ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM VŨ THỊ TRANG Tên đề tài: NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN LYSIN CỦA BACTERIOPHAGE CHỦNG K ĐẶC HIỆU Staphylococcus aureus Ở Escherichia coli KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo: Chính quy Chuyên ngành/ngành: Công nghệ sinh học Khoa: CNSH - CNTP Khóa học: 2012 – 2016 Thái Nguyên – năm 2016 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM VŨ THỊ TRANG Tên đề tài: NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN LYSIN CỦA BACTERIOPHAGE CHỦNG K ĐẶC HIỆU Staphylococcus aureus Ở Escherichia coli KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo: Chính quy Chuyên ngành/ngành: Công nghệ sinh học Lớp: K44 - CNSH Khoa: CNSH - CNTP Khóa học: 2012 – 2016 Giáo viên hƣớng dẫn: PGS TS Đồng Văn Quyền TS Dƣơng Văn Cƣờng Thái Nguyên – năm 2016 i LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới PGS TS Đồng Văn Quyền – Trưởng phòng Vi sinh vật học phân tử - Viện Công nghệ sinh học – Viện Khoa học công nghệ Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi giúp thực tập phòng, PGS.TS người thầy tận tình hướng dẫn, bảo để hoàn thành công việc cách hiệu suốt thời gian thực tập Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc giúp đỡ to lớn, ý kiến đóng góp quý báu TS Dương Văn Cường – Phó Trưởng khoa khoa Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm trình thực hoàn thành khóa luận Tôi xin gửi lời cảm ơn cô chú, anh chị phòng Vi sinh phân tử tạo cho môi trường làm việc khoa học, nghiêm túc, nhiệt tình giải đáp thắc mắc suốt trình thực khóa luận Đặc biệt xin gửi lời cảm ơn chân thành đến KS Mai Thùy Linh, ThS Bùi Thị Thùy Dương – nhân viên phòng Vi sinh phân tử, hai chị nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ đồng hành với suốt thời gian thực đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thầy, cô khoa Công nghệ sinh học công nghệ thực phẩm trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi suốt thời gian học tập hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè giúp đỡ động viên suốt thời gian học tập thực khóa luận Một lần xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2016 Sinh viên Vũ Thị Trang ii DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Trang Bảng 2.1: Vi khuẩn thường gây nhiễm trùng bệnh viện cộng đồng năm 2014 Bảng 2.2 Phương pháp phân loại thực khuẩn thể theo Ackermann (2009) .16 Bảng 2.3: Bảng thành phần cấu trúc vector pET32a (+) 30 Bảng 3.1: Thành phần môi trường LB lỏng (1 lít) 33 Bảng 3.2: Thành phần điện di DNA 33 Bảng 3.3: Thành phần gel polyacrylamide 34 Bảng 3.4: Thành phần dung dịch dùng tinh lysin phage 34 Bảng 3.5: Thành phần phản ứng cắt plasmid tái tổ hợp pCR 2.1 pET32 enzyme giới hạn 36 Bảng 3.6: Thành phần phản ứng gắn gene vào vector biểu 38 ảng 3.7: Thành phần phản ứng để xác định trình tự .40 iii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ Trang Hình 2.1: Hình thái Staphylocococcus aureus (Le Huy Chinh, 2001) Hình 2.2: Quá trình lytic (sinh tan) lysogentic (tiềm tan) thể thực khuẩn xâm nhiễm vi khuẩn ( John B et al., 2007) 18 Hình 2.3: (a)Cấu trúc peptidoglycan điển hình vi khuẩn Gram dương biểu thị phân chia vị trí bám loại lysin; (b) Cấu trúc phân tử lysin K 21 Hình 2.4: Cấu trúc vector pET32a (+) (LaVallie ER et al., 1993) 29 Hình 3.1: sơ đồ minh họa bước biểu gene mã hóa lysin .35 Hình 4.1: Kết sàng lọc dòng plasmid mang gen lysK điện di gel Agarose 43 Hình 4.2: Kết chọn lọc dòng vector tái tái tổ hợp pET32a(+) mang gen lys 44 Hình 4.3: Trình tự nucleotide acid amin suy diễn từ gen lysK mã hóa lysin .47 Hình 4.4: Kết biểu protein lysin 48 Hình 4.5: Điện di kết biểu lysin nhiệt độ khác 50 Hình 4.6: Kết biểu lysin nồng độ IPTG 51 iv DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt AEBSF APS Asp Bp CBB Cys ĐC DNA DTT E coli EDTA EtBr FDA Giải nghĩa 4- (2-Aminoethyl) benzenesulfonyl fluoride hydrochloride Ammonium persulfat Aspartic acid Base pair Coomassie brilliant blue Cystein Đường chạy Deoxiribonucleic Acid Dithiothreiol Escherichia coli Ethylenediaminetetraacetic acid Ethidium bromid Food and Drug Administration (Cục quản lý thực phẩm dược phẩm Hoa Kì) ICTV Histidin International Committee on Nomenclature of Viruses (Ủy ban Quốc tế phân loại vi rút) IPTG kDA LB NaCl Ni OD PCR PMSF RNA SDS TAE Taq TEMED V/V X- gal WHO Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside Kilo Dalton Luria Bertani Natri chlorua Niken Optical Density Polymerase chain reaction Phenylmethanesunfonylfluoride Ribonucleic acid Sodium dodecyl sulfate Tris- acid acetic- EDTA Thermus aquaticus N, N, N’, N’ – tetramethyl- ethylenediamine Volum/ volum: thể tích/ thể tích 5- bromo- 4- chloro-3 indoly-β- D- galactoside World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới) His v MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU ii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ iii DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT iv MỤC LỤC v Phần 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích nghiên cứu 1.3 Mục tiêu nghiên cứu 1.4 Ý nghĩa đề tài 1.4.1 Ý nghĩa khoa học 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn .3 Phần 2: TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 2.1 Cơ sở thực tiễn sở khoa học đề tài .4 2.1.1 Tình trạng kháng kháng sinh .4 2.1.2 Staphylococcus aureus .5 2.1.3 Các phương pháp điều trị bệnh vi khuẩn .8 2.1.4 Tổng quan thực khuẩn thể (bacteriophage) .14 2.1.5 Bacteriophage lysins .19 2.3 Đặc điểm hệ thống biểu .29 2.3.1 Vector biểu 29 2.3.2 Hệ thống biểu E.coli 31 PHẦN 3: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 3.1 Vật liệu nghiên cứu 32 3.1.1 Đối tượng 32 3.1.2 Hóa chất sinh phẩm 32 3.1.3 Trang thiết bị 32 vi 3.1.4 Môi trường dung dịch làm việc 33 3.2 Địa điểm thời gian tiến hành nghiên cứu 35 3.3 Nội dung nghiên cứu 35 3.4 Phương pháp nghiên cứu 35 3.4.1 Phương pháp cắt enzyme giới hạn 36 3.4.2 Phương pháp điện di gel Agarose 36 3.4.3 Thu nhận DNA từ gel agarose (thôi gel) 37 3.4.4 Gắn đoạn gen mã hóa lysin vào vector biểu 37 3.4.5 Biến nạp DNA plasmid vào tế bào khả biến E coli .38 3.4.6 Tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn .39 3.4.7 Xác định trình tự gen máy giải trình tự gen tự động 40 3.4.8 Phương pháp biểu protein tái tổ hợp E coli 41 3.4.9 Phương pháp điện di protein gel polyacrylamide 41 3.4.10 Phương pháp biểu hiện- xác định trạng thái tồn lysin .42 Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43 4.1 Thiết kế vector biểu 43 4.1.1 Kết thiết kế vector pET32(a+) mang gen lysK 43 4.1.2 Chọn lọc dòng plasmid mang gen lysK phương pháp lập đồ giới hạn 44 4.1.3 Kiểm tra chiều gắn khung đọc đoạn chèn vector pET32a(+) 45 4.2 Biểu gene mã hóa lysin vi khuẩn 48 4.2.1 Biểu lysin phage vi khuẩn E coli 48 4.2.2 Tối ưu hóa điều kiện biểu 49 Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53 5.1 Kết luận 53 5.2 Kiến nghị .53 TÀI LIỆU THAM KHẢO Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Từ Alexander Fleming (1881-1955) tìm kháng sinh penicillin nay, số chất kháng sinh nghiên cứu lên tới 5.000 Sự đời kháng sinh xem thần dược mang lại sống cho hàng trăm triệu người giới Số lượng kháng sinh phát triển, bào chế ngày tăng để bắt kịp xuất loại vi khuẩn gây bệnh Tuy nhiên, vi sinh vật gây bệnh trở nên kháng với loại thuốc điều trị vấn đề ngày lớn việc chăm sóc sức khỏe cộng đồng Khả kháng lại kháng sinh vi sinh vật de dọa ngày cao việc điều trị bệnh nhiễm trùng vi khuẩn, ký sinh trùng, nấm… gây Ngày nay, khoảng 70% vi khuẩn gây nhiễm trùng có mặt bệnh viện có khả kháng loại thuốc thường sử dụng để điều trị Nguy xuất chủng siêu vi khuẩn có khả kháng tất loại kháng sinh có mối lo sợ nhân loại thách thức lớn giới khoa học áo cáo giám sát toàn cầu kháng kháng sinh năm 2014 WHO cho thấy khả kháng thuốc kháng sinh không dự đoán cho tương lai, xảy ra, khắp giới, gây nhiều rủi ro khả điều trị bệnh nhiễm trùng phổ biến cộng đồng bệnh viện Vi khuẩn tụ cầu (Staphylococcus) tác nhân gây nhiều loại bệnh nặng có khả kháng kháng sinh cao Nhiễm khuẩn tụ cầu chữa trị kháng sinh bình thường, nhiều trường hợp vi khuẩn trở lên kháng thuốc, nhiễm vào quan nội tạng gây tử vong di chứng nặng nề khác Staphylococcus aureus (S aureus) tác nhân gây viêm, ngộ độc thực phẩm hội chứng sốc độc với tỷ lệ tử vong cao (Noble WC et al., 1998) Năm 1941, tất tụ cầu khuẩn vàng gây bệnh dễ dàng bị diệt kháng sinh penicillin, năm sau tụ cầu khuẩn vàng trở nên kháng thuốc Các 44 Trong trình chạy điện di, phân tử DNA có kích thước nhỏ (dạng siêu xoắn) di chuyển nhanh điện trường ngược lại, phân tử có kích thước lớn (dạng vòng) di chuyển chậm Kết sàng lọc sơ cho thấy dòng plasmid tái tổ hợp có kích thước lớn vector pET32a(+) gốc không mang gen ngoại lai (đường chạy ngắn hơn) Điều có khả khuẩn lạc trắng có gắn gen lysK nên có kích thước lớn plasmid gốc 4.1.2 Chọn lọc dòng plasmid mang gen lysK phương pháp lập đồ giới hạn Để khẳng định chắn dòng DNA plasmid có mang gen lysK, tiến hành xử lý cắt kiểm tra DNA plasmid BamHI XhoI Chúng chọn dòng plasmid tái tổ hợp pET32a(+)-lysK số để kiểm tra khả mang gen cắt với enzym giới hạn BamHI XhoI, sau điện di gel agarose 1% L 3000 bp ～1500 bp 1000 bp Hình 4.2: Kết chọn lọc dòng vector tái tái tổ hợp pET32a(+) mang gen lys ĐC M: Ladder DNA (Fermentas), ĐC 1, 2: plasmid tái tổ hợp cắt BamHI XhoI, ĐC 3: sản phẩm PCR gene lysK Kết phân tích sản phẩm cắt DNA plasmid tái tổ hợp cho thấy sau cắt enzyeme giới hạn tiến hành điện di gel agarose, ta thấy đường chạy có băng, băng bên có kích thước xấp xỉ 1500 bp với kích thước sản phâm PCR gen lysK đường chạy số Chứng tỏ dòng plasmid kiểm tra mang gene lysK (1488 bp) 45 4.1.3 Kiểm tra chiều gắn khung đọc đoạn chèn vector pET32a(+) Gen lysK vector pET32a(+) biểu chúng gắn chiều dịch mã thông suốt, mã kết thúc gen Do đó, lựa chọn dòng plasmid pET32a(+) mang gen ngoại lai sau kiểm tra enzyme giới hạn để tinh giải trình tự gen Kết phân tích trình tự gen cho thấy, trình tự gen lys vector biểu pET32(a+) giống với trình tự gen lysK tách dòng Gen lys có gắn thêm trình tự nhận biết hai enzyme giới hạn BamHI XhoI Như vậy, chứng tỏ trình khuếch đại đoạn gen lysK cặp mồi biểu sai lệch trình tự gen Trước tiến hành biểu hiện, sử dụng trình tự đoạn gen đích gắn vào vector pET32(a+) để dịch mã acid amin sở lý thuyết Kết dịch mã ( hình 4.4) cho thấy, trình tự đoạn gen đích hoàn toàn thông suốt, không xuất mã kết thúc (stop codon) gen gắn vào vector pET32a(+), có mã khởi đầu mã kết thúc, điểm kết thúc vùng khởi động, đảm bảo cho trình biểu protein thông suốt Vector pET32a(+) mang gen lysK đặt tên pETlysK Khi so sánh đoạn gen ngân hàng gen cho độ tương đồng 100% so với endolysin phage K ( KF761114.1) ATG GCT AAG ACT CAA GCA GAA ATA AAT AAA CGT TTA GAT GCT TAT 45 Met Ala Lys Thr Gln Ala Glu Ile Asn Lys Arg Leu Asp Ala Tyr 15 46 GCA AAA GGA ACA GTA GAT AGC CCT TAC AGA GTT AAA AAA GCT ACA 90 16 Ala Lys Gly Thr Val Asp Ser Pro Tyr Arg Val Lys Lys Ala Thr 30 91 AGT TAT GAC CCA TCA TTT GGT GTA ATG GAA GCA GGA GCC ATT GAT 135 31 Ser Tyr Asp Pro Ser Phe Gly Val Met Glu Ala Gly Ala Ile Asp 45 136 GCA GAT GGT TAC TAT CAC GCT CAG TGT CAA GAC CTT ATT ACA GAC 180 46 Ala Asp Gly Tyr Tyr His Ala Gln Cys Gln Asp Leu Ile Thr Asp 60 181 TAT GTT TTA TGG TTA ACA GAT AAT AAA GTT AGA ACT TGG GGT AAT 225 61 Tyr Val Leu Trp Leu Thr Asp Asn Lys Val Arg Thr Trp Gly Asn 75 226 GCT AAA GAC CAA ATT AAA CAG AGT TAT GGT ACT GGA TTT AAA ATA 270 76 Ala Lys Asp Gln Ile Lys Gln Ser Tyr Gly Thr Gly Phe Lys Ile 90 46 271 CAT GAA AAT AAA CCT TCT ACT GTA CCT AAA AAA GGT TGG ATT GCG 315 91 His Glu Asn Lys Pro Ser Thr Val Pro Lys Lys Gly Trp Ile Ala 105 316 GTA TTT ACA TCC GGT AGT TAT GAA CAG TGG GGT CAC ATA GGT ATT 360 106 Val Phe Thr Ser Gly Ser Tyr Glu Gln Trp Gly His Ile Gly Ile 120 361 GTA TAT GAT GGA GGT AAT ACT TCT ACA TTT ACT ATT TTA GAG CAA 405 121 Val Tyr Asp Gly Gly Asn Thr Ser Thr Phe Thr Ile Leu Glu Gln 135 406 AAC TGG AAT GGT TAT GCT AAT AAA AAA CCT ACA AAA CGT GTA GAT 450 136 Asn Trp Asn Gly Tyr Ala Asn Lys Lys Pro Thr Lys Arg Val Asp 150 451 AAT TAT TAC GGA TTA ACT CAC TTC ATT GAA ATA CCT GTA AAA GCA 495 151 Asn Tyr Tyr Gly Leu Thr His Phe Ile Glu Ile Pro Val Lys Ala 165 496 GGA ACT ACT GTT AAA AAA GAA ACA GCT AAG AAA AGC GCA AGT AAA 540 166 Gly Thr Thr Val Lys Lys Glu Thr Ala Lys Lys Ser Ala Ser Lys 180 541 ACG CCT GCA CCT AAA AAG AAA GCA ACA CTA AAA GTT TCT AAG AAT 585 181 Thr Pro Ala Pro Lys Lys Lys Ala Thr Leu Lys Val Ser Lys Asn 195 586 CAC ATT AAC TAT ACA ATG GAT AAA CGT GGT AAA AAA CCT GAA GGA 630 196 His Ile Asn Tyr Thr Met Asp Lys Arg Gly Lys Lys Pro Glu Gly 210 631 ATG GTA ATA CAC AAC GAT GCA GGT CGT TCT TCA GGA CAA CAA TAC 675 211 Met Val Ile His Asn Asp Ala Gly Arg Ser Ser Gly Gln Gln Tyr 225 676 GAG AAT TCA TTA GCT AAT GCA GGT TAT GCT AGA TAC GCT AAT GGT 720 226 Glu Asn Ser Leu Ala Asn Ala Gly Tyr Ala Arg Tyr Ala Asn Gly 240 721 ATT GCT CAT TAC TAC GGC TCT GAA GGT TAT GTA TGG GAA GCA ATA 765 241 Ile Ala His Tyr Tyr Gly Ser Glu Gly Tyr Val Trp Glu Ala Ile 255 766 GAT GCT AAG AAT CAA ATT GCT TGG CAC ACG GGT GAT GGA ACA GGA 810 256 Asp Ala Lys Asn Gln Ile Ala Trp His Thr Gly Asp Gly Thr Gly 270 811 GCA AAC TCA GGT AAC TTT AGA TTT GCA GGT ATT GAA GTC TGT CAA 855 271 Ala Asn Ser Gly Asn Phe Arg Phe Ala Gly Ile Glu Val Cys Gln 285 856 TCA ATG AGT GCT AGT GAT GCT CAA TTC CTT AAA AAT GAA CAA GCA 900 286 Ser Met Ser Ala Ser Asp Ala Gln Phe Leu Lys Asn Glu Gln Ala 300 47 901 GTA TTC CAA TTT ACA GCA GAG AAA TTT AAA GAA TGG GGT CTT ACT 945 301 Val Phe Gln Phe Thr Ala Glu Lys Phe Lys Glu Trp Gly Leu Thr 315 946 CCT AAC CGT AAA ACT GTA AGA TTG CAT ATG GAA TTT GTA CCA ACT 990 316 Pro Asn Arg Lys Thr Val Arg Leu His Met Glu Phe Val Pro Thr 330 991 GCC TGT CCT CAC CGT TCT ATG GTT CTT CAT ACA GGA TTT AAT CCA 1035 331 Ala Cys Pro His Arg Ser Met Val Leu His Thr Gly Phe Asn Pro 345 1036 GTA ACA CAA GGA AGA CCA TCA CAA GCA ATA ATG AAT AAA TTA AAA 1080 346 Val Thr Gln Gly Arg Pro Ser Gln Ala Ile Met Asn Lys Leu Lys 360 1081 GAT TAT TTC ATT AAA CAA ATT AAA AAC TAC ATG GAT AAA GGA ACT 1125 361 Asp Tyr Phe Ile Lys Gln Ile Lys Asn Tyr Met Asp Lys Gly Thr 375 1126 TCA AGT TCT ACA GTA GTT AAA GAT GGT AAA ACA AGT AGC GCA AGT 1170 376 Ser Ser Ser Thr Val Val Lys Asp Gly Lys Thr Ser Ser Ala Ser 390 1171 ACA CCG GCA ACT AGA CCA GTT ACA GGT TCT TGG AAA AAG AAC CAG 1215 391 Thr Pro Ala Thr Arg Pro Val Thr Gly Ser Trp Lys Lys Asn Gln 405 1216 TAC GGA ACT TGG TAT AAA CCG GAA AAT GCA ACA TTT GTC AAT GGT 1260 406 Tyr Gly Thr Trp Tyr Lys Pro Glu Asn Ala Thr Phe Val Asn Gly 420 1261 AAC CAA CCT ATA GTA ACT AGA ATA GGT TCT CCA TTC TTA AAT GCT 1305 421 Asn Gln Pro Ile Val Thr Arg Ile Gly Ser Pro Phe Leu Asn Ala 435 1306 CCA GTA GGC GGT AAC TTA CCG GCA GGG GCT ACA ATT GTA TAT GAC 1350 436 Pro Val Gly Gly Asn Leu Pro Ala Gly Ala Thr Ile Val Tyr Asp 450 1351 GAA GTT TGT ATC CAA GCA GGT CAC ATT TGG ATA GGT TAT AAT GCT 1395 451 Glu Val Cys Ile Gln Ala Gly His Ile Trp Ile Gly Tyr Asn Ala 465 1396 TAC AAC GGT AAC AGA GTA TAT TGC CCT GTT AGA ACT TGT CAA GGT 1440 466 Tyr Asn Gly Asn Arg Val Tyr Cys Pro Val Arg Thr Cys Gln Gly 480 1441 GTT CCA CCT AAT CAA ATA CCT GGC GTT GCC TGG GGA GTA TTC AAA 1485 481 Val Pro Pro Asn Gln Ile Pro Gly Val Ala Trp Gly Val Phe Lys 495 1486 TAG 496 stop 1488 496 Hình 4.3: Trình tự nucleotide acid amin suy diễn từ gen lysK mã hóa lysin 48 4.2 Biểu gene mã hóa lysin vi khuẩn 4.2.1 Biểu lysin phage vi khuẩn E.coli Để biểu gen mã hóa protein lysin, sử dụng chủng E coli BL21 Star (DE3) Chủng có ưu điểm hạn chế phân cắt protease protein ngoại lai, giúp cho protein ngoại lai ổn định tế bào sau tổng hợp Ngoài ra, DNA hệ gen E coli BL21 Star (DE3) có chứa gen mã hóa cho T7 RNA polymerase (có nguồn gốc từ bacteriophage lambda) Gen đưa vào hệ gen E coli BL21 Star (DE3) bị kiểm soát promoter lacUV5 nên cần IPTG để cảm ứng biểu T7 RNA polymerase Vector biểu pET32a(+) mang gene lys với khung đọc chuẩn biến nạp vào tế bào vi khuẩn E coli BL21 Star (DE3) phương pháp sốc nhiệt Dịch tế bào sau biến nạp cấy trải môi trường L đặc có bổ sung Amp nuôi 370C qua đêm Kết biến nạp thu khuẩn lạc riêng rẽ Chọn khuẩn lạc riêng rẽ bất kì, nuôi qua đêm môi trường LB lỏng có bổ sung Amp nuôi lắc 200 vòng/phút 370C Sau dịch nuôi cấy chuyển sang môi trường LB lỏng với tỉ lệ (1:100) có bổ sung Amp lắc tiếp OD600 đạt 0.6-0.8 (sau khoảng 2-3 giờ) bổ sung chất cảm ứng IPTG nồng độ mM (nhiệt độ 370C, nuôi lắc 200 vòng/phút), thu mẫu sau cảm ứng Điện di kiểm tra kết biểu protein gel polyacrylamide 12,5% kDa M 116 62,2 ～70 kDa 45 35 25 Hình 4.4: Kết biểu protein lysin ĐC M: thang protein chuẩn (Understained); ĐC 1: mẫu không cảm ứng IPTG; ĐC 2: mẫu cảm ứng IPTG với nồng độ mM 49 Protein tổng số dịch chiết phân tích gel polyacrylamide (hình 4.5) Kết điện di cho thấy mẫu cảm ứng mM IPTG xuất băng đậm so với băng protein khác vi khuẩn, đậm so với băng protein tương ứng mẫu không cảm ứng Băng có kích thước khoảng 70 kDa, tính toán lý thuyết 4.2.2 Tối ưu hóa điều kiện biểu Trước biểu lượng lớn để thu nhận protein tái tổ hợp phục vụ cho nghiên cứu tiếp theo, tiến hành khảo sát số điều kiện nuôi cấy nhằm tìm điều kiện tối ưu nhằm tạo lượng lysin nhiều protein trạng thái hòa tan cao Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất trạng thái biểu của protein đích hệ thống biểu tái tổ hợp Đối với hệ thống biểu vi khuẩn E coli, nhiệt độ nuôi cấy, nồng độ chất cảm ứng IPTG thời gian nuôi cấy sau cảm ứng yếu tố tác động nhiều đến biểu trạng thái protein tái tổ hợp Trong thời gian thực tập, nhóm nghiên cứu tìm nhiệt độ nồng độ IPTG tối ưu để biểu lysin 4.2.2.1 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy Nhiệt độ yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển tế bào vật chủ chứa plasmid tái tổ hợp, mặt khác ảnh hưởng đến tính ổn định plasmid tế bào từ gây ảnh hưởng đến hiệu suất chất lượng protein tái tổ hợp Nhiệt độ cao khả đào thải plasmid tế bào chủ lớn, đồng thời làm cho mRNA dễ bị phá hủy Một số protein ngoại lai tổng hợp tốt 370C tốc độ sinh trưởng chủng chủ đạt tối đa Tuy nhiên, tế bào phát triển mạnh protein tái tổ hợp đươc tổng hợp liên tục liên tục phần protein tồn dạng không hòa tan Các protein trạng thái không tan thường không đảm bảo hoạt tính sinh học Vì cần phải khảo sát nhiệt độ nuôi cấy để tìm nhiệt độ nuôi cấy thích hợp mà protein ngoại lai tổng hợp nhiểu dạng hòa tan có chất lượng tốt Để tiến hành khảo sát, nuôi cấy chủng E coli BL21 StarTM (DE3) mang vector pET32a(+) tái tổ hợp 370C đến OD600 đạt 0,6- 0,8 Sau tế bào 50 cảm ứng mM IPTG tiếp tục nuôi lắc nhiệt độ khác là: 180C 16 giờ, 250C giờ, 300C giờ, 370C Ly tâm thu tế bào nuôi cấy, sau mẫu xử lý với điều kiện tiến hành kiểm tra điện di gel polyacrylamide 12,5% M 13131313 13 M kDa 10 11 12 M 116 66,2 45 35 25 18 Hình 4.5: Điện di kết biểu lysin nhiệt độ khác ĐC M : thang protein chuẩn (Understained); ĐC 1, 2,3: nuôi cùng, dịch nổi, cặn 250C; ĐC 4, 5: dịch nổi, cặn 180C; ĐC 6, 7, 8: dịch nổi, cặn, dịch sau siêu âm 370C; ĐC 9, 10, 11, 12: dịch nổi, cặn, dịch sau siêu âm, nuôi 300C Kết điện di (hình 4.6) cho thấy nhiệt độ ảnh hưởng lớn tới trình sinh tổng hợp protein tái tổ hợp Tại 370C, kết tổng hợp protein tái tổ hợp tốt Tuy nhiên kiểm tra trạng thái biểu 250C, 300C, 370C, protein lysin biểu chủ yếu dạng không hòa tan, nhiệt độ 180C lượng lysin dạng hòa tan nhiều Như vậy, nhiệt độ có ảnh hưởng lớn đến trạng thái biểu protein tái tổ hợp Ở nhiệt độ 250C, 300C, 370C vi khuẩn sinh trưởng mạnh protein tổng hợp nhanh hệ thống tế bào vật chủ không gấp nếp để tạo thành protein có cấu trúc giống với cấu trúc tự nhiên, làm cho protein tạo tập trung lại thành dạng thể vùi (inclusion body) Vì để đảm bảo hoạt tính của enzyme, chọn nhiệt độ để biểu lysin 180C 51 4.2.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ IPTG IPTG dùng làm chất cảm ứng kích hoạt E coli sản xuất protein tái tổ hợp Nồng độ IPTG ảnh hưởng lớn đến suất chất lượng protein tái tổ hợp tạo Nếu nồng độ IPTG cao gây ức chế việc tổng hợp protein, nồng độ IPTG thấp không đủ để cảm ứng promoter tạo nhiều protein Do nồng độ IPTG yếu tố quan trọng cần khảo sát để tối ưu hóa trình biểu protein Để kiểm tra ảnh hưởng nồng độ IPTG lên trình tổng hợp protein ngoại lai nuôi cấy chủng E coli BL21 Star (DE3) tái tổ hợp 370C đến OD600 đạt 0,6-0,8 Sau đó, bổ sung vào dịch nuôi cấy với nồng độ IPTG khác nhau: 0,1 mM; 0,4 mM; 0,7mM; 1,0 mM; 1,5 mM; 1,5 mM; mM tiếp tục nuôi lắc 180C 16 Kết phân tích điện di gel polyacrylamide 12,5% (hình 4.7) cho thấy nồng độ IPTG khác có ảnh hưởng khác tới trình sinh tổng hợp protein tái tổ hợp 15 M 10 11 12 13 14 Hình 4.6: Kết biểu lysin nồng độ IPTG ĐC 1, 15: nuôi không cảm ứng; ĐC 2,3: dịch nổi, cặn cảm ứng 0,1mM IPTG; ĐC 4,5: dịch nổi, cặn cảm ứng 0,4 mM IPTG; ĐC 6,7: dịch nổi, cặn cảm ứng 0,7 mM IPTG; ĐC 8,9: dịch nổi, cặn cảm ứng 1mM IPTG; ĐC 11, 12: dịch nổi, cặn cảm ứng 1,5 mM IPTG; ĐC 13, 14: dịch nổi, cặn cảm ứng mM IPTG; ĐC M: thang chuẩn protein (Understained) 52 Từ kết điện di cho thấy lượng protein tái tổ hợp thu nồng độ 0,7 mM mM lớn Ở nồng độ IPTG nghiên cứu, biểu 180C protein tái tổ hợp tồn trạng thái dạng hòa tan dạng không hòa tan (thể vùi) Ở nồng độ từ 0,1 mM; 0,4 mM; 0,7 mM, mM protein lysin tồn trạng thái hòa tan nhiều dạng thể vùi Khi nồng độ IPTG tăng lên (1,5 mM mM) protein có dấu hiệu biểu tăng nhiên lại tồn phần lớn dạng thể vùi, tăng nồng độ IPTG cao nữa,có thể gây độc cho tế bào Ở nồng độ 0.7 mM mM IPTG thu lượng protein tái tổ hợp cao khác biệt, protein tồn trạng thái hòa tan thể vùi Kế thừa nghiên cứu trước chọn nồng độ tối ưu cho chất cảm ứng IPTG mM để biểu lượng lớn phục vụ cho nghiên cứu Qua khảo sát trên, tìm điều kiện tối ưu cho biểu lysin tái tổ hợp 180C, nồng độ chất cảm ứng IPTG mM, thu mẫu sau 16 h cảm ứng Đây điều kiện nuôi cấy áp dụng cho bước nghiên cứu sau 53 Phần KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Thiết kế thành công vector biểu pET32a(+) mang gen lysK có kích thước 1488 bp Biểu thành công protein tái tổ hợp - lysin phage dung hợp với đuôi trxA vi khuẩn E coli chủng BL21 StarTM (DE3) với kích thước khoảng 70 kDa Đã tối ưu hóa điều kiện biểu lysin tái tổ hợp để nâng cao hiệu suất biểu lysin tái tổ hợp biểu trạng thái hòa tan biểu 180C mM chất chất cảm ứng IPTG thu mẫu sau 16 cảm ứng 5.2 Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu tinh sạch, thử hoạt tính, tìm điều kiện tối ưu cho hoạt động lysin tiêu diệt vi khuẩn chủ Staphylococcus areus Từ tiến tới sản xuất lượng lớn lysin phục vụ vào thực tiễn sống TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Lê Huy Chính (2001), Vi sinh vật y học, NXB Y học Hồ Huỳnh Thùy Dương (2008), Sinh học phân tử, NXB Giáo dục, Hà Nội Khuất Hữu Thanh (2012), Cơ sở di truyền phân tử kĩ thuật gen, NX Đại học Bách Khoa Hà Nội Cao Văn Thu (2008), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục, Hà Nội Phạm Văn Ty (2007), Virut học, NXB Giáo dục, Hà Nội Bộ Y tế (2010), Báo cáo sử dụng kháng sinh kháng kháng sinh 15 bệnh viện Việt Nam năm 2008- 2009 Tổ chức Y tế giới (2014), Báo cáo giám sát toàn kháng kháng sinh năm 2014 Tiếng Anh Ackermann, H.W (2009) Phage classification and characterization Methods Mol Biol; 501: 127- 40 Bebbington, C., Yarranton G (2008), Antibodies for the treatment of Bacterial infec- tions, current experience and future prospects Curr Opin Biotechnol,19(6):613-9 10 Becker, S.C., Foster – Frey J., Donavan, D.M (2008), The phage K enzyme lysK and lysostaphin act synergistically to kill MRSA FEMS Microbial Lett, 287: 185- 91 11 Berkowitz, B.A., Bevins, C.L., Zasloff, A (1990), Magainins: a new family of membrane – active host defense peptides Biochem Pharmacol, 39(4):625-9 12 Borysowski, J., Weber-Dabrowska, B., Gorski, A (2006), Bacteriophage endolysins as a novel class of antibacterial agents Exp Biol Med (Maywood), 231(4):366-77 13 Corsini, L., Hothorn, M., Scheffzek, K., Sattler, M., Stier, G (2008), Thioredoxin as a fusion tag for carrier-driven crystallization Protein Sci, 17(12): 2070–2079 14 Cheng, Q., Nelson, D., Zhu, Z (2005), Removal of group B strep- tococi colonizing the vagina and oropharynx of mice with a bacteriophage lytic enzyme Antimicrob Agent Chemother,11: 111- 15 Dancer, S.J (2004), How antibiotics can make us sick: the less obvious adverse effects of antimicrobial chemothererapy Lancer Infect Dis, 4: 611- 16 Drawz, S.M., Bonomo, R.A (2010), Three decades of beta- lactamase inhibitors Clin Microbiol Rev, 23(1):160-201 17 Falagas, M.E., Kasiakou, S.K (2005), Colistin: the revival of polymyxins for the management of multidrug-resistant gram-negative bacterial infections Clin Infect Dis, 40(9):1333-41 18 Fischetti, V.A (2010), Bacteriophage endolysins: a novel anti- infective to control gram- positive pathogens Int J Med Microbiol,300(6):357-62 19 Gu, J., Xu, W., Lei, L., Huang, J., Feng, X., Sun, C., Du, C., Zuo J., Li, Y., Du, T., Li, L., Han, W (2011), LysGH15, a Novel Bacteriophage Lysin, Protects a Murine Bacteremia Model Efficiently against Lethal Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Infection J Clin Microbiol, 49(1):111-7 20 Gruet, P., Maicent, P., Berthelot, X., Kaltsatos, V (2001), Bovine mastitic and intramamary drug delivery: review and perspectives Adv Drug Deliv Rev, 50: 24521 Hancock, R.E., Sahl, H.G., (2006), Antimicrobial host- denfense peptides as new anti- effective therapeutic strategies Nat Biotechnol 24(12):1551-7 22 Halon, G.W., (2007), Bacteriophage: an a appraisal of their role in the treatment of bacterial infections Int J Antimicrob Agents, 30(2):118-28 23 Hashimoto, H (1994), Drug resistance of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in Japan until 1993 Jpn J Antibiot, 47(6):575-84 24 Hiramatsu, K., Aritaka, N., Hanaki, H., Kawasaki, S., Hosoda, Y., Hori, S., Fukuchi, Y., Kobayashi, I., (1997), Dissemination in Japanese hospitals of strains of Staphylococcus aureus heterogeneously resistant to vancomycin Lancet, 350(9092):1670-3 25 Horgan, M., O'Flynn, G., Garry, J., Cooney, J., Coffey, A., Fitzgerald, G.F., Ross, R.P., McAuliffe, O., (2009), The phage lysin, LysK, can be truncated to its CHAP domain and retain lytic activity against live antibioticresistant staphylococci Appl Environ Microbiol, 75:872-4 26 Jado, I., Lopez, R., Garcia, E., Fenoll, A., Casal, J., Garcia, P., (2003), Phage lytic enzymes as therapy for antibiotic – resistant Streptococcus pneumonia infection in a murine sepsis model J Antimicrob Chemother, 52: 967- 73 27 John, B Carter and Venetia, A Saunders (2007), Virology : principles and applications 28 LaVallie, E.R., DiBlasio, E.A., Kovacic, S., Grant, K.L., Schendel, P.F., McCoy JM, (1993) A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E coli cytoplasm Biotechnology (N Y), 11(2):187-93 29 Loresser, M.J., (2005), Bacteriophage endolysins – current state of research and applications Curr Opin Biotechnol, 8: 480 – 30 Lowy, F.W., (1998), Staphylococcus aureus infections N Engl J Med, 339: 520 – 32 31 Loeffer, J.M, Djurkovic, S., Fischetti, V.A., (2003), Phage lytic enzyme Cpl- as a novel antimicrobial for pneumococ- cal bacteremia Infect Immun, 71: 6199- 204 32 Loeffer, J.M., Fischetti, V.A., (2003), Synergistic lethal effect of a combination of phage lytic enzymes with different activities on penicillin – sensitive and resistant Streptococcus pneumonae strains Antimicrob Agent Chemother, 47(1):375-7 32 Loessner, M.J., Kramer, K., Ebel, F., Scherer, S (2002), C-terminal domains of Listeria monocytogenes bacteriophage murein hydrolases determine specific recognition and highaffinity binding to bacterial cell wall carbohydrates Mol Microbiol; 44:335-49 33 Rodríguez-Rubio, L., Martínez, B., Rodríguez, A., Donovan, D.M., Götz, F., García, P., (2013)., The phage lytic proteins from the Staphylococcus aureus bacteriophage vB_SauS-philPLA88 display multiple active catalytic domains and not trigger Staphylococcal resistance PLoS One, 8(5):e64671 34 Fischetti, V.A., (2008), Bacteriophage lysins as effective antibac – terials Current Opinion Microbiology, 11:393- 400 35 Fenton, M., Ross, P., McAuliffe, O., O'Mahony, J., Coffey, A., (2010), Recombinant bacteriophage lysins as antibacterials Bioeng Bugs, 1(1):9-16 36 Mayer, M.J., Narbad, A., Gasson, M.J., (2008), Molecular charac – terisation of Clostridium difficile bacteriophage and its cloned biologically active endolysin J Bacteriol, 20: 6734- 40) 37 Nelson, D., Loomis, L., Fischetti, V.A (2001), Prevention and elimination of upper respiratory colonization of mice by groupAstreptococci by using a bacteriophage lytic enzyme Proc Natl Acad Sci USA, 98(7):4107–12 38 O’Flaherty, S., Coffey, A., Meaney, W., Fitzgerald, G.F., Ross, R.P., (2005), The recombinant phage lysin LysK has a broad spectrum of lytic activity against clinically relevant staphylococci, including methicillin-resistant Staphylococcus aureus J Bacteriol, 187(20):7161-4 39 Reichert, J.M., Rosensweig, C.J., Faden, L.B., Dewitz, M.C., (2005), Monoclonal antibody successes in the clinic Biotechnol, 23(9): 1073 - 40 Sass, P., Beierbaum, G., (2007), Lytic activity of recombinant bac- teriophage phi 11 and phi 12 endolysins on whole cells and biofimls of Staphylococcus aureus Appl Environ Microbiol, 73(1): 347- 52 41 Schuch, R., Nelson, D., Fischetti, V.A., (2002), A bacteriolytic agent that detects and kills Bacillus anthracis Nature, 418: 884- 42 Schuch, R., Lee, B.K., Rotolo, H.M., Schneider, J.A., Horiuchi, B.C., Sauve, Y., Couto, K.L., Law, D.E., Raz, C., Khan, A., Fischetti, V.A., Huang, D.B., Nowinski, R.C., Wittekind, M., (2014), Combination therapy with lysin CF-301 and antibiotic is superior to antibiotic alone for treating methicillin-resistant Staphylococcus aureus-induce murine bacteremia J Infect Dis, 209(9): 146943 Mangoni, M.L., McDermott, A.M., Zasloff M Antimicrobial peptides and wound healing: biological and therapeutic considerations Exp Dermatol, 25(3):167-73 44 Yoong, P., Schuch, R., Nelson, D., Fischetti, V.A., (2006), PlyPH, a bacteriolytic enzyme with broad pH range of activity and lytic action against Bacillus anthracis J Bacteriol, 188: 2711- 45 Zimmer, M., Vukov, N., Scherer, S., Loessner, M.J (2002), The murein hydrolase of the bacteriophage phi3626 dual lysis system is active against all tested Clostridium perfringens strains Appl Environ Microbiol, 68(11):5311-7 ... Lysin bacteriophage chủng K đặc hiệu Staphylococcus aureus Escherichia coli 1.2 Mục đích nghiên cứu Biểu lysin tái tổ hợp Bacteriophage chủng K đặc hiệu Staphylococcus aureus vi khuẩn E coli. .. HỌC NÔNG LÂM VŨ THỊ TRANG Tên đề tài: NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN LYSIN CỦA BACTERIOPHAGE CHỦNG K ĐẶC HIỆU Staphylococcus aureus Ở Escherichia coli KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo: Chính... nghiên cứu - Thiết k vector biểu mang gen mã hóa lysin thực khuẩn thể vi khuẩn Staphylococcus aureus - Biểu thành công gen mã hóa lysin E coli chủng BL21 starTM (DE3) - Tối ưu số điều kiện biểu