BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ĐỖ THỊ HẠNH ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN VIRUS LÚA LÙN SỌC ĐEN PHƢƠNG NAM Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số : 62 42 02 01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Hà Nội1 – 2017 Công trình đƣợc hoàn thành tại: VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: Thầy hƣớng dẫn 1: PGS.TS Phạm Xuân Hội Thầy hƣớng dẫn 2: PGS.TS Hà Viết Cƣờng Phản biện 1: …………………………… Phản biện 2:…………………………… Phản biện 3:…………………………… Luận án đƣợc bảo vệ trƣớc Hội đồng chấm luận án cấp nhà nƣớc họp tại:Viện khoa học nông nghiệp Việt Nam Vào hồi ngày tháng năm 2017 - Có thể tìm hiểu luận án thƣ viện: Thƣ viện Quốc gia Việt Nam Thƣ viện Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam MỞ ĐẦU Tính cấp thiết tề tài Việt Nam quốc gia trồng lúa nƣớc xuất lúa hàng đầu giới Sản xuất lúa có vai trò quan trọng khoảng 70% dân số nông nghiệp an ninh lƣơng thực đất nƣớc Virus tác nhân gây bệnh nguy hiểm nguyên nhân làm cho sản lƣợng lúa không ổn định tình trạng an ninh lƣơng thực Dịch bệnh vius xảy thƣờng để lại hậu nghiêm trọng, xảy luân phiên tái bùng phát dịch sau khoảng thời gian định Virus lúa lùn sọc đen Phƣơng Nam (Southern rice black-streaked dwarf virus-SRBSDV)gây bệnh lúa lùn sọc đen đƣợc phát lần vào năm 2001 vùng trồng lúa thuộc tỉnh Quảng Đông, phía Nam Trung Quốc Virus thành viên thuộc nhóm Fijivirus-2, họ Reoviridae Triệu chứng chủ yếu lúa nhiễm bệnh thƣờng thấy lúa tƣơng đối thấp lùn, xanh đậm, bị xoăn đầu toàn lá, rách mép đặc biệt có u sáp màu trắng đến đen chạy dọc đƣờng gân mặt sau lá, bẹ đốt thân Bệnh chủ yếu nhiễm thuộc dạng thực vật thân cỏ nhƣ: lúa, ngô, cỏ Môi giới truyền bệnh SRBSDV rầy lƣng trắng rầy nâu nhỏ nhƣng có rầy lƣng trắng có khả truyền SRBSDV từ lúa sang ngô Hệ gen virus có chiều dài 29124 bp, gồm 10 phân đoạn RNA sợi đôi có kích thƣớc từ 1,8 đến 4,5 kb đƣợc đặt tên theo thứ tự từ S1 đến S10 nhƣng hầu hết chƣa đƣợc xác định chức Dựa vào mức độ bảo thủ protein, phân đoạn S9 S10 có mức độ bảo thủ cao, mã hóa cho protein vỏ virus, thích hợp để nghiên cứu chẩn đoán Phân đoạn S7 có mức bảo thủ cao mã hóa protein P7.1 có vai trò quan trọng tiến hóa, thích hợp để nghiên cứu mức độ biến động quần thể virus Ở Việt Nam, dịch bệnh lúa lùn sọc đen đƣợc phát thấy lần lúa mùa năm 2009 20 tỉnh miền Bắc miền Trung với diện tích lúa nhiễm bệnh lên tới 42.000 Vì virus lần xuất Việt Nam nên công tác chẩn đoán gặp nhiều khó khăn Hai kỹ thuật chẩn đoán bệnh virus đại phổ biến kỹ thuật RT-PCR E IS Trong kỹ thuật chẩn đoán RT-PCR cho kết có độ xác cao kỹ thuật chẩn đoán ELISA cho kết tƣơng đối xác, kỹ thuật đơn giản, giá thành rẻ nên phù hợp với điều kiện Việt Nam Tuy nhiên, chƣa có kháng thể đặc hiệu nên việc chẩn đoán bị nhiễm SRBSDV đƣợc thực phƣơng pháp RT-PCR sử dụng cặp mồi từ Trung Quốc tự thiết kế dựa trình tự phân đoạn S10 số mẫu bệnh Ngoài ra, virus thực vật vốn có tốc độ đột biến cao đặc tính mắc lỗi mã enzyme RdRP (RNA dependent RNA polymerase) virus, thay đổi nhanh chóng lực tiến hóa nhƣ ký chủ vector nhƣ chất gen phân đoạn nên khả hình thành chủng/loài virus cao Cho đến nay, chƣa có nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền SRBSDV gây bệnh vùng sinh thái trồng lúa khác Việt Nam nhƣ nghiên cứu chuẩn hóa quy trình chẩn đoán SRBSDV Xuất phát từ thực tế trên, tiến hành đề tài: “Đánh giá đa dạng di truyền phát triển kỹ thuật chẩn đoán virus lúa lùn sọc đen Phương Nam Việt Nam” 2 Mục tiêu nghiên cứu - Đánh giá đa dạng di truyền SRBSDV vùng sinh thái trồng lúa khác Việt Nam dựa kết giải trình tự phân đoạn S7, S9 S10 - Phát triển kỹ thuật chẩn đoán SRBSDV Việt Nam kỹ thuật RT-PCR ELISA Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu Đối tượng - Các mẫu virus lúa lùn sọc đen Phƣơng Nam Việt Nam - Các mẫu lúa nhiễm bệnh, bệnh mẫu rầy nhiễm, virus lúa lùn sọc đen Phƣơng Nam Nội dung - Phân lập, giải trình tự ba phân đoạn S7, S9, S10 13 mẫu SRBSDV đại diện cho vùng sinh thái Việt Nam đánh giá đa dạng di truyền - Phát triển kỹ thuật chẩn đoán đặc hiệu SRBSDV Việt Nam kỹ thuật RT-PCR - Phát triển kỹ thuật chẩn đoán đặc hiệu SRBSDV Việt Nam ELISA Tính luận án Luận án công trình Việt Nam nghiên cứu chuyên sâu có hệ thống đa dạng di truyền virus lúa lùn sọc đen phƣơng Nam bƣớc đầu chứng minh chủng SRBSDV Việt Nam có quan hệ di truyền gần gũi với mẫu SRBSDV Quảng Đông Luận án phát triển thành công kỹ thuật chẩn đoán SRBSDV RT-PCR cho kết xác 100% với mẫu lúa nhiễm bệnh biểu rõ triệu chứng phát sớm mẫu lúa nhiễm bệnh chƣa biểu rõ triệu chứng Luận án công trình nghiên cứu tạo thành công kháng thể đa dòng kháng virus lúa lùn sọc đen Phƣơng Nam protein/peptide tái tổ hợp; kháng thể đa dòng có tính đặc hiệu cao, phát virus mẫu lúa rầy nhiễm virus Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Luận án cung cấp sở liệu, thông tin khoa học đa dạng di truyền SRBSDV Việt Nam, cung cấp tƣ liệu khoa học sở khoa học khả áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử chẩn đoán SRBSDV Việt Nam Kết đánh giá đa dạng di truyền SRBSDV Việt Nam làm sở cho nghiên cứu chẩn đoán, diễn biến phát dịch đề xuất biện pháp phòng trừ hiệu giúp giảm thiểu tổn thất mùa màng cho ngƣời nông dân Kỹ thuật chẩn đoán SRBSDV RT-PCR có độ xác cao, phát đƣợc có mặt virus lúa chƣa biểu rõ triệu chứng chẩn đoán virus ELISA phát nhanh có mặt virus mẫu lúa mẫu rầy nhiễm virus có ý nghĩa công tác chẩn đoán sớm xác tác nhân gây bệnh Cấu trúc luận án Luận án dày 152 trang đánh máy vi tính khổ A4 với bảng số liệu, 49 hình Luận án gồm phần: Mở đầu trang; Tổng quan tài liệu 34 trang; Vật liệu, nội dung phƣơng pháp nghiên cứu 22 trang; Kết nghiên cứu thảo luận 71 trang; Kết luận kiến nghị 02 trang Đã tham khảo 125 tài liệu bao gồm 23 tài liệu tiếng Việt 102 tài liệu tiếng Anh Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÁC VIRUS HẠI LÚA Virus hại lúa có từ lâu đƣợc xem bệnh hại nguy hiểm hàng đầu lúa giới nói chung Việt Nam nói riêng Tuy nhiên phải đến năm 1895 nhà khoa học Nhật Bản nghiên cứu lần virus gây bệnh lúa vàng lùn (Rice dwarf virus-RDV) đƣợc phát Tiếp theo, virus lúa lùn sọc đen (RBSDV) đƣợc phát nhiều virus hại lúa khác đƣợc xác định nhƣ virus gây bệnh Tungro (Tungro baccili-form virus-RTBV Tungro spherical virus-RTSV), vàng di động (RTYV- Rice transitory yellow-ing virus), khảm đốm chết (RNMV-Rice necrosis mosaic virus), lùn xoắn (RRSV-Rice ragged stunt virus), vàng lùn (RGSV- Rice grassy stunt virus), trắng lúa (RHBV-Rice hoja blanca virus)… Cho tới nay, có 16 loại virus gây hại lúa đƣợc phát Các virus phát (vàng lùn, lùn xoắn lá, tungro, lùn sọc đen phƣơng Nam ) Việt Nam có tầm quan trọng kinh tế lan truyền qua rầy Việc chẩn đoán virus lúa thƣờng khó triệu chứng bị nhầm lẫn sử dụng thuốc trừ cỏ nguyên nhân sinh lý Phát virus rầy buộc phải sử dụng kỹ thuật chẩn đoán nhƣ E IS PCR 1.2 ĐẶC ĐIỂM CÁC FIJIVIRUS THUỘC HỌ REOVIRIDAE Các virus thuộc họ Reoviridae đƣợc đặc trƣng gen RN sợi kép (dsRN ), phân đoạn, bao gồm đến 12 phân tử RNA sợi kép mạch thẳng Chi Fijivirus có hệ gen phân đoạn gồm 10 phân tử RNA sợi kép, mạch thẳng (S1-S10) Các phân tử RN dao động từ 1,4 kb đến 4,5 kb có kích thƣớc 1.3 VIRUS LÚA LÙN SỌC ĐEN PHƢƠNG N M Bệnh lúa lùn sọc đen phƣơng nam lần xuất tỉnh Quảng Đông, Trung Quốc (2001) đƣợc xem biến chủng RBSDV Cây lúa bị nhiễm SRBSDV sinh trƣởng còi cọc, xanh đậm, xoăn trắng lá, rách mép đặc biệt có u sáp màu trắng đen chạy dọc đƣờng gân mặt sau lá, bẹ đốt thân Rầy lƣng trắng tỷ lệ nhỏ rầy nâu nhỏ vector truyền SRBSDV Hệ gen SRBSDV có chiều dài 29124 bp, gồm 10 phân đoạn RNA sợi đôi, có kích thƣớc từ 1,8 đến 4,5 kb Trong đó, phân đoạn S7 dài 2176 bp, chứa hai ORF mã hóa hai protein (40,5 kDa 36,4 kDa); phân đoạn S9 dài 1899 bp, chứa hai ORF mã hóa hai protein (39,9 kDa 24,2 kDa); phân đoạn S10 dài 1797 bp, chứa ORF mã hóa protein (62.6 kDa) hình thành lớp vỏ phân tử virus SRBSDV có tƣơng đồng triệu chứng, phổ ký chủ, hình thái học phân tử virus, huyết học với thành viên khác chi Fijivius, đặc biệt RBSDV Hai kỹ thuật chẩn đoán SRBSDV phổ biến thử nghiệm miễn dịch liên kết men (E IS ) phản ứng trùng hợp chuỗi (RT-PCR) 1.4 VIRUS LÚA LÙN SỌC ĐEN PHƢƠNG N M Ở VIỆT NAM SRBSDV lần xuất vào tháng 2009, Nghệ An, sau lan 20 tỉnh miền Bắc Bắc Trung Bộ với diện tích bị hại tới 42.000 Do tính chất nghiêm trọng SRBSDV, việc xác định tác nhân gây bệnh, nhiều nghiên cứu chất hệ gen đa dạng di truyền SRBSDV Việt Nam đƣợc nghiên cứu thời gian qua Năm 2010 2011, bệnh có xu hƣớng mở rộng nhiều địa bàn trồng lúa khác có tới 34 tỉnh có diện tích trồng lúa bị bệnh Chƣơng VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU 2.1.1 Vật liệu thực vật 13 mẫu lúa nhiễm bệnh lúa lùn sọc đen đặc trƣng đƣợc xác định RT-PCR ELISA mẫu lúa nghi nhiễm bệnh thu thập vào vụ xuân vụ mùa năm 2009-2012 tỉnh: Thái Bình, Nam Định, Ninh Bình, Sơn a, Cai, Nghệ An, Quảng Trị, Huế phòng Bệnh học phân tử - Viện di truyền Nông nghiệp cung cấp Các mẫu rầy khỏe, rầy nhiễm SRBSDV; lúa nhiễm SRBSDV, RRSV lây nhiễm nhân tạo đƣợc cung cấp Trung tâm bệnh nhiệt đới, Học viện Nông nghiệp Việt Nam Bảng 2.1 Mẫu lúa nhiễm SRBSDV dùng nghiên cứu STT Tên mẫu Giống lúa Thời vụ 10 11 12 13 SonLa-1 SonLa-2 LaoCai -1 NinhBinh-1 NinhBinh-2 ThaiBinh-1 ThaiBinh-2 NamDinh-1 NgheAn-1 QuangTri-1 QuangTri-2 Hue-1 Hue-2 Xén cù Xén cù Nhị ƣu 838 BT7 BT7 BT7 BT7 BT7 Xi 23 Nhị ƣu 986 Xi 23 Nhị ƣu 986 Nhị ƣu 986 Vụ xuân 2010 Vụ xuân 2010 Vụ xuân 2009 Vụ mùa 2009 Vụ mùa 2010 Vụ mùa 2009 Vụ mùa 2010 Vụ mùa 2009 Vụ mùa 2009 Vụ xuân 2010 Vụ xuân 2010 Vụ xuân 2010 Vụ xuân 2010 Địa điểm thu mẫu Sơn a Sơn a Lào Cai Ninh Bình Ninh Bình Thái Bình Thái Bình Nam Định Nghệ An Quảng Trị Quảng Trị Huế Huế 2.1.2 Chủng vi sinh vật Chủng vi khuẩn E coli DH5α mua hãng Invitrogen, E.coli Rosetta (DE3) mua hãng Novogen 2.1.3 Vector oligonucleotide Vector pET28a/P10 phòng Bệnh học phân tử, Viện di truyền Nông nghiệp cung cấp; pET32a mua hãng Novogen; pGEM-T mạch thẳng có đầu T mua hãng Promega Các oligonucleotide sử dụng nghiên cứu đặt mua từ hãng Invitrogen Sigma 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Đánh giá đa dạng di truyền SRBSDV Việt Nam - Phát triển kỹ thuật chẩn đoán SRBSDV Việt Nam RT-PCR - Phát triển kỹ thuật chẩn đoán SRBSDV Việt Nam ELISA 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - Tách chiết, định lƣợng DNA/RNA - Định lƣợng protein bằng phƣơng pháp Bradford - Thiết kế mồi dựa trình tự đƣợc công bố GenBank (EU784841.1, EU784843.1, EU784840) - Nhân DNA/RNA PCR RT-PCR - Nhân dòng giải trình tự DNA - Phát triển kỹ thuật chẩn đoán SRBSDV RT-PCR - Xác định vùng gen mã hóa polypeptide giàu tính kháng nguyên phần mềm Immune Epitope Database Analysis Resource - Thiết kế vector biểu gen đích tế bào vi khuẩn - Tạo kháng thể đa dòng kháng SRBSDV theo phƣơng pháp Amero (1994) Regenmortel (1993) - Phƣơng pháp kháng nguyên kháng thể: Kỹ thuật Western blot Sambrook & Rusel (2001); kỹ thuật Dot-blot Wang (2012); kỹ thuật PTA-ELISA Mowat & Dawson (1987) Cây phả hệ dựa trình tự nucleotide SRBSDV cho thấy mẫu Việt Nam Trung Quốc xuất xen kẽ phả hệ, chứng tỏ chúng quần thể virus gây hại vùng địa lý thời điểm, chƣa hình thành chủng NinhBinh-2 JQ692578.1-VN 20 JN388912.1-TQ ThaiBinh-2 60 NamDinh Hue-1 100 80 EU784841.1-QuangDong-TQ FN563995.1-HaiNam-TQ HQ731498.1-ThuaThienHue HM998850.1-TQ Hue-2 HM585273.1-TQ JQ034354.1-TQ 50 SonLa-1 80 SonLa-2 NgheAn 100 NinhBinh-1 80 40 LaoCai ThaiBinh-1 QuangTri-1 100 100 QuangTri-2 Hình 3.9 Xây dựng phả hệ SRBSDV dựa trình tự phân đoạn S7 Ghi chú: Các số nốt giá trị boostrap tính theo %) Mẫu Việt Nam rõ chấm đen Thanh bar số thay nucleotide 33 HQ731500-VN QuangTri-1 44 77 EU523359-HaiNam-TQ LaoCai 44 ThaiBinh-2 22 100 HM585271-TQ JQ692580.1-ThuaThienHue NinhBinh-2 66 11 ThaiBinh-1 55 100 SonLa-2 100 HM998852-TQ JQ773428-TQ 22 QuangTri-2 22 Hue-1 100 100 33 Hue-2 SonLa-1 77 33 NgheAn JQ034356-TQ EU784843-QuangDong-TQ NamDinh NinhBinh-1 Hình 3.12 Xây dựng phả hệ SRBSDV dựa trình tự phân đoạn S9 Ghi chú: Các số nốt giá trị boostrap tính theo % (1000 lần lặp) Mẫu Việt Nam rõ chấm đen 11 ThaiBinh-2 GQ472845-TQ SonLa-1 LaoCai NinhBinh-1 57 28 71 NinhBinh-2 HM585270-TQ 57 JQ692581.1-ThuaThienHue 85 100 EU784840-QuangDong-TQ JQ034357-TQ 42 NamDinh 100 HQ731501-VN EU523360-HaiNam-TQ NgheAn SonLa-2 HQ394212-TQ 100 ThaiBinh-1 100 100 QuangTri-1 100 Hue-1 100 QuangTri-2 Hue-2 Hình 3.14 Xây dựng phả hệ SRBSDV dựa trình tự phân đoạn S10 Ghi chú: Các số nốt giá trị boostrap tính theo %) Mẫu Việt Nam rõ chấm đen Thanh bar số thay nucleotide 3.2 NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN SRBSDV BẰNG RT-PCR Quy trình chẩn đoán đặc hiệu SRBSDV Việt Nam kỹ thuật RT-PCR đƣợc tối ƣu yếu tố ảnh hƣởng nhƣ: vị trí lấy mẫu, phƣơng pháp chiết RNA, trình tự mồi, loại phản ứng RT-PCR, điều kiện phản ứng RT-PCR Phản ứng RT-PCR tối ƣu cho quy trình xét nghiệm SRBSDV có thành phần bao gồm 8,6 µl ddH2O, 0,6 µl loại mồi (Fw: CACCCCACATCGCGTCATCT, Rv: CCCATTTGAGCAGGAAC TTCAC), 0,5 µl RN khuôn, 1,5 µl đệm 10X, 1,5 µl dNTP mM, 0,2 µl Taq DNA polymerase U/µl; 0,75 µl Reverse transcriptase U/µl, 0,75 µl Ribolock Rnase chu trình nhiệt là: 42oC - 10 phút, 94oC - phút, (94oC - 30 giây, 56oC - 20 giây, 72oC - 1,5 phút) x 35 chu kỳ, 72oC - phút, bảo quản 4oC 12 Tiến hành thử nghiệm quy trình tối ƣu đƣợc 192 mẫu lúa gồm 102 mẫu khô 90 mẫu tƣơi (Bảng 3.6) Bảng 3.6 Thử nghiệm quy trình chẩn đoán SRBSDV RT-PCR Loại mẫu Lúa bệnh Lúa nhiễm RRSV Lúa thu thập từ vùng dịch, giải trình tự gen Lúa lây nhiễm nhân tạo biểu bệnh Lúa lây nhiễm nhân tạo chƣa biểu bệnh Lúa thu thập từ vùng dịch Dạng bảo quản Tình trạng nhiễm Tƣơi Khô SRBSDV Kết chẩn đoán Mồi đặc Tỉ lệ phát hiệu bệnh 0/10 0% 0/5 0% 10 0 Không Không Mồi Actin 10/10 5/5 13 Nhiễm 13/13 13/13 100 % 64 Nhiễm 64/64 64/64 100 % 10 Nghi nhiễm 10/10 2/10 20 % 84 Nghi nhiễm 90/90 79/90 88 % Kết thử nghiệm cho thấy quy trình đƣợc xây dựng phát xác 100% có mặt SRBSDV mẫu bệnh, bao gồm mẫu tƣơi mẫu khô, phát có mặt SRBSDV giai đoạn chƣa biểu bệnh 3.3 PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN SRBSDV BẰNG ELISA Mục tiêu nội dung nghiên cứu tạo kháng thể đặc hiệu virus phát triển kỹ thuật chẩn đoán SRBSDV Việt Nam kỹ thuật E IS Các định hƣớng tạo kháng thể đa dòng nhƣ: (1) sử dụng hạt virus tinh chiết từ nhiễm bệnh (2) sử dụng protein vỏ (dạng đầy đủ đoạn peptide) tái tổ hợp 3.3.1 Tạo kháng thể đa dòng kháng SRBSDV hạt virus tinh chiết Hạt virus đƣợc tinh chiết từ mẫu lúa lây nhiễm nhân tạo SRBSDV để gây đáp ứng miễn dịch thỏ Kháng thể IgG tinh đƣợc kiểm tra PTA-ELISA Kết thu đƣợc cho thấy 13 kháng thể IgG tinh có hiệu giá 1/200 (Hình 3.30) phát xác có mặt SRBSDV mẫu bệnh (Hình 3.31) Hình 3.30 Xác định hiệu giá kháng thể IgG PTA- ELISA Ghi chú: Mẫu kháng thể IgG tinh pha loãng theo tỉ lệ:1/100, 1/200, 1/500, 1/1000, mẫu dịch chiết bệnh (cột màu xanh) khỏe (cột màu đỏ) Đồ thị thể ODA405 trung bình lần xét nghiệm Hình 3.31 Xét nghiệm SRBSDV mẫu lúa bệnh Ghi chú: Mẫu dich chiết pha loãng theo tỷ lệ 1/5; 1/10 1/20 Kháng thể IgG tinh pha loãng theo tỉ lệ:1/200, mẫu dịch chiết bệnh (cột màu xanh) khỏe (cột màu đỏ) Đồ thị thể giá trị ODA405 trung bình lần xét nghiệm 3.3.2 Nghiên cứu tạo kháng thể kháng SRBSDV protein vỏ tái tổ hợp P10 SRBSDV Chúng tiếp tục nghiên cứu tạo kháng thể đặc hiệu SRBSDV protein vỏ tái tổ hợp sử dụng vector pET28a/P10 Protein tái tổ hợp đƣợc biểu vi khuẩn E coli Rossetta tinh cột sắc kí lực Ni2+ agarose (Hình 3.33) Protein 14 tái tổ hợp tinh đƣợc sử dụng để gây đáp ứng miễn dịch chuột Kháng thể IgG đƣợc tinh từ kháng huyết (đã kiểm tra đáp ứng miễn dịch) cột sắc ký lực Protein A-sepharose (Hình 3.35) Hình 3.33 Tinh protein P10 cột sắc ký lực Ni-NTA Ghi chú: (A) Dịch chiết tế bào phân đoạn tinh protein điện di gel SDS-PAGE 12% (B) Protein P10 phát kháng thể anti-His-tag pha loãng 1: 5000 MK: thang chuẩn protein; giếng 1: Dịch chiết tế bào; giếng 2: dịch không gắn cột; giếng 3,4: phân đoạn rửa cột; giếng 5-8: phân đoạn đẩy cột imidazol 250 mM Hình 3.35 Kiểm tra kháng thể IgG tinh Ghi chú: (A) Kháng thể tinh qua cột Protein A-Sepharose điện di gel SDS-PAGE 12% Giếng Mk: Thang chuẩn protein; giếng 1: phân đoạn rửa giải (B) Khả phát protein P10 kháng thể IgG tinh pha loãng 1: 2000; Giếng Mk: Thang chuẩn Protein; Giếng 1: Protein P10 tinh sạch; Giếng 2: Dịch chiết vi khuẩn mang pET28a (Đối chứng âm); Giếng 3: Dịch chiết vi khuẩn mang pET28a/P10 15 Hiệu giá kháng thể đƣợc xác định kĩ thuật Dot-blot Kết thu đƣợc cho thấy kháng thể IgG sau đƣợc tinh phát đƣợc protein P10 tái tổ hợp nồng độ pha loãng 1:6000 (Hình 3.36A cột 2) SRBSDV mẫu dịch chiết lúa ngô bệnh nồng độ pha loãng 1:5000 (Hình 3.36B) 1: 50 1: 100 1: 200 B A Hình 3.36 Xác định hiệu giá kháng thể tinh Dot-blot Ghi chú: (A) Xác định hiệu giá kháng thể sau tinh đánh giá protein P10 phương pháp Dot-blot; kháng huyết (cột 1) kháng thể sau tinh (cột 2) pha loãng tỉ lệ 1:1000, 1:2000, 1:3000, 1:4000, 1:5000 1:6000 (B) Độ đặc hiệu kháng thể tinh đánh giá dịch chiết lúa ngô pha loãng theo tỉ lệ 1:50, 1:100 1:200; mẫu kháng thể tinh pha loãng tỉ lệ 1:1000 1:5000; (+): dịch chiết nhiễm SRBSDV; (-): dịch chiết bệnh Độ đặc hiệu kháng thể tinh đƣợc tiếp tục xác định kĩ thuật ELISA sử dụng mẫu lúa nhiễm SRBSDV RRSV Kết cho thấy kháng thể nồng độ pha loãng 1:5000 có khả nhận biết đặc hiệu SRBSDV mẫu lúa nhiễm bệnh lùn sọc đen (Hình 3.37), ra, kháng thể sau tinh có khả phát sớm có mặt SRBSDV trong mẫu xét nghiệm có tỉ lệ rầy nhiễm SRBSDV cao 50% (bằng phƣơng pháp lây nhiễm nhân tạo) (Hình 3.38) 16 Hình 3.37 Đánh giá độ đặc hiệu kháng thể ELISA Ghi chú: Mẫu kháng thể IgG tinh pha loãng tỉ lệ 1/5000 kiểm tra ELISA với mẫu dịch chiết khỏe (cột màu xanh dương), nhiễm SRBSDV (cột màu đỏ) nhiễm RRSV (cột màu xanh lá) pha loãng tỉ lệ 1/10, 1/20, 1/30, 1/40, 1/50 1/60 Đồ thị thể giá trị ODA492 trung bình lần xét nghiệm Hình 3.38 Đánh giá khả phát SRBSDV mẫu rầy nhiễm SRBSDV ELISA Ghi chú: Mẫu kháng thể IgG tinh pha loãng tỉ lệ 1/5000 kiểm tra ELISA với mẫu rầy trộn theo tỉ lệ [số rầy bệnh (B)]:[số rầy khỏe (K)] 0B:5K, 1B:4K, 2B:3K, 3B:2K, 4B: 1K 5B:0K Đồ thị thể giá trị ODA492 trung bình lần xét nghiệm (ĐC) đối chứng âm 3.3.3 Nghiên cứu tạo kháng thể đa dòng SRBSDV polypeptide giàu tính kháng nguyên Mục tiêu nghiên cứu tạo kháng thể kháng P10 từ polypeptide giàu tính kháng nguyên nhằm tăng tính đặc hiệu cho xét 17 nghiệm ELISA Đoạn polypeptide giàu tính kháng nguyên protein vỏ P10 đƣợc lựa chọn phần mềm tin sinh Kết phân tích tính ƣa nƣớc, khả nằm bề mặt cấu trúc không gian vùng polypeptide P10 phần mềm IEDB cho thấy vùng polypeptide vị trí 259-425 vị trí 365-557 đƣợc dự đoán giàu tính kháng nguyên (Hình 3.39 3.40) đảm bảo tính bảo thủ tất mẫu SRBSDV phân lập Việt Nam A B Hình 3.39 Dự đoán tính kháng nguyên protein P10 Ghi chú: Biểu đồ dự đoán tính ưa nước (A) khả nằm bề mặt phân tử (B) vùng polypeptide P10 Vùng màu vàng: vùng polypeptide ưa nước nằm bề mặt phân tử; vùng màu xanh: vùng polypeptide kỵ nước không nằm phân tử Threshold: giá trị ngưỡng 18 Hình 3.40 Dự đoán vùng polypeptide có cấu trúc không gian có khả tạo epitope Ghi chú: Các vùng polypeptide có cấu trúc không gian có khả tạo epitope nằm vị trí 1-166 (A), 235-415 (B), 446-557 (C) P10 đoạn nucleotide mã hóa chuỗi axit amin vị trí 259-425 365-557 (đặt tên P10.1 P10.2) đƣợc phân lập kỹ thuật PCR (Hình 3.41, giếng 3) Sản phẩm PCR sau đƣợc nhân dòng vào vector pGEM-T Hình 3.41 Nhân đoạn gen P10.1 P10.2 PCR Ghi chú: Giếng Mk: Thang chuẩn DNA kb; giếng 2: PCR với cặp mồi S10-P1-Fw/ S10-P1-Rv ; giếng 4: PCR với cặp mồi S10-P2-Fw/ S10-P2-Rv; giếng 3: khuôn pGEM/S10; giếng 4: Đối chứng âm (khuôn H2O) Tiếp theo, đoạn gen P10.1 P10.2 đƣợc cắt ghép nối vào vector biểu pET32a Vector tái tổ hợp đƣợc kiểm tra PCR cắt enzyme giới hạn Kết thu đƣợc hình 3.45 cho thấy đoạn gen P10.1 P10.2 đƣợc ghép nối thành công vào vector biểu pET32a Các vector pET32a/P10.1 pET32a/P10.2 19 sau đƣợc giải trình tự mồi T7 Hình 3.45 Kiểm tra pET32a/P10.1 pET32a/P10.2 PCR cắt giới hạn Ghi chú: (A) PCR pET32a/P10.1; giếng 2: PCR với cặp mồi S10-P1Fw/S10-P1-Rv; giếng 4: PCR với cặp mồi T7-Fw/T7-Rv; giếng 3: đối chứng âm (khuôn H2O); giếng 4: khuôn plasmid (B) PCR pET32a/P10.2; giếng 2: PCR với cặp mồi S10-P2-Fw/S10-P2-Rv; giếng 4: PCR với cặp mồi T7-Fw/T7-Rv; giếng 3: khuôn plasmid; giếng 4:đối chứng âm (khuôn H2O).(C) Cắt giới hạn plasmid EcoRI/XhoI; giếng 3: sản phẩm cắt giới hạn; giếng 4: plasmid nguyên bản; giếng 2: pET32a/P10.1; giếng 4: pET32a/ 10.2 iếng : Thang DN chuẩn kb Hình 3.46 Biểu protein tái tổ hợp P10.1 P10.2 tế bào E coli Ghi chú: (A) Kết điện di dịch chiết tế bào SDS-PAGE 12% (B) Polypeptide P10.1 P10.2 phát kháng thể anti-His-tag (pha loãng 1: 5000) Giếng M: thang chuẩn protein; giếng 1: dịch chiết tế bào mang pET32a trống; giếng 2: thể tan dịch chiết tế bào mang pET32a/P10.1; giếng 3: thể cặn dịch chiết tế bào mang pET32a/P10.1; giếng 4: thể tan dịch chiết tế bào mang pET32a/P10.2; giếng 5: thể cặn dịch chiết tế bào mang pET32a/P10.2 20 Polypeptide tái tổ hợp P10.1 P10.2 đƣợc biểu vi khuẩn E coli Rossetta (Hình 3.46) tinh cột sắc kí lực Ni2+ agarose (Hình 3.47) Protein tái tổ hợp tinh đƣợc sử dụng để gây đáp ứng miễn dịch chuột Hình 3.1 Tinh polypeptide P10.1 P10.2 sắc ký lực Ni-NTA Ghi chú: Mẫu protein điện di gel SDS-PAGE 12% (A) Kết tinh polypeptide P10.1; giếng 1-4: dịch rửa cột imidazol 30 mM; giếng 5-14: phân đoạn đẩy cột imidazol 250m (B) Kết tinh P10.2; giếng 1: dịch chiết tế bào không cảm ứng IPTG; giếng 2: dịch chiết tế bào cảm ứng IPTG; giếng 3: dịch rửa cột; giếng 4: thang chuẩn protein; giếng 5-12: phân đoạn đẩy cột imidazol 250m Kháng huyết chuột sau tuần tiêm đƣợc kiểm tra khả nhận mặt đặc hiệu kháng nguyên kỹ thuật lai thẩm tách miễn dịch Kết thu đƣợc hình 3.48 cho thấy kháng thể có mặt mẫu kháng huyết chuột độ pha loãng 1:2000 có khả nhận biết đặc hiệu với protein P10 tái tổ hợp tinh cho phép kết luận việc gây kháng thể đa dòng từ polypeptide P10.1 P10.2 tái tổ hợp chuột bạch thành công 21 Hình 3.48 Kiểm tra đáp ứng miễn dịch kháng huyết Ghi chú: Kháng huyết chuột sau tiêm P10.1 (giếng 1) P10.2 (giếng 2) tuần (pha loãng 1:2000) kiểm tra lai thẩm tách miễn dịch Giếng Mk: thang protein chuẩn; giếng 2: mẫu P10 tinh Hiệu giá kháng thể đƣợc xác định kĩ thuật Dot-blot Kết thu đƣợc cho thấy kháng huyết tạo từ polypeptide P10.1 độ pha loãng 1:7000 (Hình 3.49 hàng 1) P10.2 độ pha loãng 1:6000 (Hình 3.49 hàng 2) phát protein tái tổ hợp P10 Hình 3.49 Xác định hiệu giá kháng huyết Ghi chú: Hiệu giá kháng huyết kháng P10.1 (hàng 1) P10.2 (hàng 2) đánh giá mẫu protein P10 tinh Kháng huyết pha loãng tỉ lệ 1:1000, 1:2000, 1:3000, 1:4000, 1:5000, 1:6000,1:7000 1:8000 22 KẾT LUẬN Đã phân lập giải trình tự đầy đủ ba phân đoạn S7, S9 S10 13 mẫu SRBSDV đại diện cho vùng sinh thái khác Việt Nam với kích thƣớc lần lƣợt 2176 bp, 1849 bp 1798 bp Mức độ tƣơng đồng nucleotide mẫu virus Việt Nam với dao động từ 97,6-100% với chủng Trung Quốc dao động từ 97,3 - 99,8% Cây phả hệ dựa trình tự nucleotide cho thấy mẫu virus Việt Nam Trung Quốc quần thể virus gây hại vùng địa lý thời điểm Kết so sánh trình tự amino acid khung đọc mở, SRBSDV Việt Nam có quan hệ di truyền gần gũi với SRBSDV Quảng Đông Đã phát triển kỹ thuật chẩn đoán SRBSDV Việt Nam kỹ thuật RT-PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu S10-t1-Fw/S10-t1-Rv Thử nghiệm kỹ thuật chẩn đoán SRBSDV 192 mẫu bệnh cho kết xác 100% với mẫu lúa nhiễm bệnh biểu rõ triệu chứng Đặc biệt, kỹ thuật chẩn đoán SRBSDV phát sớm có mặt virus giai đoạn lúa chƣa biểu rõ triệu chứng bệnh Đã tạo thành công bốn kháng thể kháng SRBSDV từ hạt virus gây bệnh, protein tái tổ hợp P10 polypeptide giàu tính kháng nguyên để phát triển kỹ thuật chẩn đoán SRBSDV ELISA Kháng thể tạo từ hạt SRBSDV nồng độ pha loãng 1:200 phát đƣợc có mặt SRBSDV dịch chiết mẫu nhiễm bệnh kỹ thuật PTA - ELISA Kháng thể tạo từ protein vỏ P10 tái tổ hợp nồng độ pha loãng 1:5000 phát 23 đƣợc có mặt SRBSDV dịch chiết mẫu nhiễm bệnh kỹ thuật Dot blot Kháng thể tạo từ polypeptide tái tổ hợp P10.1 nồng độ pha loãng 1:7000 phát đƣợc protein tái tổ hợp P10 kỹ thuật Dot-blot Kháng thể tạo từ polypeptide tái tổ hợp P10.2 nồng độ pha loãng 1:6000 phát đƣợc protein tái tổ hợp P10 kỹ thuật Dot-blot Đã thử nghiệm thành công kháng thể tạo từ protein vỏ P10 tái tổ hợp chẩn đoán SRBSDV kĩ thuật ELISA lúa rầy Ở nồng độ pha loãng 1:5000, kháng thể tạo từ protein vỏ P10 tái tổ hợp phát đƣợc có mặt SRBSDV dịch chiết mẫu nhiễm bệnh Đặc biệt kháng thể tạo từ protein vỏ P10 tái tổ hợp phát xác có mặt SRBSDV mẫu xét nghiệm có tỉ lệ rầy nhiễm SRBSDV cao 50%, mở hội phát sớm diễn biến phát dịch phục vụ công tác dự tính dự báo KIẾN NGHỊ Tiếp tục phân lập giải trình tự phân đoạn lại hệ gen SRBSDV để hoàn thiện việc giải mã hệ gen SRBSDV Việt Nam vùng sinh thái khác phục vụ nghiên cứu đa dạng di truyền, nguy phát sinh chủng kiểm soát virus công nghệ gen Tiếp tục đánh giá độ đặc hiệu, phản ứng chéo kháng thể đa dòng tạo nghiên cứu để đảm bảo tính xác phƣơng pháp ELISA Sản xuất kháng huyết SRBSDV với số lƣợng lớn phục vụ công tác dự tính dự báo, chẩn đoán bệnh trƣờng hợp dịch bùng phát, tiến tới sản xuất kit chẩn đoán nhanh virus quick-stick 24 DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Nguyễn Hoàng Quang, Lại Phƣơng iên, Đỗ Thị Hạnh, Hà Viết Cƣờng, Phạm Xuân Hội, 2014, “Nghiên cứu đa dạng di truyền phân đoạn S7 virus lúa lùn sọc đen Phƣơng Nam Việt Nam”, Tạp chí Nông nghiệp & Phát triển Nông thôn, số 2 Nguyễn Hoàng Quang, Phạm Thanh Tâm, Đỗ Thị Hạnh, Phạm Xuân Hội, 2014, “Phân tích đa dạng di truyền chức phân đoạn S9 số chủng virus lúa lùn sọc đen Phƣơng Nam miền Trung miền Bắc Việt Nam”, Tạp chí Nông nghiệp & Phát triển Nông thôn, số 20 Nguyễn Hoàng Quang, Đỗ Thị Hạnh, Phạm Thị Vân, Trần Thị Nhƣ Hoa, Hà Viết Cƣờng, Phạm Xuân Hội, 2013, “Phân tích trình tự phân đoạn S10 chủng virus gây bệnh lúa lùn sọc đen Việt Nam”, Tạp chí Khoa học công nghệ nông nghiệp Việt Nam, số 2(41) Đỗ Thị Hạnh, Phạm Thị Vân, Phạm Xuân Hội, 2015, “Tạo kháng thể đa dòng kháng vi rút lùn sọc đen Phƣơng Nam hại lúa protein tái tổ hợp”, Tạp chí Nông nghiệp & Phát triển Nông thôn, số 23 Đỗ Thị Hạnh Đàm Quang Hiếu, Nguyễn Duy Phƣơng, Phạm Xuân Hội, 2015, “Biểu tinh polypeptit giàu tính kháng nguyên P10.2 protein vỏ P10 virus gây bệnh lúa lùn sọc đen”, Tạp chí Khoa học công nghệ nông nghiệp Việt Nam, số 6(59) Đỗ Thị Hạnh, Phạm Thanh Tâm, Phạm Xuân Hội, 2015, “Phân lập biểu đoạn gen mã hóa polypeptit giàu tính kháng nguyên protein vỏ P10 virus gây bệnh lúa lùn sọc đen”, Tạp chí Khoa học Phát triển tập 13, số 25 ... Đánh giá đa dạng di truyền phát triển kỹ thuật chẩn đoán virus lúa lùn sọc đen Phương Nam Việt Nam 2 Mục tiêu nghiên cứu - Đánh giá đa dạng di truyền SRBSDV vùng sinh thái trồng lúa khác Việt. .. vùng sinh thái Việt Nam đánh giá đa dạng di truyền - Phát triển kỹ thuật chẩn đoán đặc hiệu SRBSDV Việt Nam kỹ thuật RT-PCR - Phát triển kỹ thuật chẩn đoán đặc hiệu SRBSDV Việt Nam ELISA Tính... 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Đánh giá đa dạng di truyền SRBSDV Việt Nam - Phát triển kỹ thuật chẩn đoán SRBSDV Việt Nam RT-PCR - Phát triển kỹ thuật chẩn đoán SRBSDV Việt Nam ELISA 2.3 PHƢƠNG PHÁP