MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan probiotic .2 1.1.1 Đại cương probiotic 1.1.2 Vai trò probiotic 1.1.3 Tình hình nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic giới Việt Nam 1.1.4 Loài Lactobacilus acidophilus 1.2 Tổng quan vi nang 1.2.1 Khái niệm, đặc điểm ưu nhược điểm vi nang 1.2.2 Các ứng dụng vi nang ngành Dược 12 1.2.3 Các phương pháp bào chế vi nang 13 1.2.4 Tổng quan số thành phần sử dụng bào chế vi nang 19 1.2.5 Một số nghiên cứu nước bào chế vi nang probiotic 22 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 Nguyên vật liệu thiết bị nghiên cứu .28 2.1.1 Nguyên liệu 28 2.1.2 Thiết bị 29 2.2 Nội dung nghiên cứu .30 2.2.1 Bào chế vi nang L acidophilus 30 2.2.2 Theo dõi độ ổn định vi nang L acidophilus đông khô 31 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 31 2.3.1 Phương pháp bào chế vi nang L acidophilus 31 2.3.2 Phương pháp đánh giá 35 2.3.3 Phương pháp đánh giá độ ổn định vi nang L acidophilus đông khô 40 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .41 3.1 Kết bào chế vi nang L acidophilus .41 3.1.1 Kết khảo sát yếu tố công thức ảnh hưởng đến vi nang 41 3.1.2 Kết khảo sát quy trình bào chế đến vi nang 56 3.2 Kết theo dõi độ ổn định vi nang L acidophilus đông khô 62 3.3.1 Kết đánh giá vi nang L acidophilus thời điểm t = 62 3.3.2 Kết đánh giá khả hút ẩm vi nang bào chế mơi trường bão hịa muối Kali dihydro phosphat 63 3.3.3 Kết theo dõi độ ổn định vi nang L acidophilus bảo quản điều kiện khác 64 CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN .67 4.1 Bàn luận kết bào chế vi nang L acidophilus 67 4.1.1 Bàn luận kết khảo sát công thức 67 4.1.2 Bàn luận kết xây dựng quy trình 73 4.2 Bàn luận kết theo dõi độ ổn định vi nang đông khô 76 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 80 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ATCC Trung tâm giữ giống quốc gia Mỹ (American Type Culture Collection) ALG Alginat B longum Bifidobacterium longum B bifidum Bifidobacterium bifidum B subtilis Bacillus subtilis Cfu Số đơn vị khuẩn lạc (Colony-Forming Units) CMC Critical Micelle Concentration CS Chitosan CT Công thức DP Degree of Polymerization (Mức độ trùng hợp) ĐK Đông khô E coli Escherichia coli EE Hiệu suất tạo nang (Encapsulation efficiency) EY Hiệu suất bao vi sinh vật (Encapsulation yield) FOS Fructo- oligosaccharides FAO Tổ chức Nông lƣơng giới (Food and Agriculture Organization) GOS Galacto- oligosaccharides GRAS Chứng nhận an toàn (Generally Recognized As Safe) h Giờ IDF Liên đoàn Sữa giới (International Federation) kl/tt Khối lƣợng/thể tích KT LAB Kích thƣớc Nhóm vi khuẩn Lactic (Lactic acid bacteria) L Lactobacillus Dairy MRS Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn (de Man, Rogosa, Sharpe) MRSA Môi trƣờng nuôi cấy thạch (MRS Agar) MRSB Môi trƣờng nuôi cấy lỏng (MRS Brown) MT Môi trƣờng NC Nghiên cứu PE Polyethylene SEM Kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscope) TB Tế bào TC NSX Tiêu chuẩn nhà sản xuất TD Tá dƣợc TEM Kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission Electron Microscope) TKHH Tinh khiết hóa học VK Vi khuẩn v/ph Vòng/phút VN Vi nang VSV Vi sinh vật WHO Tổ chức Y tế giới (World Health Organization) DANH MỤC CÁC BẢNG TÊN BẢNG STT TRANG Bảng 1.1 Các hệ bào chế chế phẩm chứa probiotic Bảng 1.2 Một số sản phẩm probiotic chứa L acidophilus thị trường Bảng 2.1 Các nguyên liệu pha môi trường 28 Bảng 2.2 Các tá dược sử dụng 29 Bảng 2.3 Môi trường sử dụng nghiên cứu 29 Bảng 2.4 Các yếu tố ảnh hưởng mức khảo sát 30 Bảng 2.5 Các thông số kỹ thuật mức khảo sát 31 Bảng 3.1 Kết bào chế vi nang thay đổi thể tích cắn sinh khối tế bào 42 Bảng 3.2 Kết bào chế vi nang thay đổi tỷ lệ pha nước /pha dầu 43 Bảng 3.3 Kết bào chế vi nang thay đổi tỷ lệ Tween 80 44 Bảng 3.4 Kết bào chế vi nang thay đổi nồng độ alginat 46 Bảng 3.5 Kết bào chế vi nang thay đổi nồng độ Calciclorid 48 Bảng 3.6 Kết bào chế vi nang thay đổi nồng độ glycerol 49 Bảng 3.7 Kết bào chế vi nang thay đổi nồng độ chitosan 51 Bảng 3.8 Kết đánh giá khả bảo vệ VSV vi nang môi trường acid pH 1,2 thay đổi nồng độ Chitosan 52 Bảng 3.9 Phần trăm số VSV sống sót thời điểm so với mật độ ban đầu pH 1,2 53 Bảng 3.10 Kết đánh giá khả giải phóng VSV mơi trường đệm phosphat pH 7,4 thay đổi nồng độ Chitosan 54 Bảng 3.11 Phần trăm số VSV giải phóng pH 7,4 so với mật độ ban đầu 55 Bảng 3.12 Kết bào chế vi nang thay đổi thời gian nhũ hóa TÊN BẢNG STT 56 TRANG Bảng 3.13 Kết bào chế vi nang thay đổi tốc độ khuấy môi trường 57 Bảng 3.14 Kết bào chế vi nang thay đổi thời gian ủ calci clorid 58 Bảng 3.15 Bảng 3.16 Bảng 3.17 Bảng 3.18 Bảng 3.19 Bảng 3.20 Bảng 3.21 Bảng 4.1 Kết bào chế vi nang thay đổi thời gian ủ vi nang chitosan Công thức vi nang L acidophilus bào chế phương pháp nhũ tương 59 60 Thơng số quy trình bào chế vi nang L acidophilus phương pháp nhũ tương Đặc tính vi nang L acidophilus sau đơng khô 60 62 Phần trăm khối lượng vi nang tăng lên mơi trường bão hịa muối Kali dihydrophotphat 63 Kết theo dõi chất lượng vi nang L acidophilus sau tháng bảo quản điều kiện thường 65 Kết theo dõi chất lượng vi nang L acidophilus sau tháng bảo quản tủ lạnh 65 So sánh kết nghiên cứu thời gian nhũ hóa với tác giả khác 74 DANH MỤC CÁC HÌNH STT TÊN HÌNH TRANG Hình 1.1 Hình ảnh L acidophilus kính hiển vi điện tử Hình 1.2 Các loại vi nang 10 Hình 1.3 Các giai đoạn q trình tách pha đơng tụ đơn 15 Hình 1.4 Công thức cổ điển hai đơn vị monomeric acid alginic 19 Hình 1.5 Cấu trúc dạng mono α-L-guluronic acid (G); β-D-mannuronic acid (M) dạng liên hợp Alginat 20 Hình 1.6 Vị trí ion calci gel tạo gel calci alginat 21 Hình 1.7 Cấu trúc hóa học chitin, chitosan cellulose 22 Hình 2.1 Mơ tả qui trình pha lỗng mẫu 35 Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn hiệu suất tạo vi nang, hiệu suất bao VSV, số lượng 43 VSV sau đông khô thay đổi tỷ lệ pha nước /pha dầu Hình 3.2 Hình 3.3 Hình 3.4 Hình 3.5 Hình 3.6 Hình 3.7 Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn hiệu suất tạo vi nang, hiệu suất bao VSV, số lượng VSV sau đông khô thay đổi tỷ lệ chất diện hoạt Đồ thị biểu diễn hiệu suất tạo vi nang, hiệu suất bao VSV, số lượng VSV sau đông khô thay đổi nồng độ alginat Đồ thị biểu diễn hiệu suất tạo vi nang, hiệu suất bao VSV, số lượng VSV sau đông khô thay đổi nồng độ Calciclorid Đồ thị biểu diễn hiệu suất tạo vi nang, hiệu suất bao VSV, số lượng VSV sau đông khô thay đổi nồng độ glycerol Đồ thị biểu diễn hiệu suất bao VSV, số lượng VSV 1g vi nang ĐK thay đổi nồng độ Chitosan Đồ thị biểu diễn phần trăm số lượng VSV sống sót môi trường acid pH 1,2 thay đổi nồng độ Chitosan Đồ thị biểu diễn phần trăm số lượng VSV giải phóng mơi 45 47 48 50 51 53 55 trường pH 7,4 thay đổi nồng độ Chitosan STT TÊN HÌNH TRANG Hình 3.9 Sơ đồ quy trình bào chế vi nang L acidophilus 61 Hình 3.10 Hình thái học vi nang đơng khơ 62 Hình 3.11 Hình 3.12 Đồ thị biểu diễn mối tương quan kích thước vi nang khả hút ẩm mơi trường bão hịa muối Kali dihydrophotphat Đồ thị biến thiên độ ẩm theo thời gian bảo quản Hình 3.13 Đồ thị biến thiên số lượng VSV theo thời gian bảo quản 64 65 66 ĐẶT VẤN ĐỀ Cùng với phát triển xã hội, khoa học công nghệ cụm từ, “chế phẩm sinh học” khơng cịn q xa lạ ngƣời Nhắc tới chế phẩm sinh học probiotic, prebiotic thấy đƣợc lợi ích mà chúng mang lại cho sức khỏe ngƣời Chế phẩm sinh học ngày đƣợc ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực đời sống nhƣ công nghiệp thực phẩm, sản xuất dƣợc phẩm, mỹ phẩm, nông nghiệp, thuốc thú y Đối với chế phẩm probiotic, khả ổn định hoạt tính probiotic vấn đề quan trọng Những năm gần đây, việc sử dụng polyme tự nhiên để thiết kế xây dựng hệ phân phối thuốc đƣợc nhiều nhà khoa học giới ý đến khả tƣơng thích sinh học phân hủy sinh học tốt chúng Các công nghệ khác nhƣ bao vi nang, cố định tế bào lên men liên tục đƣợc phát triển tế bào có số lƣợng cao quy mơ lớn đảm bảo tính ổn định probiotic thời gian dài Tuy nhiên, Việt Nam, sản phẩm probiotic chƣa đƣợc trọng nghiên cứu, nguồn cung cấp chủ yếu phụ thuộc vào nhập sản xuất nƣớc với quy mô nhỏ Sản phẩm nhập có chất lƣợng ổn định nhƣng giá thành cao; nhà sản xuất nƣớc chƣa quan tâm đến việc đầu tƣ công nghệ Sản phẩm probiotic nƣớc chủ yếu hệ cũ, đƣợc bảo vệ khỏi suy thối đƣờng tiêu hóa nhƣ giảm tỷ lệ sống sót gây yếu tố bên ngồi nhƣ bao bì điều kiện bảo quản Do đó, chế phẩm probiotic khơng phát huy đƣợc tác dụng nhƣ hiệu điều trị không cao Vì lý trên, chúng tơi thực đề tài: “Nghiên cứu bào chế vi nang Lactobacillus acidophilus với alginat chitosan phương pháp đông tụ từ nhũ tương” với hai mục tiêu sau: Xây dựng đƣợc công thức bào chế xác định đƣợc số thơng số quy trình bào chế vi nang L acidophilus với alginat chitosan phƣơng pháp nhũ tƣơng quy mơ phịng thí nghiệm Bƣớc đầu đánh giá độ ổn định vi nang L acidophilus bào chế đƣợc CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan probiotic 1.1.1 Đại cƣơng probiotic Khái niệm probiotic đƣợc đƣa nhà khoa học Eli Metchnikoff, ghi sách “Kéo dài sống” năm 1908 Ơng cho ngƣời nơng dân Bulgary sống lâu họ thƣờng xuyên sử dụng sữa chua có chứa VK lactic có lợi cho VSV đƣờng ruột [38] Đến năm 2002, Tổ chức Y tế giới (WHO) tổ chức Nông lƣơng giới (FAO) đƣa định nghĩa hoàn chỉnh probiotic nhƣ sau: “Probiotic VSV sống mà đƣa vào thể với lƣợng đủ lớn đem lại tác động có lợi cho sức khỏe vật chủ” [82] Những loài VK hay sử dụng chế phẩm probiotic thuộc chi Bifidobacterium chi Lactobacillus Trong trình sử dụng, VK probiotic bị ảnh hƣởng nhiều điều kiện bất lợi MT bên ngồi đƣờng tiêu hóa, để có tác dụng, sản phẩm chứa probiotic phải có 107 - 108 cfu/ml TB VSV sống ngày hết hạn sử dụng [45, 70] 1.1.2 Vai trò probiotic 1.1.2.1 Tác động kháng khuẩn Probiotic làm giảm số lƣợng VK để ngăn chặn mầm bệnh cụ thể là: Tiết chất kháng khuẩn: VK probiotic tạo chất đa dạng ức chế khuẩn Gram (+) Gram (-) gồm có acid hữu cơ, hydrogen peroxid chất diệt khuẩn Những hợp chất không làm giảm sinh vật mang mầm bệnh sống đƣợc mà cịn ảnh hƣởng đến trao đổi chất VK tạo độc tố làm giảm pH khoang ruột thông qua tạo acid chuỗi ngắn dễ bay hơi, chủ yếu acid acetic, propionic, butyric, acid lactic Các VSV probiotic cịn có khả cạnh tranh với VSV gây bệnh để ngăn chặn bám dính chúng vào đƣờng ruột cạnh tranh dinh dƣỡng cần thiết [72] 1.1.2.2 Tác động mơ biểu bì ruột - Probiotic đẩy mạnh liên kết chặt chẽ TB biểu mô tạo phân tử phòng vệ nhƣ chất nhầy lửng pha dầu bề mặt phân cách hai pha, làm cho q trình thu VN khó hơn, hao phí nhiều nên hiệu suất tạo VN thấp Hơn nữa, tốc độ nhẹ (mức 1) khuấy trộn AGL với ion Ca2+ không cấu trúc gel calci AGL lỏng lẻo, VN tạo thành mềm VSV dễ bị ngồi Khi tăng tốc độ khuấy lên mức lên mức AGL đƣợc khuấy trộn tiếp xúc với dung dịch CaCl2 nhiều hơn, từ tạo điều kiện cho ion Ca2+ xâm nhập củng cố mạng lƣới gel calci AGL Vì vậy, hiệu suất bao gói L acidophilus VN cao hơn, số lƣợng VSV 1g VN ĐK tăng lên Theo kết NC Ding Shah (2009) cho thấy với hai kỹ thuật đồng mà NC thử nghiệm phƣơng pháp sử dụng sóng siêu âm phƣơng pháp khuấy từ có tác dụng giảm KT VN Tuy nhiên, q trình đồng hóa VN thực với tốc độ cao (> 1000v/ph) làm giảm đáng kể khả sống sót VSV probiotic [28] NC Kunz Benno (2011) cho kết quả: tăng tốc độ khuấy từ 200v/ph lên 600v/ph dẫn đến giảm KT VN xuống lần Phần kết luận tác giả lựa chọn tốc độ khuấy thích hợp tạo VN 400v/ph [19] 4.1.2.3 Ảnh hưởng thời gian ủ calci clorid Kết NC mục 3.1.2.3 cho thấy: thời gian ủ VN CaCl2 tốt 30 phút Có thể nói: thời gian ủ CaCl2 q trình tạo phức hợp ion Ca2+ với AGL nên mục đích tạo điều kiện ion Ca2+ xâm nhập vào cấu trúc VN cịn cần thiết cho việc hồn thiện lớp áo calci AGL Chính vậy, với thời gian ủ 30 phút, lớp áo calci AGL bảo vệ VSV hoàn thiện làm số lƣợng VSV sống cao Khi ion Ca2+ hoàn thiện lớp calci AGL kéo dài thời gian ủ khơng làm thay đổi lớp calci AGL Điều giải thích cho kết ủ với thời gian 45 phút không thấy hiệu cao 30 phút Ngƣợc lại, thời gian ủ CaCl2 ngắn (trong 20 phút) ion Ca2+ chƣa tạo liên kết hoàn toàn với tất chuỗi G phân tử AGL, mạng lƣới liên kết gel calci AGL tạo thành lỏng lẻo, nên VSV dễ dàng ngồi làm cho VN khơng đồng hình dạng, cầu khơng Có thể giải thích thêm: ban đầu, VN tạo thành cịn bị dẹt, lõm Sau khoảng đến phút, VN phồng lên cầu, lúc hạt mềm Sau 75 bổ sung CaCl2 2% ủ 30 phút, hạt VN tạo đƣợc có thời gian tiếp xúc với dung dịch CaCl2 nhiều hơn, tạo điều kiện ion Ca2+ xâm nhập tạo nhiều liên kết nhóm -COO- AGL với ion Ca2+ nhằm ổn định cấu trúc VN, sau thời gian đƣợc ủ, hạt chắc, cầu Liên quan đến thời gian ủ VN CaCl2, theo NC tác giả Chandramouli (2004) thời gian ủ CaCl2 ảnh hƣởng đến số lƣợng VSV tồn VN sau điều kiện acid pH =2 Để VSV probiotic ổn định VN, tác giả cho VN nên đƣợc ủ dung dịch CaCl2 0,1M thời gian 30 phút trƣớc tiến hành bƣớc [22] Kết tƣơng đồng với kết NC Lotfipour (2012) tác giả xác định thời gian ủ VN L acidophilus thích hợp 35 phút, nồng độ AGL 1,5 % nồng độ CaCl2 2,5% [54] 4.1.2.4 Ảnh hưởng thời gian ủ chitosan Q trình ủ CS có tác dụng làm tăng q trình tiếp xúc gốc acid COOcủa AGL nhóm amin NH2- CS để hình thành liên kết CS AGL Q trình ủ CS giúp hồn thiện lớp áo kép polyme CS bao bên VN để bảo vệ L acidophilus, làm tăng hiệu bao gói VSV hạn chế đƣợc số lƣợng VSV bị ngồi Theo kết mục 3.1.2.4 cho thấy thời gian ủ tăng từ 20 phút lên 30 phút số VSV 1g VN tƣơi đƣợc tăng lên từ 1,2.1010 cfu/g đến 4,3.1010 cfu/g Tuy nhiên, q trình ủ có lƣợng TB bị thất ngồi MT bị chết ủ thời gian dài khơng có chất dinh dƣỡng Do vậy, kéo dài thời gian ủ lên 45 phút số VSV 1g VN tƣơi lại giảm 3,7.1010 cfu/g thấp so với ủ 30 phút Do thời gian ủ phù hợp NC 30 phút 4.2 Bàn luận kết theo dõi độ ổn định vi nang đông khô - Ở thời điểm ban đầu t=0: Kết đánh giá VN L acidophilus sau ĐK thu đƣợc bảng 3.19 cho thấy: hàm ẩm sau trình ĐK 2,48 %, KT trung bình 156,84 ± 65,09 µm số lƣợng VSV sống 3,2 1010 cfu/g Nhƣ mẫu VN bào chế theo công thức quy trình mà chúng tơi lựa chọn đạt u cầu hàm ẩm (≤ 5%) đạt số lƣợng VK probiotic (> 107 cfu/g), KT VN nằm khoảng từ 91,75àm ữ 221,93 àm 76 KT vi nang: ht VN thu đƣợc có KT trung bình nhỏ 156,84 µm nhiên trị số độ lệch chuẩn (SD) lớn cho thấy KT VN sau ĐK không đồng So sánh với kết tạo VN phƣơng pháp khác cho thấy VN bào chế theo phƣơng pháp nhũ tƣơng cho KT trung bình: lớn so với phƣơng pháp phun sấy [77] nhỏ phƣơng pháp đùn [64] Liên quan đến kết đánh giá kích thƣớc vi nang, Đỗ Quốc Cƣờng NC năm 2009 vi nang kích thƣớc 1,0 ± 0,1mm khả bảo vệ L acidophilus vi nang có kích thƣớc 2,0 ± 0,1mm 3,0 ± 0,1mm nhƣng lại phù hợp để lên men sữa chua vi nang có kích thƣớc lớn lên men biến động trình tƣơng đƣơng với tiếp giống TB tự do, đồng thời đánh giá cảm quan phƣơng pháp so sánh cặp cho thấy làm thay đổi giá trị cảm quan sản phẩm nhất: trạng thái sữa chua, màu, mùi, vị mẫu vi nang thấp mẫu TB tự nhƣng không đáng kể [2] Nhƣ vậy, vi nang chúng tơi bào chế đƣợc có kích thƣớc nhỏ 1,0 ± 0,1mm nên nhƣ đƣợc sử dụng làm nguyên liệu probiotic để bổ sung vào thực phẩm lên men (sữa chua, hoa quả…) khả thay đổi cảm quan sản phẩm ứng dụng đƣợc Liên quan đến kết phân tích hình thái học, Lee cộng (2004) tiến hành đánh giá ảnh hƣởng CS trọng lƣợng phân tử thấp, trung bình, cao (ký hiệu CS A, B C) đến hình thái vi nang bào chế theo phƣơng pháp phun sấy Kết cho thấy: vi nang đƣợc phủ CS A có hình cầu bề mặt mịn so với CS B C Điều đƣợc lý giải CS A có độ nhớt thấp nên khuếch tán nhanh chóng lên bề mặt vi nang Cịn dung dịch CS B,C chất sánh, đặc nên phun phân bố khơng đều, làm cho bề mặt vi nang khơng đồng sau đơng khơ bề mặt vi nang sần sùi, nhăn nheo, hình dạng bị biến đổi khơng cịn cầu Trong NC này, sử dụng CS trọng lƣợng phân tử thấp (5000 Da) nên vi nang thu đƣợc có hình thức tƣơng đối đạt: hình cầu, bề mặt mịn, khơng bị nhăn nheo, sần sùi - Độ ổn định vi nang bảo quản điều kiện thường tủ lạnh: Kết theo dõi mẫu VN sau tháng bảo quản điều kiện khác cho thấy: trình bảo quản mẫu VN Ở điều kiện nhiệt độ phòng tủ lạnh 77 hàm ẩm mẫu nói chung tăng dần, cịn số lƣợng VSV L acidophilus nang lại giảm dần Lý giải điều ẩm khơng khí khuếch tán qua bao bì đƣợc sản phẩm hấp thụ Hàm ẩm bên ngồi khơng khí cao, mẫu VN bảo quản dễ hút ẩm Tuy nhiên trình lấy mẫu chuẩn bị đo hàm ẩm, tiếp xúc với độ ẩm cao khơng khí, mẫu hút ẩm làm cho hàm ẩm tăng lên Hàm ẩm phụ thuộc đáng kể vào độ ẩm tƣơng đối khơng khí thời gian mẫu tiếp xúc với MT Ngƣợc lại, hàm ẩm cao khả sống sót VSV giảm Điều giải thích do: điều kiện có ẩm nhiệt độ thích hợp, VSV trở lại trạng thái hoạt động, sinh trƣởng, phát triển, già hóa chết Do đó, để VN L acidophilus dạng ĐK ổn định mẫu cần phải đƣợc bảo quản bao bì kín tránh đƣợc khuếch tán ẩm khơng khí từ ngồi MT Nhiều NC ra: ngồi hàm ẩm yếu tố nhiệt độ MT yếu tố quan trọng làm giảm số lƣợng VSV đặc biệt chủng nhạy cảm với nhiệt độ nhƣ L acidophilus Chính vậy, ngồi theo dõi thay đổi độ ẩm số lƣợng VSV sống sót, NC chúng tơi tiến hành NC bảo quản mẫu VN ĐK hai điều kiện nhiệt độ bên khác 40C, 250C để đánh giá ảnh hƣởng Tuy nhiên kết NC cho thấy số lƣợng VSV thay đổi tháng bảo quản điều kiện thƣờng (250C) tủ lạnh (40C) khơng thấy có khác biệt hai điều kiện (p > 0,05) Trong NC Nguyễn Mai Hƣơng (2012) theo dõi hàm ẩm số lƣợng VSV mẫu VN L acidophilus bảo quản điều kiện thƣờng cho thấy số lƣợng VSV mẫu giảm tỷ lệ nghịch với hàm ẩm: thời điểm đánh giá mẫu sau ĐK lƣợng VSV đạt 1,48 x 1010 cfu/g, độ ẩm 2,03% nhƣng kết sau 12 tuần hàm ẩm đo đƣợc 3,24% số VSV giảm xuống 3,78 x 10 cfu/g [7] Tƣơng tự, NC năm 2014 Song Huiyi cộng độ ổn định VN probiotic tiến hành tháng cho thấy: số lƣợng VSV tất mẫu có xu hƣớng giảm dần nhiệt độ thời gian bảo quản tăng lên [78] 78 Trong trình bảo quản, khơng nhiệt độ mà độ ẩm yếu tố quan trọng định sống sót VK probiotic [42] Theo NC Heidebach năm 2010, cho thấy độ ẩm ảnh hƣởng đến sống sót VSV q trình bảo quản độ ẩm có liên quan đến hoạt độ nƣớc aw mẫu Cụ thể: hoạt độ nƣớc mẫu cân với độ ẩm khơng khí xung quanh, nên độ ẩm bên cao dẫn đến gia tăng nồng độ nƣớc hoạt động mẫu, dẫn tới trình oxy hóa gia tăng nhanh chóng gây bất lợi cho VSV Ngƣợc lại, độ ẩm MT thấp khiến nƣớc từ TB khuếch tán bên dẫn đến giảm thiệt hại cho VK Chính điều kiện tối ƣu mà tác giả RH khoảng từ – 11% [43] Khả sống sót probiotic phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhƣ: chủng vi sinh, dạng bào chế vi nang, độ ẩm tuyệt đối (RH) mức độ khử hoạt tính Đối với dạng bào chế VN thấy VSV đƣợc bảo vệ khỏi tác động nhiệt độ điều kiện nhiệt độ thấp có lợi cho ổn định VSV hơn, góp phần hạn chế ảnh hƣởng độ ẩm [15, 43] 79 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT KẾT LUẬN Trải qua thời gian NC, đề tài đạt đƣợc số kết nhƣ sau: Kết xây dựng cơng thức quy trình bào chế vi nang L acidophilus: Đề tài xác định đƣợc thành phần công thức thơng số kỹ thuật quy trình bào chế vi nang L acidophilus khả thi quy mơ phịng thí nghiệm - Chi tiết thành phần cơng thức tốt nhƣ sau: Thể tích CT cắn sinh khối TB 26 - 10ml Tỷ lệ Tween 80 0,4% Tỷ lệ pha Nồng độ nội/pha calci ngoại clorid 40/100 2% Nồng độ alginat 3% Tỷ lệ Nồng độ glycerol chitosan 15% 0,4% Các thơng số quy trình bào chế vi nang theo phƣơng pháp nhũ tƣơng: Thời gian nhũ hóa: 20 phút Tốc độ nhũ hóa: 400 – 500 vòng/ phút Thời gian ủ dung dịch Calci clorid: 30 phút Thời gian ủ dung dịch CS: 30 phút Kết theo dõi độ ổn định vi nang L acidophilus đông khô Đề tài đánh giá đƣợc độ ổn định vi nang L acidophilus sau ĐK hai điều kiện khác nhiệt độ phòng tủ lạnh thời gian tháng: Vào thời điểm kết thúc trình đánh giá (tháng thứ 5) hàm ẩm mẫu đo đƣợc đạt quy định hàm ẩm là: 4,05% (điều kiện thƣờng) 3,89% (trong tủ lạnh) Số lƣợng VSV sống có giảm sút theo thời gian bảo quản nhƣng cao mật độ tối thiểu 107 cfu/g với kết tƣơng ứng 1,8.109 cfu/g 5,4.109 cfu/g NC không thấy đƣợc khác biệt có ý nghĩa thống kê hàm ẩm mật độ VSV bảo quản vi nang hai điều kiện nhiệt độ (p > 0,05) 80 ĐỀ XUẤT - Tiếp tục NC bào chế vi nang L acidophilus kết hợp với số VK probiotic khác để tạo thêm nhiều sản phẩm phục vụ cho nhu cầu ngày tăng sản phẩm probiotic - Nên có thêm NC để đánh giá sâu ảnh hƣởng loại bao bì khác đến độ ổn định vi nang L acidophilus trình bảo quản Từ lựa chọn bao bì bảo quản tốt cho chế phẩm probiotic để chúng phát huy tối đa tác dụng sử dụng Bởi điều kiện khí hậu nóng, ẩm cao kéo dài nhƣ nƣớc ta VSV dễ bị tiêu diệt 81 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Bộ Y tế (2010), "Quá trình thiết bị", Nhà xuất Y học Đỗ Quốc Cƣờng (2009), "Nâng cao chất lƣợng sữa chua phƣơng pháp vi gói vi khuẩn lactic", Khóa luận tốt nghiệp Đại học, Trường Đại Học Kỹ thuật công nghệ TP HCM Võ Huy Dâng (2002), "Công nghệ vật liệu y sinh học", tr 350-358 Lê Thị Thu Hiền, Đàm Thanh Xuân, Lê Ngọc Khánh (2012 ), "Nghiên cứu sử dụng tế bào vi khuẩn Lactobacillus acidophilus cố định chất mang alginat lên men sản xuất calci lactat", Tạp chí hóa học, 50(5A), tr 117121 Nguyễn Trọng Hiệp, Bùi Tùng Hiệp, Nguyễn Văn Vinh (2009), "Bàn khả sống sót vi sinh vật sản phẩm probiotics", Tạp chí dược học, tr 4-7 Phạm Thị Minh Huệ "Nghiên cứu bào chế viên nén nifidipin tác dụng kéo dài", Luận án tiến sỹ dược học, trường Đại học Dược Hà Nội, tr 22 - 32 Nguyễn Mai Hƣơng (2014), "Nghiên cứu sử dụng tinh bột làm chất bảo vệ trình tạo nguyên liệu probiotic chứa Lactobacillus acidophilus", Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, Trường Đại học Dược Hà nội Nguyễn Thị Huyền, CS (2014), "Khảo sát thành phần vi sinh đặc tính probiotic sản phẩm men tiêu hóa thị trƣờng", Tạp chí khoa học phát triển, tập 12 số 1, tr 65-72 Nguyễn Văn Long (1997), "Vi nang", Tài liệu sau đại học, trường Đại học Dược Hà Nội 10 Nguyễn Văn Long (2005), "Một số chuyên đề bào chế đại", NXB Y học, Hà Nội 11 Lê Quan Nghiệm, Huỳnh Văn Hóa (2007), "Bào chế sinh dƣợc học ", NXB Giáo dục, Hà Nội 12 Lê Xuân Phƣơng (2008), "Thí nghiệm vi sinh vật học", Đại học Đà Nẵng 13 Ninh Thị Kim Thu, Đàm Thanh Xuân, Nguyễn Thị Trinh Lan (2013), "Nghiên Cứu Vai Trị Của Alginat Trong Q Trình Tạo Nguyên Liệu Probiotics Chứa Lactobacillus Acidophilus", Luận văn thạc sỹ dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội TIẾNG ANH 14 Abbaszadeh Sepideh, Gandomi Hassan, Misaghi Ali, et al (2014), "The effect of alginate and chitosan concentrations on some properties of chitosan‐coated alginate beads and survivability of encapsulated Lactobacillus rhamnosus in simulated gastrointestinal conditions and during heat processing", Journal of the Science of Food and Agriculture, 94 (11), pp 2210-2216 15 Abe Fumiaki, Miyauchi Hirofumi, Uchijima Ayako, et al (2009), "Effects of storage temperature and water activity on the survival of Bifidobacteria in powder form", International journal of dairy technology, 62 (2), pp 234239 16 Altermann Eric, Russell W Michael, Azcarate-Peril M Andrea, et al (2005), "Complete genome sequence of the probiotic lactic acid bacterium Lactobacillus acidophilus NCFM", Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 102 (11), pp 3906-3912 17 Anal Anil Kumar, Singh Harjinder (2007), "Recent advances in microencapsulation of probiotics for industrial applications and targeted delivery", Trends in Food Science & Technology, 18 (5), pp 240-251 18 Ann Eun Y, Kim Younghoon, Oh Sejong, et al (2007), "Microencapsulation of Lactobacillus acidophilus ATCC 43121 with prebiotic substrates using a hybridisation system", International journal of food science & technology, 42 (4), pp 411-419 19 Anwar Sri Haryani, Kunz Benno (2011), "The influence of drying methods on the stabilization of fish oil microcapsules: Comparison of spray granulation, spray drying, and freeze drying", Journal of Food Engineering, 105 (2), pp 367-378 20 Brownlie K, M Lakkis Jamileh (2007), Encapsulation and Controlled Release Technologies in Food Systems, Second Edition, pp 1-15 21 Carr Frank J, Chill Don, Maida Nino (2002), "The lactic acid bacteria: a literature survey", Critical reviews in microbiology, 28 (4), pp 281-370 22 Chandramouli V, Kailasapathy K, Peiris P, et al (2004), "An improved method of microencapsulation and its evaluation to protect Lactobacillus spp in simulated gastric conditions", Journal of microbiological methods, 56 (1), pp 27-35 23 Chávarri María, Marón Izaskun, Ares Raquel, et al (2010), "Microencapsulation of a probiotic and prebiotic in alginate-chitosan 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 capsules improves survival in simulated gastro-intestinal conditions", International journal of food microbiology, 142 (1), pp 185-189 Chopde Santosh, Pawar Nilkanth, Kele Vijay, et al (2014), "Microencapsulation of probiotic bacteria of available techniques, focusing on biomaterials-a review", Agricultural Reviews, 35 (4), pp 287-294 Claesson Marcus J, van Sinderen Douwe, O'Toole Paul W (2008), "Lactobacillus phylogenomics–towards a reclassification of the genus", International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 58 (12), pp 2945-2954 Dianawati Dianawati, Mishra Vijay, Shah Nagendra P (2012), "Role of calcium alginate and mannitol in protecting Bifidobacterium", Applied and environmental microbiology, 78 (19), pp 6914-6921 Ding WK, Shah Nagendra P (2008), "Survival of free and microencapsulated probiotic bacteria in orange and apple juices", Int Food Res J, 15 (2), pp 219-32 Ding WK, Shah Nagendra P (2009), "Effect of homogenization techniques on reducing the size of microcapsules and the survival of probiotic bacteria therein", Journal of food science, 74 (6), pp 231-236 Donthidi AR, Tester Richard F, Aidoo Kofi E (2010), "Effect of lecithin and starch on alginate-encapsulated probiotic bacteria", Journal of microencapsulation, 27 (1), pp 67-77 Etchepare Mariana de Araújo, Barin Juliano Smanioto, Cichoski Alexandre José, et al (2015), "Microencapsulation of probiotics using sodium alginate", Ciência Rural, 45 (7), pp 1319-1326 Favaro-Trindade CS, Heinemann RJB, Pedroso DL (2011), "Developments in probiotic encapsulation", CAB Rev, 6, pp 1-8 Gbassi Gildas K, Vandamme Thierry (2012), "Probiotic encapsulation technology: from microencapsulation to release into the gut", Pharmaceutics, (1), pp 149-163 Gibson Glenn R, Fuller Roy (2000), "Aspects of in vitro and in vivo research approaches directed toward identifying probiotics and prebiotics for human use", The journal of nutrition, 130 (2), pp 391S-395S Goderska Kamila (2012), Different methods of probiotics stabilization, INTECH Open Access Publisher, pp Gomes Ana MP, Malcata F Xavier (1999), "Bifidobacterium spp and Lactobacillus acidophilus: biological, biochemical, technological and 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 therapeutical properties relevant for use as probiotics", Trends in Food Science & Technology, 10 (4), pp 139-157 Gong Jianhua, Forster Robert J, Yu Hai, et al (2002), "Diversity and phylogenetic analysis of bacteria in the mucosa of chicken ceca and comparison with bacteria in the cecal lumen", FEMS microbiology letters, 208 (1), pp 1-7 Grant Gregor T, Morris Edwin R, Rees David A, et al (1973), "Biological interactions between polysaccharides and divalent cations: the egg-box model", FEBS letters, 32 (1), pp 195-198 Guarner Francisco, Khan Aamir G, Garisch J, et al (2008), "World Gastroenterology Organisation Practice Guideline: Probiotics and PrebioticsMay 2008: guideline", South African Gastroenterology Review, (2), pp 1425 Gupta Kailash C, Ravi Kumar Majeti NV (2000), "An overview on chitin and chitosan applications with an emphasis on controlled drug release formulations", Journal of Macromolecular Science, Part C: Polymer Reviews, 40 (4), pp 273-308 Hanna Marwan Y AlHurr Aseel I Ibrahim Mumtaz K (2011), "Formulation & stability of Lactobacillus acidophilus microcapsules with a clinical trial for treatment and eradication of Helicobacter pylori infections", pp Hansen L Truelstrup, Allan-Wojtas PM, Jin Y-L, et al (2002), "Survival of Ca-alginate microencapsulated Bifidobacterium spp in milk and simulated gastrointestinal conditions", Food Microbiology, 19 (1), pp 35-45 Heidebach Thomas, Först Petra, Kulozik Ulrich (2010), "Influence of caseinbased microencapsulation on freeze-drying and storage of probiotic cells", Journal of Food Engineering, 98 (3), pp 309-316 Higl Bettina, Kurtmann Lone, Carlsen Charlotte U, et al (2007), "Impact of Water Activity, Temperature, and Physical State on the Storage Stability of Lactobacillus paracasei ssp paracasei Freeze‐Dried in a Lactose Matrix", Biotechnology Progress, 23 (4), pp 794-800 Husni Rola N, Gordon Steven M, Washington John A, et al (1997), "Lactobacillus bacteremia and endocarditis: review of 45 cases", Clinical Infectious Diseases, 25 (5), pp 1048-1055 Joint FAO (2002), "WHO working group report on drafting guidelines for the evaluation of probiotics in food", London, Ontario, Canada, 30, pp Kailasapathy K, Sultana K (2003), "Survival and [beta]-D-galactosidase activity of encapsulated and free Lactobacillus acidophilus and 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 Bifidobacterium lactis in ice-cream", Australian journal of dairy technology, 58 (3), pp 223 Kailasapathy Kaila (2002), "Microencapsulation of probiotic bacteria: technology and potential applications", Current issues in intestinal microbiology, (2), pp 39-48 Kalliomäki Marko, Salminen Seppo, Arvilommi Heikki, et al (2001), "Probiotics in primary prevention of atopic disease: a randomised placebocontrolled trial", The Lancet, 357 (9262), pp 1076-1079 Ko JA, Park Hyun Jin, Hwang SJ, et al (2002), "Preparation and characterization of chitosan microparticles intended for controlled drug delivery", International journal of pharmaceutics, 249 (1), pp 165-174 Krasaekoopt Wunwisa, Bhandari Bhesh, Deeth Hilton (2003), "Evaluation of encapsulation techniques of probiotics for yoghurt", International Dairy Journal, 13 (1), pp 3-13 Krasaekoopt Wunwisa, Bhandari Bhesh, Deeth Hilton (2004), "The influence of coating materials on some properties of alginate beads and survivability of microencapsulated probiotic bacteria", International dairy journal, 14 (8), pp 737-743 Kumar Manoj, Kumar Ashok, Nagpal Ravinder, et al (2010), "Cancerpreventing attributes of probiotics: an update", International journal of food sciences and nutrition, 61 (5), pp 473-496 Lee JS, Cha DS, Park Hyun Jin (2004), "Survival of freeze-dried Lactobacillus bulgaricus KFRI 673 in chitosan-coated calcium alginate microparticles", Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52 (24), pp 7300-7305 Lotfipour Farzaneh, Mirzaeei Shahla, Maghsoodi Maryam (2012), "Evaluation of the effect of CaCl2 and alginate concentrations and hardening time on the characteristics of Lactobacillus acidophilus loaded alginate beads using response surface analysis", Advanced pharmaceutical bulletin, (1), pp 71 Mandal S, Puniya AK, Singh K (2006), "Effect of alginate concentrations on survival of microencapsulated Lactobacillus casei NCDC-298", International Dairy Journal, 16 (10), pp 1190-1195 Martin MJ, Lara-Villoslada F, Ruiz MA, et al (2013), "Effect of unmodified starch on viability of alginate-encapsulated Lactobacillus fermentum CECT5716", LWT-Food Science and Technology, 53 (2), pp 480-486 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 Mortazavian Amir, Razavi Seyed Hadi, Ehsani Mohammad Reza, et al (2007), "Principles and methods of microencapsulation of probiotic microorganisms", Iranian journal of biotechnology, (1), pp 1-18 Murtaza Ghulam, Waseem Amir, Hussain Izhar (2011), "Alginate microparticles for biodelivery: A review", African Journal of Pharmacy and Pharmacology, (25), pp 2726-2737 Naruszewicz Marek, Johansson Marie-Louise, Zapolska-Downar Danuta, et al (2002), "Effect of Lactobacillus plantarum 299v on cardiovascular disease risk factors in smokers", The American journal of clinical nutrition, 76 (6), pp 1249-1255 Nazzaro Filomena, Fratianni Florinda, Coppola Raffaele, et al (2009), "Fermentative ability of alginate-prebiotic encapsulated Lactobacillus acidophilus and survival under simulated gastrointestinal conditions", Journal of Functional Foods, (3), pp 319-323 Netherwood Trudy, Gilbert HJ, Parker DS, et al (1999), "Probiotics shown to change bacterial community structure in the avian gastrointestinal tract", Applied and environmental microbiology, 65 (11), pp 5134-5138 Patil Poonam, Chavanke Daksha, Wagh Milind (2012), "A review on ionotropic gelation method: novel approach for controlled gastroretentive gelispheres", Int J Pharm Pharm Sci, (4), pp 27-32 Patterson JA, Burkholder KM (2003), "Application of prebiotics and probiotics in poultry production", Poultry science, 82 (4), pp 627-631 Petrović Tanja, Nedović Viktor, Dimitrijević-Branković Suzana, et al (2007), "Protection of probiotic microorganisms by microencapsulation", Chemical Industry and Chemical Engineering Quarterly/CICEQ, 13 (3), pp 169-174 Pop Oana Lelia, Diaconeasa Zoriţa, Thorsten Brandau, et al (2015), "Effect of Glycerol, as Cryoprotectant in the Encapsulation and Freeze Drying of Microspheres Containing Probiotic Cells", Bulletin of University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine Cluj-Napoca Food Science and Technology, 72 (1), pp 27-32 Porubcan Randolph Stanley (2006), "Formulations to increase in vivo survival of probiotic bacteria and extend their shelf-life", pp Postgate JR, Hunter JR (1961), "On the survival of frozen bacteria", Microbiology, 26 (3), pp 367-378 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 Rokka Susanna, Rantamäki Pirjo (2010), "Protecting probiotic bacteria by microencapsulation: challenges for industrial applications", European Food Research and Technology, 231 (1), pp 1-12 Rowe Raymond C, Sheskey Paul J, Quinn Marian E (2009), Handbook of pharmaceutical excipients, Pharmaceutical press, pp Saad N, Delattre C, Urdaci M, et al (2013), "An overview of the last advances in probiotic and prebiotic field", LWT-Food Science and Technology, 50 (1), pp 1-16 Santivarangkna Chalat, Naumann Dieter, Kulozik Ulrich, et al (2010), "Protective effects of sorbitol during the vacuum drying of Lactobacillus helveticus: an FT-IR study", Annals of microbiology, 60 (2), pp 235-242 Shah Nagendra P (2007), "Functional cultures and health benefits", International Dairy Journal, 17 (11), pp 1262-1277 Sheu TY, Marshall RT (1993), "Microentrapment of lactobacilli in calcium alginate gels", Journal of Food Science, 58 (3), pp 557-561 Silva Catarina M, Ribeiro António J, Figueiredo Isabel Vitória, et al (2006), "Alginate microspheres prepared by internal gelation: Development and effect on insulin stability", International journal of pharmaceutics, 311 (1), pp 1-10 Singh Pramod Kumar, Deol Parneet Kaur, Kaur Indu Pal (2012), "Entrapment of Lactobacillus acidophilus into alginate beads for the effective treatment of cold restraint stress induced gastric ulcer", Food & function, (1), pp 83-90 Soccol Carlos Ricardo, Vandenberghe Luciana Porto de Souza, Spier Michele Rigon, et al (2010), "The potential of probiotics: a review", Food Technology and Biotechnology, 48 (4), pp 413-434 Sohail Asma, Turner Mark S, Coombes Allan, et al (2011), "Survivability of probiotics encapsulated in alginate gel microbeads using a novel impinging aerosols method", International Journal of Food Microbiology, 145 (1), pp 162-168 Song Huiyi, Yu Weiting, Liu Xiudong, et al (2014), "Improved probiotic viability in stress environments with post-culture of alginate–chitosan microencapsulated low density cells", Carbohydrate polymers, 108, pp 1016 Sultana Khalida, Godward Georgia, Reynolds N, et al (2000), "Encapsulation of politicos bacteria with alginate–starch and evaluation of 80 81 82 83 84 survival in simulated gastrointestinal conditions and in yoghurt", International journal of food microbiology, 62 (1), pp 47-55 Umer Hammad, Nigam Hemlata, Tamboli Asif M, et al (2011), "Microencapsulation: Process, techniques and applications", International journal of research in pharmaceutical and biomedical sciences, (2), pp 474-481 Vivek K (2013), "Use of encapsulated probiotics in dairy based foods", International Journal of Food, Agriculture and Veterinary Sciences, (1), pp 188-99 WHO (2006), Probiotics in food: health and nutritional properties and guidelines for evaluation, Food and Agriculture Organization of the United Nations, pp Yoon Ho-Geun, Lee Kyung-Han, Kim Hee-Yun, et al (2002), "Gene cloning and biochemical analysis of thermostable chitosanase (TCH-2) from Bacillus coagulans CK108", Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 66 (5), pp 986-995 Zanjani Mohammad Ali Khosravi, Tarzi Babak Ghiassi, Sharifan Anousheh, et al (2014), "Microencapsulation of probiotics by calcium alginategelatinized starch with chitosan coating and evaluation of survival in simulated human gastro-intestinal condition", Iranian journal of pharmaceutical research: IJPR, 13 (3), pp 843 ... chitosan Công thức vi nang L acidophilus bào chế phương pháp nhũ tương 59 60 Thông số quy trình bào chế vi nang L acidophilus phương pháp nhũ tương Đặc tính vi nang L acidophilus sau đông khô 60 62... Kết bào chế vi nang thay đổi nồng độ alginat 46 Bảng 3.5 Kết bào chế vi nang thay đổi nồng độ Calciclorid 48 Bảng 3.6 Kết bào chế vi nang thay đổi nồng độ glycerol 49 Bảng 3.7 Kết bào chế vi nang. .. muốn a) b) c) d) Hình 1.2 – Các loại vi nang e) a) Vi nang dạng lỏng; b) Vi nang dạng rắn; c) Vi nang nhiều lớp; d) Vi nang đa nhân; e) Vi nang vi nang Vi nang có nhiều loại: VN đơn nhân VN phần