Đang tải... (xem toàn văn)
Với mục đích nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng sinh và hoạt tính của enzyme invertase ngoại bào từ các chủng nấm men Saccharomyces spp., tôi đã tiến hành tuyển chọn các chủng nấm men Sacharomyces spp. có khả năng sinh enzyme invertase cao và đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố từ các chủng nấm men được cung cấp. Dựa vào điều kiện cho phép của phòng thí nghiệm, tôi tiến hành lựa chọn các chủng có khả năng cao thuộc chi Saccharomyces, thấy rằng trong 20 chủng được cung cấp có 6 chủng thuộc chi Saccharomyces. Bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch (Praveen Reddy và cộng sự, 2010), tôi đã tuyển chọn được 2 chủng 259 và 263 có khả năng sinh invertase ngoại bào cao. Tôi tiến hành đánh giá ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy như thời gian ủ, nguồn carbon, nguồn nitrogen, pH môi trường đến khả năng tổng hợp invertase ngoại bào và ảnh hưởng pH đệm, ion kim loại và nồng độ cơ chất khác nhau đến hoạt tính enzyme thô thu được. Kết quả cho thấy, cả 2 chủng 259 và 263 đều tổng hợp invertase ngoại bào tốt ở pH 6, nguồn carbon và nguồn nitrogen tốt nhất trong các nguồn được nghiên cứu là sucrose và pepton. Tuy nhiên, thời gian nuôi cấy thích hợp đối với chủng 259 là 48 giờ và 263 là 56 giờ. Enzyme thô thu được từ 2 chủng 259 và 263 hoạt động tốt ở pH 5 và ion Mn2+ làm tăng hoạt tính enzyme. Nồng độ sucrose thích hợp là 200mM.
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ ĐẾN KHẢ NĂNG SẢN XUẤT VÀ HOẠT TÍNH CỦA ENZYME INVERTASE NGOẠI BÀO CỦA CÁC CHỦNG SACCHAROMYCES SPP HÀ NỘI – 2016 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ ĐẾN KHẢ NĂNG SẢN XUẤT VÀ HOẠT TÍNH CỦA ENZYME INVERTASE NGOẠI BÀO CỦA CÁC CHỦNG SACCHAROMYCES SPP Người thực hiện: PHẠM THÙY TRANG Ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: TS Nguyễn Văn Giang HÀ NỘI – 2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu khoá luận trung thực chưa sử dụng công bố Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực khoá luận cảm ơn thông tin trích dẫn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày 31 tháng 12 năm 2016 Sinh viên Phạm Thùy Trang LỜI CẢM ƠN Sau thời gian thực tập Bộ môn Công nghệ Vi sinh, quan tâm, giúp đỡ dìu dắt tận tình thầy cô giáo, cán phòng thí nghiệm Bộ môn, cố gắng nỗ lực thân, hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo khoa Công nghệ sinh học truyền đạt cho kiến thức vô quan trọng quý báu suốt thời gian học tập, rèn luyện trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Văn Giang tận tình hướng dẫn dạy dỗ suốt trình học tập nghiên cứu Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới TS Nguyễn Xuân Cảnh, ThS Trần Thị Đào, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian thực tập Qua xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể Phòng, Ban khoa Công nghệ sinh học toàn thể bạn bè giúp đỡ, động viên tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình học tập thực tập tốt nghiệp Và cuối cùng, với tất lòng kính trọng biết ơn vô hạn, xin gửi lời cảm ơn tới Bố, Mẹ, Ông, Bà người thân nuôi nấng, động viên tạo động lực cho suốt trình học tập, nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn ! Sinh viên Phạm Thùy Trang MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH – ĐỒ THỊ TÓM TẮT Với mục đích nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố đến khả sinh hoạt tính enzyme invertase ngoại bào từ chủng nấm men Saccharomyces spp., tiến hành tuyển chọn chủng nấm men Sacharomyces spp có khả sinh enzyme invertase cao đánh giá ảnh hưởng yếu tố từ chủng nấm men cung cấp Dựa vào điều kiện cho phép phòng thí nghiệm, tiến hành lựa chọn chủng có khả cao thuộc chi Saccharomyces, thấy 20 chủng cung cấp có chủng thuộc chi Saccharomyces Bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch (Praveen Reddy cộng sự, 2010), tuyển chọn chủng 259 263 có khả sinh invertase ngoại bào cao Tôi tiến hành đánh giá ảnh hưởng số điều kiện nuôi cấy thời gian ủ, nguồn carbon, nguồn nitrogen, pH môi trường đến khả tổng hợp invertase ngoại bào ảnh hưởng pH đệm, ion kim loại nồng độ chất khác đến hoạt tính enzyme thô thu Kết cho thấy, chủng 259 263 tổng hợp invertase ngoại bào tốt pH 6, nguồn carbon nguồn nitrogen tốt nguồn nghiên cứu sucrose pepton Tuy nhiên, thời gian nuôi cấy thích hợp chủng 259 48 263 56 Enzyme thô thu từ chủng 259 263 hoạt động tốt pH ion Mn 2+ làm tăng hoạt tính enzyme Nồng độ sucrose thích hợp 200mM Phần I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Invertase (β.D fructofuranosidase, EC.3.2.1.26) thủy phân liên kết α-1,4 glycosid α-D-glucose β-D-fructose phân tử sucrose (Li cộng sự, 1998; Mobini-Dehkordi cộng sự, 2008) Invertase enzyme công nghiệp quan trọng ứng dụng nhiều công nghiệp sản xuất đồ uống, bánh kẹo sản phẩm tạo hơn, ổn định không bị kết tinh Ngoài ra, sử dụng sản xuất dược phẩm, axit lactic ethanol (Acosta cộng sự, 2000; Sanchez cộng sự, 2001) Cùng với phát triển ngành công nghiệp thực phẩm, chế biến dược phẩm nhu cầu invertase tăng lên Tuy nhiên, sử dụng invertase có nguồn gốc từ vi sinh vật phổ biến dễ dàng sử dụng chất hóa học để thay trình thủy phân giá thành cao enzyme Ở Việt Nam, chủ yếu nghiên cứu sản xuất invertase từ bã men bia thông qua trình tự phân nấm men Sử dụng enzyme invertase an toàn hiệu suất cao chất hóa học (Rossi-Alva Rocha-Leao, 2003; Tomotani Vitolo, 2004; Kaur Sharma, 2005; Aranda cộng sự, 2006; Oztop cộng sự, 2009; Celebi cộng sự, 2009), phụ phẩm ngành công nghiệp sản xuất bia enzyme sản xuất qua trình thường không ổn định tinh (Chan cộng sự, 1991) Vì thu nhận invertase ngoại bào từ trình lên men chìm chủng nấm men Saccharomyces spp giải pháp cho vấn đề Xuất phát từ lý trên, thực đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố đến khả sản xuất hoạt tính enzyme invertase ngoại bào chủng Saccharomyces spp.” làm xác định số thông số thích hợp với trình lên men chìm chủng nấm men Saccharomyces spp phát triển quy trình sản xuất invertase từ Saccharomyces spp 1.2 Mục tiêu đề tài Tuyển chọn chủng nấm men Saccharomyces spp có khả sinh enzyme invertase ngoại bào cao nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố đến khả sản xuất ( thời gian ủ, nguồn carbon, nguồn nitrogen, pH môi trường nuôi cấy) hoạt tính enzyme invertase ngoại bào chúng ( pH đệm, ion kim loại, nồng độ chất) Đối tượng nội dung nghiên cứu đề tài Đối tượng nghiên cứu 1.3 Các chủng nấm men cung cấp phòng thí nghiệm Công nghệ vi sinh – Khoa Công nghệ sinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam Nội dung nghiên cứu Tuyển chọn – chủng nấm men Saccharomyces spp có khả sinh invertase cao từ chủng cung cấp Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian nuôi cấy, nguồn carbon, nguồn nitrogen, pH đến khả sản xuất enzyme invertase Nghiên cứu ảnh hưởng số ion kim loại pH đệm, nồng độ chất đến hoạt tính enzyme invertase Phần II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Enzyme invertase - Tên hệ thống: β-D-fructofuranoside fructohydrolase (EC 3.2.1.26) - Tên gọi khác: Invertase, saccharase, glucosucrase, β-h-fructosidase, β- fructosidase, sucrose, maxinvert L 100, fructosylinvertase, alkaline invertase, acid invertase - Phân loại enzyme: Theo IUMBMB, invertase thuộc nhóm hydrolase (nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân) EC 3.2: Glycosylase EC 3.2.1: Glycosidase EC 3.2.1.26: β-D-fructofuranoside fructohydrolase 2.1.1 Phản ứng xúc tác Invertase thủy phân liên kết α-1,4 glycosid α-D-glucose β-D-fructose phân tử sucrose (Li cộng sự, 1998; Mobini-Dehkordi cộng sự, 2008) Ngoài ra, có khả thủy phân chất có đuôi fructosyl sucrose, raffinose, stachyose inulin (Rubio cộng sự, 2002; Rubio Navarro, 2006; Gore cộng sự, 2009; Liqin Du cộng sự, 2013) Hình 2.1 Cơ chế thủy phân sucrose (Nguồn hình: http://www1.lsbu.ac.uk/water/enztech/sucrose.html) 2.1.2 Động học invertase Nghiên cứu động học enzyme nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố ảnh hưởng nồng độ chất, enzyme, pH môi trường, nhiệt độ, chất kìm hãm … đến tốc độ phản ứng enzyme xúc tác Việc nghiên cứu động học enzyme cho ta biết vấn đề sau đây: - Có thể biết chế phân tử tác động enzyme - Cho phép ta hiểu biết mối quan hệ mặt lượng trình enzyme 10 Mỗi vi sinh vật có phạm vi pH sinh trưởng tổng hợp hoạt chất tốt pH ảnh hưởng đến khả hòa tan chất môi trường nên ý nghĩa lớn sinnh trưởng tổng hợp hoạt chất vi sinh vật Dải pH nghiên cứu từ đến môi trường có chứa yeast extract, pepton sucrose Đối với chủng nấm men 259 263 pH = khả tổng hợp invertase không cao Dải pH ghi nhận để tổng hợp tốt enzyme invertase chủng từ – Đây dải pH tương đối rộng Trong đó, pH pH tốt cho tổng hợp invetase chúng môi trường YPS Hoạt độ chủng 259 263 pH tối ưu 9.824 U/ml 7.766 U/ml Ở pH hoạt độ enzyme đạt cực tiểu 0.713 U/ml 0.504 U/ml Hình 4.11 Ảnh hưởng pH đến khả sinh enzyme invertase Các kết phù hợp với nghiên cứu có Shankar cộng sự, 2013 nghiên cứu tối ưu hóa trình sản xuất enzyme invertase từ chủng Saccharomyces cervisiae MK phương pháp lên men chìm thấy chủng có khả sinh invertase khoảng pH rộng từ đến tối ưu pH = Ngoài ra, báo cáo Muhammad Umar Hayyat Sikander Ali, 2013 pH = pH thích hợp Saccharomyces carlsbergensis UV-dg4 sinh trưởng tổng hợp invertase tốt 4.4 Ảnh hưởng số điều kiện môi trường đến hoạt tính enzyme invertase 4.4.1 Ảnh hưởng pH đệm Enzyme thô khảo sát ổn định ảnh hưởng pH với hệ thống đệm: citrate (pH 3.0 - 4.0), acetate (pH 5.0 – 7.0), phosphate (pH 8.0 – 9.0) với nồng độ 0,1M Enzyme ủ trước với hệ thống đệm 30 phút 30 oC trước thử nghiệm hoạt tính enzyme điều kiện thử nghiệm tiêu chuẩn, sau hoạt tính tương đối tính toán Sự phân li phân tử protein giá trị pH khác làm thay đổi tính chất trung tâm liên kết chất hoạt động phân tử enzyme, dẫn đến giá trị xúc tác khác phụ thuộc vào giá trị pH, enzyme có pH tối thích Kết nghiên cứu cho thấy: 39 Enzyme invertase thô thu từ chủng nấm men 259 263 hoạt động dải pH rộng Trong đó, chủng 259 hoạt động tốt dải pH từ 3–7 tối ưu pH với hoạt độ 8.486 U/ml Tại pH hoạt tính enzyme invertase giảm mạnh Chủng 263 pH đệm tác động không nhiều tới hoạt tính enzyme invertase, pH tối ưu cho hoạt động enzyme hoạt độ 4.017 U/ml Hình 4.12 Ảnh hưởng pH đệm đến hoạt tính enzyme invertase Shankar cộng sự, 2014 nghiên cứu lại enzyme hoạt động tốt dải từ – 8, tối ưu pH với hoạt độ 98% 99% 4.4.2 Ảnh hưởng số ion kim loại Các ion kim loại khảo sát ảnh hưởng tới hoạt động enzyme invertase Bao gồm ion : Mg2+, Cu2+, Zn2+, Fe2+, Mn2+, Na+, K+, Ca2+ Dịch enzyme thô ủ trước với muối có nồng độ mM chứa ion kim loại (KCl, MnSO4, ZnSO4, CuCl2, MgSO4, NaNO3, CaCl2, FeSO4) 30 phút 30oC trước thử hoạt tính enzyme Ống đối chứng ống chứa enzyme không ủ với ion kim loại Hình 4.13 Ảnh hưởng số ion kim loại Đối với chủng 259, ion kim loại ảnh hưởng đáng hoạt tính enzyme Enzyme hoạt động mạnh mẽ môi trường chứa Mn 2+ ứng với hoạt độ tăng 43% so với đối chứng hoạt động môi trường có Cu 2+ ứng với hoạt độ giảm 30% so với đối chứng Trong đó, hoạt độ chủng 263 bị phân hóa rõ rệt loại ion kim loại khác Ion Mg2+ ức chế hoạt động chủng mạnh Hoạt độ chủng giảm xuống 41% so với đối chứng Ion Na + ion Mn2+ kích thích tương đối mạnh hoạt tính enzyme chủng 263 Ion Na + làm hoạt độ enzyme tăng lên 40% so với đối chứng Trong ion Mn 2+ làm hoạt độ tăng lên 175% (tăng gần lần) so với đối chứng 40 Shankar cộng sự, 2014 lại Ca 2+ làm hoạt độ enzyme tốt với gần 100% K + Mn2+ lại làm hoạt độ enzyme giảm xuống khoảng 10% 4.4.3 Ảnh hưởng nồng độ chất đến hoạt tính enzyme invertase Nồng độ enzyme nồng độ chất có ảnh hưởng đáng kể đến hoạt tính enzyme Tốc độ phản ứng phần lớn phản ứng biến đổi theo nồng độc chất nồng độ enzyme Khi tăng nồng độ chất tốc độ phản ứng tăng nồng độ chất tương đối thấp Khi nồng độ chất lớn tốc độ phản ứng phụ thuộc vào nồng độ chất có khuynh hướng đạt cực đại nồng độ enzyme có mặt định Ở nồng độ chất thấp, nhiều phân tử enzyme có trung tâm hoạt động chưa liên kết với chất Nên việc tăng hạn chế chất tăng tốc độ phản ứng Tuy nhiên, nồng độ chất cao, hầu hết trung tâm phản ứng liên kết với chất làm cho số phân tử enzyme trở thành yếu tố giới hạn Khi số phân tử ezyme tăng tốc độ phản ứng cự đại tăng lên tương ứng Trong thí nghiệm này, nồng độ sucrose khác bao gồm 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 mM thử nghiệm để xác định ảnh hưởng tới khả phân giải enzyme invertase Đường sucrose pha đệm acetate 0,03 M, pH sử dụng thay dung dịch đường thí nghiệm thử hoạt tính enzyme Hình 4.14 Ảnh hưởng nồng độ chất Kết thí nghiệm cho thấy nồng độ chất ảnh hưởng không đáng kể để đến hoạt tính enzyme Hoạt tính enzyme tăng dần nồng độ sucrose tăng dần, đạt cực đại nồng độ 200mM sau giảm dần nồng độ sucrose Trong nghiên cứu Miguel Plascencia-Espinosa cộng sự, 2014, invertase tinh khiết INV3-N thu nhận từ Candida guilliermondii MpIIIa hoạt động mạnh mẽ nồng độ chất 400mM 41 Phần KẾT LUẬN 5.1 Kết luận Từ 20 chủng nấm men cung cấp có chủng cho thuộc chi Saccharomyces có khả sản xuất enzyme invertase mức độ khác Đã chọn chủng nấm men 259 263 có khả sinh enzyme invertase ngoại bào cao Chủng 259 có khả tổng hợp invertase tốt sau 48 pH 6, nguồn carbon sucrose nguồn nitrogen pepton Chủng 263 có khả tổng hợp invertase tốt sau 56 pH 6, nguồn carbon sucrose nguồn nitrogen pepton Enzyme thô thu từ chủng 259 hoạt động tốt pH 5, ion Mn 2+ làm tăng hoạt tính enzyme mạnh mẽ Enzyme thô thu từ chủng 263 hoạt động tốt pH 5, ion Mn 2+ làm tăng hoạt tính enzyme Nồng độ sucrose phù hợp cho phản ứng enzyme thô thu từ hai chủng 200mM 5.2 Kiến nghị Nghiên cứu tiếp ảnh hưởng số điều kiện môi trường khác đến khả tổng hợp invertase ngoại bào chủng nấm men 259 263 nhiệt độ, tốc độ lắc, lượng giống… Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố khác tới hoạt tính enzyme invertase ngoại bào thô nhiệt độ tác động nồng độ ion Mn2+ khác tới hoạt tính enzyme Ngoài khả sinh enzyme invertase ngoại bào chủng nấm men có khả sinh enzyme nội bào Tiếp tục nghiên cứu enzyme nội bào chủng nấm men so sánh số tiêu với enzyme invertase ngoại bào Định danh xác tới loài chủng nấm men 259 263 42 Phần TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Lương Đức Phẩm (2009) Nấm men công nghiệp, tái lần thứ Nhà xuất khoa học kĩ thuật 331 trang Nguyễn Lân Dũng (2009) Vi sinh vật học Nhà xuất Giáo dục 518 trang Nguyễn Văn Thành, Nguyễn Minh Thủy, Trần Thị Quế Nguyễn Thị Mỹ Tuyền (2013) Phân lập, tuyển chọn định danh nấm men lên men rượu vang khóm Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, số 25: 27-35 TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI Aafia Aslam (2011).Studies on the submerged fermentation of invertase by Saccharomyces cerevisiae, Pakistan Research Repository Acosta, N., A Beldarrain, L Rodriguez and Y Alonso (2000) Characterization of recombinant invertase expressed in methylotrophic yeasts Biotechnol Appl Biochem., 32(3): 179-178 Aranda, C., A Robledo, O Loera, C Juan, C Esquivel, R Rodriguez and C N Aguillar (2006) Fungal invertase expression in soild state fermentation Food Technol Biotechnol., 44: 229-233 Arfi, K., R Tâche, H E Spinnler and P Bonnarme (2003) Dual influence of the carbon source and l-methionine on the synthesis of sulphur compounds in the cheeseripening yeast Geotrichum candidum Appl Microbiol Biotechnol., 61: 359-365 Arguelles, M E., M Rojas, G Gonzalez and E Torres (1995) Production and properties of three pectinolytic activities produced by Aspergillus niger in submerged and solid state fermentation Appl Microbiol Biotechnol., 43: 808-814 Barlikova, A., J Svorc and S Miertus (1991) Invertase for inverted syrup production and sugar determination Anal Chim Acta., 247: 83-87 Batista, A S., L C Miletti and B U Stambuk (2004) Sucrose fermentation by Saccharomyces cerevisiae lacking hexose transport J Mol Microbiol Biotechnol., 8(1): 26-33 Belcarz, A., G Ginalska and J Lobarzewski and C Penel (2002) The novel nonglycosylated invertase from Candida utilis (the properties and the conditions of production and purification) Biochim Biophys Acta., 1594(1): 40-53 Belcarz, A., G Ginalska, J Lobarzewski, H Greppin and J Fiedurek (2000) The optimization of the liquid affinity chromatography conditions of the extracellular invertase isolation from the Candida utilis cultures Chromatographia, 51(1): 121-129 10 Bhatti, H N., M Asgher, A Abbas, R Nawaz and M A Sheiki (2006) Studies on kinetics and thermostability of a novel acid invertase from Fusarium solani J Agric Food Chem., 54: 4617-4623 11 Marian Carlson (1999) Glucose repression in yeast Curr Opin Microbial., 2: 202-207 43 12 Celebi, S., E Ibibican, S K Kayahan, B Yigitsoy and L.Toppare (2009) Immobilization of invertase in copolymer of 2,5-Di (thiophen2-yl)-1-p-Tolyl-1H-Pyrrole with pyrrole J Macromolecular Sci., 46: 739-744 13 Chan, E., C S Chen, C S Gong and L F Chen (1991) Production, separation and purification of yeast invertase as a byproduct of continuous ethanol fermentation Appl Microbiol Biotechnol., 36 (1): 44-47 14 Chaudhuri, A., G Bharadwaj and R Maheshwari (1999) An unusal pattern of invertase activity development in the thermophilic fungus Thermomyces lanuginosus FEMS Microbiol Lett., 177: 39-45 15 Costaglioli, P., E Meilhoc, I Janatova, R Klein, and J Masson (1997) Secretion of invertase from Schwanniomyces occidentalis Biotechnol Lett., 19: 623-627 16 De Gines, S C., M C Maldonado and F G de Valdez (2000) Purification and characterization of invertase from Lactobacillus reuteri CRL 1100 Curr Microbiol., 40(3): 181-184 17 De la Vega, M., F Cejudo and A Paneque 1991 Purification and properties of an extracellular invertase from Azotobacter chroococcum Enz Microbial Technol., 13: 267-271 18 Dixon, M and E C Webb (1979) Enzyme, 3rd ed., Longman Group Limited, London 19 Dworschack, R G and L J Wickerham (1961) Extracellular invertase by sucrosefermenting yeasts US Patent 2953500 20 Dynesen, J., H P Smits, L Olsson and J Nielsen (1998) Carbon catabolite repression of invertase during batch cultivations of Saccharomyces cerevisiae: the role of glucose, fructose, and mannose Appl Microbiol Biotechnol., 50(5): 579-582 21 Gangadhara, P R Kumar and V Prakash (2008) Influence of Polyols on the stability and kinetic parameters of invertase from Candida utilis: Correlation with the conformational stability and activity J Protein, 27(7-8): 440-449 22 Ghosh, K., A Dhar and T B Samanta (2001) Purification and Characterization of an invertase produced by Aspergillus ochraceus TS Indian J Biochem Biophys., 38 (3): 180-185 23 Gutierrez-Alonso, P., L Fernandez-Arrojo, F J Plou and M FernándezLobato (2009) Biochemical characterization of a betafructofuranosidase from Rhodotorula dairenensis with transfructosylating activity FEMS Yeast Res., 9(5): 768-773 24 Herwig, C., C Doerries, I Marison and U von Stockar (2001) Quantitative analysis of the regulation scheme of invertase expression in Saccharomyces cerevisiae Biotechnol Bioeng., 76(3): 247-258 25 Hina Ashraf and Zill-e-Huma Bilal (2015) Biosynthesis, partial purification and characterization of invertase through carrot (Daucus carota l.) peels J Biochem Tech 6(1): 867-874 26 Samarth Kulshrestha, Prasidhi Tyagi, Vinita Sindhi (2013) Kameshwar Sharma Yadavilli c Invertase and its applications – a brief view Journal of Pharmacy Research 7(9): 792–797 44 27 Kaur, N and A D Sharma (2005) Production, optimization and characterization of extracellular invertase by an actinomycete strain J Sci Ind Res., 64: 515-519 28 Klein, F., A Karwan and U Wintersberger (1989) After a single treatment with EMS the number of non-colony-forming cells increases for many generations in yeast populations Mut Res., 210 (1): 157-164 29 Koo, J., K Hyup, K.S Young, R.Y Choel, H Nansoo and S Jin-ho (1998) Invertase production by fed-batch fermentation of recombinant Saccharomyces cerevisiae J Microbiol Biotechnol., 8(3): 203-207 30 Kurakake, M., R Masumoto, K Maguma, A Kamata, E Saito, N Ukita and T Komaki (2010) Production of fructooligosaccharides by betafructofuranosidases from Aspergillus oryzae KB J Agric Food Chem., 58(1): 488-92 31 Lambert, P W., J L Meers and D J Best (1983) The Production of Industrial Enzymes: Industrial and diagnostic enzymes Phil Trans Royal Soc Lond., 300(1100): 263-282 32 Li, S., H P Yang and H M Zhou (1998) Inactivation and conformational changes of yeast invertase during unfolding in urea and guanidinium chloride solutions J Pept Res., 51(1): 45-48 33 Luxhoi, J., J Magid, D Tscherko and E Kandeler (2002) Dynamics of invertase, xylanase and coupled quality indices of decomposing green and brown plants residue Soil Biol Biocem., 34: 501-508 34 Boris Magasanik (1992) Regulation of nitrogen utilization In: The molecular and cellular biology of the yeast Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring Harbor, New York pp 283317 35 Martinezforce, E and T Benitez (1995) Effects of varying media, temperature and growth rates on the intracellular concentrations of yeast amino acids Biotechnol Prog., 11(4): 386-392 36 Matrai, T., S Mayer, S Kokai and I Salamon (2000) Invertase production of common storage moulds in food and feed grains as a possibility for rapid detection of Aspergillus flavus group and Aspergillus fumigatus Int J Food Microbiol., 61(2-3): 187-191 37 Miguel Plascencia-Espinosa, Alejandro Santiago-Hernández, Patricia PavónOrozco,Vanessa Vallejo-Becerra, Sergio Trejo-Estrada, Alejandro Sosa-Peinado, Claudia G Benitez-Cardoza, María Eugenia Hidalgo-Lara (2014) Effect of deglycosylation on the properties of thermophilic invertase purified from the yeast Candida guilliermondii MpIIIa Process Biochemistry vol 49(9), pp 1480–1487 38 Mizunaga, T., J S Ikacz, L Rodriguez, R A Hackel and J O Lampen (1981) Temperature-sensitive forms of large and small invertase in a mutant derived from a Suc1 strain of Saccharomyces cerevisiae Mol Cell Biol., 1(5): 460-468 39 Mobini-Dehkordi, M., I Nahvi, H Zarkesh-Esfahani, K Ghaedi, M Tavassoli and R Akada (2008) Isolation of a novel mutant strain of 45 Saccharomyces cerevisiae by an ethyl methane sulfonate- induced mutagenesis approach as a high producer of bioethanol J Biosci Bioeng., 105(4): 403-408 40 Mona M Rashad and Mohamed U Nooman (2009) Production, purification and characterization of extracellular invertase from Saccharomyces Cerevisiae NRRL Y12632 by solid – state fermentation of red carrot residue Australian Journal of Basic and Applied Sciences, 3(3): 1910-1919 41 Moreno, S., Y Sanchez and L Rodriguez (1990) Purification and characterization of the invertase from Schizosaccharomyces pombe A comparative analysis with the invertase from Saccharomyces cerevisiae Biochem J., 267(3): 697-702 42 Muhammad Umar Hayyat and Sikander Ali (2013) Kinetics of an extracellular β-D-Fructofuranosidase fructohydrolase production from a derepressed mutant of Saccharomyces carlsbergensis and parameter significance analysis by 2-factorial design Pakistan J Zool., vol 45(5), pp 1299-1310 43 Mwesigye, P K and J P Barford (1996) Mechanism of sucrose utilisation by Saccharomyces cerevisiae J General Appl Microbiol., 42(4): 297-306 44 Nishizawa, M., Y Maruyama and M Nakamura (1980) Purification and characterization of invertase isoenzymes from Fusarium oxysporum Agri Bio Chem., 44: 489-498 45 Osho, A (2005) Ethanol and sugar tolerance of wine yeasts isolated from fermenting cashew apple juice Afr J Biotechnol., 4: 660-662 46 Oztop, H N., C Hepokur and D Saraydin (2009) Hydrogels for immobilization of invertase J Food Sci., 74(7): 45-49 47 P Praveen Reddy, G.S.N Reddy and M.B Sulochana (2010) Screening of βfructofuranosidase producers with high transfructosylation activity and its experimental run studies on reaction rate of enzyme Journal of Biological Sciences 10 (3): 237-241 48 Perez, J A., J Rodríguez, T Ruiz and L Rodríguez (2001) Expression of Pichia anomala INV1 gene in Saccharomyces cerevisiae results in two different active forms of hypoglycosylated invertase Arch Microbiol., 175 : 189-197 49 Porro, D., E Martegani, A Tura and B M Ranzi (1991) Development of a pH controlled fed-batch system for budding yeast Res Microbiol., 142(5): 535-539 50 Prakash S Bisen (2014) Laboratory Protocols in Applied Life Sciences 51 Robledo-Olivo, Armando, Contreras-Esquivel, C Juan, Herrera, R Rodriguez and N A Cristobal (2009) Induction and repression kinetics of fungal betafructofuranosidase in submerged culture Int J Food Eng., 5(2): Article DOI: 10.2202/1556-3758.1224 52 Rodriguez, J., A Perez, T Ruiz and L Rodriguez (1995) Characterization of the invertase from Pichia anomala J Biochem 306: 235-239 53 Rodriguez, M., A Gomez, F Gonzalez, E Barzana and A LopezMunguia (1997) Selectivity of methyl-fructoside synthesis with betafructofuranosidase Appl Biochem Biotechnol., 9(2): 167-75 46 54 Romero-Gomez, S J., C Augur and G Viniegra-Gozalez (2000) Invertase production by Aspergillus niger in submerged and solidstate fermentation Biotechnol Lett., 22: 1255-1258 55 Rossi-Alva, J C and M H M Rocha-Leao (2003) A strategic study using mutant-strain entrapment in calcium alginate for the production of Saccharomyces cerevisiae cells with high invertase activity Appl Biochem Biotechnol., 38: 43-51 56 Rubio, M C., R Runco and A R Navarro (2002) Invertase from a strain of Rhodotorula glutinis Phytochm 61(6): 605-609 57 Sanchez, M P., J F Huidobro, I Mato, S Munigategui and M T Sancho (2001) Evolution of invertase activity in honey over two years J Agric Food Chem., 49(1): 416-422 58 Segel, I (1975) Enzyme Kinetics-Behavior and analysis of rapid equilibrium and stayedstate enzyme systems, John Wiley, New York 59 Shankar S R Madhan, R Sathyavani and Bubna Niket (2010) Production and partial purification of invertse using Cympopogan caecius leaf powder as substrate Indian J Microbiol 50:318–324 60 Sikander Ali, Ikram Ul-Haq (2007) Kinetics of invertase production by Saccharomyces cerevisiae in batch culture Pak J Bot., 39(3): 907-912 61 Silveira, M C F., E M M Oliveira, E Carvajal and E P S Bon (2000) Nitrogen regulation of Saccharomyces cerevisiae invertase Appl Biochem Biotechnol., 84-86: 247-254 62 Sommer, R (1998) Yeast extracts: Production, properties and components Food Australia, 50(4): 181-183 63 T Shankar, P.Thangamathi, R.Rama, T Sivakumar (2013) Optimization of invertase production using Saccharomyces Cerevisiae MK under varying cultural conditions International Journal of Biochemistry and Biophysics 1(3): 47-56 64 T.Shankar, P.Thangamathi, R Rama and T.Sivakumar (2014) Characterization of invertase from Saccharomyces cerevisiae MTCC 170 African journal of microbiology research 8(13):1385-1393 65 Tomotani, E J and M Vitolo (2004) Screening of dowex anionexchange resins for invertase immobilization Appl Biochem Biotechnol., 113: 145-159 66 Uma, C., D Gomathi, C Muthulakshmi and V K Gopalakrishnan (2010) Production, purification and characterization of invertase by Aspergillus flavus using fruit peel waste as substrate Adv Biol Res., 4(1): 31-36 67 Vrabel, P., M Polakovic, V Stefuca and V Bales (1997) Analysis of mechanism and kinetics of thermal inactivation of enzymes: Evaluation of multitemperature data applied to inactivation of yeast invertase Enz Microbial Technol., 20(5): 348-354 68 Walker, G.M (1998) Yeast Physiology and Biotechnology, John Wiley & Sons, Chichester 69 Win, T T., N Isono1, Y Kusnadi, K Watanabe, K Obae, I Hiroyuki and M Hirokazu (2004) Enzymatic synthesis of two novel nonreducing oligosaccharides using transfructosylation activity with beta-fructofuranosidase from Arthrobacter globiformis Biotechnol Lett., 26: 499-503 47 70 Workman, W E and D F Day (1983) Purification and properties of the ß-fructofuranosidase from Kluyveromyces fragilis FEBS Lett., 160(1-2): 16-20 71 Yoshikawa, J., S Amachi, H Shinoyama and T Fujii (2006) Multiple β-fructoduranosidases by Aureobasidium pullulans DSM 2404 and their roles in the fructooligosaccharide production FEMS Microbiol Lett., 265: 159-163 72 Yusa, Y and S Enokida (1953) Invertase of yeast Ann Rept Takamine Lab., 5: 38-39 73 Zech, M and H Goerisch (1995) Invertase from Saccharomyces cerevisiae: reversible inactivation by components of industrial molasses media Enz Microbial Technol., 17(1): 41-46 74 Zhang, W G and X Y Ge (2006) Fructanohydrolase production in A niger SL-09, Food Technol Biotechnol 44(1): 59-64 48 PHỤ LỤC Đường chuẩn glucose Thử nguồn carbon 49 Thử nguồn nitrogen Thử pH môi trường 50 Ảnh hưởng pH đệm 51 Ảnh hưởng ion kim loại Ảnh hưởng nồng độ chất 52 53 ... SINH HỌC KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ ĐẾN KHẢ NĂNG SẢN XUẤT VÀ HOẠT TÍNH CỦA ENZYME INVERTASE NGOẠI BÀO CỦA CÁC CHỦNG SACCHAROMYCES SPP Người thực hiện:... đích nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố đến khả sinh hoạt tính enzyme invertase ngoại bào từ chủng nấm men Saccharomyces spp. , tiến hành tuyển chọn chủng nấm men Sacharomyces spp có khả sinh enzyme invertase. .. cho vấn đề Xuất phát từ lý trên, thực đề tài: Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố đến khả sản xuất hoạt tính enzyme invertase ngoại bào chủng Saccharomyces spp. ” làm xác định số thông số thích hợp