ĐỀ TÀI Các phương pháp hóa lý kiểm nghiệm thuốc L/O/G/O www.trungtamtinhoc.edu.vn CÁC PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ TRONG KIỂM NGHIỆM THUỐC Phần Phần PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ PHÂN TỬ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO www.trungtamtinhoc.edu.vn PHẦN PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ PHÂN TỬ I Quang phổ hấp thụ UV-VIS II Quang phổ hồng ngoại (IR) III Quang phổ huỳnh quang I QUANG PHỔ HẤP THỤ UV-VIS Độ hấp thụ – Độ hấp thụ tuân theo định luật Lambert – Beer biểu diễn phương trình sau: A= 𝟏 𝐋𝐠 𝐓 = 𝐈𝟎 𝐥𝐠 𝐈 = 𝐊𝐂𝐋 Trong đó: T : Độ truyền qua I0 : cường độ ánh sáng đơn sắc tới I : cường độ ánh sáng đơn sắc sau truyền qua dung dịch K : hệ số hấp thụ phụ thuộc λ, thay đổi theo cách biểu thị nồng độ L : chiều dài lớp dung dịch C : nồng độ chất tan dung dịch www.trungtamtinhoc.edu.vn ĐIỀU KIỆN ÁP DỤNG: Ánh sáng phải đơn sắc Khoảng nồng độ phải thích hợp: định luật Lambert- beer giới hạn định nồng độ Dung dịch phải suốt Chất thử phải bền dung dịch bề tác dụng ánh sáng UV VIS www.trungtamtinhoc.edu.vn MÁY QUANG PHỔ Máy quang phổ thích hợp cho việc đo phổ vùng tử ngoại khả kiến gồm hệ quang học có khả tạo ánh sáng đơn sắc vùng từ 200 đến 800nm thiếp bị thích hợp để đo độ hấp thụ www.trungtamtinhoc.edu.vn HIỆU CHỈNH MÁY QUANG PHỔ Kiểm tra độ dài sóng HIỆU CHỈNH Kiểm tra độ hấp thụ Giới hạn ánh sáng lạc Độ phân giải Độ rộng giải phổ nguồn Cuvet www.trungtamtinhoc.edu.vn ỨNG DỤNG CỦA PHỔ UV-VIS TRONG KIỂM NGHIỆM THUỐC  Định tính khử tinh khiết: cực đại hấp thụ đặc trưng định tính chất  Định lượng: chọn điều kiện xây dựng quy trình định lượng Chọn bước sóng kính lọc Chọn khoảng nồng độ thích hợp Chọn điều kiện khác: loại trừ ảnh hưởng chất lạ, chọn pH dung môi thích hợp, thực phản ứng màu, www.trungtamtinhoc.edu.vn Các phương pháp định lượng: Phương pháp đo phổ trực tiếp: − Đo phổ hấp thụ A dung dịch, tính nồng độ C dựa vào giá trị độ hấp thụ riêng: A = E1%1cm L.C L = 1cm  C = 𝐴 𝐸1%1𝑐𝑚  Để áp dụng phương pháp này, cần phải chuẩn hóa máy quang phổ bước sóng lẫn độ hấp thụ  Phương pháp gián tiếp: phương pháp đường chuẩn, so sánh thêm chuẩn Đặc điểm phương pháp gián tiếp:  Phải có chất chuẩn để so sánh  Có thể không cần phải chuẩn máy www.trungtamtinhoc.edu.vn  Phương pháp so sánh: theo định luật Lambert- beer suy ra: Cx = 𝐴𝑋 Cs 𝐴𝑠 Trong đó: Ax độ hấp thụ dung dịch mẫu thử có nồng độ Cx As độ hấp thụ dung dịch chuẩn có nồng độ Cs  Chú ý: nồng độ dung dịch thử Cx Cs không chênh lệch nhiều 10 www.trungtamtinhoc.edu.vn Định lượng phương pháp HPLC Quá trình định lượng HPLC chia thành bước: Phương pháp định lượng Đo tín hiệu detector Tiến hành sắc kí Lấy mẫu thử 31 www.trungtamtinhoc.edu.vn  Lấy mẫu Sai số lấy mẫu tăng lên khâu sau: Lấy mẫu đại diện Bảo quản mẫu 02 01 03 Xử lý mẫu 32 www.trungtamtinhoc.edu.vn  Tiến hành tách sắc ký Quá trình chạy sắc ký cần ý: Có thể xảy phân hủy chất thử phân tích Có thể xuất pic lạ sắc đồ Vì cần phải kiểm tra sắc ký vết tạp 33 www.trungtamtinhoc.edu.vn  Tiến hành tách sắc ký • Chuẩn bị mẫu thử • Tiêm mẫu Dung môi phải đáp ứng yêu cầu sau: Độ tinh khiết cao để pic lạ Có thể hòa lẫn với dung môi rửa giải Có cách tiêm mẫu vào cột Dùng bơm tiêm Cho đáp ứng nhỏ với detector Dung môi dung dịch thử phải lọc qua màng lọc 0,45 𝝁𝒎 Dùng van tiêm mẫu thể tích xác định 34 www.trungtamtinhoc.edu.vn  Đo tín hiệu detector (detector UV-VIS) a) Detector phải đáp ứng yêu cầu sau: b) Tín hiệu detector • Hoạt động vùng tuyến tính • Có độ hấp thụ nhỏ dung môi • Tránh lọt không khí vào cột detector • Giữ cell làm thường xuyên • Tín hiệu detector đo chất khỏi cột sắc ký máy ghi lại dạng pic 35 www.trungtamtinhoc.edu.vn CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG Phương pháp chuẩn hóa điện tích 04 Phương pháp chuẩn ngoại 01 03 Phương pháp thêm chuẩn 02 Phương pháp chuẩn nội 36 www.trungtamtinhoc.edu.vn 6.1 Phương pháp chuẩn ngoại - Phương pháp chuẩn ngoại phương pháp hai mẫu chuẩn mẩu thử tiến hành điều kiện - So sánh diện tích (chiều cao) pic mẫu thử với diện tích (chiều cao) pic mẫu chuẩn tính nồng độ chất mẫu thử Phương pháp chuẩn hóa: Một điểm Nhiều điểm 37 www.trungtamtinhoc.edu.vn 6.1 Phương pháp chuẩn ngoại Chuẩn hóa điểm: chọn nồng độ mẫu chuẩn xấp xỉ với nồng độ mẩu thử Tính nồng độ mẫu thử theo công thức: 𝑆𝑋 𝐶𝑋 = 𝐶𝑆 𝑆𝑆 Trong đó: CX: nồng độ mẫu thử SX (HX): diện tích (chiều cao) pic mẫu thử CS: nồng độ chất chuẩn SS (HS): diện tích (chiều cao) pic mẫu chuẩn 38 www.trungtamtinhoc.edu.vn 6.1 Phương pháp chuẩn ngoại Chuẩn hóa nhiều điểm: Đối với mẫu chuẩn ta tiến hành sau: - Chuẩn bị dãy chuẩn với nồng độ tăng dần tiến hành sắc ký S1 X S2 - Vẽ đồ thị chuẩn biểu diễn tương quan diện tích S pic với nồng độ chất chuẩn C 39 www.trungtamtinhoc.edu.vn 6.1 Phương pháp chuẩn ngoại  Đối với mẫu thử: Chuẩn bị dãy mẫu thử với nồng độ tăng dần  sắc ký - Áp kiện diện tích (chiều cao) pic chất thử vào đường chuẩn nồng độ Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính: Y = a + bCx Trong đó: Y : Diện tích pic a : Giao điểm đường chuẩn với trục tung b : Độ dốc đường chuẩn Cx: Nồng độ chất thử 40 www.trungtamtinhoc.edu.vn Lưu ý: Độ lớn diện tích ( chiều cao) pic mẫu thử phải nằm đoạn tuyến tính đường chuẩn Khoảng tuyến tính S1 x S2 41 www.trungtamtinhoc.edu.vn 6.2 Phương pháp chuẩn nội  Là phương pháp người ta thêm vào mẫu chuẩn lẫn mẫu thử lượng chất tinh khiết, tiến hành sắc ký điều kiện  Chất thêm gọi chuẩn nội 42 www.trungtamtinhoc.edu.vn 6.2 Phương pháp chuẩn nội Yêu cầu chất chuẩn nội: Không phản ứng với thành phần mẫu thử Phải có độ tinh khiết cao dễ kiếm Có cấu trúc hóa học tương tự chất thử Có nồng độ xấp xỉ với nồng độ chất thử 43 www.trungtamtinhoc.edu.vn 6.2 Phương pháp chuẩn nội Phương pháp chuẩn hóa điểm     Hệ số đáp ứng Fx: Phương pháp𝑚𝐶chuẩn hóa nhiều điểm 𝑆𝐶 𝑚𝐶 𝑆𝐼𝑆  Đối với mẫu thử: 𝐹𝑋 = : = 𝑚𝐼𝑆 𝑆𝐼𝑆 𝑚𝐼𝑆 𝑆𝐶 Chuẩn bị dãy chuẩn có chứa Là phương-Ta pháp chuẩn nội thêm tiến hành song song 𝐶𝐶 𝑆𝐼𝑆 độ) chất chuẩn khác lượng (hoặc vào haiđược mẫu thêm chuẩnchuẩn mẫu nộithử vớilượng 𝐹𝑋 = nồng 𝐶𝐼𝑆 𝑆𝐶 tất chứa chứa Tiến hành sắc ký nồng độ thang chuẩn Tronglượng đó: (hoặc nồng độ) chuẩn nội tỉ số Shoặc /S dựa vào Công thức-Tính tính lượng nồng độ T is mC,mIS khối lượng chất chuẩn chuẩn nội hành sắc kí vẽ đường chuẩn tìm nồng - Tiến thành phầnđường chuẩn mẫu thử CC,CIS nồng độ chuẩn chuẩn nội độ chất thử (CT) Tính lượng: SC, SIS lần lược diện tích pic chuẩn chuẩn nội 𝑆𝑇 𝑚𝑇 = 𝑚𝐼𝑆 𝐹𝑋 𝑆𝐼𝑆 Tính nồng độ: 𝑆𝑇 𝐶𝑇 = 𝐶𝐼𝑆 𝐹𝑋 𝑆𝐼𝑆 44 www.trungtamtinhoc.edu.vn L/O/G/O Nhóm www.trungtamtinhoc.edu.vn 45 [...]... sạch nó thường xuyên • Tín hiệu detector đo được khi chất ra khỏi cột sắc ký được máy ghi lại dưới dạng pic 35 www.trungtamtinhoc.edu.vn 6 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG Phương pháp chuẩn hóa điện tích 04 Phương pháp chuẩn ngoại 01 03 Phương pháp thêm chuẩn 02 Phương pháp chuẩn nội 36 www.trungtamtinhoc.edu.vn ... rửa giải: Trong sắc kí pha đảo các chất phân cực ra trước, các chất ít và không phân cực ra sau 27 www.trungtamtinhoc.edu.vn 4 CHUẨN HÓA CỘT SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Mục đích: Kiểm tra hiệu năng của các cột HPLC và để xác định một cách khách quan xem khi nào chúng cần phải thay thế Chuẩn hóa cột sắc ký pha đảo Chuẩn bị dung dịch các chất chuẩn: Pha một hỗn hợp dung dịch các chất chuẩn trong methanol... Phương pháp thêm chuẩn so sánh: 𝐴𝑥 𝐶𝑥 𝐴′𝑥 = 𝐶𝑠 + 𝐶𝑥  Trong đó: 𝐴𝑥 ∶ độ hấp thụ của dung dịch thử 𝐴′𝑥 : độ hấp thụ của dung dịch chuẩn đã thêm chuẩn 𝐶𝑠 : nồng độ của dung dịch chuẩn  Phương pháp đường chuẩn: Đồ thị của phương pháp đường chuẩn A= f (C) 11 www.trungtamtinhoc.edu.vn II Quang phổ hồng ngoại 1 MỞ ĐẦU − Phổ hồng ngoại là phương pháp đo sự hấp thụ bức xạ hồng... phổ hồng ngoại trong định tính  Hầu hết các dược điển trên thế giới đều dựa trên 2 nguyên tắc: − So sánh sự phù hợp giữa chất thử với phổ chuẩn cho sẵn trong sách tra cứu hoặc trong thư viện phổ lưu giữ trong máy tính − So sánh sự phù hợp giữa phổ chất thử với phổ của hóa chất chuẩn được ghi trong cùng điều kiện • Định tính sử dụng chất chuẩn so sánh: • Định tính sử dụng phổ chuẩn trong atlas hoặc... Bảo quản mẫu 02 01 03 Xử lý mẫu 32 www.trungtamtinhoc.edu.vn  Tiến hành tách sắc ký Quá trình chạy sắc ký cần chú ý: Có thể xảy ra sự phân hủy các chất thử trong khi phân tích Có thể xuất hiện các pic lạ trên sắc đồ Vì vậy cần phải kiểm tra bằng sắc ký các vết tạp đó 33 www.trungtamtinhoc.edu.vn  Tiến hành tách sắc ký • Chuẩn bị mẫu thử • Tiêm mẫu Dung môi phải đáp ứng các yêu cầu sau: Độ tinh... Quang phổ huỳnh quang (Fluorometry) Nguồn sáng 2 MÁY Bộ đơn sắc Cuvet Thường dùng đèn xenon,laser Dùng cách tử Thường dùng thạch anh (1x1 cm) có 4 mặt trong suốt 16 www.trungtamtinhoc.edu.vn 3 CHUẨN HÓA MÁY Máy quang phổ huỳnh quang phải được chuẩn hóa thường xuyên với chất chuẩn 4 PHƯƠNG PHÁP ĐO Kiểm tra vùng tuyến tính của Mẫu thử luôn cường độ huỳnh được đo so quang và điều chỉnh sánh với mẫu độ... (IR) khi nó đi qua một lớp chất cần thử, ở các số sóng khác nhau − Vùng bức xạ hồng ngoại sử dụng trong các máy quang phổ IR thường là 600 – 4000cm-1 12 www.trungtamtinhoc.edu.vn 2 Máy quang phổ hấp thụ IR Máy quang phổ ghi phổ trong vùng hồng ngoại bao gồm một hệ quang học có khả năng cung cấp ánh sáng đơn sắc trong giải phổ từ 4000cm-1 - 670cm-1 và một phương tiện đo tỉ số giữa cường độ ánh sáng... rộng pic đo ở các đáy pic 21 www.trungtamtinhoc.edu.vn 2 MÁY HPLC Sơ đồ nguyên lý của máy HPLC 22 3 CÁC KỸ THUẬT HPLC Sắc ký phân bố Hấp phụ Trao đổi ion Các kỹ thuật HPLC Sắc ký loại cỡ (rây phân tử) 23 www.trungtamtinhoc.edu.vn  Sắc ký phân bố hiệu năng cao (Partition Chromatography)  Pha tĩnh Pha tĩnh trong sắc ký phân bố bao gồm một lớp mỏng pha lỏng hữu cơ bao trên bề mặt của các tiểu phân chất... gồm các nhóm phân cực liên kết với chất mang như nhóm alkylnitril [-(CH2)nCN] và alkylamin [-(CH2)nNH2] Cột nhanh đạt cân bằng nên rất thuận lợi cho phân tách gradient Cột thích hợp với nhiều dung môi và dễ tái sinh Ưu điểm Cột rất bền Cột alkylamin có thể có chức năng như một cột trao đổi anion yếu 26 www.trungtamtinhoc.edu.vn  Sắc kí pha đảo (reversed phase)  Trong kiểm nghiệm thuốc bằng phương pháp. .. HPLC, sắc ký pha đảo được sử dụng nhiều nhất  Trong kỹ thuật này pha tĩnh bao gồm các nhóm không cực như octadecyl (C18), octyl (C8) hay phenyl (C6H5)  Pha động là những dung môi phân cực như : nước, methanol, acetonitril (ACN) Chú ý  Khi pha động có thêm các muối vô cơ hoặc các chất hoạt động bề mặt, nên lọc nó trước khi dùng vì có thể có cặn không tan trong nước gây bẩn cột  Việc đuổi khí rất quan ...CÁC PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ TRONG KIỂM NGHIỆM THUỐC Phần Phần PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ PHÂN TỬ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO www.trungtamtinhoc.edu.vn PHẦN PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ...  Để áp dụng phương pháp này, cần phải chuẩn hóa máy quang phổ bước sóng lẫn độ hấp thụ  Phương pháp gián tiếp: phương pháp đường chuẩn, so sánh thêm chuẩn Đặc điểm phương pháp gián tiếp:  Phải... www.trungtamtinhoc.edu.vn Các phương pháp định lượng: Phương pháp đo phổ trực tiếp: − Đo phổ hấp thụ A dung dịch, tính nồng độ C dựa vào giá trị độ hấp thụ riêng: A = E1%1cm L.C L = 1cm  C =