ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN KHẮC SINH NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT SAPONIN CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ TỪ HẢI SÂM CERCODEMAS ANCEPS Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm Mã số: 60.42.0114 CÁN BỘ HƢỚNG DẪN: TS NGUYỄN XUÂN CƯỜNG PGS TS HOÀNG THỊ MỸ NHUNG HÀ NỘI, 2016 MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chƣơng – TỔNG QUAN 1.1 Saponin .9 1.1.1 1.1.2 1.1.3 1.2 Saponin khả kháng u Cơ chế kháng u số saponin 10 Mối liên quan cấu trúc chức kháng u saponin 1.2.1 1.2.2 1.3 13 Saponin từ hải sâm 13 Hải sâm 13 Nguồn saponin từ hải sâm 14 Một số phƣơng pháp phân lập xác định cấu trúc hợp chất hóa học 15 1.3.1 Sắc ký cột 15 1.3.2 Sắc kí lớp mỏng 16 1.3.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR) 16 1.3.3.1 Phổ 1H-NMR 16 1.3.3.2 Phổ 13C-NMR 16 1.3.3.3 Phổ DEPT (Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer) 17 1.3.3.4 Phổ 2D-NMR 17 1.4 Ung thƣ .18 19 1.5 Các mô hình sàng lọc thuốc chống ung thƣ Error! Bookmark not defined 1.5.1 1.5.2 1.5.3 Mô hình nuôi cấy đơn lớp tế bào Error! Bookmark not defined Mô hình nuôi cấy khối cầu đa bào Error! Bookmark not defined Mô hình động vật thí nghiệm Error! Bookmark not defined Chƣơng – ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Error! Bookmark not defined 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.1.1 2.1.2 2.1.3 2.1.4 2.1.5 2.1.6 2.2 2.2.1 2.2.2 2.2.3 2.3 Loài hải sâm Cercodemas anceps Error! Bookmark not defined Mẫu chế phẩm sinh học Error! Bookmark not defined Dòng tế bào ung thư mô liên kết Sarcoma-180 Error! Bookmark not defined Dòng tế bào ung thư vú MCF7 Error! Bookmark not defined Dòng tế bào ung thư biểu mô ruột kết HCT116 Error! Bookmark not defined Chuột nhắt trắng Swiss Error! Bookmark not defined Hoá chất, thiết bị Error! Bookmark not defined Hoá chất Error! Bookmark not defined Thiết bị Error! Bookmark not defined Dụng cụ vật tư tiêu hao Error! Bookmark not defined Phƣơng pháp nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.3.1 Phân lập hợp chất saponin từ hải sâm Error! Bookmark not defined 2.3.2 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập từ hải sâm Bookmark not defined Error! 2.3.3 Phương pháp thử độc tính tế bào mô hình đơn lớp Error! Bookmark not defined 2.3.4 Phương pháp xác định tế bào apoptosis tác dụng CPSH Error! Bookmark not defined 2.3.5 Phương pháp gây u thực nghiệm cho động vật thí nghiệm Error! Bookmark not defined 2.3.6 Phương pháp thử tác dụng chế phẩm chuột thí nghiệm Error! Bookmark not defined 2.3.7 Các phương pháp đánh giá tác dụng kháng u chế phẩm sinh học Error! Bookmark not defined Chƣơng – KẾT QUẢ Error! Bookmark not defined 3.1 Kết phân lập hợp chất từ hải sâm Cercodemas anceps Error! Bookmark not defined 3.2 Kết xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập đƣợc Error! Bookmark not defined 3.3 Error! Bookmark not defined Kết thử độc tính với tế bào hai chất phân lập Error! Bookmark not defined 3.4 Kết đánh giá tác động CPSH mô hình in vitro in vivo Error! Bookmark not defined KẾT LUẬN Error! Bookmark not defined KIẾN NGHỊ Error! Bookmark not defined TÀI LIỆU THAM KHẢO 20 DANH MỤC HÌNH MINH HỌA Hình 1.1: Các đặc trƣng tế bào ung thƣ 19 Hình 1.2: Quá trình chết theo chƣơng trình (apoptosis) Error! Bookmark not defined Hình 1.3: Sự biểu sớm PS màng tế bào chết theo chƣơng trình Error! Bookmark not defined Hình 1.4: Một số dòng tế bào ung thƣ dạng sống chúng Error! Bookmark not defined Hình 1.5: Cách phân loại 11 lớp hợp chất saponin Error! Bookmark not defined Hình 2.1: Loài hải sâm Cercodemas anceps nghiên cứu Error! Bookmark not defined Hình 2.2: Tế bào ung thƣ mô liên kết Sarcoma-180 nghiên cứu Error! Bookmark not defined Hình 2.3: Tế bào ung thƣ vú MCF7 nghiên cứu Error! Bookmark not defined Hình 2.4: Tế bào ung thƣ biểu mô ruột kết HCT116 nghiên cứu Error! Bookmark not defined Hình 2.5: Chuột nhắt trắng Swiss (Mus musculus) nghiên cứu Error! Bookmark not defined Hình 2.6: Cấu trúc hoá học muối MTS sản phẩm màu Formazan Error! Bookmark not defined Hình 2.7: Tỷ lệ độ hấp thụ ánh sáng 490 nm với số lƣợng tế bào Error! Bookmark not defined Hình 2.8: Bố trí thí nghiệm MTS Error! Bookmark not defined Hình 2.9: Xác định số IC50 Error! Bookmark not defined Hình 2.10: Annexin V gắn màng tế bào chết theo chƣơng trình Error! Bookmark not defined Hình 2.11: Hình ảnh cắt dọc cấu trúc da Error! Bookmark not defined Hình 2.12: Thuốc 6MP (Purinethol hay Mercaptopurine) Error! Bookmark not defined Hình 2.13: Thƣớc kẹp caliper Error! Bookmark not defined Hình 3.1: Phổ 13C-NMR chất Error! Bookmark not defined Hình 3.2: Phổ H-NMR chất Error! Bookmark not defined Hình 3.3: Phổ HSQC chất Error! Bookmark not defined Hình 3.4: Phổ HMBC chất Error! Bookmark not defined Hình 3.5: Phổ COSY chất Error! Bookmark not defined Hình 3.6: Phổ ROESY chất Error! Bookmark not defined Hình 3.7: Cấu trúc hóa học hợp chất – hợp chất colochiroside A Error! Bookmark not defined Hình 3.8: Phổ 13C-NMR chất Error! Bookmark not defined Hình 3.9: Phổ 1H-NMR chất Error! Bookmark not defined Hình 3.10: Phổ HMBC chất Error! Bookmark not defined Hình 3.11: Phổ HSQC chất Error! Bookmark not defined Hình 3.12: Phổ COSY chất Error! Bookmark not defined Hình 3.13: Phổ ROESY chất Error! Bookmark not defined Hình 3.14: Cấu trúc hóa học hợp chất – hợp chất philinopside A Error! Bookmark not defined Hình 3.15: Đƣờng cong đáp ứng liều tế bào HCT116 với hai chất Error! Bookmark not defined Hình 3.16: Đƣờng cong đáp ứng liều tế bào Sar-180 với hai chất Error! Bookmark not defined Hình 3.17: Đƣờng cong đáp ứng liều tế bào MCF7 với hai chất Error! Bookmark not defined Hình 3.18: Đƣờng cong đáp ứng liều Sar.180 (A) MCF7 (B) CPSH Error! Bookmark not defined Hình 3.19: Mẫu ĐC TB Sar.180 với Annecxin V Error! Bookmark not defined Hình 3.20: Mẫu ĐC TB Sar.180 với PI Error! Bookmark not defined Hình 3.21: Mẫu ĐC TB MCF7 với Annecxin V Error! Bookmark not defined Hình 3.22: Mẫu ĐC TB MCF7 với PI Error! Bookmark not defined Hình 3.23: Tế bào Sar.180 nhuộm Annexin V sau ủ với CPSH Error! Bookmark not defined Hình 3.24: Tế bào Sar.180 nhuộm nhân PI sau ủ với CPSH Error! Bookmark not defined Hình 3.25: Tế bào MCF7 nhuộm Annexin V sau ủ với CPSH Error! Bookmark not defined Hình 3.26: Tế bào MCF7 nhuộm nhân PI sau ủ với CPSH Error! Bookmark not defined Hình 3.27: U thực nghiệm dƣới da số chuột thí nghiệm Error! Bookmark not defined Hình 3.34: Đồ thị biểu diễn tăng trọng lƣợng lô ung thƣ trình thí nghiệm Error! Bookmark not defined Hình 3.29: Hình ảnh khối u chuột lô thí nghiệm vào ngày thứ 32 sau cấy u Error! Bookmark not defined Hình 3.30: Đồ thị tăng trƣởng kích thƣớc trung bình u rắn lô thí nghiệm Error! Bookmark not defined DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Hóa chất sử dụng thí nghiệm Error! Bookmark not defined Bảng 2.2: Thiết bị sử dụng thí nghiệm Error! Bookmark not defined Bảng 2.3: Dụng cụ vật tƣ dùng thí nghiệm Error! Bookmark not defined Bảng 2.4: Dải nồng độ thuốc sử dụng thí nghiệm MTS Error! Bookmark not defined Bảng 2.5: Quy trình tiến hành thí nghiệm MTS Error! Bookmark not defined Bảng 2.6: Sơ đồ thí nghiệm xác định tế bào chết theo chƣơng trình Error! Bookmark not defined Bảng 2.7: Quy trình tiến hành thí nghiệm miễn dịch huỳnh quang Error! Bookmark not defined Bảng 2.8: Lô thông số trình thí nghiệm Error! Bookmark not defined Bảng 2.9: Thang đánh giá hiệu lực kháng u H Itokawa Error! Bookmark not defined Bảng 3.1: Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, Pyridine-d5) 13C-NMR 125 MHz, Pyridine-d5) phần aglycon hợp chất 1, chất tham khảo Error! Bookmark not defined Bảng 3.2: Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, Pyridine-d5) 13C-NMR (125 MHz, Pyridine-d5) phần chuỗi đƣờng hợp chất 1, chất tham khảo Error! Bookmark not defined Bảng 3.3: Tổng hợp trọng lƣợng trung bình chuột lô thí nghiệm Error! Bookmark not defined Bảng 3.4: Theo dõi kích thƣớc khối u trình thử nghiệm Error! Bookmark not defined Bảng 3.5: Tổng hợp kết khảo sát tác dụng kháng u CPSH chuột mang u rắn Sar.180 Error! Bookmark not defined Bảng 3.6: Các số huyết học chuột lô thí nghiệm đối chứng Error! Bookmark not defined BẢNG DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Từ đầy đủ ADN (DNA) Deoxyribonucleic acid TBUT Tế bào ung thƣ PS Phosphatidylserine SKLM Sắc ký lớp mỏng HPLC High Performance Liquid Chromatography CPSH Chế phẩm sinh học UT Ung thƣ ĐCDM Đối chứng dung môi ĐCSH Đối chứng sinh học EGF Epidermal growth factor HeLa Henrietta Lacks' 'Immortal' cell line IC50 Inhibited Concentration at 50% LD50 Lethal Dose at 50% TLCT Trọng lƣợng thể MMP-9 Matrix metallopeptidase MTS (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4sulfophenyl)-2H-tetrazolium) NMR Nuclear Magnetic Resonance (Cổng hƣởng từ hạt nhân) OD Optical Density MỞ ĐẦU Ba tỷ USD số tiền khổng lồ mà nhà sáng lập mạng xã hội Facebook - Mark Zuckerberg cam kết hiến tặng cho khoa học, nhằm mục đích giải loại bệnh nguy hiểm kỷ tới Một bốn loại bệnh bệnh ung thƣ Bệnh ung thƣ bệnh xuất kỷ gần đây, đƣợc ghi nhận từ năm 3000 đến 1500 trƣớc Công nguyên Nhƣ vậy, bệnh ung thƣ tồn ngƣời suốt chiều dài lịch sử.Tuy hiểu đƣợc chất bệnh ung thƣ nhƣng việc phòng tránh chữa trị ung thƣ thách thức to lớn cho tất Nhiều năm qua, giới có nhiều công trình nghiên cứu khoa học ung thƣ, kèm theo số liệu thống kê đáng lƣu ý Theo báo cáo Tổ chức Y tế giới (WHO) số 297, tháng năm 2011, ung thƣ nguyên nhân gây tử vong hàng đầu toàn giới Số lƣợng ngƣời tử vong ung thƣ năm 2008 7,6 triệu ngƣời tổng số 57 triệu ca tử vong bệnh tật toàn cầu (chiếm 13%) Riêng Hoa Kỳ năm 2008 có tới 1,5 triệu ca mắc ung thƣ Tổ chức Y tế giới dự đoán đến năm 2030, loài ngƣời phải đối mặt với số ngƣời tử vong bệnh ung thƣ tăng lên 11 triệu ngƣời toàn giới Tại Việt Nam, theo thông tin đƣợc đƣa hội thảo khoa học Ung bƣớu quốc gia lần thứ VII vào năm 2013, năm Việt Nam có khoảng 150.000 ngƣời mắc ung thƣ 75.000 ngƣời tử vong bệnh này, tức 205 ngƣời/ ngày số dự báo ngày tăng cao Nếu có dịp đặt chân đến Bệnh viện K thấy rõ ung thƣ trở thành vấn nạn xã hội Căn vào hiểu biết ngƣời ung thƣ, nhà khoa học giới định hƣớng nghiên cứu theo nhiều hƣớng khác Trong đó, xu hƣớng sàng lọc chất tách chiết từ động vật, thực vật diễn mạnh mẽ bật Hiện nay, hàng trăm chất đƣợc tìm với tác dụng có khả chống lại tế bào ung thƣ.Ở Việt Nam, khoảng 90 chất đƣợc sử dụng.Một chất có khả chữa trị định cho số ngƣời số loại ung thƣ nên việc phối hợp nhiều loại thuốc mang đến hiệu cao hơn, tránh đƣợc việc quen thuốc tế bào ung thƣ Hơn nữa, ung thƣ lại nhóm bệnh vô phức tạp, tác động đến hầu khắp quan thể, nên việc tiếp tục tìm chất bổ sung hoàn thiện cho chất đƣợc nghiên cứu việc vô quan trọng đƣợc ƣu tiên hàng đầu Trong đó, nhiều nghiên cứu giới hợp chất saponin có tiềm gây độc với nhiều dòng tế bào ung thƣ ngƣời.Nhƣng saponin nhóm hợp chất có cấu trúc phức tạp tác dụng khác nhóm hợp chất saponin Để góp phần làm rõ tác dụng hợp chất saponin, Tiến sĩ Nguyễn Xuân Cƣờng Viện Hóa sinh biển thuộc Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam định hƣớng nghiên cứu loài hải sâm với tiềm mang nhiều hợp chất saponin Cùng với nhóm Nghiên cứu Ung thƣ học thực nghiệm, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội, tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu phân lập số hợp chất saponin có hoạt tính kháng tế bào ung thƣ từ hải sâm Cercodemas anceps” với mục đích: Phân lập xác định cấu trúc từ đến hợp chất saponin từ loài hải sâm Cercodemas anceps Đánh giá đƣợc hoạt tính diệt tế bào ung thƣ chất phân lập đƣợc số dòng tế bào ung thƣ mô hình động vật in vivo Chương – TỔNG QUAN 1.1 Saponin 1.1.1 Saponin khả kháng u Saponin nhóm hợp chất đƣợc phân bố rộng rãi tự nhiên, có đặc tính hoạt động bề mặt không bay Cái tên saponin có nguồn gốc tiếng Latin từ “sapo”, có nghĩa “xà phòng” chất tạo bọt dạng nhƣ xà phòng rung lắc mạnh với nƣớc Hiện tƣợng đƣợc giải thích mặt cấu trúc saponin gồm aglycone không phân cực kết hợp với nhiều gốc monosaccharide Sự kết hợp thành phần cấu trúc phân cực không phân cực phân tửcủa chúng giải thích chúng tạo bọt nƣớc Saponin thông thƣờng có thực vật thƣờng có nhiều rễ, thân, lá, hoa hạt Cụ thể hơn, hợp chất đƣợc ghi nhận có 100 họ thực vật có 150 saponin tự nhiên đƣợc cho có khả kháng ung thƣ (anti-cancer) [11] Bộ khung saponin có nguồn gốc từ tiền chất oxidosqualene (Hình 1.1) đặc trƣng 30 carbon gắn thêm glycosyl.Dựa khung carbon, saponin đƣợc chia thành triterpenes steroid.Sự khác lớp steroid bị nhóm methyl nên khung có 27 carbon, triterpenes có đủ 30 carbon Các thành phần glycone chúng thƣờng oligosaccharide, chúng đƣợc xếp dạng thẳng phân nhánh, thƣờng liên kết với nhóm hydroxyl thông qua liên kết acetal [16] Dựa khung carbon, kết hợp với đƣờng sinh tổng hợp triterpenes steroid, Jean-Paul Vincken cộng chia thành 11 lớp saponin khác bao gồm: dammaranes, tirucallanes, lupanes, hopanes, oleananes, taraxasteranes, ursanes, cycloartanes, lanostanes, cucurbitanes steroids [11](Hình 1.1).Các nhóm cho thấy hiệu kháng u thông qua nhiều đƣờng khác Trên giới có nhiều nghiên cứu chế saponin nhƣ tƣơng quan cấu trúc chức dƣới cấp độ phân tử tế bào để hiểu chế tác động hóa sinh học saponin Một số saponin đặc biệt với khả kháng u mạnh nhƣ ginsenoside thuộc loại dammarane cho thấy khả ức chế hình thành khối u cách kìm giữ số thành phần nhƣ tế bào nội mô mạch máu ngăn cản neo bám, xâm lấn di tế bào khối u Dioscin thành phần loại steroid đƣợc nghiên cứu sâu với khả kháng khối u thông qua ngăn cản chu trình tế bào apoptosis Nhiều phân tử quan trọng 10 khác thuộc oleanane saponin nhƣ avicin, platycodon, sailosaponin, soysaponin với tubeimosides cho thấy vai trò quan trọng [11] Các nghiên cứu đại cho thấy saponin có khả kháng khối u nhiều dòng tế bào ung thƣ nhƣ LA795 [13], MCF7 MDA-MB-231 [10] Vài loại saponin ức chế phát triển tế bào khối u thông qua việc làm dừng chu trình kích thích apoptosis với giá trị IC50 khoảng 2,5 µM đến µM [10] Đối với động vật, số saponin đƣợc nghiên cứu có giá trị LD50 khác nhƣ polyphyllin D thuộc loại steroid có giá trị LD50 2,73 mg/kg [10], hay saponin tách chiết từ Citrullus colocynthis có giá trị LD50 200 mg/kg [24] Trong đó, saponin kết hợp điều trị liệu pháp kháng u cho kết cải thiện nhiều Hơn nữa, hiểu biết cách rõ ràng mối liên quan cấu trúc saponin với yếu tố khác giúp việc sử dụng saponin hiệu 1.1.2 Cơ chế kháng u số saponin Saponin đa dạng cấu trúc nên tác động kháng ung thƣ lớp đa dạng Nhiều lớp thể tính kháng u rõ rệt với nhiều đƣờng khác Cycloartanes: Loại saponin cho thấy khả kháng ung thƣ nhƣng chúng đƣợc sử dụng kết hợp điều trị hóa trị khối u Chúng làm giảm biểu dấu chuẩn ung thƣ ruột HCC (human colon cancer) α-fetoprotein ngăn cản phát triển tế bào HepG2 cách cảm ứng trình chết theo chƣơng trình điều khiển đƣờng tín hiệu NF-kB phụ thuộc ERK (ERK-independent NF-kB) [11] Dammeranes: hầu hết loại saponin cho thấy khả kháng ung thƣ.Những saponin loại thƣờng có tác dụng mạnh với tế bào ung thƣ di tế bào không ác tính.IC50 tế bào không ác tính gấp tới 40 đến 150 lần IC50 tế bào ác tính Bằng ảnh chụp hiển vi điện tử biện pháp hóa sinh, saponin đƣợc chứng minh phá hủy màng màng ty thể tế bào ung thƣ tụy bạch cầu ngƣời, dẫn đến làm khả vận chuyển qua màng, làm tăng canxi nội bào, qua kích hoạt đƣờng chết theo chƣơng trình thông qua canxi [11] Oleananes: loại đƣợc tìm thấy nhiều tự nhiên có khả kháng ung thƣ qua nhiều đƣờng nhƣ kháng u, chống lại khả di căn, kích thích miễn dịch Một số chất nhƣ Avincin có nguồn gốc từ Acacia victoriae samạc Australia có 11 khả dephosphoryl hóa Stat3 nhiều dòng tế bào ung thƣ dẫn đến làm giảm hoạt động Stat3, qua làm giảm hoạt động nhiều protein nhƣ c-myc, cyclin D1, Bcl2, survivin VEGF Avincin D G gây ức chế phát triển tế bào lympho T, cảm ứng khởi động đƣờng chết theo chƣơng trình đẩy tế bào vào đƣờng chết kiểu tự thực bào [11].Chất Tubeimoside có hiệu gây độc với tế bào ung thử cổ tử cung HeLa thông qua chế làm rối loạn hoạt động ty thể gây chết tế bào ức chế lên lƣới nội chất ức chế trùng hợp tubulin Ngoài ra, chất Saikosaponin A làm giảm khả sống khả phân chia tế bào MCF7, khởi phát chết theo chƣơng trình dừng chu trình tế bào pha G1 Hay chất saponin đƣợc tách chiết từ Platycodon grandiflorumtác động đến hoạt động thoi vô sắc nên làm dừng phân chia tế bào, ức chế hoạt động telomerase thông qua can thiệp vào trình phiên mã hTERT telomere Spirostanes cho thấy khả kháng u mạnh kích thích hệ miễn dịch Trong đó, chất Polyphyllin D nhiều nghiên cứu gần cho thấy tiềm gây chết theo chƣơng trình thông qua đƣờng ty thể lƣới nội chất nhƣ số chất khác Bên cạnh đó, chất Dioscin nghiên cứu tiền lâm sàng lại cho thấy khả ức chế hoạt động phân chia hầu hết dòng tế bào ung thƣ máu khối u rắn Phân tích proteomic cho thấy chất thúc đẩy apoptosis thông qua đƣờng ty thể số đƣờng khác Trong thực tế, chất Formosanin C nhóm có tác động lên đáp ứng miễn dịch đƣợc sử dụng hỗ trợ cho chất 5-fluorouracil (chất đƣợc sử dụng điều trị ung thƣ) Con đƣờng ảnh hƣởng Formosanin C chất hoạt hóa caspase-2, biến đổi hoạt động ty thể (trong tế bào ung thƣ ruột kết HT29) [11] 12 Hình 1.1: Cách phân loại 11 lớp hợp chất saponin 13 1.1.3 Mối liên quan cấu trúc chức kháng u saponin Sự khác cấu trúc saponin khác loại, vị trí, số lƣợng gốc đƣờng gắn liên kết glycoside vị trí khác vòng, qua định đặc tính tác dụng đáp ứng sinh học saponin đó, đặc biệt khả kháng u Chúng ta thấy số mối liên quan cấu trúc hoạt động nhƣ sau: - Tác dụng aglycone khả kháng u saponin: so sánh khác vị trí số lƣợng nhóm hydroxyl aglycone cho thấy khả khác saponin TubeimosideII có C-16 nhóm hydroxyl đóng vai trò quan trọng việc điều chỉnh hoạt động sinh học tubeimosideII giảm khả gây độc Nhƣng C17 nhóm hydroxyl có khả gây độc C-27 hydroxyl có khả kháng u [11] Tác dụng chuỗi đƣờng cấu trúc saponin: liên kết đƣờng, số lƣợng thứ tự xếp đƣờng ảnh hƣởng đến khả saponin Ví dụ: với loại aglycone độ dài chuỗi đƣờng nhƣng cầu nối liên kết cho tiềm kháng u khác disaccharide với 1-3 cầu nối cho tác dụng 1-2 1-4 cầu nối Số lƣợng gốc đƣờng ảnh hƣởng đến khả kháng u saponin Hoạt động ginsenoside có tác động theo thứ tự: monosaccharide glycoside > disaccharide glycoside > trisaccharide glycoside > tetrasaccharide glycoside [11] Tóm lại, phát phát triển saponin đóng góp lớn vào liệu pháp ung thƣ nhiều thành phần, số đƣợc ứng dụng thử nghiệm lâm sàng Hầu hết tất saponin gây cảm ứng chết theo chƣơng trình cho tế bào khối u, chúng thuốc đƣợc ƣa dùng liệu pháp chữa ung thƣ loại trừ tế bào khối u apoptosis biện pháp hữu ích để tăng hiệu cho bệnh nhân, tránh việc bị hoại tử Mảng kiến thức quan trọng chế kháng u saponin cần thiết cho việc cải thiện trực tiếp liệu pháp chống khối u dựa saponin tƣơng lai.Mặt khác, nghiên cứu thử nghiệm nên đƣợc tập trung vào việc kết hợp saponin thuốc kháng u khác 1.2 Saponin từ hải sâm 1.2.1 Hải sâm Hải sâm hay đƣợc gọi dƣa biển, sâm biển, đỉa biển, loài động vật không xƣơng sống Thân có dạng ống dài nhƣ dƣa, phình thon nhỏ hai đầu 14 với gai thịt nhỏ Phía trƣớc có miệng với vành tua rõ rệt, phía sau hậu môn Dọc thân dãy chân ống Da mềm có phiến xƣơng nằm rải rác dƣới da Hải sâm động vật phân tính, trừ số loài thuộc Không chân (Apoda) Trứng thụ tinh phát triển thể mẹ Chúng sống bò đáy, độ sâu khác nhau, có số loài thuộc họ Pelagothuridae bơi lội Hải sâm có khả tái sinh cao sức chịu đựng bền bỉ (có thể sống dƣới nƣớc tới độ sâu 6.000m) Có nhiều loại hải sâm thuộc chi Holothuria, Actinopyga, Stichopus Trong đó, hai loài hải sâm đen trắng đƣợc sử dụng rộng rãi hơn:  Hải sâm đen (Holothuria vagabunda) có thân màu đen, bụng nhạt màu hơn, dài 30-40cm  Hải sâm trắng (H scabra) có lƣng màu xám, nhạt dần hai bên, bụng trắng, dài 40-50cm, có đến 60-70cm Trên giới, hải sâm có hàng nghìn loài, phân bố nhiều nƣớc nhƣ Trung Quốc, Nhật Bản, Úc, Ấn Độ, Malaysia, vùng Đông Phi Ở Việt Nam, có bốn loài đƣợc phát phổ biến hải sâm đen, hải sâm trắng, hải sâm vú (Microthele nobilis Selenka) hải sâm mít (Actinopyga echinites Jaeger) Chúng có khắp tuyến biển từ bắc vào nam, nhiều Phú Yên, Khánh Hòa, Vũng Tàu, Côn Đảo, Phú Quốc, Kiên Giang Chúng thƣờng sống dải nông ven bờ đến độ sâu khoảng 5-7m, chủ yếu vịnh nơi nhiều đá ngầm Chúng di chuyển cách nƣớc co duỗi cơ; ăn động vật, thực vật nhỏ đáy chất bã hữu Các nghiên cứu thành phần hóa học cho thấy hải sâm chứa nhiều chất có hoạt tính quý báu nhƣ hoạt tính gây độc tế bào, chống oxy hóa, kháng MAO Đặc biệt có mặt hợp chất triterpenes saponin (holothurin) có hoạt tính gây độc tế bào mạnh nhiều dòng tế bào ung thƣ ngƣời, hứa hẹn cho việc phát triển dƣợc phẩm có tác dụng phòng trị bệnh ung thƣ 1.2.2 Nguồn saponin từ hải sâm Trƣớc đây, Saponin đƣợc phân tách từ nhiều loài sinh vật biển nhƣ hải sâm (Nigrelli 1952; Yamanouchi 1955), biển (Mackie Turner 1970), hải miên (Thompson 1985).Trong hải sâm, saponin chất chuyển hóa thứ cấp Về mặt cấu trúc , chúng glycoside triterpene đƣợc tạo thành từ chuỗi oligosaccharide aglycone holostane-3b-ol, đóng vai trò quan trọng tác dụng dƣợc lý hải 15 sâm Trên giới, nhóm nghiên cứu tìm 59 gylcoside tritecpen.Nhiều saponin xuất nhiều loài hải sâm khác nhƣng có nhiều saponin đặc hiệu cho loài Trong thể hải sâm, saponin phân bố khác nồng độ saponin khác khoang thể Saponin đƣợc tìm thấy quan tiêu hóa, cơ, lớp biểu bì, buồng trứng tinh hoàn (thay đổi theo chu kỳ sinh sản) ống Cuvierian Saponin tách từ hải sâm thể dƣợc tính cao với khả kháng u, kháng viêm, kháng khuẩn, kháng virut, kháng nấm, Ở Việt Nam, vài nhóm nghiên cứu phân lập saponin từ hải sâm.Trong có nhóm nghiên cứu Nguyễn Hải Đăng thuộc viện Hóa học hợp chất thiên nhiên phân tách đƣợc hai hợp chất từ loài hải sâm Holothuria scabravào năm 2007 Trong đó, nhóm nghiên cứu sử dụng khối phổ cộng hƣởng từ hạt nhân để xác định cấu trúc hóa học hai hợp chất Holothurin A3 Holothurin A4 với hoạt tính gây độc lên dòng tế bào ung thƣ KB Hep-G2 với IC50 lần lƣợt 0,87 0,32 µg/ml (đối với chất Holothurin A3); 1,12 0,57 µg/ml (đối với chất Holothurin A4) 1.3 Một số phương pháp phân lập xác định cấu trúc hợp chất hóa học 1.3.1 Sắc ký cột Đây phƣơng pháp sắc kí phổ biến nhất, đơn giản nhất, chất hấp phụ làpha tĩnh gồm loại silica gel (có kích thƣớc hạt khác nhau) pha thƣờng phađảo YMC, ODS, Dianion Chất hấp phụ đƣợc nhồi vào cột (cột thuỷtinh kim loại, phổ biến cột thuỷ tinh) Độ mịn chất hấp phụ rấtquan trọng, phản ánh số đĩa lí thuyết hay khả tách chất hấp phụ.Kích thƣớc chất hấp phụ nhỏ số đĩa lí thuyết lớn, khả năngtách cao, ngƣợc lại.Tuy nhiên, chất hấp phụ có kích thƣớc hạt càngnhỏ tốc độ chảy giảm, gây tƣợng tắc cột (dung môi khôngchảy đƣợc).Khi ngƣời ta phải sử dụng áp suất, với áp suất trung bình (MPC)hoặc áp suất cao (HPLC) Trong sắc kí cột, tỉ lệ đƣờng kính (D) so với chiều cao cột (L) quantrọng, thể khả tách cột.Tỉ lệ L/D phụ thuộc vào yêu cầu tách,tức phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể.Trong sắc kí, tỉ lệ quãng đƣờng chất cần tách so với quãng đƣờng dung môi gọi Rf, với chất có Rf khác Nhờvào khác Rf mà ta tách chất khỏi hỗn hợp.Tỉ lệ chất so với tỉ lệ chất hấp phụ quan trọng Tuỳ theo yêu cầutách mà ta có tỉ lệ khác nhau: 16 Tách thô tỉ lệ thấp (1/5 – 1/10), tách tinhthì tỉ lệ cao tuỳ vào hệ số tách (tức phụ thuộc vào khác Rfcủa chất), mà hệ số khoảng 1/20 – 1/30 - Có hai cách đƣa chất hấp phụ lên cột: Cách 1: Nhồi cột khô: Theo cách này, chất hấp phụ đƣợc đƣa trực tiếp vào cột khô, sau dùng que mềm để gõ nhẹ lên thành cột để chất hấp phụ xếp chặt trongcột Sau dùng dung môi chạy cột để chạy cột đến cột suốt Cách 2: Nhồi cột ƣớt: Chất hấp phụ đƣợc hoà tan dung môi chạy cột trƣớc với lƣợng dung môi tối thiểu, sau đƣa dần lên cột đến đủ lƣợng cần thiết Khi chuẩn bị cột phải lƣu ý không đƣợc để bọt khí bên (nếu có bọt khí gây nên tƣợng chạy rối cột, giảm hiệu tách) cột không đƣợc nứt, gãy, dò Tốc độ chảy dung môi ảnh hƣởng đến hiệu tách Nếu tốc độ dòng chảy lớn làm giảm hiệu tách Còn tốc độ dòng chảy quáthấp kéo dài thời gian tách ảnh hƣởng đến tiến độ công việc 1.3.2 Sắc kí lớp mỏng Sắc kí lớp mỏng (SKLM) thƣờng đƣợc sử dụng để kiểm tra địnhhƣớng cho sắc kí cột SKLM đƣợc tiến hành mỏng tráng sẵn silica geltrên đế nhôm hay đế thuỷ tinh Ngoài ra, SKLM dùng để điều chế thu chấttrực tiếp Bằng việc sử dụng SKLM điều chế (bản đƣợc tráng sẵn silica geldày hơn), đƣa lƣợng chất nhiều lên sau chạy sắc kí, ngƣờita cạo riêng phần silica gel có chứa chất cần tách giải hấp phụ bằngdung môi thích hợp để thu đƣợc chất riêng biệt Có thể phát chất trênbản mỏng đèn tử ngoại, chất màu đặc trƣng cho lớp chấthoặc sử dụng dung dịch H2SO4 10% 1.3.3 Phổ cộng hưởng SpectroscopyNMR) 1.3.3.1 Phổ 1H-NMR từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance Trong phổ 1H-NMR,độ dịch chuyển hoá học (δ) protonđƣợc xácđịnh thang ppm từ 0-14ppm, tuỳ thuộc vào mứcđộ lai hoá nguyên tửcũng nhƣđặc trƣng riêng phần Dựa vào nhữngđặc trƣng củađộ dịchchuyển hoá học tƣơng tác spin mà ta xácđịnhđƣợc cấu trúc hoá họccủa hợp chất 1.3.3.2 Phổ 13C-NMR 17 Phổ cho tín hiệu vạch phổ cacbon.Mỗi nguyên tử cacbon cộnghƣởngở trƣờng khác cho tín hiệu phổ khác nhau.Thangđo củaphổ 13C-NMR ppm, với dải thangđo rộng 0-230ppm 1.3.3.3 Phổ DEPT (Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer) Phổ cho ta tín hiệu phân loại loại cacbon khác nhau.Trên phổDEPT, tín hiệu cacbon bậc bốn biến mất.Tín hiệu CH CH3 nằmvề phía CH2 phía phổ DEPT 1350.Trên phổ DEPT 900chỉ xuất tín hiệu phổ CH 1.3.3.4 Phổ 2D-NMR Đây kỹ thuật phổ hai chiều, cho phép xácđịnh tƣơng tác củacác hạt nhân từ phân tử không gian hai chiều Một số kỹ thuật chủ yếuthƣờngđƣợc sử dụng nhƣ sau: Phổ HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence): Các tƣơng tác trực tiếp H-Cđƣợc xácđịnh nhờ vào tƣơng tác phổ Trên phổ, trục phổ 1HNMR, trục 13C-NMR Các tƣơng tác HSQC nằm trênđỉnh ô vuông phổ - Phổ H-1H COSY (HOMOCOSY) (1H-1H Chemical Shif Correlation Spectroscopy): Phổ biểu diễn tƣơng tác xa H-H, chủ yếu proton đính với cacbon liền kề Nhờ phổ mà phần phân tử đƣợc nối ghép lại với Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity): Đây phổ biểu diễn tƣơng tác xa H C phân tử Nhờ vào tƣơng tác phổ mà phần phân tử nhƣ toàn phân tửđƣợc xácđịnh cấu trúc Phổ NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy): Phổ biểu diễn tƣơng tác xa không gian proton không kểđến liên kết mà tínhđến khoảng cách nhấtđịnh không gian Dựa vào kết phổ xácđịnh cấu trúc không gian phân tử Nhƣ trênđãđề cập, việc sử dụng loại phổ, ngƣời ta sử dụng kết hợp phƣơng pháp chuyển hoá hoá học nhƣ phƣơng pháp phântích, so sánh, kết hợp khác.Đặc biệtđối với phân tử nhiều mạch nhánh dài,tín hiệu phổ NMR bị chồng lấp nhiều, khó xácđịnh xácđƣợc chiều dàicác mạch, nhƣđối với phân tử có 18 cácđơn vịđƣờng việc xácđịnhchính xác loại đƣờng nhƣ cấu hình đƣờng thông thƣờng phải sử dụngphƣơng pháp thuỷ phân xácđịnh phƣơng pháp so sánh LCMS hoặcGC-MS với cácđƣờng chuẩn dự kiến 1.4 Ung thư Ung thƣ nhóm bệnh liên quan đến phân chia tế bào, số tế bào thoát khỏi kiểm soát, biệt hoá sinh lý tiếp tục nhân lên.Những tế bào có khả xâm lấn phá huỷ tổ chức xung quanh.Đồng thời chúng di trú đến phát triển nhiều quan khác để hình thành nên khối u Cuối ung thƣ gây tử vong biến chứng rối loạn chức thể[22, 23] Quần thể tế bào ung thƣ có thay đổi rõ nét mặt hình thái chức so với tế bào bình thƣờng.Về mặt hình thái, tế bào ung thƣ có nhân lớn bình thƣờng, nhân chia thùy có nhân khổng lồ phân chia mạnh gọi nhân quái Tế bào chất có nhiều tổn thƣơng thoái hóa nhƣ nhiều hang, hốc, chất chế tiết, thể vùi Qua đó, tỷ lệ nhân tế bào chất bị phá vỡ Về mặt chức năng, tế bào ung thƣ biệt hóa nên không thực đƣợc chức bình thƣờng chúng tiết chất đặc trƣng dòng tế bào nhƣ µFP, CA125 (ung thƣ buồng trứng), CA25 (ung thƣ đại tràng), HCG (ung thƣ thai, tinh hoàn)… Khi quan sát quần thể tế bào ung thƣ, nhà nghiên cứu đƣa ba học thuyết để giải thích nguồn gốc quần thể này:  Thuyết đơn dòng: Là quan niệm kinh điển cho khối u phát sinh từ tế bào mẹ nhân lên Ví dụ: Ở bệnh bạch cầu tủy phụ nữ da đen thấy đồng loại tế bào thƣơng tổn nhiễm sắc thể số 10 Các tế bào tiết men Glucose-6phosphate dehydroglubuline  Thuyết đa dòng: Dựa kết quan sát hình thái chức cho thấy tổ chức ung thƣ có nhiều loại tế bào nên chuẩn đoán tế bào học dễ nhầm lẫn có nhiều dấu chuẩn sinh học (marker)  Thuyết ổn định gen TBUT: Có thể ban đầu dòng, gen ung thƣ không ổn định nên có tế bào biến dị sinh hàng loạt tế bào hỗn hợp Ví dụ: u lympho ác tính tế bào lớn, tế bào nhỏ loại ung thƣ phổi thể hỗn hợp, ung thƣ mô liên kết thể hỗn hợp Trong trình đa giai đoạn hình thành khối u, tế bào ung thƣ thu nhận biểu nhiều đặc điểm, có sáu khả sinh học bật tạo nên đặc tính phức tạp 19 mặt tổ chức bệnh, bao gồm: trì tín hiệu tăng sinh; trốn tránh yếu tố ức chế khối u; chống lại chết tế bào; cho phép nhân lên gần nhƣ bất tử; cảm ứng hình thành mạch máu; hoạt hóa trình xâm lấn di căn[7].Trong nghiên cứu này, muốn đánh giá tác động chất đến trình gây chết tế bào ung thƣ nên quan tâm nhiều đến đặc điểm chống lại chết tế bào ung thƣ Hình 1.2: Các đặc trưng tế bào ung thư[7] Có thể nói rằng, đặc điểm tế bào ung thƣ liên quan đến khả trì tăng sinh vô hạn chúng Các mô bình thƣờng điều khiển chu kỳ phân chia cách hợp lý xác Do đó, số lƣợng tế bàoluôn đƣợc đảm bảo cân bằng, qua đó, cấu trúc nhƣ chức mô đƣợc đảm bảo ổn định Các tế bào ung thƣ có khả trì tín hiệu tăng sinh số đƣờng khác Chúng sản xuất yếu tố tăng trƣởng cho để tự kích thích tăng sinh Ngoài ra, chúng gửi tín hiệu kích thích tế bào thƣờng để hỗ trợ hình thành chất khối u, cung cấp yếu tố tăng trƣởng cần thiết khác cho khối u[27, 28] Trong trình phát triển, tế bào thường xuyên sinh thay cho tế bào chết mô để đảm bảo số lượng tế bào cho mô hoạt động bình thường.Các tế bào bị chết già, sai hỏng ADN, tác động học hay mô cần giảm số lượng tế bào.Trong thực tế, tất tế bào có sẵn chương 20 trình để chết.Nhưng trạng thái hoạt động bình thường có loạt tín hiệu ngăn cản chúng thực trình chết Khi tín hiệu đi, có tín hiệu gây chết mạnh hoạt hóa, tế bào vào chu TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Nhƣ Hiền, Trịnh Xuân Hậu (2006), "Tế bào học" Nhà xuất Đạihọc Quốc Gia Hà Nội Phùng Phƣớng, Nguyễn Văn Cầu, Nguyễn Trần Thúc Huân (2005), "Ung thƣhọc đại cƣơng" Đại học Y Dược Huế Lê Đình Sáng (2010), "Bệnh học ung thƣ" Đại học Y Khoa Hà Nội Tài liệu tiếng Anh Freshney RI (2005), Culture of specific cell types, Wiley Online Library, Teicher BA, Andrews PA (2004), Anticancer drug development guide, Springer Science & Business Media, Freshney RI Culture of animal cells, a manual of basic technique, John Wiley and Sons, inc, Abou-Ghali M, Stiban J (2015), "Regulation of ceramide channel formation and disassembly: Insights on the initiation of apoptosis".Saudi journal of biological sciences, 22 (6), p 760-772 Drozdova OA, Avilov SA, Kalinin VI, Kalinovsky AI, Stonik VA, Riguera R, Jiménez C (1997), "Cytotoxic Triterpene Glycosides from Far‐Eastern Sea Cucumbers Belonging to the Genus Cucumaria".Liebigs Annalen, 1997 (11), p 2351-2356 Dzieciolowska EW (2009), "Selected peripheral blood cell parameters in twelve inbred strains of laboratory mice".Animal Science Papers and Reports, 27 (p 69-77 Hanahan D, Weinberg RA (2011), "Hallmarks of cancer: the next generation".cell, 144 (5), p 646-674 21 Kalinin VI, Silchenko AS, Avilov SA, Stonik VA, Smirnov AV (2005), "Sea cucumbers triterpene glycosides, the recent progress in structural elucidation and chemotaxonomy".Phytochemistry Reviews, (2-3), p 221-236 Kennedy BK (2014), "Similarities and differences between mice and humans revealed".Pann State, p 10 Lee M-S, Chan JY-W, Kong S-K, Yu B, Eng-Choon VO, Nai-Ching HW, Mak Chung-Wai T, Fung K-P (2005), "Effects of polyphyllin D, a steroidal saponin in Paris polyphylla, in growth inhibition of human breast cancer cells and in xenograft".Cancer biology & therapy, (11), p 1248-1254 11 Man S, Gao W, Zhang Y, Huang L, Liu C (2010), "Chemical study and medical application of saponins as anti-cancer agents".Fitoterapia, 81 (7), p 703-714 12 Mariño G, Kroemer G (2013), "Mechanisms of apoptotic phosphatidylserine exposure".Cell research, 23 (11), p 1247-1248 13 Rao A, Sung M (1995), "Saponins as anticarcinogens".The Journal of nutrition, 125 (3 Suppl), p 717S-724S 14 Sharpless NE, DePinho RA (2006), "The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development".Nature reviews Drug discovery, (9), p 741-754 15 Silchenko AS, Kalinovsky AI, Avilov SA, Andryjashchenko PV, Dmitrenok PS, Kalinin VI, Stonik VA (2012), "3β-O-Glycosylated 16β-acetoxy-9β-H-lanosta-7, 24diene-3β, 18, 20β-triol, an intermediate metabolite from the sea cucumber Eupentacta fraudatrix and its biosynthetic significance".Biochemical Systematics and Ecology, 44 (p 53-60 16 Sparg S, Light M, Van Staden J (2004), "Biological activities and distribution of plant saponins".Journal of ethnopharmacology, 94 (2), p 219-243 17 Tong Y, Zhang X, Tian F, Yi Y, Xu Q, Li L, Tong L, Lin L, Ding J (2005), "Philinopside a, a novel marine‐derived compound possessing dual anti‐angiogenic and anti‐tumor effects".International journal of cancer, 114 (6), p 843-853 22 18 Yi YH, Xu QZ, Li L, Zhang SL, Wu HM, Ding J, Tong YG, Tan WF, Li MH, Tian F (2006), "Philinopsides A and B, two new sulfated triterpene glycosides from the sea cucumber Pentacta quadrangularis".Helvetica chimica acta, 89 (1), p 54-63 19 ZHANG Y-j, YI Y-h "Antitumor activities in vitro of the triterpene glycoside Colochiroside A from sea cucumber Colochirus anceps" p 20 Zhang Y, Yi Y (2011), "[Studies on antitumor activities of triterpene glycoside colochiroside A from sea cucumber Colochirus anceps]".Zhongguo Zhong yao za zhi= Zhongguo zhongyao zazhi= China journal of Chinese materia medica, 36 (4), p 504507 21 Zhang Y J LXJ, Yi Y H (2005), "A new triterpene glycoside from the seacucumber Colochirous anceps".Chinese Journal of Marine Drugs, 24(2) (p 13-17 22 Phùng Phƣớng NVC, Nguyễn Trần Thúc Huân (2005), "Ung thƣ học đại cƣơng".Đại học Y Dược Huế, p 23 Sáng LĐ (2010), "Bệnh học ung thƣ".Đại học Y Khoa Hà Nội., p 24 Diwan FH(1) A-HI, Mohammed ST (2000 Mar-May), "Effect of saponin on mortality and histopathological changes in mice".East Mediterr Health J, 6(2-3):345-51 (p 25 Voigt W (2005), Sulforhodamine B assay and chemosensitivity, Springer, 26 Adams J, Cory S (2007), "The Bcl-2 apoptotic switch in cancer development and therapy".Oncogene, 26 (9), p 1324-1337 27 Bhowmick NA, Neilson EG, Moses HL (2004), "Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression".Nature, 432 (7015), p 332-337 28 Cheng N, Chytil A, Shyr Y, Joly A, Moses HL (2008), "Transforming growth factor-β signaling–deficient fibroblasts enhance hepatocyte growth factor signaling in mammary carcinoma cells to promote scattering and invasion".Molecular Cancer Research, (10), p 1521-1533 29 Grivennikov SI, Greten FR, Karin M (2010), "Immunity, inflammation, and cancer".Cell, 140 (6), p 883-899 23 30 Lowe SW, Cepero E, Evan G (2004), "Intrinsic tumour suppression".Nature, 432 (7015), p 307-315 24 ... kháng tế bào ung thƣ từ hải sâm Cercodemas anceps với mục đích: Phân lập xác định cấu trúc từ đến hợp chất saponin từ loài hải sâm Cercodemas anceps Đánh giá đƣợc hoạt tính diệt tế bào ung thƣ chất. .. Cuvierian Saponin tách từ hải sâm thể dƣợc tính cao với khả kháng u, kháng viêm, kháng khuẩn, kháng virut, kháng nấm, Ở Việt Nam, vài nhóm nghiên cứu phân lập saponin từ hải sâm. Trong có nhóm nghiên cứu. .. nhỏ đáy chất bã hữu Các nghiên cứu thành phần hóa học cho thấy hải sâm chứa nhiều chất có hoạt tính quý báu nhƣ hoạt tính gây độc tế bào, chống oxy hóa, kháng MAO Đặc biệt có mặt hợp chất triterpenes