ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC - NGU N TH TH NGHI N C U PH N OẠI GI NG C INH TS O I C THU C NG SPINIBARBUS VI T NA A TR N G N T TH (COI, 16S rRNA) UẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGH SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2015 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC - NGU N TH TH INH NGHI N C U PH N OẠI TS O I C THU C GI NG C NG SPINIBARBUS VI T NA A TR N G N T TH COI, 16S rRNA) Chuyên ngành: CÔNG NGH SINH HỌC ã số: 60 42 02 01 UẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGH SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG ẪN KHOA HỌC TS KI TH PHƯ NG OANH THÁI NGUYÊN - 2015 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn i ỜI CẢ N Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, phòng Đào tạo, ban chủ nhiệm Khoa Khoa học Sự sống - Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên tạo điều kiện cho học tập hoàn thành luận văn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Kim Th Phương Oanh, trư ng phòng Hệ gen học môi trường, Viện Nghiên c u hệ Gen - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, người cô dành nhiều thời gian, tâm huyết, tận tình giúp đỡ hướng dẫn suốt trình thực hoàn thiện luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn quan tâm, bảo giúp đỡ nhiệt tình tập th cán Phòng Hệ gen học môi trường - Viện Nghiên c u hệ Gen - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, c ng cán phòng ban khác, thuộc Viện Nghiên c u hệ Gen giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho trình thực đề tài Tôi c ng xin chân thành cảm ơn nhà ngư loại học TS Nguy n Văn Hảo TS Nguy n Th iệu Phương thuộc Viện Nghiên c u Nuôi tr ng Thủy sản I c ng anh H nốt - người dân tộc Vân Kiều nhiệt tình giúp đỡ việc thu thập phân loại hình thái mẫu cá nghiên c u Cuối c ng, xin cảm ơn gia đình, bạn bè tập th lớp Cao học Công nghệ sinh học K6B động viên, giúp đỡ suốt trình học tập thực luận văn Th i Ngu n ng 17 tháng 11 năm 2015 H viên Nguy n Th Th y inh Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ii ỜI CA ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn hoàn toàn trình bày dựa kết nghiên c u khoa học thân hướng dẫn chuyên môn TS Kim Th Phương Oanh, trư ng phòng Hệ gen học môi trường, Viện Nghiên c u hệ Gen, c ng với hướng dẫn k thuật cán phòng Hệ gen học môi trường Các số liệu hình ảnh, kết trình bày luận văn trung thực, không chép t bất c tài liệu, công trình nghiên c u người khác mà không rõ ngu n tham khảo Tôi xin ch u trách nhiệm lời cam đoan trước hội đ ng nhà trường Thái Nguyên, ngày 17 tháng 11 năm 2015 H viên Nguy n Th Th y inh Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn iii C C ỜI CẢ N i ỜI CA ĐOAN ii C C iii ANH C C C K HI U C C CH VI T TẮT v ANH C C C ẢNG vi ANH C C C H NH vii Đ U Chương 1: T NG QUAN T I I U 1.1 T ng quan giống cá ng 1.1.1 V tr phân loại phân bố 1.1.2 Đ c m sinh học 1.1.3 Giá tr kinh tế 1.2 Nghiên c u phân loại cá 1.2.1 Khái niệm hệ thống phân loại cá 1.2.2 Đ c m hình thái thường d ng phân loại cá 1.2.3 Phân loại học phân t phân loại cá 1.2.4 Tình hình nghiên c u phân loại cá Việt Nam 1.3 Đ c m hệ gen ty th vai trò gen ty th phân loại phân t 11 1.3.1 Đ c m hệ gen ty th 11 1.3.2 S d ng gen ty th phân loại phân t 12 1.3.3 Hệ gen ty th số loài thuộc giống cá ng Spinibarbus) 12 Chương 2: VẬT I U V PHƯ NG PH P NGHI N C U 14 2.1 Vật liệu 14 2.1.1 Nguyên liệu 14 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn iv 2.1.2 Hóa chất 15 2.1.3 Thiết b , d ng c nghiên c u 16 2.2 Phương pháp nghiên c u 17 2.2.1 Phương pháp nghiên c u hình thái 17 2.2.2 Phương pháp nghiên c u sinh học phân t 17 Chương 3: K T QUẢ NGHI N C U V THẢO UẬN 27 3.1 Kết phân loại m t hình thái 27 3.2 Kết tách chiết N t ng số 28 3.3 Kết khuếch đại gen 16S rRN COI b ng k thuật PCR 29 3.4 Kết tinh sản ph m PCR 30 3.5 Kết giải trình tự gen 31 3.5.1 Kết giải mã đoạn gen 16S rRN ba mẫu cá nghiên c u 31 3.5.2 Kết giải mã đoạn gen COI ba mẫu cá nghiên c u 34 3.6 Kết phân t ch phân t phân loại mẫu cá nghiên c u dựa đoạn gen 16S rRN COI 38 3.6.1 Kết phân t ch phân t phân loại mẫu cá nghiên c u dựa đoạn gen 16S rRN 38 3.6.2 Kết phân t ch phân t phân loại mẫu cá nghiên c u dựa đoạn gen COI 43 3.7 Đánh giá t nh hiệu N barcoding s d ng đ phân loại giống cá ng Spinibarbus) 48 K T UẬN V KI N NGH 49 T I I U THA PH KHẢO 50 C 56 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn v ANH C C C K HI U C C CH VI T TẮT COI Cytochrome c Oxidase subunit I DNA Deoxyribonucleic Acid bp basepair dNTP deoxynucleotide triphosphate ddNTP dideoxynucleotide triphosphate EDTA Ethylene-Diamine-Tetra-Acetic acid epp eppendorf EtBr Ethidium Bromide Kb Kilobase K2P Kimura 2-Parameter mM milliMol ML Maximum Likelihood MP Maximum Parsimony mtDNA mitochondrial DNA ng nanogram NJ Neighbour Joining OD Opitical Density PCR Polymerase Chain Reaction pmol picomol Primer F Primer Forward Primer R Primer Reverse SDS Sodium Dodecyl Sulfate TAE Tris base-Acetic acid-EDTA µl microliter Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn vi ANH C C C ẢNG ảng 2.1: Các hóa chất s d ng 15 ảng 2.2: Các thiết b , d ng c s d ng 16 ảng 2.3: Các c p m i s d ng nghiên c u 19 ảng 2.4: Thành phần phản ng PCR 22 ảng 3.1: ảng kết xác đ nh n ng độ O 260/280 N t ng số mẫu cá nghiên c u 28 ảng 3.2: ảng kết xác đ nh n ng độ O 260/280 sản ph m PCR mẫu cá nghiên c u sau tinh 30 ảng 3.3: ảng thống kê phần kết L ST đoạn gen 16S rRN ba mẫu nghiên c u 32 ảng 3.4: ảng thống kê phần kết L ST đoạn gen COI ba mẫu nghiên c u 35 ảng 3.5: ảng thống kê khoảng biến thiên khoảng cách di truyền số node phát sinh chủng loại Hình 3.4 cho phân tách rõ loài c ng giống 41 ảng 3.6: Khoảng cách di truyền K2P gi a loài cá nghiên c u loài thuộc giống cá ng đ nh danh Gen ank t d liệu trình tự đoạn gen 16S rRNA 42 ảng 3.7: ảng thống kê khoảng biến thiên khoảng cách di truyền số node phát sinh chủng loại Hình 3.5 cho phân tách rõ loài c ng giống 46 ảng 3.8: Khoảng cách di truyền K2P gi a loài cá nghiên c u loài thuộc giống cá ng đ nh danh Gen ank t d liệu trình tự đoạn gen COI 46 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn vii ANH Hình 1.1: Sự phân bố giống cá C C C H NH ng Spinibarbus) [26] Hình 1.2: Đ c m hình thái đ c trưng giống cá ng Hình 2.1: Các mẫu cá s d ng nghiên c u 14 Hình 2.2: Sơ đ thiết kế m i khuếch đại hai đoạn gen 16S rRN COI 20 Hình 2.3: Sơ đ chu trình nhiệt khuếch đại đoạn gen 16S rRN b ng phản ng PCR 22 Hình 2.4: Sơ đ chu trình nhiệt khuếch đại đoạn gen COI b ng phản ng PCR 23 Hình 3.1: Kết điện di ki m tra sản ph m tách N t ng số gel agarose 0,8% 28 Hình 3.2: Kết điện di ki m tra sản ph m PCR gel agarose ,8 29 Hình 3.3: Kết điện di ki m tra sản ph m PCR sau tinh 31 Hình 3.4: Cây phát sinh chủng loại NJ xây dựng dựa trình tự đoạn gen 16S rRN mẫu cá nghiên c u loài cá khác thuộc họ cá Chép 39 Hình 3.5: Cây phát sinh chủng loại NJ xây dựng dựa trình tự đoạn gen COI mẫu cá nghiên c u loài cá khác thuộc họ cá Chép 44 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Đ U h n tài Giống cá ng (Spinibarbus nh ng giống cá thuộc họ cá Chép Cyprinidae) Các loài cá thuộc giống cá ng phân bố chủ yếu sông lớn ph a nam Trung Quốc, ph a bắc Việt Nam Lào Theo kết nghiên c u gần đây, Việt Nam giống cá ng có 13 loài, có loài phát có khả loài Việt Nam, cá ng mệnh danh loại cá vua sông suối Tây ắc ưa chuộng, cho thấy giá tr kinh tế cao cá ng nói riêng c ng loài thuộc giống cá ng nói chung Giống cá ng nh ng giống cá qu hiếm, số loài thuộc giống cá ng ghi sách Đỏ Việt Nam, có nguy tuyệt chủng m c độ V đ ng thời n m danh sách đỏ có nguy tuyệt chủng IUCN International Union for Conservation of Nature) Trước thực tế số loài thuộc giống cá ng có hình thái bên tương đối giống nhau, dựa vào đ c m hình thái s g p khó khăn phân loại cấp độ loài ho c mẫu phân loại có k ch thước nhỏ Hơn n a, số loài thuộc giống cá ng phát hiện, xét m t hình thái có khả loài cần kh ng đ nh lại m c độ phân t Nh m cung cấp ngu n d liệu m t di truyền, h trợ việc nhận dạng số loài cá thuộc giống cá ng kh ng đ nh lại số loài cho loài thuộc giống cá ng phát Việt Nam Chúng tiến hành thực đề tài: Nghiên u h n i t số ài thu giống ng (Spinibarbus Việt Na ựa gen ty thể COI 16S rRNA tiêu a tài Xác đ nh th mã vạch phân t N barcoding marker) cho số loài thuộc giống cá ng Spinibarbus dựa phân t ch hai gen ty th : cytochrome c oxidase subunit I (COI) 16S rRN Đối tư ng h vi nghiên u Một số loài phân loại sơ m t hình thái thuộc giống cá ng (Spinibarbus) ho c đánh giá có mối quan hệ di truyền gần g i với giống cá ng thu thập sông Đakrông, huyện Đakrông, tỉnh Quảng Tr , bao g m: Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 57 PH C 1: Khóa h n i h nh th i ài thu giống ng 1 Tia đơn cuối vây lưng mảnh mềm ho c c ng yếu ph a sau trơn bóng ho c cưa Phân giống cá Chầy đất Spinibarbus Oshima, 1919) 2(5) Kh i m vây lưng gi a ho c gần mút mõm tới gốc vây đuôi Đường bên 28 vảy, tia đơn cuối vây lưng mềm Viền sau vây lưng có dải mầu đen đ c biệt 3(4) Lưng cong Mõm tày kết hạch Miệng hình móng ngựa (nhỏ vòng tròn Rạch miệng kéo dài tới đường th ng đ ng qua l m i trước Khoảng cách mắt hẹp OO=1,9O L.l=27-28 v y, đường bên th ng 1- C Chầy ất S hollandi Oshima 4(3) Lưng th ng Mõm nhọn có kết hạch Miệng hình móng ngựa (lớn vòng tròn Rạch miệng kéo dài tới đường th ng đ ng qua gi a m i mắt Khoảng cách mắt rộng OO=2,3O L.l.=24-25 v y, đường bên phần trước võng xuống ph a b ng 2- C Chầy ất a ể S babeensis Nguyen V H Kh i m vây lưng gần gốc vây đuôi mút mõm Đường bên 28 vảy Tia đơn cuối vây lưng hoá xương t ho c nhiều Viền sau vây lưng viền đen ho c nhiều vây có viền đen Đường bên v y Trước vây lưng gốc vây đuôi đốm đen Vây lưng, vây đuôi, vây b ng vây hậu môn viền sau sẫm đen Thân thấp Lo=3,92H Đầu dài Lo=3,79T L.l.=32 v y Gai vây lưng nhỏ yếu ọc thân có sọc đen t sau nắp mang đến gốc vây đuôi 3- C Chầy ất s S vitatus Nguyen V.H & Nguyen H.D Thân cao Lo=3,52H Đầu ngắn Lo=4,27T L.l.=3 v y Gai vây lưng to ọc thân sọc đen t sau nắp mang đến gốc vây đuôi 4- Cá Chầy ất ầu ngắn S brevicephalus Nguyen H.D & Nguyen V.H Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 58 Đường bên 28-29 v y Trước vây lưng gốc vây đuôi có đốm đen Vây lưng, vây đuôi, vây b ng vây hậu môn có viền sau sẫm đen 5- Cá Bulu S hoenoti sp.n 1 Tia đơn cuối vây lưng gai c ng ph a sau có cưa (Phân giống cá ng Spinibarbichthys Oshima, 1926) 11 18 Kh i m vây lưng sau kh i m vây b ng 12(17) Môi bao ch t lấy hàm dưới, làm cho nếp bên môi c ng nếp bên ph a b ng bao lấy hàm Vây b ng vết đen mực nho 13 14 Kh i m vây lưng gần mút mõm gốc vây đuôi Đường bên 32-33 v y Lược mang cung mang I: -12 công th c hầu 2.3.5-5.3.2 6- C ng S denticulatus (Oshima) 14(13) Kh i m vây lưng gần gốc vây đuôi mút mõm Đường bên v y 15 16 Thân thấp Lo>3H Đường bên -30 v y Lược mang cung mang I: 6-8 Công th c hầu: 2.3.4-4.3.2 7- C ng th n S nammauensis Nguyen V.H 16(15) Thân cao (Lo3H Đường bên 31-32 v y Gi a gốc vây đuôi đốm đen sẫm Các vây có mầu h ng ho c da cam 10-C Thần S sinensis (Bleeker) Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 59 21 Thân cao Lo