Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy, chuyển hóa sinh học và thu nhận γ-decalactone từ dầu thầu dầu bằng nấm men Yarrowia lipolytica

70 366 0
  • Loading ...
1/70 trang

Thông tin tài liệu

Ngày đăng: 08/03/2017, 03:45

Header Page of 148 Đ IăH CăQU CăGIAăHÀăN I TR NGăĐ IăH CăKHOAăH CăT ăNHIểN NGUY NăXUỂNăVI T NGHIểNăC UăĐI UăKI NăNUỌIăC Y,ăCHUY NăHịAă SINHăH CăVÀăTHUăNH Nă- DECALACTONEăT ă D UăTH UăD UăB NGăN MăMENăYarrowia LU NăVĔNăTH CăSĨăKHOAăH C Hà Nội - 2014 Footer Page of 148 lipolytica Header Page of 148 Đ IăH CăQU CăGIAăHÀăN I TR NGăĐ IăH CăKHOAăH CăT ăNHIểN NGUY NăXUỂNăVI T NGHIểNăC UăĐI UăKI NăNUỌIăC Y,ăCHUY NăHịAă SINHăH CăVÀăTHUăNH Nă- DECALACTONEăT ă D UăTH UăD UăB NGăN MăMENăYarrowia lipolytica Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 01 07 LU NăVĔNăTH CăSĨăKHOAăH C NG IăH NGăD NăKHOAăH C:ă PGS.TS.ăNGUY NăTH ăHOÀIăTRỂM PGS.TS.ăNGỌăT Hà Nội - 2014 Footer Page of 148 THÀNH Header Page of 148 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt L IăC Mă N Tôi xin chân thành cảm ơn PGS TS Nguyễn Thị Hoài Trâm PGS.TS Ngô Tự Thành người trực tiếp hướng dẫn khoa học tận tình giúp đỡ suốt trình nghiên cứu, hoàn thành đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn anh chị cán Bộ môn Công nghệ Enzim Protein, Viện Công nghiệp Thực phẩm-Bộ Công thương nhiệt tình giúp đỡ, bảo chia sẻ với thời gian thực tập Nhân dịp này, xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh học, thầy giáo, cô giáo Bộ môn Vi sinh vật học động viên, dẫn, đóng góp ý kiến tạo điều kiện thuận lợi để hoàn thành luận văn Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình, người thân bạn bè động viên, giúp đỡ suốt trình thực đề tài Hà Nội tháng 6-2014 H c viên:ăNguy năXuơnăVi t Chuyên ngành Vi sinh vật học Footer Page of 148 Khóa 2011-2013 Header Page of 148 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt M CăL C L IăC Mă N M CăL C DANHăM CăHỊNHăV DANHăM CăB NG DANHăM CăCH ăVI TăT T DANHăM CăCH ăVI TăT T M ăĐ U CH NGăI.ăT NGăQUANăTÀIăLI U 1.1 N mămen Yarrowia lipolytica .4 1.2.ăCh tăth măt ălipit .7 1.2.1 VƠiănétăv ăcácăch tăth mădùngătrongăcôngănghi păth căph m 1.2.2.ăCh tăth mă-decalactone 1.2.3.ăCácăconăđ ngăt oăthƠnhăch tăth măγ-decalactoneă ăviăsinhăv t .10 1.3.ăChuy năhóaăsinhăh căaxităricinoleicăthƠnhăch tăth măγ- decalactoneăb ngă cácăch ngăn mămenăchuy năhóaăch tăbéo .12 1.3.1.ăNgu năc ăch t .12 1.3.2.ăCácăch ngăn mămenăcóăkh ănĕngăchuy năhóa axităricinoleicăthƠnhăch tă th măγ- decalactone 14 1.4.ă ngăd ngăc aăn mămenăchuy năhóaăch tăbéo .14 1.5.ăCácăy uăt ă nhăh ngăđ năchuy năhóaăsinhăh căaxităricinoleicăthƠnhăch tă th măγ- decalactone b ngăn mămen 17 1.6.ăTìnhăhìnhănghiênăc u vƠăs năxu tă- decalactone ngoƠiăn CH NGă2:ăNGUYểNăLI UăVÀăPH c 18 NGăPHỄP 21 2.1.ăNguyênăli u,ăhóaăch t,ăthi t b ,ăd ngăc ăvƠămôiătr ngănghiênăc u 21 2.1.1 Viăsinhăv t 21 2.1.2 Hóaăch t 21 2.1.3.ăThi tăb 21 2.1.4.ăMôiătr ngă 23 Chuyên ngành Vi sinh vật học Footer Page of 148 Khóa 2011-2013 Header Page of 148 Luận văn thạc sĩ khoa học 2.2.ăPh Nguyễn Xuân Việt ngăăpháp 23 2.2.1.ăNhơnăgi ngăvƠălênămenătrênămáyăl c .23 2.2.2.ăLênămenătheoăm ătrênăn i 5L 24 2.2.3.ăLênămenătheoăm ă- cóăti păd n c ăch t, n i 5L .24 2.2.4.ăLênămenătheoăm ătrênăn i 50L 25 2.2.5.ăLênămenătheoăm ăcóă- ti păd n c ăch t,ătrênăn i 50L 25 2.2.6.ăĐ măs ăl ngăt ăbƠoăb ngăbu ngăđ măh ngăc u 25 2.2.7 Lactone hóa d ch sau lên men 26 2.2.8.ăCh ngăc tăd chălênămenăđưăđ călactoneăhóa 26 2.2.9 Tách chi t -decalactone b ng dung môi .26 2.2.10.ăLo iăb ădungămôiăkh iăd chăchi t 26 2.2.11ăLƠmăs chăd chăchi tăcôăđặc 27 2.2.11.1ăLƠmăs chăd chăchi tăcôăđặcăb ngăcáchăr aăki m 27 2.2.11.2ăăLƠmăs chăd chăchi tăcôăđặcăb ngăNa2SO4 khan .27 2.2.12.ăĐánhăgiáăc măquan 27 2.2.13 Phơnătíchăđ nhăl CH ngă-decalactone b ng s c ký khí 27 NGă3:ăK TăQU ăVÀ BÀNăLU N 30 3.1 L aăch năđi uăki nălênămenătrênămáyăl c 30 3.1.1.ăL aăch năt căđ ăl c 30 3.1.2.ăL aăch năpHămôiătr ngălênămen 30 3.1.3.ăL aăch năth iăgianănhơnăgi ng 31 3.1.4.ăL aăch nătỷăl ăc yăgi ng 32 3.1.5.ăL aăch năth iăgianălênămen 33 3.1.6.ă ngăd ngăph 3.2.ăNghiênăc uăcácăph ngăphápălênămenăti păd năc ăch tă(fed-culture) 33 ngăth călênămenă ăquyămôă5LăvƠă50L 35 3.2.1.ăLênămenă ăquyămôă5L 35 3.2.2.ăLênămenă ăquyămôăpilotătrênăn iădungătíchă50ălít 40 3.2.3.ăSoăsánhătómăt tăcácăph ngăth călênămenă ăquyămôă5LăvƠă50L 43 3.3.ăL aăch năđi uăki năchi tărútăvƠăthuănh năγ-decalactone t ăd chălênămen 44 Chuyên ngành Vi sinh vật học Footer Page of 148 Khóa 2011-2013 Header Page of 148 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt 3.3.1.ăL aăch năđi uăki năchi tărút γ-decalactone 44 3.3.2 L aăch năđi uăki năthuănh năvƠălƠmăs chăγ-decalactoneăt ăd chălênămen49 K TăLU N 55 TÀIăLI UăTHAMăKH O 57 Chuyên ngành Vi sinh vật học Footer Page of 148 Khóa 2011-2013 Header Page of 148 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt DANHăM CăHỊNHăV Hình 1.1 Tế bào Yarrowia lipolytica sinh trư ng môi trư ng chứa methy ricinoleate Hình 1.2: Sơ đồ chế chuyển hóa axit ricinoleic thành ch t thơm -decalactone 11 Hình 1.3: Một số hình nh thầu dầu (Ricinus communis) 12 Hình 1.4 Công thức c u t o c a axit ricinoleic (12 hydroxy-9-octadecenoic acid) 13 Hình 3.1 Động học trình lên men theo phương thức batch culture, không khống chế pH DO nồi lên men dung tích 5L 36 Hình 3.2 Động học trình lên men theo phương thức batch culture, không khống chế pH có khống chế DO (A), có khống chế pH DO (B) quy mô 5L .38 Hình 3.3 Động học trình lên men theo phương thức Fed-batch culture, có khống chế pH DO, quy mô 5L 39 Hình 3.4 Động học trình lên men quy mô 50L, theo phương thức Batch culture (A) Fed-batch culture (B) 42 Hình 3.5 Sắc kỦ đồ -decalactone thu nhận từ dịch lên men ch ng Y lipolytica VTP (A), sau làm s ch phương pháp “Chiết rút-làm s ch” (B), phương pháp “Chưng c t-chiết rút-làm s ch” (C), -decalactone cô đặc (D) 53 Chuyên ngành Vi sinh vật học Footer Page of 148 Khóa 2011-2013 Header Page of 148 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt DANHăM CăB NG B ngă1.1.ăThành phần axít hữu dầu thầu dầu .13 B ng 1.2 Một số vi sinh vật có kh chuyển hóa dầu thầu dầu thành ch t thơm - decalactone 14 B ngă2.1 Các hoá ch t sử d ng 21 B ngă2.2ăThiết bị nghiên cứu 22 B ngă3.1.ă nh hư ng c a tốc độ lắc đến hiệu su t lên men 30 B ngă3.2.ă nh hư ng c a pH môi trư ng đến hiệu su t lên men 31 B ngă3.3.ăSự biến đổi mật độ tế bào theo th i gian nhân giống .32 B ngă3.4.ă nh hư ng c a tỷ lệ c y giống đến hiệu su t lên men máy lắc 32 B ngă3.5.ă nh hư ng c a th i gian lên men đến hiệu su t tổng hợp -decalactone c a ch ng Y lipolytica VTP5 .33 B ngă3.6.ă nh hư ng c a hàm lượng dầu thầu dầu sử d ng ban đầu đến hiệu su t tổng hợp -decalactone c a ch ng Y lipolytica VTP5 .34 B ngă3.7.ăTổng hợp kết qu lựa chọn điều kiện lên men sinh -decalactone nh Y lipolytica VTP5 quy mô máy lắc 34 B ngă3.8.ăSo sánh kết qu lên men theo phương thức, thiết bị dung tích 5L 39 B ngă3.9ăSo sánh lượng -decalactone cực đ i th i gian đ t được, quy mô 5L 50L 43 B ngă3.10.ăLựa chọn dung môi tách chiết -decalactone từ dịch lên men……… 45 B ngă3.11 Lựa chọn điều kiện lactone hóa để thu nhận -decalactone từ dịch lên men 46 B ngă 3.12.ă nh hư ng c a tốc độ khu y th i gian chiết rút đến hiệu su t thu nhận -decalactone từ dịch lên men 47 B ngă 3.13.ă nh hư ng c a tỷ lệ dung môi sử d ng đến hiệu su t chiết rút decalactone từ dịch lên men 48 B ngă3.14.ă nh hư ng c a số lần chiết rút đến hiệu su t chiết rút -decalactone từ dịch lên men 48 B ngă 3.15.ă Hiệu su t thu nhận -decalactone từ dịch lên men theo phương pháp “chiết rút - làm s ch” 50 B ngă 3.16.ă Hiệu su t thu nhận -decalactone từ dịch lên men theo phương pháp “chưng c t - chiết rút- làm s ch” .50 Chuyên ngành Vi sinh vật học Footer Page of 148 Khóa 2011-2013 Header Page of 148 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt DANHăM CăCH ăVI TăT T Aox Acyl-coA oxydase ATP Adenosin triphosphat CoA Coenzyme A Cs Cộng FDA Food and drug administration GC Gas chromatography (Sắc kỦ khí) Mb Megabase POX Peroxisomal acyl-CoA oxidase v/p Vòng/phút Y- VTP5 Yarrowia lipolytica-VTP5 YM Yeast Maltose Y- MTLY36-2P Yarrowia lipolytica- MTLY36-2P DO Dessolved Oxygen (Hàm lượng ôxy hòa tan) YMA Yeast Maltose Agar S cerevisiae Saccharomyces cerevisiae DE Diethyl ether U Unit L Lít Chuyên ngành Vi sinh vật học Footer Page of 148 Khóa 2011-2013 Header Page 10 of 148 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt M ăĐ U Con ngư i biết đến ch t thơm sử d ng chúng từ hàng nghìn năm Nó làm tăng ch t lượng c a nhiều s n phẩm, đặc biệt thực phẩm Khi đ i sống ngày phát triển, xã hội văn minh ch t thơm s n xu t sử d ng ngày đa d ng phong phú c số lượng lẫn ch t lượng Hiện nay, ngành công nghiệp chế biến thực phẩm có nhu cầu r t lớn ch t ph gia t o hương Hương t o nên giá trị c m quan hương vi đặc trưng cho thực phẩm Trong trình chế biến thực phẩm, c u tử hương nguyên liệu ban đầu dần m t đi, điều bắt buộc nhà công nghệ ph i nghĩ tới phương án thêm ch t ph gia t o hương Mặt khác, s n phẩm thực phẩm pha chế (nước ngọt, rượu mùi, sữa chua ) cần có mặt c a ch t t o hương Ngoài công nghiệp thực phẩm ra, ngành khác có nhu cầu sử d ng ch t ph gia t o hương, là: công nghiệp mỹ phẩm, ch t ph gia để s n xu t nước hoa, ph n son, kem xoa; công nghiệp dược cần thêm ch t t o hương vào thuốc, đặc biệt lo i thuốc cho trẻ em để làm át hương vị khó chịu c a thuốc làm cho thuốc dễ uống hơn; việc s n xu t hàng tiêu dùng kem đánh răng, xà phòng thơm, nước gội đầu, vv cần bổ xung ch t ph gia t o hương Trong số c u tử t o hương este, andehyde, lactone, alcohol lactone hợp ch t phổ biến c u tử hương thơm số lo i hoa qu , th o mộc đào, mận, dừa, dâu tây Trong lactone -decalactone (C10H18O2) có giá trị nh t, nghiên cứu nhiều nh t Ch t tồn t i tự nhiên mức độ vi lượng, song thành phần ch đ o t o nên hương thơm cho nhiều lo i qu - decalacton tổng hợp đư ng sinh tổng hợp từ dầu thực vật nh trình chuyển hoá c a vi sinh vật Trong lo i dầu thực vật, dầu thầu dầu (castor oil), lo i nguyên liệu phù hợp cho trình tổng hợp -decalactone Quá trình thuỷ phân dầu thầu dầu t o axit ricinoleic, “cơ ch t” để số n m men chuyển hóa thành ch t thơm, nh trình -oxi hóa Chuyên ngành Vi sinh vật học Footer Page 10 of 148 Khóa 2011-2013 Header Page 56 of 148 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt 3.3.1.3 Lựa chọn tốc độ khuấy thời gian chiết rút γ-decalactone B ng γ.1β cho th y kết qu c a thí nghiệm sau: - Tốc độ khu y thích hợp để chiết rút -decalactone từ dịch lên men dung môi diethyl ether 100 vòng/phút Nếu tăng tốc độ khu y đến 150 – 200 vòng/phút lượng -decalactone tách chiết gi m dần Do dùng tốc độ khu y 100 vòng/phút để nghiên cứu lựa chọn th i gian chiết rút thích hợp - Th i gian chiết rút từ 10 đến 25 phút không nh hư ng nhiều đến hiệu su t chiết rút -decalactone trư ng hợp c a tốc độ khu y Tuy nhiên, diethyl ether có nhiệt độ bay th p (35oC) nên kéo dài th i gian chiết rút dung môi bị hao h t, nh hư ng đến hiệu su t thu nhận -decalactone dung môi Vì theo chúng tôi, th i gian chiết rút tốt nh t từ 10 đến 15 phút B ngă3.12 nh hư ng c a tốc độ khu y th i gian chiết rút đến hiệu su t thu nhận -decalactone từ dịch lên men Ch ătiêu Tốc độ khu y (Th i gian chiết rút phút) Th i gian chiết rút (Khu y 100 vòng/phút) Thôngăs L ng γ-decalactone (g/L) 50 vòng/phút 1,545 ± 0,36 100 vòng/phút 1,774 ± 0,022 150 vòng/phút 1,530 ± 0,014 200 vòng/phút 1,305 ± 0,018 phút 1,774± 0,037 10 phút 2,243 ± 0,034 15 phút 2,258 ± 0,027 20 phút 2,099 ± 0,039 25 phút 2,022 ± 0,045 3.3.1.4 Lựa chọn tỷ lệ dung môi chiết rút Kết qu trình bày b ng 3.13 cho th y tỷ lệ dung môi/dịch lên men (v/v) thích hợp để chiết rút -decalactone 0,5/1 Khi tăng tỷ lệ dung môi, tổng lượng -decalactone chiết rút từ dịch lên men có tăng lên, lượng dung môi tiêu tốn tăng theo Nếu coi hiệu su t chiết rút theo tỷ lệ dung môi tương đương với thể tích dịch lên men (tỷ lệ 1/1) 100% chiết rút nửa thể tích dung môi (tỷ lệ 0,5/1), hiệu su t thu nhận -decalactone 97,2% Chuyên ngành Vi sinh vật học Footer Page 56 of 148 47 Khóa 2011-2013 Header Page 57 of 148 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt B ng 3.13 nh hư ng c a tỷ lệ dung môi sử d ng đến hiệu su t chiết rút decalactone từ dịch lên men Tỷăl ădungă môi/d chălênămenăă L ngăădungămôiă chi tărút thuăđ ngăγ- L că T ng l ngăγ- Hi uă decalactone decalactone su tăthuă (v/v) (mL) (mg/mL) (mg) nh n(%) 0,3/1 27 5,392 145,6 ± 0,022 92,0 0,5/1 45 3,417 153,8 ± 0,027 97,2 0,7/1 65 2,386 155,1 ± 0,034 98,0 1/1 94 1,684 158,3 ± 0,021 100 3.3.1.5 Lựa chọn số lần chiết rút -decalactone dịch lên men chiết rút γ lần diethyl ether với tỷ lệ dung môi/dịch lên men tương ứng 0,5/1, 0,3/1 0,3/1, phần dung môi sau lần chiết rút phân tích GC để xác định lượng -decalactone Kết qu trình bày b ng 3.14 cho th y cần chiết rút lần thu nhận 96,5% -decalactone dịch lên men, l i γ,5% chiết rút nốt lần thứ β Như vậy, sử d ng dung môi diethyl ether, với tốc độ khu y 100 v/p, th i gian chiết rút 10 phút, cần chiết rút lần để thu nhận -decalactone từ dịch lên men B ng 3.14 nh hư ng c a số lần chiết rút đến hiệu su t chiết rút -decalactone từ dịch lên men S ăl năchi tărút L ngăγ-decalactone (g/L) Hi uăsu tăthuă nh n (%) Lần 1: tỷ lệ diethyl ether/dịch lên men = 3,417 ± 0,019 96,5 Lần β (tỷ lệ 0,3/1) 0,124 ± 0,011 3,5 Lần γ (tỷ lệ 0,3/1) 0 0,5/1 (v/v) Tổng Chuyên ngành Vi sinh vật học Footer Page 57 of 148 3,541 ± 0,019 48 Khóa 2011-2013 Header Page 58 of 148 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt 3.3.2 L a ch năđi u ki n thu nh n làm s chăγ-decalactone t d ch lên men Thu nhận s n phẩm bước quan trọng khó khăn nh t nhiều trình s n xu t s n phẩm công nghệ sinh học, đặc biệt ch t t o hương thơm, tính ch t dễ bay hòa tan c a chúng Các phương pháp sử d ng công nghệ để chiết rút thu nhận ch t thơm từ môi trư ng lỏng bao gồm: dùng dung môi hữu cơ, chưng c t, phân tách lo i màng chuyên d ng, h p ph cacbon ho t tính [28][37][38] sử d ng lo i nhựa hữu lỗ xốp để chiết rút ch t hương thơm, tính ch t kị nước tự nhiên diện tích bề mặt lớn c a chúng [8] Do điều kiện thực tế t i nơi thực tập, sau nghiên cứu lựa chọn điều kiện lactone hóa chiết rút -decalactone từ dịch lên men, tiến hành kh o sát điều kiện thu nhận làm s ch -decalactone theo hai phương pháp: (i) “chiết rút - làm s ch”, (ii) “ chưng c t - chiết rút - làm s ch” Sự khác b n β phương pháp chỗ: theo phương pháp thứ hai, việc chưng c t lo i bỏ số hợp phần khó/ không bay dịch sau lên men, mà phương pháp thứ nh t Trong lo i thực nghiệm này, mẫu nghiên cứu thực với lượng mẫu 1000 mL dịch lên men/lần 3.3.2.1 Thu nhận làm γ-decalactone theo phương pháp “chiết rút – làm sạch” B ng 3.15 trình bày hiệu su t thu nhận -decalactone từ dịch lên men sau công đo n chiết rút, làm s ch thu nhận Kết qu thu cho th y: - Hiệu su t thu nhận -decalactone theo phương pháp này, sau qua t t c công đo n, đ t 50,1% -decalactone thu theo cách có độ s ch sắc ký 99,43% (hình 3.5 B) - Hiệu su t thu nhận -decalactone phần nước sau rửa kiềm lần lần β r t th p, (2,4 2,9% theo thứ tự) Vì vậy, thực chiết rút thu nhận -decalactone từ dịch lên men decalactone pha nước sau rửa kiềm Chuyên ngành Vi sinh vật học Footer Page 58 of 148 quy mô lớn, không cần bước thu nhận - 49 Khóa 2011-2013 Header Page 59 of 148 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt B ngă3.15 Hiệu su t thu nhận -decalactone từ dịch lên men theo phương pháp “chiết rút - làm s ch” L Tênăm u ngă L ng γ- T ngăL ng Hi uă dung môi decalactone γ-decalactone su tă chi tăthuă (mg/mL) (mg) thu đ că(mL) nh n (%) 1000 mL dịch lên men, axit hóa đến pH = β, chiết rút 445 4,526 2014,1 ± 0,41 100 410 3,645 1494,5 ± 0.35 74,2 210 0,230 48,3 ± 0.16 2,4 370 3,691 1365,7 ± 0,47 67,8 195 0,299 58,3 ± 0,22 2,9 6,0 206,080 1236,5 ± 0,38 50,1 diethyl ether (tỷ lệ dung môi/dịch lên men =0,5/1), thu pha dung môi Rửa kiềm lần (NaOH 0,1N, pH=1β, tỷ lệ 1: 1) - Thu phần dung môi (a) - Phần nước chứa cặn,chỉnh pH đến 2, chiết rút DE (0,5/1), thu phần dung môi Rửa kiềm lần β phần dung môi (a) (NaOH 0,1N, pH=1β, tỷ lệ 1:1) - Thu phần dung môi (b) - Pha nước chứa cặn, chỉnh pH đến 2, chiết rút DE (0,5/1), thu phần dung môi Phần dung môi (b) cô chân không để đuổi DE 35oC Bổ sung ethanol (99,5%) cô chân không, để đuổi hết DE nhiệt độ 55oC Thu dịch -decalactone cô đặc Chuyên ngành Vi sinh vật học Footer Page 59 of 148 50 Khóa 2011-2013 Header Page 60 of 148 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt 3.3.2.2 Thu nhận γ-decalactone theo phương pháp “Chưng cất - chiết rút làm sạch” Theo phương thức này, dịch lên men, sau axit hóa đến pH = β, chưng c t thiết bị chưng c t cồn, quy mô phòng thí nghiệm, thiết bị chưng c t nước Clevenger Kết qu trình bày b ng γ.16 cho th y hiệu su t thu nhận -decalactone theo phương pháp “Chưng c t – chiết rút” r t th p, đ t γ5,4 %, với độ s ch sắc kỦ 99,43% (Hình 3.5 C) B ng 3.16 Hiệu su t thu nhận -decalactone từ dịch lên men theo phương pháp “chưng c t- chiết rút” L Tênăm u ngă L ng γ- T ngăl ng γ- Hi uă dung decalactone decalactone su tă môi (mg/mL) (mg) thu chi tăthuă đ nh n că (%) (mL) Dịch lên men chiết rút diethyl ether sau axit hóa đến 4,166 4166,0 ± 0,39 100 400 7,894 3157,6 ± 0,31 75,8 6,0 204,322 1225,9 ± 0,45 29,4 pH=2 Sử dụng thiết bị chưng cất cồn 1000 mL dịch lên men pH=β, chưng c t 100oC; Thu 800 ml dịch ngưng t , chiết rút DE (0,5/1) Thu pha dung môi chiết Cô chân không đuổi dung môi DE nhiệt độ γ5oC (760 mmHg); bổ sung ethanol (99,5%) cô chân không đuổi hết dung môi DE nhiệt độ o 55 C (350 mmHg) Chưng cất thiết bị Clevenger 1000 mL dịch lên men, pH=2, chưng c t 100oC, thu nhận: Chuyên ngành Vi sinh vật học Footer Page 60 of 148 51 Khóa 2011-2013 Header Page 61 of 148 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt - -decalactone không tan 4,0 203,16 812,6 ± 0,34 4,0 165,633 662,5 ± 0,29 nước - 800 ml dịch ngưng t , chiết rút DE (0,5/1) Thu pha dung môi chiết Cô chân không đuổi dung môi DE γ5oC (760 mmHg); bổ sung ethanol (99,5%) cô chân không đuổi hết dung môi DE 55oC (350 mmHg) Tổng 1475,1 35,4 Hiệu su t thu nhận -decalactone từ dịch lên men nghiên cứu c a chúng tôi, c β phương pháp th p so với c a Alchihab cộng (β010): Khi sử d ng nhựa MN-β0β để h p ph -decalactone từ dịch lên men thiết bị dung tích 100 lít ch ng n m men ưa l nh Rh aurantiaca A19 sau ph n h p ph ethanol, hiệu su t thu nhận -decalactone sau cô kiệt đuổi dung môi đ t 56% [8] Chuyên ngành Vi sinh vật học Footer Page 61 of 148 52 Khóa 2011-2013 Header Page 62 of 148 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt (A) (B) Chuyên ngành Vi sinh vật học Footer Page 62 of 148 53 Khóa 2011-2013 Header Page 63 of 148 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt (C) (D) Hình 3.5 Sắc kỦ đồ -decalactone thu nhận từ dịch lên men ch ng Y lipolytica VTP (A), sau làm s ch phương pháp “Chiết rút-làm s ch” (B), phương pháp “Chưng c t-chiết rút-làm s ch” (C), -decalactone cô đặc (D) Chuyên ngành Vi sinh vật học Footer Page 63 of 148 54 Khóa 2011-2013 Header Page 64 of 148 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt K TăLU N Các điều kiện lên men thích hợp để chuyển hóa dầu thầu dầu thành decalactone nh ch ng n m men Y lipolytica VTP5 sau: a) Trên máy lắc, giá trị pH 6,0; tốc độ lắc β00 v/p; tuổi giống gi tỉ lệ giống 10% (v/v, mật độ giống = 6.5x106 tế bào/mL); th i gian thích hợp ngày b) Trên nồi lên men 5L, so sánh lên men theo mẻ theo mẻ có tiếp dần ch t, (khống chế pH, DO) phương thức thứ hai cho lượng - decalactone cao nh t, đ t 7,γ4γ g/L c) Trên nồi lên men 50L, lên men theo mẻ có tiếp dần ch t, không khống chế pH DO, lượng -decalactone đ t 8,10 g/L d) So sánh ba quy mô lên men cho th y xu t thu nhận -decalactone sau: 50L > 5L, 5L > máy lắc Các điều kiện thích hợp để thu nhận s n phẩm từ dịch lên men ch ng Y lipolytica VTP5 sau: - Dung môi diethyl ether, lactone hóa t i pH β có gia nhiệt 90oC/10 phút - Tốc độ chiết rút 100 v/p - Tỉ lệ dung môi/ dịch lên men 0,5/1, số lần chiết rút So sánh hai phương pháp thu nhận -decalactone (“chiết rút – làm s ch” “chưng c t - chiết rút” ) cho th y: - Hiệu su t thu nhận c hai phương pháp th p (29,4% 35,4%) ch t thơm thu có độ tinh s ch cao (99,43%) Chuyên ngành Vi sinh vật học Footer Page 64 of 148 55 Khóa 2011-2013 Header Page 65 of 148 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt KI NăNGH Về trình lên men - Tiếp t c lên men chuyển hóa dầu thầu dầu thành -decalactone ch ng Y lipolytica VTP nồi lên men 50L lớn mà có kh khống chế pH DO Về dung môi - Cần nghiên cứu thêm dung môi có kh chiết rút nhiều lượng decalactone dung môi dùng - Cần nghiên cứu thêm phương pháp thu nhận s n phẩm cách chiết nh hai hay nhiều nhóm dung môi khác Chuyên ngành Vi sinh vật học Footer Page 65 of 148 56 Khóa 2011-2013 Header Page 66 of 148 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt TÀIăLI UăTHAMăKH O Tiếng Việt L i Thị Ngọc Hà (β00γ), “ Một số yếu tố nh hư ng đến kh sinh tổng hợp -decalactone c a ch ng n m men Yarrowica lipolytica Wβ9”, Tạp chí khoa học kỹ thuật Nông nghiệp, tr 222 – 226 Đặng Thị Thu, Cơ sở công nghệ sinh học tập 2, Công nghệ hóa sinh, Nhà xu t b n Giáo d c Việt Nam Vũ Nguyên Thành (β00γ), Báo cáo tổng kết nhiệm vụ thường xuyên “ B o tồn, lưu giữ nguồn gen vi sinh vật công nghiệp thực phẩm β00γ”, Viện Công nghiệp Thực phẩm Bùi Quang Thuật Kula J ( β006), “ Tổng hợp hợp ch t thơm ch t ho t động sinh học từ dầu thầu dầu”, Tuyển tập công trình nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học – công nghiệp thực phẩm giai đoạn 2001 – 2005, Nhà xu t b n Lao động xã hội, tr 377 – 383 Internet https://www.google.com.vn/search?q=Ricinus+communis&newwindow Tiếng Anh Aguedo M, Gomes N, Escamilla García E, Waché Y, Mota M, Teixeira J.A & Belo I (2005), “Decalactone production by Yarrowia lipolytica under increased O2 transfer rates”, Biotechnology Lett, 27(20), pp 1617-1621 Aguedo M, Ly MH, Belo I, Teixeira JA, Belin JM, Waché Y (2004), “The use of enzymes and microorganisms for the production of aroma compounds from lipits”, Food Technology and Biotechnology, 42(4), pp 327-336 Alchihab M, Destain J, Aguedo M, Wathelet JP, Thonart P (2010), “The utilization of gum Tragacanth to improve the growth of Rhodotorula aurantiaca and the production of -decalactone in large scale”, Appl Biochem, 62(1), pp 233-241 Barnett JA (2003), “Beginnings of microbiology and biochemistry: the contribution of yeast research”, Microbiology (Reading, Engl.), pp 557-567 Chuyên ngành Vi sinh vật học Footer Page 66 of 148 57 Khóa 2011-2013 Header Page 67 of 148 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt 10 Barth G, Gaillardin C (1997), “Physiology and genetics of the dimorphic fungus Yarrowia lipolytica”, FEMS Microbiology Reviews, 19, pp 219-237 11 Beoloupos A, Mrozova Z, Thevennieau F, Le Dall MT, Hapala I, Papanikolaou S, Chardot T, Nicaud JM (β008), “Control of lipid accumulation in the yeast Yarrowia lipolytica”, Applied and Environmental Microbiology, 74(24), pp 77797789 12 Berger R.G (1986), “Biosynthesis of Flavor Compounds by Microorganisms Odorous Constituents of Polyporus durus”, (Basidiomycetes), Volume 41, Section C, A European journal of biosciences, pp 559-563 13 Boog ALGM, Peters ALJ, Ross R (1998), “Process for producing - decalactone”, Unite States patent 5.789.212 14 Chanika S, Benjamas C, thanwadde T.S and Thanwien B (2011), “Efficicient concomitant production of lipids and carotenoids by oleaginous red yeast Rhodotorula glutinis culture in palm oil mill effuluent and application of lipids for biodiesel production”, Biotechnology and Bioprocess Engineering, 16(1), pp 23-33 15 Cheetham P.S.J., Maume K.A, De Rooij J.F.M (199γ), “Method of producing gamma hydroxydecanoic acid or its lactone by feeding a ricinoleic acid source to Sporobolomyces odrus or Rhodotorula glutinis”, United States Patent 5.219.742 16 Coelho M.A.Z, Amaral P.F.F and Belo I (β010), “Yarrowia lipolytica : an industrial work horse”, Current Research, Technology and Education Topic in Applied Microbiology and Microbial Biotechnology, Vol 2, pp 930-944 17 Farbood MI, Willis BJ (1985), “Production of -decalactone”, Unite States Patent 4.560.656 18 Fickers, P., Benetti, P.H., Wache, Y., Marty, A., Mauersberger, S., Smit, M.S and Gerold Barth, Claude Gaillardin, (1996), “Physiology and genetics of the dimorphic fungus Yarrowia lipolytica” 19 Gatfield, I.-L (1999), “Biotechnological production of natural flavor materials”, In Flavor Chemistry: 30 Years of Progress ed, Teranishi, R., Wick, E.L and Hornstein, I., pp 211–227 New York: Kluwer Academic, Plenum Publishers Chuyên ngành Vi sinh vật học Footer Page 67 of 148 58 Khóa 2011-2013 Header Page 68 of 148 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt 20 Gatfield, I.-L., Gu¨ntert, M., Sommer, H., and Werkhoff, P.(1993), “Some aspects of the microbiological production offlavor-active lactones with particular reference to -decalactone”, Chem Microbiol Technol Lebensm, 15, pp 165–170 21 Gill C.O, Haill M.G, and Ratledge C (1977), “Lipid accumulation in an oleaginous yeast (Candida 107) growing on glucose in single – stage continous culture”, Appl Environ Microbiol 1977 February, 33(2), pp 231-239 22 Gomes N, Teixeira JA, Belo I (2012), “Fed-batch culture of Yarrowia lipolytica for -decalactone production from methyl ricinolate”, Biotechnol Lett, 34, pp 649654 23 Gopinath M, Vijayakumar L, Dhannasekar R, Viruthagiri T (β008), “Microbial biosynthetic of -decalactone and its applications”, Global Journal of Biotechnology, Biochemistry, 3(2), pp 60-68 24 Groguenin, A., Wache ´, Y., Escamilla Garcı´a, E., Aguedo, M., Husson, F., Ledall, M.-T., Nicaud, J.-M., and Belin, J.-M (2004), “Genetic engineering of oxidation pathway in the yeast Yarrowia lipolytica to increase the production of aroma compounds”, J Molec Catal B, 28, pp 75–79 25 Le Clainche A (1997), “Maîtrise de la production de -lactone par la levure Yarrowia lipolytica : mise en évidence de l’existence d’une famille multigénitique d’acyl-CoA oxydases” 26 Li Y, Zongbao Z, and Fengwu B (2007), “High density cultivation of oaleagious yeast Rhodosparidrum toruloides Y4 in fed-batch culture”, Enzyme and and Microbial Technology, 41(3), pp 312-317 27 Martina Carnecka, Andrea Halienova, Radka Koci, “Production of carotenoidergosterol-supplemented biomass by red yeast Rhodotorula glutinis grown under external stress”, Food Technology and Biotechology, Vol 48 (1) 28 Mediaros ABP, Pandey A, Vandenberghe LPS, Pastore GM, Soccd CR (2006), “Prodution and recovery of aroma compounds produced by solid-state fermentation using different adsorbents”, Food technol Biotechnol, 44, pp 47-51 Chuyên ngành Vi sinh vật học Footer Page 68 of 148 59 Khóa 2011-2013 Header Page 69 of 148 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt 29 Moradi H, Asadllahi MA, Nahvi I (2013), “Improved -decalactone production from castor oil by fed-batch culture cultivation of Yarrowia lipolytica”, Biocatalysis and Agriculture Biotechnology, 2, pp 64-68 30 Nadal M, García-Pedrajas MD, Gold SE (2008), “Dimorphism in fungal plant pathogens”, FEMS Microbiol Lett, 284, pp 127–134 31 Pagot Y, Le Clainche A, Nicaud JM, Waché Y, Belin JM (1998), “Peroxisomal -oxidation activities and -decalactone production by the yeast Yarrowia lipolytica”, Appl Microbiol Biotechnol , 49, pp 295-300 32 Papaparaskevas D, Christakopoulos P, Kelos D, Macris BJ (1992), “Optimizing production of extracellular lipase from Rhodotorula glutinis”, Biotechnology Lett, 14, pp 397-402 33 Rabenhorst J, Gatfield I (β00β), “Method of producing -decalactone using Yarrowia lipolytica strain HR 145 (DSM 1βγ97)”, Unite States Patent 6.415.565 34 Rabenhorst J, Gatfield I (2012), “Method of producing -decalactone using Yarrowia lipolytica strain HR 124 (DSM 12397)”, Unite States patent N0 6451565 B1 35 Rodrigues G, Pais C (2007), “The influence of acetic and other weak carboxylic acids on growth and cellular death of the yeast Yarrowia lipolytica”, Food Technology and Biotechnology, 38, pp 27-32 36 Ruiz-Herrera J, Sentandreu R (2002), “Different effectors of dimorphism in Yarrowia lipolytica”, Arch Microbiol, 178, pp 477–483 37 Souchon I, Spinnler HE, Dufoss L,Voilleg A (1998), “Trapping of - decalactone by adsorption on hydrophobic sorbents: application to the bioconversion of methyl ricinoleate by the yeast”, Sporidiobolus salmonicolor Biotechnol tech, 12, pp 109-113 38 Suryadi I, Suresh B (2000), “Adsorption of flavor ester on granular activated carbon”, CanjChem Eng, 78, pp 892-901 39 Waché Y et al., (2001), “Role of -oxidation enzymes in -decalactone production by the yeast Yarrowia lipolytica”, Appl Environ Microbiol., 67(12), pp 5700-5704 Chuyên ngành Vi sinh vật học Footer Page 69 of 148 60 Khóa 2011-2013 Header Page 70 of 148 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt 40 Waché Y et al., (2002),“Optimization of Yarrowia lipolytica 's -oxidation pathway for -decalactone production”, J Mol Catal B: Enzym , pp 347-351 41 Waché Y, Aguedo M, Nicaud JM, Belin JM (2003), “Catabolism of hydroxyacids and biotechnological production of lactones by Yarrowia lipolytica”, Applied Microbiology and Biotechnology, 61, pp 393-600 Chuyên ngành Vi sinh vật học Footer Page 70 of 148 61 Khóa 2011-2013 ... a.Cây thầu dầu b.Qu thầu dầu c .Dầu thầu dầu Hình 1.3 Một số hình nh thầu dầu [5] H t thầu dầu chứa kho ng 50-60% dầu Dầu thầu dầu ch t lỏng sền sệt, không màu vàng, mùi vị nh t Dầu thầu dầu chứa... môi trường nghiên cứu 2.1.1 Vi sinh v t Trong nghiên cứu này, ch ng n m men Yarrowia lipolytica VTP-5 dùng để chuyển hóa dầu thầu dầu thành - decalactone Đây ch ng n m men chuyển hóa ch t béo... decalactone dầu thầu dầu Cây, qu dầu thầu dầu thương phẩm minh họa hình 1.3 a b Dầu thầu dầu có tên thương phẩm tiếng Anh castor oil (hình 1.3 c), tách từ h t thầu dầu (Ricinus communis) thu c họ Thầu dầu
- Xem thêm -

Xem thêm: Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy, chuyển hóa sinh học và thu nhận γ-decalactone từ dầu thầu dầu bằng nấm men Yarrowia lipolytica, Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy, chuyển hóa sinh học và thu nhận γ-decalactone từ dầu thầu dầu bằng nấm men Yarrowia lipolytica, Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy, chuyển hóa sinh học và thu nhận γ-decalactone từ dầu thầu dầu bằng nấm men Yarrowia lipolytica

Từ khóa liên quan

Mục lục

Xem thêm

Gợi ý tài liệu liên quan cho bạn

Nhận lời giải ngay chưa đến 10 phút Đăng bài tập ngay