Header Page of 148 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TR N H U T M Nghiên cứu xây dựng quy trình pilot sản xuất sinh khối Bacillus spp làm nguyên liệu probiotic cung cấp carotenoid Chuyên ngành: Công nghệ dƣợc phẩm M số: 62 73 01 01 TÓM TẮT U N ÁN TIẾN S DƢỢC HỌC Thành phố Hồ Chí Minh - 2014 Footer Page of 148 Header Page of 148 Footer Page of 148 Header Page of 148 Công trình hồn thành tại: ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP.HCM Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Trần Cát Đông GS.TS Nguyễn Văn Thanh Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ Hội đồng chấm luận án cấp trường Họp tại:…………………………………………………… Vào hồi…… giờ……ngày… tháng… năm…… Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Thư viện khoa học tổng hợp TP.HCM - Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Footer Page of 148 Header Page of 148 Footer Page of 148 Header Page of 148 GIỚI THIỆU U N ÁN Đặt vấn đề Trong nh ng năm gần đây, việc dùng nguồn vi khuẩn để sản xuất số carotenoid quan trọng quan tâm nghi n cứu Việc sử dụng vi khuẩn sinh carotenoid làm nguy n liệu sản xuất thực phẩm chức có nhiều ưu điểm dễ ni cấy qui mô lớn, tăng trưởng nhanh, sử dụng chất giá thành thấp, ngồi cịn có nh ng giá trị cộng th m bổ sung th m men trợ ti u hóa, ổn định bảo quản Trong số vi khuẩn sinh carotenoid, Bacillus có nhiều ưu điểm ch ng có khả tạo bào tử bền với nhiệt n n dễ bảo quản sản xuất Tr n giới Việt Nam chưa có nhiều nghi n cứu sâu, tồn diện Bacillus sinh carotenoid để cung cấp carotenoid Mục ti u luận án nghi n cứu xây dựng quy trình pilot sản xuất sinh khối Bacillus spp làm nguy n liệu probiotic cung cấp carotenoid, hướng đến nội dung sau: Phân lập Bacillus sinh carotenoid, khảo sát đặc điểm probiotic Khảo sát khả sinh carotenoid từ vi khuẩn phân lập Khảo sát môi trường thay điều kiện nuôi cấy để xây dựng quy trình l n men Xây dựng quy trình l n men quy mô pilot để sản xuất sinh khối Bacillus làm nguy n liệu probiotic cung cấp carotenoid Xây dựng ti u chuẩn sở nguy n liệu Nghi n cứu khả ứng dụng sinh khối thu Tính cấp thiết đề tài Các chất chống oxi hóa tự nhi n quan tâm nghi n cứu nhiều flavonoid, carotenoid, polyphenol,… đó, carotenoid ch nhiều làm giảm t lệ m c bệnh mạn t nh ung thư, mạch, Footer Pagetim of 148.ch a bệnh m t Các carotenoid sử dụng Header Page of 148 chế phẩm thường chiết xuất từ thực vật tổng hợp hóa học, có nhiều nhược điểm sử dụng dung môi chiết xuất độc hại ảnh hưởng đến môi trường, phụ thuộc vào thời tiết, carotenoid k m bền khó bảo quản,… Việc sử dụng bào tử vi khuẩn Bacillus sinh carotenoid dạng probiotic, cung cấp carotenoid đường ti u hóa có nhiều ưu điểm thời gian nuôi cấy ng n, không qua chiết xuất, bảo quản carotenoid đơn giản, hướng tiếp cận nguồn phương thức cung cấp carotenoid so với cách thức truyền thống chiết xuất hay tổng hợp hóa học tồn nhiều nhược điểm n u Những đóng góp luận án Đây nghi n cứu đầu ti n sử dụng bào tử Bacillus làm nguồn cung cấp carotenoid Việt Nam Nghi n cứu mở hướng tiếp cận nguồn phương thức cung cấp carotenoid, với nh ng đóng góp cụ thể sau: - Phân lập, định danh hai chủng vi khuẩn Bacillus Việt Nam Bacillus marisflavi DD1.1 Bacillus infantis AT14, đáp ứng y u cầu làm nguy n liệu probiotic cung cấp carotenoid - Xây dựng quy trình l n men thu sinh khối bào tử ổn định quy mô pilot, với thông số phù hợp, sử dụng nguy n liệu giá thành thấp, s n có Việt Nam, quy trình có t nh kinh tế, ứng dụng vào thực tế tạo n n sản phẩm có giá cạnh tranh - Chứng minh khả hấp thu carotenoid ni m mạc ruột, khả điều trị ti u chảy kháng sinh tr n mơ hình động vật có v hai chủng vi khuẩn Bacillus phân lập Footer Page of 148 Header Page of 148 Bố cục luận án Luận án gồm: 139 trang, đặt vấn đề trang, tổng quan tài liệu 26 trang, đối tượng - vật liệu - thiết bị phương pháp nghi n cứu 21 trang, kết nghi n cứu 72 trang, bàn luận 14 trang, kết luận kiến nghị trang Luận án có 71 bảng, 23 hình, sơ đồ, 118 tài liệu tham khảo, gồm 11 tài liệu tiếng Việt, 107 tài liệu tiếng Anh, 13 phụ lục thể kết thực nghiệm Chƣơng TỔNG QUAN TÀI IỆU 1.1 Thực phẩm chức năng: khái niệm, ti u ch 1.2 Probiotic: khái niệm, ti u ch probiotic 1.3 Thực phẩm chức probiotic sức khỏe: tác dụng thực phẩm chức probiotic sức khỏe, y học 1.4 Carotenoid: cấu tr c, phân loại, đặc t nh l hóa, tác dụng sinh học vai carotenoid y học, phương pháp định lượng, định t nh carotenoid 1.5 Các vi sinh vật sinh carotenoid: trình bày chi sinh carotenoid loại carotenoid đặc trưng sinh 1.6 Vi khuẩn Bacillus: đặc điểm vi khuẩn bào tử Bacillus, ứng dụng 1.7 L n men sản xuất sinh khối: vấn đề môi trường l n men, yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp carotenoid vi sinh vật 1.8 Nghi n cứu vi khuẩn sinh carotenoid giới Việt Nam: tóm t t nghi n cứu tr n giới nước tình hình nghi n cứu vi khuẩn Bacillus sinh carotenoid Chưa có nhiều nghi n cứu vi khuẩn Bacillus sinh carotenoid Footer Page of 148 Header Page of 148 Chƣơng ĐỐI TƢỢNG, V T IỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu: vi khuẩn (VK) phân lập từ mẫu đất nước Rịa - V ng Tàu, ình Thuận, Nha Trang Đà N ng 2.2 Vật liệu sn v tv n v tt n m: chủng vi khuẩn ATCC, từ dự án Colorspore, PTN Vi sinh Công nghệ Dược Chuột nh t tr ng Swiss albio, Viện Pasteur Nha Trang t Sigma, Merck, công ty dược nước M tr n TSA, TS , NA, N Ấn Độ MHA (Đức) 2.3 Thiết Máy luân nhiệt Mastercycler Personal (Eppendorf), ộ điện di ngang Mini-Sub Cell GT (Bio-Rad), Máy quang phổ UV-Vis GeneQuant 1300 (GE HealthCare), Máy tán si u âm VCX 130P (Sonics), hệ thống HPLC Smartline 2500 (Knauer), … 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1 Phân lập chủng VK, sàng lọc, đ nh danh T u t p mẫu tv n Vùng biển Cần Giờ, Rịa - V ng Tàu, Đà N ng, ình Thuận, Nha Trang P ân l p Trực khuẩn Gram (+), sinh bào tử, có màu lưu lại để nghi n cứu sàng lọc khả sinh carotenoid S n lọ : hoạt t nh chống oxy hóa, phổ UV-Vis dịch chiết sinh khối Địn d n : Dựa tr n giải trình tự gen 16S rADN 2.4.2 Khảo sát đặc điểm pro iotic K ả năn s n enzym n oạ b o ủ ủn v k uẩn: khả sinh protease (caseinase, gelatinase), amylase, lipase Footer Page of 148 Header Page of 148 T k ả năn ố k án vớ VK ây b n (chủng ATCC): S aureus, E coli, S faecalis, P aeruginosa, Sal paratyphi A, K pneumoniae K ả năn ịu d dị vị v muố m t Khả sống sót VK sau 30, 60, 90 ph t pH 2, 3; sau 1, muối mật 0,15%, 0,3% n T m n ạy ảm k án s n : PP pha loãng kháng sinh thạch theo M7 - A9 M45 – A (CLSI) Sử dụng 15 kháng sinh đại diện cho nhóm penicilin, cephem, glycopeptid, aminoglycosid, macrolid, tetracyclin, quinolon, phenicol, ansamycin 2.4.3 Khảo sát điều kiện nuôi cấy đƣờng cong tăng trƣởng Đ ều k n p át tr ển ủ v k uẩn từ 20 - 45oC, từ pH - 11 Đ n on tăn tr ởn TSB đo OD giờ, đếm sống để kiểm chứng Xác định thời gian hệ 2.4.4 Khảo sát đặc điểm sinh carotenoid Xá ịn m l ợn roteno d bằn PLC (Knauer - Đức): acetonitril:methanol:dicloromethan (7:2:1, tt/tt), RP18 (250 mm, 4,6 mm, μm); UV-Vis, λ450nm; ml/ ph t; to phòng; 20μl Xác định hàm lượng carotenoid qua đường chuẩn canthaxanthin K ảo sát tạo roteno d t eo t n Đường cong tăng trưởng: giờ, đo OD tr n erlen Hàm lượng carotenoid: định lượng HPLC (với thông số tr n), (thử nghiệm sơ bộ) 2.4.5 Nghiên cứu quy trình ni cấy K ảo sát MT t y t ế cho TSB: Khoai tây, b p, gạo, đậu nành, đối chứng với TS , chọn MT có sinh khối carotenoid ≥ MT TS K ảo sát k ả năn tạo b o t MT t eo t n • So sánh tạo bào tử gi a MTTT bổ sung K , Mg , Mn2+, Ca2+, Fe2+ + với DSM, TSM, 2SG (cả hai dạng lỏng r n) Footer Page of 148 2+ Header Page 10 of 148 • Khảo sát ảnh hưởng khống đến khả tạo bào tử carotenoid: phương pháp bề mặt đáp ứng – RSM K ảo sát t n số lên men tron MT lỏn : T lệ truyền chủng, tốc độ khuấy, pO2 2.4.6 Xây dựng tiêu chuẩn ột sinh khối tử Dựa tr n chuy n luận chế phẩm iosubtyl DĐVN IV 2.4.7 Thử nghiệm độc tính, sinh khả dụng chuột Đ tín p 14 ngày Đối tượng: DD1.1; AT14 Đối chứng: NaCl 0,85%, HU58 (B.subtilis) Liều: 107, 108, 5x109 bào tử/g TTC Xác định LD50 Giải phẫu đại thể: tìm bất thường nội tạng Đ tín bán tr n d ễn: 60 ngày Đối tượng: DD1.1; AT14 Đối chứng: NaCl 0,85%, HU58 (B.subtilis) Liều: 107 bào tử/g TTC - Theo dõi: biểu bất thường - X t nghiệm: bất thường sinh hóa/ huyết học - Vi phẫu: bất thường mô học nội tạng S n k ả dụn u t 60 ngày Đối tượng: DD1.1; AT14 Đối chứng: NaCl 0,85%, HU58 (B.subtilis), dầu gấc (β-caroten) Liều: 106 bào tử/g TTC Đánh giá t ch l y carotenoid gan 2.4.8 Ứng dụng nguyên liệu sinh khối 2.4.8.1 Đ ều trị t ảy k án s n Gây ti u chảy chuột streptomycin lincomycin, trì ¼ liều, lần/ngày Thử nghiệm: AT14, DD1.1, S02 (1 VK hay VK, lần/ngày) Quan sát phân chuột hàng ngày đến hết ti u chảy B sun v k uẩn v o sữ u : Mẫu thử: DD1.1, AT14 (106 – 5x108 bào tử/ml) Mẫu chứng: khơng có bào tử VK Footer Page 10 of 148 11 Header Page 15 of 148 3.7 Quy trình lên men thu tử L Môi trường ĐK15 bổ sung agar 105 g 72,94 ml KCl 10% 10,42 ml MgSO4 12% 10,5 ml Ca(NO3)2 1M 6,86 ml MnCl2 10 mM 5,94 ml FeSO4 mM Chuẩn MT Nhân giống Phân lập tr n TSA, 37oC, 24 Tiệt trùng 121oC, 15 ph t Tăng sinh cấp 1, 10 ml TSB 37oC, 200 vòng/ph t, 12 Đổ hộp nhựa, 70 ml/hộp Tăng sinh cấp 2, 350 ml TSB 37oC, 200 vòng/ph t, 12 Cấy chủng, ml/hộp L n men 37oC, 48 Chủng gốc AT14 ên men Th m ml NaCl 0,85% vào hộp, dùng que trải thu sinh khối Sinh khố i ướt giàu bào tử Xử lý sau lên men Tinh ch ́ bào tử đông khô Nguyên liêụ AT14 Sơ đồ 3.1 Quy trình ni cấy thu bào tử AT14 tr n môi trường r n 7L Môi trường Đ5 bổ sung 105 g agar 76,86 ml KCl 10%, 10,22 ml MgSO4 12%, 10,36 ml Ca(NO3)2 1M, 8,26 ml MnCl2 10 mM, 4,55 ml FeSO4 mM Chuẩn MT Tăng sinh cấp 1, 10 ml TSB 37oC, 200 vòng/ph t, 12 Đổ hộp nhựa, 70 ml/hộp Tăng sinh cấp 2, 350 ml TSB 37oC, 200 vòng/ph t, 12 Cấy chủng, ml/hộp Th m ml NaCl 0,85% vào hộp, dùng que trải thu sinh khối Nhân giống Phân lập tr n TSA, 37oC, 24 Tiệt trùng 121oC, 15 ph t L n men 37oC, 48 Chủng gốc DD1.1 ên men Sinh khố i ướt giàu bào tử Xử lý sau lên men Tinh ch ́ bào tử đông khô Ngun liêụ DD1.1 Sơ đồ 3.2 Quy trình ni cấy thu bào tử DD1.1 tr n môi trường r n Footer Page 15 of 148 12 Header Page 16 of 148 L Môi trường ĐK15 bổ sung 77,52 ml KCl 10% 12 ml MgSO4 12% 5,76 ml Ca(NO3)2 1M ml MnCl2 10 mM 8,56 ml FeSO4 mM Chủng AT14 Chuẩn MT Tăng sinh cấp 1, 10 ml TSB 37oC, 200 vòng/ph t, 12 Tiệt trùng 121oC, 50 ph t L n men 37oC, pO2 50%, pH 8, 350 vòng/ph t Nhân giống Phân lập tr n TSA, 37oC, 24 Tăng sinh cấp 2, 400 ml TSB 37oC, 200 vòng/ph t, 12 ên men Sinh khố i ướt giàu bào tử Ly tâm thu sinh khố i sau 32 giờ Xử lý sau lên men Tinh ch ́ bào tử đông khô Ngun liêụ AT14 Sơ đồ 3.3 Quy trình ni cấy thu bào tử AT14 tr n môi trường lỏng L Môi trường Đ5 bổ sung 57,76 ml KCl 10% 10,64 ml MgSO4 12% 9,52 ml Ca(NO3)2 1M 8,72 ml MnCl2 10 mM 4,4 ml FeSO4 mM Chủng DD1.1 Chuẩn MT Tăng sinh cấp 1, 10 ml TSB 37oC, 200 vòng/ph t, 12 Tiệt trùng 121oC, 50 ph t L n men 37oC, pO2 50%, pH 8, 250 vịng/ph t Ly tâm thu sinh khớ i sau 36 giờ Nhân giống Phân lập tr n TSA, 37oC, 24 Tăng sinh cấp 2, 400 ml TSB 37oC, 200 vịng/ph t, 12 ên men Sinh khớ i ướt giàu bào tử Xử lý sau lên men Tinh ch ́ bào tử đông khô Nguyên liêụ DD1.1 Sơ đồ 3.4 Quy trình ni cấy thu bào tử DD1.1 tr n môi trường lỏng Footer Page 16 of 148 13 Header Page 17 of 148 3.7.3 Ứng dụng quy trình lên men thu tử AT14 DD1.1 Kết ứng dụng thu sinh khối bào tử bảng 3.4, 3.5 ảng 3.4 Ứng dụng quy trình l n men thu bào tử AT14, DD1.1 tr n môi trường r n (7 L) Chủng AT14 (ĐK15KA) DD1.1 (Đ5KA) Mẻ lên men TB TB BT sau lên ƣợng Carotenoid BT sau tinh chế BT sau đông khô men sinh khối (μg/109BT) 12 12 x 10 CFU (%) x 10 CFU (%) x 1012 CFU (g) 21,32 17,65 (82,8) 16,11 (75,6) 55,95 1,1 22,11 16,87 (76,3) 16,49 (74,6) 54,40 1,2 21,17 17,01 (80,3) 16,74 (79,1) 54,68 1,1 21,53 17,18 (79,8) 16,45 (76,4) 55,02 1,13 96,03 84,07 (87,5) 80,81 (84,2) 187,04 0,31 94,23 85,61 (90,9) 81,05 (86,0) 190,08 0,31 95,32 82,95 (87,0) 80,71 (84,7) 184,83 0,32 95,19 84,21 (88,5) 80,85 (84,9) 187,31 0,31 ảng 3.5 Ứng dụng quy trình l n men thu bào tử AT14, DD1.1 môi trường lỏng (8 L) Chủng AT14 (ĐK15K) DD1.1 (Đ5K) Mẻ lên men TB TB BT sau lên ƣợng Carotenoid BT sau tinh chế BT sau đông khô men sinh khối (μg/109BT) 12 12 x 10 CFU (%) x 10 CFU (%) x 1012 CFU (g) 39,14 31,36 (80,1) 30,29 (77,4) 86,86 1,51 39,32 30,72 (78,1) 30,08 (76,5) 85,51 1,53 38,82 30,26 (77,9) 29,18 (75,2) 84,55 1,51 39,09 30,78 (78,7) 29,85 (76,4) 85,64 1,52 72,53 64,83 (89,4) 61,65 (85,0) 160,38 0,42 71,45 65,15 (91,2) 62,08 (86,9) 161,07 0,43 73,01 64,56 (88,4) 60,38 (82,7) 159,80 0,41 72,33 64,85 (89,7) 61,37 (84,8) 160,43 0,42 Các mẻ l n men AT14 DD1.1 tr n môi trường lỏng r n theo quy trình đề xuất có số lượng bào tử thu ổn định T nh giá thành môi trường thay nguy n liệu so sánh với môi trường thương mại tạo bào tử DSM: ảng 3.6 Giá thành MTTT r n so với thạch DSM Tên môi trƣờng Giá thành lít MT (VNĐ) Footer Page 17 of 148 Đ5KA (cho DD1.1) 7.300 ĐK15KA (cho AT14) 9.800 Thạch DSM 21.000 14 Header Page 18 of 148 ảng 3.7 Giá thành MTTT lỏng so với môi trường DSM Tên mơi trƣờng Giá thành lít MT (VNĐ) Đ5K (cho DD1.1) 2.300 ĐK15K (cho AT14) 4.000 DSM 15.000 T nh giá nguy n liệu bào tử thu từ quy trình sản xuất: Giá nguy n liệu bào tử AT14 từ 80 – 130 đồng /liều, DD1.1 từ 26 – 39 đồng /liều (109 bào tử/liều) 3.8 Xây dựng tiêu chuẩn nguyên liệu sinh khối Dựa tr n ti u chuẩn chế phẩm iosubtyl DĐVN IV gồm ti u ch :  Định nghĩa  Sản xuất  Y u cầu kỹ thuật: + Thành phần nguy n liệu + Ti u chuẩn nguy n liệu: hình thức, định t nh vi sinh vật, khối lượng làm khô, công hiệu, giới hạn nhiễm khuẩn, t nh an toàn Các ti u ch có phương pháp thử kèm theo Kết kiểm nghiệm Trung tâm Kiểm nghiệm Dược phẩm Thực phẩm Mỹ phẩm TP.HCM đạt ti u 3.9 Thử nghiệm độc tính LD50 đường uống DD1.1 AT14 >1011 bào tử /chuột, tức >5x1012 bào tử/kg Sau 60 ngày thử nghiệm, khơng có chuột chết, cân nặng khơng có khác biệt, số huyết học, sinh hóa bình thường Khơng có thay đổi mơ học thận, lách, ruột non gan 3.10 Hấp thu, tích lũy carotenoid từ AT14 DD1.1 gan chuột Chuột uống bào tử AT14, DD1.1 lượng carotenoid t ch l y gan tương đương với việc sử dụng dầu gấc cao gấp 16 lần lô NaCl 0,85% Page lô sử 18 dụng Footer ofbào 148.tử VK khơng sinh carotenoid HU58 Từ cho 15 Header Page 19 of 148 thấy chủng DD1.1, AT14 có khả sinh carotenoid cung cấp cho thể vật chủ qua ni m mạc ruột 3.11 Khả tr tiêu chảy kháng sinh AT14, DD1.1 Liều tối thiểu phòng ngừa điều trị ti u chảy B infantis AT14 B.marisflavi DD1.1 106 bào tử/10g TTC (#108 bào tử/1 kg thể trọng, lần/ngày) mẫu thử chứa vi khuẩn mẫu thử phối hợp với B subtilis BS02 Tương tự với liều sản phẩm probiotic chứa Bacillus WHO 3.12 Khả ứng dụng 3.12.1 ổ sung bào tử vào s a chua Khi bổ sung từ 5x107 - 108 bào tử /ml (tương ứng với 5x109 - 1010 bào tử tr n h s a chua 100 ml), s a chua có màu s c khác biệt so với mẫu đối chứng mức độ ưa th ch 50% tử VK ổn định trình bảo quản s a chua (1 - 45 ngày) 3.12.2 Độ ổn định cốm hỗn dịch bổ sung bào tử vi khuẩn Sau 12 tháng theo dõi độ ổn định cốm hỗn dịch bổ sung bào tử AT14 DD1.1 nhiệt độ phòng (25 - 30oC), độ ẩm 70 – 75%, số lượng bào tử vi khuẩn khơng thay đổi nhiều Vì vậy, sử dụng AT14 DD1.1 bào chế cốm hỗn dịch Chƣơng BÀN U N 4.1 Vi khuẩn sinh carotenoid Nghi n cứu tiến hành thu thập mẫu rộng vùng biển số tỉnh Việt Nam, bao gồm việc lấy mẫu lặp lại nh ng địa điểm cho kết khả quan nghi n cứu trước, kết phân lập 72 chủng, có 38 chủng có tiềm Với 38 chủng phân lập được, Footer Page 19 of 148 16 Header Page 20 of 148 kèm theo d liệu nghi n cứu đặc t nh probiotic làm tiền đề cho nghi n cứu sâu việc theo đuổi mục ti u nghi n cứu sử dụng Bacillus ứng dụng thực phẩm chức thuốc Kết qu t phổ UV-Vis dịch chiết cho thấy đa số mẫu có đỉnh hấp thu vùng 450 - 500nm (vùng hấp thu carotenoid) n cạnh đó, kết phân t ch HPLC với đầu dò UV-Vis đề tài này, c ng nhóm nghi n cứu Dự án Colorspores Đại học Hoàng gia Holloway Anh Quốc kết luận chủng phân lập có khả sinh carotenoid Dựa tr n đặc t nh quan trọng carotenoid khả chống oxy hóa, đối chiếu với chất chống oxy hóa biết HT, vitamin C, β- caroten, lutein, lycopene, zeaxanthin, nhận thấy khả chống oxy hóa dịch chiết từ chủng vi khuẩn tương đương với chất chống oxy hóa truyền thống mà ch ng ta dùng vitamin C, β-caroten, lutein, điều mở nhiều triển vọng cho nghi n cứu s p tới khả ứng dụng chất chống oxy hóa từ vi khuẩn Định danh giải trình tự 16S rADN, 38 chủng phân lập thuộc chi Bacillus, số loài ghi nhận tác giả khác khả sinh carotenoid, ri ng chủng thuộc loài: B infantis, B ferrariarum, B catenulatus, B vietnamensis, B boroniphilus, B baekryungensis, B alcalophilus, B selenatarsenatis B mangrovensis chưa thấy có tài liệu ghi nhận khả sinh carotenoid nghi n cứu Điều cho thấy vi khuẩn thuộc chi Bacillus có nh ng lồi có khả sinh carotenoid chưa biết đến Hầu hết chủng có khả sinh enzym protease (caseinase gelatinase) enzym amylase, chủng vi khuẩn Footer Page 20 of 148 17 Header Page 21 of 148 khả cung cấp carotenoid cịn tiết enzym hỗ trợ cho hệ ti u hóa Các chủng khảo sát có khả sống sót cao điều kiện pH muối mật hệ ti u hóa, nh ng đặc t nh quan trọng việc sử dụng làm probiotic đảm bảo khả sống sót vi khuẩn để đến ruột non phát huy tác dụng mong muốn Các carotenoid sinh từ VK phân lập thuộc nhóm xanthophyl So sánh với chất chuẩn nhận thấy: • DD1.1: loại carotenoid, thời gian lưu 5,1 10,1 ph t (ứng với canthaxanthin) • AT14: loại carotenoid, đỉnh ch nh 8,1 ph t, đỉnh phụ 3,9 ph t (tương tự astaxanthin) • HC28 có đỉnh ch nh 5,1 ph t, đỉnh khác 8,1 9,9 ph t • CG17.0 AT22 có đỉnh ch nh 3,9 ph t tương tự astaxanthin Hai chủng cịn có carotenoid khác 8,1 3,0 ph t Việc t ch l y carotenoid theo hai hướng: • ớn (tí lũy ùn vớ s n k ố tế b o - DD1.1, AT14, HU36): carotenoid t ch l y với sinh khối tế bào đạt cực đại với sinh khối tối ưu, tương tự nghi n Veiga-Crespo cộng • ớn (tí lũy l ên qu n enzym t n ợp roteno d - AT22, CG17.0, HC28): cần đạt hàm lượng enzym cần thiết cho việc sinh tổng hợp, carotenoid gần không tăng pha l y thừa, tăng dần pha ổn định đạt cực đại vào gi a cuối pha ổn định Tương tự nghi n cứu Kim cộng 4.2 Môi trƣờng thay Nhằm hướng đến mục ti u sản xuất, cần phải tìm nguồn nguy n liệu giá thành thấp, s n có Việt Nam để thay mơi trường thương Footer Page 21 of 148 18 Header Page 22 of 148 mại có giá thành cao, đảm bảo t nh khả thi quy trình l n men đưa vào ứng dụng thực tế Nghi n cứu tìm mơi trường thay dạng r n lỏng, với thành phần tối ưu khoáng chất để tạo bào tử chủng AT14 DD1.1 với suất cao giá thành rẻ gấp nhiều lần so với môi trường thương mại Cụ thể chủng AT14: MT lỏng ĐK15% + khoáng (ĐK15K) cho lượng bào tử cao 4,5 lần so với DSM 2SG Trong MT r n ĐK15% + khoáng (ĐK15KA) cho bào tử cao 4,4 lần so với ĐK15K Chủng DD1.1: MT lỏng Đậu 5% + khoáng (Đ5K), thu bào tử gấp 16,8 lần 2SG 30,2 lần DSM Trong MTTT r n (Đ5KA) cao gấp lần Đ5K 4.3 ên men thu tử tiêu chuẩn nguyên liệu sinh khối Từ nh ng kết nghi n cứu thu được, đề xuất bốn quy trình pilot l n men thu sinh khối bào tử hai chủng vi khuẩn Bacillus sinh carotenoid AT14 DD1.1 phân lập (hai quy trình l n men tr n mơi trường r n hai quy trình mơi trường lỏng) với qui mô lớn 10.000 liều (109 bào tử/liều) Áp dụng sản xuất quy mô pilot, nhận thấy quy trình cho lượng bào tử ổn định, giá thành thấp nhiều so với môi trường thương mại từ 2-3 lần (l n men tr n môi trường lỏng) từ 3,8–6,5 lần (môi trường r n) Nguy n liệu bào tử thu có chi ph sản xuất giao động từ 80 – 130 VNĐ /liều 109 bào tử AT14 (lượng carotenoid trung bình 1,13 – 1,52 µg/liều) 26 – 39 VNĐ /liều 109 bào tử DD1.1 (lượng carotenoid trung bình 0,31 – 0,42 µg/liều), chứng tỏ quy trình đáp ứng mặt kỹ thuật hiệu kinh tế ứng dụng để sản xuất, cung cấp nguy n liệu bào tử AT14 DD1.1 cho ngành dược thực phẩm chức Footer Page 22 of 148 19 Header Page 23 of 148 Quy trình l n men r n nồi l n men có nghĩa ứng dụng thiết thực Cụ thể, quy trình l n men tr n mơi trường r n có nhược điểm tương đối thủ cơng, giới hạn quy mơ sản xuất, nhi n áp dụng để sản xuất mà khơng địi hỏi phải đầu tư th m sở vật chất, trang thiết bị, đơn vị ứng dụng dễ dàng triển khai giai đoạn đầu thăm dò thị trường, nhu cầu thị trường nhỏ Ngược lại, quy trình l n men nồi l n men đòi hỏi phải đầu tư sở vật chất trang thiết bị tốn k m nồi l n men, ưu điểm tự động hóa, sản xuất nh ng mẻ lớn so với quy trình l n men tr n mơi trường r n, quy trình phù hợp thị trường sản phẩm khả quan, cần sản xuất lô lớn để cung cấp cho nhu cầu người sử dụng 4.4 Độc tính hai chủng AT14 DD1.1 Liều cao 1011 bào tử/con chuột không gây chết chuột sau 72 14 ngày thử nghiệm, kết luận liều LD50 đường uống DD1.1 AT14 >1011 bào tử /con chuột, tức >5x1012 bào tử /kg thể trọng Đối với probiotic tr n thị trường, liều VK cao cho người trưởng thành sử dụng 1011 CFU/kg thể trọng / ngày, liều khảo sát đề tài x 1012 bào tử /kg thể trọng/ngày cao gấp 50 lần so với liều cao thực tế sử dụng Thử nghiệm độc t nh bán trường diễn DD1.1, AT14 60 ngày thử nghiệm nhận thấy khơng có khác biệt gi a lơ thử nghiệm, lơ chứng lơ đối chứng Ngồi ra, nghi n cứu trước, DD1.1, AT14 chứng minh khơng mang gen gây độc Từ đó, kết luận hai chủng DD1.1, AT14 an tồn có khả làm probiotic Footer Page 23 of 148 20 Header Page 24 of 148 4.5 Hấp thu, tích lũy carotenoid từ AT14 DD1.1 gan chuột Chuột uống bào tử AT14 DD1.1 lượng carotenoid t ch l y gan tương đương với việc sử dụng dầu gấc cao gấp 16 lần so với lô NaCl 0,85% lô sử dụng bào tử VK không sinh carotenoid B subtilis HU58 Như vậy, nói nghi n sử dụng bào tử Bacillus làm nguồn cung cấp carotenoid có nhiều ưu điểm: • Cung cấp carotenoid đường ti u hóa thể vật chủ hấp thu trực tiếp qua ni m mạc ruột; • Khơng cần chiết xuất trước n n không sử dụng loại dung môi độc hại ảnh hưởng đến môi trường, đồng thời hạn chế nhược điểm carotenoid k m bền với nhiệt độ tác nhân oxi hóa, gi p việc bảo quản đơn giản Đây hướng tiếp cận nguồn phương thức cung cấp carotenoid 4.6 Khả điều tr tiêu chảy liên quan đến kháng sinh Kết cho thấy tiềm ứng dụng làm probiotic thực phẩm chức AT14, DD1.1 nói ri ng vi khuẩn Bacillus sinh carotenoid nói chung lớn, không giới hạn phạm vi làm nguồn cung cấp carotenoid Đồng thời qua kết này, r t số nhận x t sau: - Không thiết sử dụng vi khuẩn có t nh đối kháng với vi khuẩn gây bệnh phòng điều trị ti u chảy, nhận định không nhằm mục đ ch bác bỏ kết nghi n cứu công bố trước đây, d liệu bổ sung nhằm gi p cho nghi n Footer Page 24 of 148 21 Header Page 25 of 148 cứu định hướng sàng lọc, lựa chọn chủng, tránh bỏ sót chủng tiềm - Gián tiếp chứng tỏ bào tử hai chủng AT14 DD1.1 nảy mầm trở lại thành dạng sinh dư ng sau vào đường ti u hóa, l luận bổ sung tiếp tục khẳng định kết hấp thu t ch l y carotenoid gan chuột đề tài này, là: sau uống vào, bào tử vi khuẩn nảy mầm cung cấp carotenoid ni m mạc ruột - AT14 DD1.1 khơng có lợi điểm đề kháng với kháng sinh, dùng chung với kháng sinh liều trì có tác dụng, điều kết đáng quan tâm ch ng ta lo ngại nguy chuyển gen đề kháng kháng sinh, chủng nghi n cứu đảm bảo ưu điểm khả dùng chung với kháng sinh điều trị ti u chảy 4.7 Khả ứng dụng tử AT14 DD1.1 sinh carotenoid số d ng chế phẩm Tr n dạng chế phẩm thử nghiệm s a chua, thuốc cốm, hỗn dịch, bào tử AT14 DD1.1 cho kết khả quan Độ ổn định bào tử 45 ngày s a chua, 12 tháng thuốc cốm hỗn dịch Điều cho thấy tiềm ứng dụng bào tử AT14 DD1.1 tr n dạng chế phẩm lớn, sử dụng bào tử vi khuẩn AT14 DD1.1 làm probiotic để cung cấp carotenoid KẾT U N Mục ti u đề tài nghi n cứu, phân lập số vi khuẩn Bacillus sinh carotenoid, từ xây dựng quy trình pilot sản xuất sinh khối làm nguy n Footer Page 25 of 148 22 Header Page 26 of 148 liệu probiotic cung cấp carotenoid Sau thời gian thực hiện, kết nghi n cứu luận án đáp ứng mục ti u đặt ra, hoàn thành nội dung nghi n cứu: Phân lập vi khuẩn Bacillus sinh carotenoid khảo sát đặc điểm probiotic Đã phân lập, định danh 38 chủng Bacillus, ngoại trừ khả đối kháng với vi khuẩn gây bệnh, 38 chủng có nh ng đặc điểm probiotic có khả sinh carotenoid Từ chọn hai chủng có tiềm Bacillus infantis AT14, Bacillus marisflavi DD1.1 để nghi n cứu sản xuất ứng dụng Đặc điểm sinh carotenoid từ chủng phân lập đƣợc Các chủng tiềm có khả sinh carotenoid thuộc nhóm xanthophyl Hàm lượng carotenoid t ch l y đạt cực đại vào cuối pha l y thừa pha ổn định tr n đường cong tăng trưởng Do đó, thu nhận carotenoid cao với thời điểm sinh khối tế bào đạt cực đại Môi trƣờng nuôi cấy thay điều kiện nuôi cấy Xác định điều kiện tăng trưởng chủng tìm mơi trường giá thành thấp đậu khoai tây để thay môi trường thương mại đ t tiền Môi trường nghi n cứu có giá thành rẻ khả tạo bào tử cao nhiều lần so với môi trường thương mại Quy trình lên men quy mơ pilot để sản xuất sinh khối tử Đã xây dựng quy trình l n men ổn định, có suất cao giá thành thấp tr n môi trường r n lỏng để sản xuất sinh khối bào tử vi khuẩn B marisflavi DD1.1 B infantis AT14 Footer Page 26 of 148 23 Header Page 27 of 148 - L n men tr n môi trường r n với qui mô mẻ 15.000 liều bào tử Bacillus infantis AT14 (109 bào tử /liều) 75.000 liều bào tử Bacillus marisflavi DD1.1 (109 bào tử/liều) - L n men môi trường lỏng với qui mô mẻ 25.000 liều Bacillus infantis AT14 (109 bào tử/liều), 55.000 liều Bacillus marisflavi DD1.1 (109 bào tử /liều) Tiêu chuẩn sở nguyên liệu Đã xây dựng ti u chuẩn sở cho nguy n liệu bột sinh khối Khả ứng dụng sinh khối tử thu đƣợc Các chủng B marisflavi DD1.1 B infantis AT14 khơng có độc t nh qua thử nghiệm độc t nh cấp bán cấp, với LD50 > 5x1012 CFU/kg Đã chứng minh carotenoid sinh từ chủng B marisflavi DD1.1 B infantis AT14 hấp thu vào thể vật chủ qua ni m mạc ruột t ch l y gan chuột tử B marisflavi DD1.1 B infantis AT14 chứng minh có khả điều trị ti u chảy li n quan đến kháng sinh tr n mơ hình chuột sử dụng độc lập phối hợp với chủng B subtilis BS02 tử chủng B marisflavi DD1.1 B infantis AT14 sử dụng làm vi khuẩn probiotic bổ sung vào chế phẩm s a chua cung cấp carotenoid với liều l n đến 1010 bào tử/ 100 ml s a chua mà không làm cảm quan hay mùi vị sản phẩm ột nguy n liệu bào tử dạng thuốc cốm, hỗn dịch chứa bào tử chủng B marisflavi DD1.1 B infantis AT14 ổn định 12 tháng Footer Page 27 of 148 24 Header Page 28 of 148 KIẾN NGHỊ Tiến hành thử nghiệm độc t nh thử nghiệm lâm sàng tr n người tình nguyện chủng Tăng qui mô l n men để thu bào tử với lượng lớn chế chế phẩm sử dụng chủng để phục vụ việc chăm sóc bảo vệ sức khỏe Footer Page 28 of 148 Header Page 29 of 148 DANH MỤC CÁC C NG TR NH NGHIÊN CỨU CỦA TÁC GIẢ ĐÃ C NG BỐ IÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI U N ÁN Trần H u Tâm, Trần Cát Đông, Nguyễn Văn Thanh (2014), “Nghi n cứu t nh an toàn sinh khả dụng hai chủng vi khuẩn Bacillus sinh carotenoid”, Tạp í D ợ ọ , số 457: tr.30-36 Trần H u Tâm, Nguyễn Thị Linh Giang, Nguyễn Văn Thanh, Trần Cát Đông (2014), “Khả điều trị ti u chảy li n quan đến kháng sinh tr n mơ hình chuột bào tử trực khuẩn sinh carotenoid phân lập Việt Nam”, Tạp í Y ọ T ự n , số 916: tr.28-31 Trần H u Tâm, Trần Thị Thanh Thảo, Trần Cát Đông (2014), “Nghi n cứu bổ sung Bacillus sinh carotenoid vào s a chua”, Tạp í Y ọ TP CM 18(2): tr.267-271 V Thanh Thảo, Nguyễn Minh Thái, Nguyễn Thị Linh Giang, Trần H u Tâm, Trần Cát Đông (2014), “Nghi n cứu đặc t nh probiotic Bacillus subtilis S02”, Tạp í Y ọ t ự n , số 907(3): tr 20-24 L Minh Tr , Trần H u Tâm, Trần Thị Thanh Thảo, Trần Cát Đông (2011), “Khảo sát môi trường nuôi cấy Bacillus sinh carotenoid từ nguồn nguy n liệu rẻ tiền”, Tạp í Y ọ TP.HCM 15(1): tr 189-194 V Thanh Thảo, Trần H u Tâm, Trần Thành Đạo, Trần Cát Đông (2011), “Khảo sát tạo carotenoid theo thời gian pha sinh dư ng số chủng B llus” Tạp í Y ọ TP.HCM 15(1): tr 211-217 Footer Page 29 of 148 ... dụng sinh học vai carotenoid y học, phương pháp định lượng, định t nh carotenoid 1.5 Các vi sinh vật sinh carotenoid: trình bày chi sinh carotenoid loại carotenoid đặc trưng sinh 1.6 Vi khuẩn Bacillus: ... để cung cấp carotenoid Mục ti u luận án nghi n cứu xây dựng quy trình pilot sản xuất sinh khối Bacillus spp làm nguy n liệu probiotic cung cấp carotenoid, hướng đến nội dung sau: Phân lập Bacillus. .. khuẩn AT14 DD1.1 làm probiotic để cung cấp carotenoid KẾT U N Mục ti u đề tài nghi n cứu, phân lập số vi khuẩn Bacillus sinh carotenoid, từ xây dựng quy trình pilot sản xuất sinh khối làm nguy