trạng nhập viện) Cán điều tra rà soát so sánh với bệnh án gốc để đảm bảo thơng tin đầy đủ Đồng thời, vịng 48 sau trẻ nhập viện, mẫu nước bọt mẫu phân thu thập Mẫu phân (5-20ml) thu thập từ bô sạch, dùng riêng cho trẻ tube đựng mẫu có gắn mã vạch tương ứng với mã vạch trẻ phiếu điều tra ca bệnh Để bảo mật, tên trẻ không ghi lại mẫu bệnh phẩm Mẫu nước bọt (20-100l) thu thập cách hút dịch lưỡi cạnh má với ống hút trước sau ăn 30 phút.Trẻ tráng miệng nước lọc trước thu thập mẫu Các mẫu phân mẫu nước bọt sau thu thập dán mã vạch lưu giữ -20oC trước chuyển PTN Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung Ương Trong trường hợp không thu thập mẫu nước bọt, trẻ đưa vào nghiên cứu ghi rõ phân tích kết Nếu số mẫu chưa đủ 641 tiếp tục lấy tiếp sang năm sau đủ cỡ mẫu tối thiểu Nếu số trẻ chọn đạt đủ 641 trước kết thúc năm 2013, lấy tiếp hết năm, sau chọn mẫu ngẫu nhiên hệ thống từ số trẻ chọn đạt đủ 641 trẻ bệnh thỏa mãn tiêu chuẩn nghiên cứu Theo khảo sát sơ bộ, hàng năm có khoảng 1800 trẻ tiêu chảy phải nhập Bệnh viện Đa khoa Hà Nam Như dự kiến vòng 12 tháng chọn đủ số lượng mẫu phù hợp với tiêu chí lựa chọn kế hoạch nghiên cứu đề - Với bệnh nhân khơng có triệu chứng tiêu chảy: Với mục đích khảo sát tỷ lệ nhiễm vi rút khơng triệu chứng nhằm đánh giá xác gánh nặng bệnh tật nhiễm NoV, chọn phương pháp lấy mẫu thuận tiện để lựa chọn trẻ nhập bệnh viện đa khoa Hà Nam khơng có triệu chứng tiêu chảy Chúng tiến hành lựa chọn bệnh nhân nghiên cứu rải tháng năm Hàng tháng mẫu phân 15-20 bệnh nhân không mắc tiêu chảy tuổi vào điều trị Khoa Nhi bệnh viện đa khoa Hà Nam thu thập, tháng 12/2012 đến 11/2013, đạt đủ số lượng bệnh nhân theo cỡ mấu tối thiểu tính tốn 219 Khi cần thiết sonde đưa vào hậu môn để hỗ trợ lấy mẫu phân vòng 48 sau nhập viện để phòng tình trạng nhiễm chéo bệnh viện Mẫu nước bọt lấy tương tự nhóm trẻ có triệu chứng tiêu chảy Các thông tin nhân chủng học, triệu chứng lâm sàng phương pháp điều trị, tình trạng nhập viện bác sỹ khám ghi chép lại phiếu điều tra Cán điều tra bác sỹ, điều dưỡng Khoa đào tạo tiêu chuẩn lựa chọn, phương pháp tư vấn, điền phiếu điều tra phương pháp lấy mẫu phân/ mẫu nước bọt Các thông tin lâm sàng bác sỹ trực tiếp khám điền vào phiếu, thơng tin dịch tễ, nhân chủng học, hộ gia đình điều dưỡng thu thập hồn thiện phiếu điều tra 2.3.3 Biến số, số - Tuổi, giới, tiền sử sinh, nuôi dưỡng, sử dụng vắc xin phòng RV, tháng, mùa - Dấu hiệu lâm sàng tiêu chảy: số lần tiêu chảy nhiều nhất/ngày, số ngày tiêu chảy, số lần nôn nhiều nhất/ngày, số ngày nôn, sốt, dấu hiệu nước - Các genogroup NoV: GI, GII; kháng nguyên nhóm máu: ABO, Lewis + Kháng nguyên nhóm máu ABO: A, B, O, AB + Kháng nguyên nhóm máu Lewis: Lea/x, Lea+/x+ b-/y- khơng tiết, Leb/y, Lea-/x- b+/y+ tiết hồn tồn, Lea/x b/y, Lea+/x+ b+/y+ tiết khơng hồn tồn 2.3.4 Kỹ thuật cơng cụ thu thập thông tin 2.3.4.1 Công cụ kỹ thuật thu thập nghiên cứu - Các công cụ kỹ thuật điều tra dịch tễ dựa vào vấn - Công cụ nghiên cứu lâm sàng dựa vào bệnh án bệnh viện bệnh án nghiên cứu 2.3.4.2 Thiết bị dụng cụ sử dụng nghiên cứu - Máy Real time PCR Rotogene (Invitrogen, Mỹ), Máy luân nhiệt Eppendorf - Máy chụp ảnh kết điện di thạch, máy đo nồng độ ADN NanoDrop, Máy đọc trình tự gen ABI 3130, Máy đọc phiến ELISA 2.3.4.3 Hóa chất sinh phẩm - Hóa chất sinh phẩm tách chiết ARN: Kit tách chiết ARN QIAamp viral RNA mini Kit (Qiagen, Đức); Sinh phẩm dùng phát định type NoV - Sinh phẩm xác định HBGA: Kháng thể đơn dòng xác định nhóm máu A,B,O, Lewis a,b,x,y (Covance Laboratories) 2.4 Phương pháp xác định NoV - Thu thập mẫu phân; Tách chiết ARN vi rút từ mẫu phân - Phản ứng Real time RT-PCR phát ARN NoV giá trị Ct ngưỡng=40, mẫu dương tính với Ct0,1 coi dương tính 2.6 Xử lý phân tích số liệu Số liệu xử lý, phân tích phần mềm SPSS 20.0 Sử dụng thuật toán thống kê y sinh học để phát mối liên quan, so sánh khác biệt nhóm: Mơ tả số lượng, tỷ lệ, phân tích liên quan xác định yếu tố ảnh hưởng OR (95% CI), ngưỡng có ý nghĩa thống kê p< 0,05 2.7 Đạo đức nghiên cứu Đề cương nghiên cứu Hội đồng Y đức Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương thông qua Chỉ lấy mẫu bệnh nhân có phiếu đồng ý tham gia nghiên cứu bố mẹ bệnh nhân, phiếu gia đình bệnh nhân giữ lại Mỗi bệnh 10 nhân tham gia nghiên cứu, quy ước có mã số định, để người thực nghiên cứu tên bệnh nhân nhằm bảo mật thông tin Mẫu lấy từ bệnh nhân phục vụ cho nghiên cứu 2.8 Hạn chế đề tài Mẫu thu thập nghiên cứu từ trẻ nhập viện tiêu chảy cấp trẻ nhập viện nguyên nhân khác, kết luận tỷ lệ nhiễm NoV vai trò NoV bệnh tiêu chảy rút từ nghiên cứu áp dụng cho quần thể trẻ mắc tiêu chảy nặng, cần thiết phải nhập viện Vai trò NoV bệnh tiêu chảy cộng đồng không đánh giá Giám sát tiến hành Khoa Nhi Bệnh viện tỉnh Hà Nam với phân bố trẻ đến từ huyện thuộc tỉnh không đại diện cho dân số trẻ huyện mà phụ thuộc vào lựa chọn dịch vụ y tế gia đình trẻ Do không kết luận khác gánh nặng bệnh tiêu chảy nói chung nhiễm NoV nói riêng huyện thuộc tỉnh Hà Nam CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Thực trạng số yếu tố liên quan đến nhiễm NoV trẻ tuổi bệnh viện đa khoa tỉnh Hà Nam năm 2013 3.1.1 Thực trạng nhiễm NoV trẻ có/khơng có triệu chứng tiêu chảy Bảng 3.1.Phân bố nhiễm NoV tình trạng bệnh Nhiễm NoV(+),RV(+) NoV(+),RV(-) NoV(-),RV(+) NoV(-),RV(-) Tổng N 57 167 188 229 641 Tiêu chảy % 95%CI 8,9 6,8-11,3 26,0 22,6-29,6 29,3 25,8-33,0 35,8 32,0-39,5 100,0 Không tiêu chảy n % 95%CI 0,5 0,0-2,5 40 18,2 13,3-24,0 0,0-2,5 0,5 177 80,8 74,9-85,8 219 100,0 Tổng N % 58 6,7 207 24,2 189 21,9 406 47,2 860 100,0 Trong số 641 trẻ nhập viện tiêu chảy, tỷ lệ phát nhiễm NoV 34,9% (đơn nhiễm NoV(+) 26%, đồng nhiễm 8,9%) Đối với bệnh nhân khơng có biểu tiêu chảy (219 bệnh nhân), tỷ lệ số trẻ nhiễm NoV cao (18,7%) 3.1.2 Thực trạng nhiễm NoV bệnh nhân tiêu chảy Phân tích biểu lâm sàng tiêu chảy nhiễm NoV cách đánh giá đặc điểm lâm sàng bệnh nhi nhiễm NoV: Nhiễm NoV (+) 167 trường hợp không nhiễm NoV (-) 229 trường hợp ( tiêu chảy nguyên nhân khác) Bảng 3.5 Phân bố bệnh nhân theo tuổi tình trạng nhiễm NoV tiêu chảy NoV (-) NoV (+) Tổng Tuổi (tháng) N % N % n % < tháng 90 34,9 20 12,0 100 25,3 6-