Bài CÁC THAO TÁC CƠ BẢN TRONG NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT I/ CÁC CÔNG VIỆC CẦN CHUẨN BỊ TRƯỚC KHI TIẾN HÀNH PHA MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VÀ THAO TÁC CẤY MẪU VÀO MÔI TRƯỜNG: 1.Các công việc cần thiết trước pha môi trường: _Chuẩn bị thiết bị dụng cụ: + Cân phân tích, nồi hấp khử trùng, thiết bị chỉnh pH, tủ cấy vô trùng, Hình 1.Máy đo pH Hình Cân phân tích + Hình Dụng cụ cấy Dao, kẹp, giấy cấy, cốc thủy tinh, đèn cồn, ống nghiệm, lọ, Các dụng cụ phải hấp khử trùng trước sử dụng - Chuẩn bị hóa chất khử trùng: cồn 700, dd NACLO, Chuẩn bị hóa chất pha môi trường Khử trùng nơi thao tác cấy dụng cụ cấy: Trước đưa vào sử dụng, phòng cấy cần xử lý formol cách rót formaldehyde (formalin) 4% số nắp đĩa petri để rải rác vài nơi phòng cho bốc tự Đóng kín cửa phòng cấy 24h, sau bỏ formaldehyde khử formaldehyde thừa dung dịch NH3 25% 24h Bề mặt nơi chuẩn bị cấy, bề mặt bên tủ cấy phải khử trùng trước cấy cách lau bề mặt cồn 90% Bật tia UV 15 phút trước cấy để diệt mầm vi sinh bề mặt tủ cấy 2.Thao tác khử trùng cấy mẫu vào môi trường: - Khử trùng mẫu: Để đạt mục đích khử trùng (loại bỏ hết mầm vi sinh vật, mô thực vật tăng trưởng, phát triển), việc khử trùng phải tìm ba yếu tố liên quan chặt chẽ với liên quan tới mô thực vật đem khử trùng là: + + Chất khử trùng Nồng độ chất khử trùng + Thời gian khử trùng Bảng Một số tác nhân khử trùng dùng cho thực vật Tác nhân vô trùng Nồng độ (%) Thời gian xử lý(phút) Hiệu Canxi hypoclorid 9-10 5-30 Rất tốt Natri hypoclorid 5-30 Rất tốt hydro peroxide 10-12 5-15 tốt Nước Brom 1-2 2-10 Rất tốt HgCl2 0.1-1 2-10 Trung bình Chất kháng sinh 4-50 30-60 Khá tốt Vô trùng mẫu thao tác khó, thành công lần Tuy vậy, kiên trì tìm nồng độ thời gian vô trùng thích hợp sau vài lần thử chắn đạt kết - Dụng cụ: kẹp, dao, giấy cấy, đèn cồn, cốc thủy tinh, cồn 960 Các dụng cụ kim loại kẹp cấy, dao mổ, que cấy vòng, kim mũi nhọn khử trùng cách đốt lửa đèn cồn Các dụng cụ phải nhúng vào cồn 96 cho nhỏ hết giọt cồn thừa đưa vào lửa -Thao tác: khử trùng vị trí làm việc, tay, dụng cụ cấy, dụng cụ chứa môi trường nuôi chai, lọ II CÁCH PHA MÔI TRƯỜNG: Môi trường nuôi cấy phù hợp thành công thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật Thành phần môi trường dinh dưỡng thay đổi tùy theo loài, phận nuôi cấy, tùy theo phát triển phân hóa mô cấy, tùy theo việc muốn trì mô trạng thái callus, tạo rễ, tạo mầm hay muốn tái sinh hoàn chỉnh Tuy tất môi trường nuôi cấy gồm thành phần Đường cung cấp nguốn carbon Các muối khoáng đa lượng Các muối khoáng vi lượng Các vitamin Các chất điều hòa sinh trưởng Bảng Thành phần môi trường MS (1962) cách pha stock Hóa chất g/l Stock x 10 g/l MgSO4.7H2O 0.37 3.7 KH2PO4 0.17 1.7 KNO3 1.9 19 NH4NO3 1.65 16.5 CaCl2.2H2O 0.44 4.4 Hóa chất mg/l Stock x 100 g/l Na2EDTA 37.3 3.37 FeSO4.7H2O 27.8 2.78 Hóa chất mg/l Stock x 1000 g/l H3BO3 6.2 6.2 MnSO4.4H2O 22.3 22.3 ZnSO4.7H2O 11.5 11.5 Na2MoO4.2H2O 0.25 0.25 KI 0.83 0.83 CuSO4.5H2O 0.025 0.025 CoCl2.6H2O 0.025 0.025 Macro MS FeEDTA Micro MS 1.Cách pha stock đa lượng: Stock đa lượng có thành phần (MgSO4.7H2O, KH2PO4, KNO3, NH4NO3, CaCl2.2H2O) Mỗi lần cho loại khoáng vào phải khuấy tan hoàn toàn bổ sung thêm 100ml nước cất hai lần trước bổ sung thêm khoáng khác vào ( phương pháp pha thể tích tăng dần) Chú ý: CaCl2.2H2O phản ứng tạo kết tủa với MgSO 4.7H2O nên hai chất phải pha tách rời theo trình tự , cho CaCl vào sau Cho tất vào bình đựng, dùng nước cất hai lần chuẩn lại cho thể tích cần pha - Cách pha stock vi lượng: Stock vi lượng có thành phần ( H 3BO3, MnSO4.4H2O, ZnSO4.7H2O, Na2MoO4.2H2O, KI, CuSO4.5H2O, CoCl2.6H2O) Cân đủ số mg/l thành phần, làm tan hoàn toàn Cuối thêm nước cho đủ thể tích cần pha stock đa lượng Hình Stock vi lượng - Cách pha stock sắt EDTA: Sắt EDTA có thành phần ( Na2EDTA, CaCl2.2H2O) Nồng độ 10ml/l môi trường Chuẩn bị becher 250ml (mỗi becher chứa 100ml nước cất hai lần) đun 800C Cho FeSO4.7H20 Na2EDTA vào hai becher riêng biệt Cho becher chứa FeSO4.7H2O vào Na2EDTA khuấy đều, bổ sung thêm nước cho đủ thể tích cần pha Bảo quản chai màu 4-100C Hình Stock FeEDTA Cách pha vitamin: Vitamin thường dùng Pirydoxine (B6), Nicotinic Acid (P.P), Thiamin-HCl (B1) cần dùng thể tích tính toán hút cho đủ thể tích Hình Vitamin + Cách pha chất điều hòa sinh trưởng thực vật: Nhóm cytokynin cân đủ mg cytokinin hòa tan ml NaOH 1N Cho thêm nước cất cho đủ thể tích cần pha Nhóm auxin cân đủ mg auxin hòa tan ml NaOH 1N Cho thêm nước cất cho đủ thể tích cần pha Bài PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG MẪU CẤY I/Nguyên tắc Ở đa số loài thực vật, nách mang chồi ngủ Các chồi ngủ có đặc tính hoàn toàn giống với đỉnh sinh trưởng, có khả tăng trưởng phát triển thành thể thực vật toàn vẹn Các chồi ngủ đa số bị ức chế phát triển chồi đỉnh (tính ưu ngọn) Nếu tách riêng đoạn thân có mang chồi nách khỏi thể thực vật, tác động chất kích thích sinh trưởng ngoại sinh cytokinin, auxin từ chồi nách tạo nhiều chồi II/Mẫu vật, hóa chất, dụng cụ Đoạn thân cành có mang chồi ngủ, cồn 70o, 96o, xà phồng bột, Javen, nước cất vô trùng, cốc thủy tinh khử trùng, kẹp cấy, dao mổ, đèn cồn, gòn thấm nước III/Tiến hành thí nghiệm Rửa vòi nước máy (10p) Cành tươi non Cắt thành đoạn nhỏ Ngâm, lắc nước xà phòng (15p) Rửa vòi nước máy (5p) Ngâm javen/nước tỷ lệ 1:2 (20p) Rửa nước cất vô trùng (4lần) Cho vào tủ cấy lắc với cồn 700(1p) Rửa nước cất vô trùng (3lần) Cấy mẫu Quan sát TH1: Khử trùng đoạn thân cành chứa mầm ngủ phía mặt đất Hình 7,8 Khử trùng mẫu phía mặt đất Rửa vòi nước máy (10p) TH2: Khử trùng đoạn thân cành chứa mầm ngủ phía mặt đất Cành,củ chứa chồi ngủ nhẹ Ngâm, nước phòng, (30p) Rửa nước máy (5p) Ngâm javen/nước tỷ lệ 1:1 (25p) Rửa nước cất vô trùng (4lần) Cho vào tủ cấy lắc với cồn 700(1p) Rửa nước cất vô trùng (3lần) Cấy mẫu Quan sát xà chà vòi Trong thời gian xử lý, mô cấy phải ngập hoàn toàn dung dịch diệt khuẩn Nếu mô non thời gian xử lý ngắn Đối với phận có nhiếu bụi đất, trước xử lý nên rửa kỹ xà phòng vòi nước chảy Khi xử lý xong, mô cấy rửa nhiều lần nước cất vô trùng(3-5 lần) Những phần mô cấy bị tác nhân vô trùng làm cho trắng cần phải cắt bỏ trước đặt mô cấy lên môi trường Để tránh ảnh hưởng trực tiếp tác nhân vô trùng lên mô cấy, nên ý để lại lớp bọc ngâm mô vào dung dịch diệt khuẩn Lớp cuối cắt bỏ bóc trước đặt mô cấy lên môi trường Chú ý không ngâm mô cồn 90oC Nhận xét: Mẫu cấy chứa chồi ngủ đoạn thân cành phía mặt đất nhiễm mẫu phía mặt đất mẫu mặt đất nhiều vi vinh vật hơn, mẫu lớn khó khử trùng Kết sau1,2 tuần nuôi cấy: Hình 11 Mẫu sống  Đưa mẫu vào tủ cấy→ Lắc cồn 70OC 1’ →Rửa cồn nước cất lần  Loại bỏ phần mô bên →Cắt lát mỏng chứa phần thượng tầng củ cà rốt đặt vào môi trường  Quan sát, ghi nhận biểu mẫu cấy, vị trí phát sinh callus môi trường khác IV/ Quan sát , ghi nhận kết Hình 16,17 Mẫu nhiễm nấm mốc nhiễm khuẩn Hình 18 Mẫu carot sống • • • • • Tỉ lệ sống chết sau nuôi cấy Tổng số mẫu nuôi cấy 25 mẫu: Có mẫu sống đạt 24% Có 19 mẫu chết chiếm 76%, đó: + 10 mẫu chết nấm mốc 52,63% + mẫu chết nhiễm khuẩn 47,36% Nguyên nhân mẫu bị chết : Trong trình khử mẫu làm mẫu chết, mẫu bị nhiễm trước cấy Các mẫu bị nhiễm nấm mốc thao tác cấy chưa xác điều kiện vô trùng chưa đảm bảo tốt, que cấy nóng làm mẫu bị chết, môi trường nuôi cấy khộng đảm bảo.Dụng cụ thủy tinh, dụng cụ cấy chưa vô trùng tuyệt đối Điều kiện nuôi cấy, thời gian lấy mẫu ảnh hưởng đến sức sống mẫu Trong mẫu sống chưa có mẫu phát sinh callus nên chưa lựa chọn môi trường thích hợp cho phát sinh callus Theo lý thuyết môi trường thích hợp tạo callus môi trường MS gồm sucrose 20g/l, agar 8g/l, NAA 10mg/l, BA 1mg/l Sự tạo mô sẹo tác dụng auxin trình: + Sự phản phân hóa tế bào nhu mô mộc libe, nhu mô vỏ hay lõi + Sự phân chia tế bào tượng tầng + Sự xáo trộn mô phân sinh sơ khởi ( chồi hay rễ) Bài NHÂN CHỒI VÀ TẠO RỄ TRONG NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT I/ Nguyên tắc Nhân giống trồng phương pháp nuôi cấy mô tế bào invitro gọi vi nhân giống Nhân giống invitro: Sử dụng mô nuôi cấy có kích thước nhỏ, trì nhân nhanh kiểu gen hiếm, làm vật liệu cho chọn giống, hiệu kinh tế cao Có nhiều phương pháp vi nhân giống khác để tạo chồi từ tạo invitro hoàn chỉnh Tùy đối tượng khác mà sử dụng phương pháp phù hợp Nuôi cấy quan Nuobvgf Chồi Cây Nuôi cấy callus Callus Cây trưởng thành Chồi Cây Callus Tế bào đơn Phôi Cây Nuôi cấy phôi Nuôi cấy tế bào Chồi, cụm chồi, phôi củ nhỏ II/ Mẫu vật, hóa chất dụng cụ Mẫu chồi thực hành 2,3 HÌnh 19 Mẫu lan nuôi cấy mô Kẹp cấy, dao mổ môi trường III/ Tiến hành thí nghiệm TH1: Khảo sát ảnh hưởng BA lên tạo chồi Mẫu cấy phần gốc chứa chồi ngủ, nguyên chồi Cây Mẫu cấy vào môi trường MS môi trường MS có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng BA Môi trường nhân chồi Môi trường MS đối chứng có sucrose 20g/l agar 8g/l Môi trường MS gồm sucrose 20g/l, agar 8g/l, BA 2mg/l, NAA 1mg/l TH2: Khảo sát ảnh hưởng NAA lên tạo rễ Mẫu cấy cụm chồi tách chồi riêng rẽ cấy vào môi trường MS có chứa than hoạt tính môi trường MS có than hoạt tính bổ sung NAA Môi trường tạo rễ Môi trường MS đối chứng có sucrose 20g/l agar 8g/l, than hoạt tính 2g/l Môi trường MS gồm sucrose 20g/l, agar 8g/l, NAA 1mg/l than hoạt tính 2g/l IV/ Nhận xét kết Hình 20 Mẫu lan bị nhiễm sau cấy chuyền Nhận xét ảnh hưởng BA NAA lên trình kích thích nhân chồi, tạo rễ hoa lan Từ kết nuôi cấy sau đến tuần tỉ lệ mẫu chết 100% Theo lý thuyết cho thấy kết hợp môi trường MS có bổ sung BA 2mg/l NAA 1mg/l ảnh hưởng tích cực lên hình thành chồi sinh trưởng chồi Môi trường MS có bổ sung NAA 1mg/l than hoạt tính thích hợp cho tạo rễ invitro hoa lan BÀI PHƯƠNG PHÁP TÁCH VÀ NUÔI CẤY ĐỈNH SINH TRƯỞNG I/ Nguyên tắc Đỉnh sinh trưởng phần chóp búp thân nơi sinh phần Đỉnh sinh trưởng thường mềm yếu mẫn cảm với ánh sáng, chứa nhiều auxin nơi diễn trao đổi chất mạnh Phương pháp tách nuôi cấy đỉnh sinh trưởng sử dụng nuôi cấy invitro với mục đích nhằm phục hồi giống trồng bị nhiễm bệnh tạo hoàn toàn bệnh Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng sử dụng phần mô phân sinh với 3-4 tiền phát khởi có kích thước từ 0,1-0,15mm tính từ chóp sinh trưởng Kỹ thuật phức tạp, phải thực kính hiển vi khả sống sót mẫu có kích thước nhỏ thường không cao, đòi hỏi thao tác thật tỉ mỉ, xác lựa chọn môi trường thích hợp Có phương thức phát triển hoàn chỉnh từ đỉnh sinh trưởng nuôi cấy: Phát triển trực tiếp: Chủ yếu mầm (dicotyledon) khoai tây, thuốc lá, cam chanh, hoa cúc… Đỉnh sinh trưởng→ Chồi nách→ Cây Phát triển gián tiếp: Chủ yếu gặp đối tượng mầm (monocotyledon) phong lan, dứa, huệ, … đỉnh sinh trưởng tạo protocorm từ protocorm phát triển thành hoàn chỉnh Đỉnh sinh trưởng→ Protocorm→ Cây II/ Mẫu vật, hóa chất dụng cụ Hình21.Hoa huệ trắng Cồn 70oC, 90oC, xà phòng bột, Javen, nước cất vô trùng, dao cấy, lưỡi dao cấy, đèn cồn, kính lúp, đĩa petri III/ Tiến hành thí nghiệm Chọn chồi huệ sạch, cắt bỏ  Rửa mẫu vòi nước máy 10’  Ngâm mẫu xà phòng 30’→ Dùng bàn chải mềm chà nhẹ với xà phòng  Rửa xà phòng vòi nước 5’  Ngâm mẫu dung dịch Javen/nước với tỉ lệ 1/1 → Rửa Javen nước cất vô trùng lần  Đưa mẫu vào tủ cấy, lắc cồn 70oC 1’ → Rửa cồn nước cất vô trùng lần  Sau khử trùng tách bỏ kính lúp 2X thị kính 10X  Chồi giữ kẹp nhỏ lúc tiến hành tách lá.→ Đầu dao mổ phải khử trùng thường xuyên trình tách  Khi đỉnh sinh trưởng 1-2 phát thể dùng dao mổ tách rời đặt vào môi trường nuôi cấy để tránh mẫu bị khô Hình 22,23 Đỉnh sinh trưởng kính hiển vi IV/ Kết luận *Ý nghĩa phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng: Phục hồi giống trồng bị nhiễm bệnh, tạo hoàn toàn bệnh nhiễm virus Nhân nhanh số lượng giống virus Những bị nhiễm virus tạo bệnh nhờ nuôi cấy dỉnh sinh trưởng Trạng thái vật lý môi trường có ý nghĩa quan trọng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng * Để loại bỏ virus trồng thường có phương pháp: Kết hợp xử lý nhiệt xử lý hóa chất với nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng chọn lọc phương pháp thử virus *Nếu đặt đỉnh sinh trưởng không ngắn lên môi trường (mặt cắt không tiếp xúc với bề mặt môi trường) đỉnh sinh trưởng không lên Vì mặt cắt không tiếp xúc với môi trường không tiếp xúc hấp thu chất dinh dưỡng, chất điều hòa sinh trưởng Vì phần đỉnh sinh trưởng không sống phát triển Bài THUẦN DƯỠNG CÂY CON RA VƯỜN ƯƠM I/Nguyên tắc Giai đoạn đưa hoàn chỉnh từ ống nghiệm đất bước cuối trình nhân giống invitro bước định khả ứng dụng trình tron thực tiễn sản xuất Đây giai đoạn chuyển invitro từ trạng thái sống dị dưỡng sang sống hoàn toàn tự dưỡng Sự thành công kỹ thuật nhân giống thực vật thể qua số sống vườn ươm Tỉ lệ nuôi cấy sống vườn ươm phụ thuộc nhiều vào kĩ thuật hóa Do đó, việc hóa nhằm mục đích cho nuôi cấy thích nghi với điều kiện môi trường tự nhiên: Nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng, chế độ dinh dưỡng, dịch bệnh, II Vật liệu, dụng cụ Các mẫu vitro tái sinh hoàn chỉnh đủ lá, rễ Hình 24 mẫu lan nuôi cấy mô Giá thể hỗn hợp để ươm (xơ dừa, tro trấu,…), khay ươm Hình 24 Giá thể ươm III Cách tiến hành Thực hành 1: Chuẩn bị giá thể ươm Chuẩn bị giá thể: 50% đất+ 50% tro trấu, xơ dừa + phân ủ hoai mục Điều chỉnh ẩm độ giá thể: 70% Tiệt trùng giá thể: Hấp hay hóa chất (24 trước trồng) Giá thể hoàn thiện Sơ đồ: chuẩn bị giá thể ươm Thực hành 2: Ươm invitro vào giá thể trồng Bình nuôi cấy mô để điều kiện vườn ươm (trước 1- tuần) Dùng kẹp gắp khỏi bình nuôi cấy (tránh làm tổn thương rễ) Rửa agar, để nước Ngâm hóa chất tiệt trùng phút Soi lỗ nhỏ giá thể, đặt vào, ấn nhẹ để cố định Đánh giá số lượng sống sau tháng Sơ đồ: Ươm in vitro vào giá thể trồng *Phương pháp hóa chuyển vườn ươm Cây lấy từ lọ đủ tiêu chuẩn cấy Rửa nước sạch, cho hết phần thạch, không cho dính lại dù nhỏ Phân loại thành dạng ghi rõ lọ cấy Nhúng vào dung dịch chống nấm +Đất lấy đất cát nhỏ, không lẫn hạt sạn lớn +Được trải sọt lớp khoảng 4-5 cm +Phun nước vừa ướt đất *Cấy Các tiêu đủ điều kiện đưa vườn ươm: • • • • Chiều cao: 5- cm Rễ: nhiều, dài, khỏe Số lá: -5 Sức sống: khỏe, phát triển tốt Tất thao tác dùng găng tay Dùng que chọc lỗ lớp đất vừa chuẩn bị, đặt xuống lắp lớp đất lại *Đưa vào môi trường chăm sóc Sau cấy xong, phải đặt môi trường ổn định Luôn giữ ấm cho đất, bề mặt ướt tránh ánh sáng mặt trời mạnh nhiệt độ cao Tránh nhiễm vi khuẩn nấm gây nên tượng thối nhũn Điều kiện môi trường vườn ươm: + Nhiệt độ: 30oC + Ánh sáng: • Tuần 1: 50% ánh sáng tự nhiên ( 7000 lux) • Tuần 2: 70% ánh sáng tự nhiên ( 10000- 12000 lux) • Tuần 3: 100% ánh sáng tự nhiên +Độ ẩm: • Tuần 1: phun sương ẩm 90% • Tuần 2: phun sương ẩm 70% • Tuần 3: phun sương ẩm 60% IV Kết - Sự khác biệt đặc điểm trồng bình nuôi cấy tự nhiên Đặc điểm Hình thái lớp cutin Hình thái khí Lá Thân Rễ Cây bình nuôi cấy Lớp cutin dạng hạt que nhám Khí dạng hình tròn Lá mỏng Hệ mạch phát triển, thiếu mô cương mô Rễ chưa có chức Cây tự nhiên Lớp cutin lớp sáp dầy Khí dạng hình elip Lá dầy Phát triển đầy đủ Chức rễ hoàn thiện [...]... tạo mô sẹo Ngược lại, những mảnh cơ quan trưởng thành không có khả năng tạo mô sẹo Sự tạo mô sẹo ở thực vật xảy ra khi môi trường nuôi cấy được bổ sung một lượng auxin thích hợp Hình 13 Mô sẹo Hình 14 Nhân giống thông qua giai đoạn tạo mô sẹo A Mô sẹo sau 2 tuần nuôi cấy B Mô sẹo sau 4 tuần nuôi cấy C Tạo chồi từ mô sẹo D Cây tái sinh từ mô sẹo E Thu được từ cây con nuôi cấy mô thông qua tạo mô sẹo...BÀI 3 PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY TẠO MÔ SẸO Ở THỰC VẬT I/ Nguyên tắc Trong các đặc tính sinh lý của cơ thể thực vật, khi bị những tổn thương về mặt vật lý (những vết cắt trên cơ thể, những tổn thương do côn trùng tấn công) thực vật có khả năng hình thành những tế bào mới để hàn kín những chỗ tổn thương đó Những tế bào mới được hình thành đó là mô sẹo Mô sẹo là một khối tế bào nhu mô phát triển vô tổ chức,... Chồi Cây Callus Tế bào đơn Phôi Cây Nuôi cấy phôi Nuôi cấy tế bào Chồi, cụm chồi, phôi củ nhỏ II/ Mẫu vật, hóa chất dụng cụ Mẫu chồi bài thực hành 2,3 HÌnh 19 Mẫu lan nuôi cấy mô Kẹp cấy, dao mổ và môi trường bài 3 III/ Tiến hành thí nghiệm TH1: Khảo sát ảnh hưởng của BA lên sự tạo chồi Mẫu cấy là phần gốc chứa chồi ngủ, nguyên cây hoặc chồi ngọn Cây Mẫu được cấy vào môi trường MS và môi trường MS có... không có khả năng nhân giống thông qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Những mô của thực vật có thể dùng nuôi cấy tạo mô sẹo là: thượng tầng libe mộc, tượng tầng vỏ, phôi nhũ, tế bào diệp nhục, lá, trụ bì rễ, tử diệp,… Cây tái sinh từ mô sẹo có đặc tính giống như cây mẹ Từ một cụm tế bào mô sẹo có thể tái sinh cùng một lúc nhiều chồi hơn là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Mô sẹo thường được tạo ra do những xáo... nhau của thực vật, thường do các tế bào trong vùng thượng tầng ( vùng phân sinh) như thượng tầng liber- mộc, thượng tầng vỏ ở gốc của đoạn cắt tạo thành Những tế bào mô sẹo thường có hình cầu, màu trắng hoặc nâu nhạt Khối mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong điều kiện môi trường không có chất kích thích sinh trưởng tạo mô sẹo Nuôi cấy mô sẹo được thực hiện với các loài thực vật không... callus Theo lý thuyết môi trường thích hợp tạo callus là môi trường MS gồm sucrose 20g/l, agar 8g/l, NAA 10mg/l, BA 1mg/l Sự tạo mô sẹo do tác dụng của auxin do 3 quá trình: + Sự phản phân hóa của tế bào nhu mô mộc và libe, nhu mô vỏ hay lõi + Sự phân chia của tế bào tượng tầng + Sự xáo trộn của mô phân sinh sơ khởi ( chồi hay rễ) Bài 4 NHÂN CHỒI VÀ TẠO RỄ TRONG NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT I/ Nguyên tắc Nhân... pháp nuôi cấy mô tế bào invitro được gọi là vi nhân giống Nhân giống invitro: Sử dụng mô nuôi cấy có kích thước nhỏ, duy trì và nhân nhanh các kiểu gen hiếm, làm vật liệu cho chọn giống, hiệu quả kinh tế cao Có nhiều phương pháp vi nhân giống khác nhau để tạo chồi từ đó tạo cây con invitro hoàn chỉnh Tùy từng đối tượng khác nhau mà sử dụng phương pháp phù hợp Nuôi cấy cơ quan Nuobvgf Chồi Cây Nuôi cấy. .. nhiễm trước khi cấy Các mẫu bị nhiễm nấm mốc do thao tác cấy chưa chính xác và điều kiện vô trùng chưa đảm bảo tốt, que cấy quá nóng làm mẫu bị chết, môi trường nuôi cấy khộng đảm bảo.Dụng cụ thủy tinh, dụng cụ cấy cũng chưa được vô trùng tuyệt đối Điều kiện nuôi cấy, thời gian lấy mẫu của ảnh hưởng đến sức sống của mẫu Trong 6 mẫu sống chưa có mẫu nào phát sinh callus nên chưa lựa chọn được môi trường... điều hòa sinh trưởng BA Môi trường nhân chồi Môi trường MS đối chứng có sucrose 20g/l và agar 8g/l Môi trường MS gồm sucrose 20g/l, agar 8g/l, BA 2mg/l, NAA 1mg/l TH2: Khảo sát ảnh hưởng của NAA lên sự tạo rễ Mẫu cấy là cụm chồi được tách ra từng chồi riêng rẽ và được cấy vào môi trường MS có chứa than hoạt tính và môi trường MS có than hoạt tính và bổ sung NAA Môi trường tạo rễ Môi trường MS đối chứng... cấy mô thông qua tạo mô sẹo II/ Mẫu vật, hóa chất, dụng cụ Củ cà rốt sạch bệnh Cồn 700C, 96oC Xà phòng bột, Javen, nước cất vô trùng Cốc thủy tinh khử trùng, kẹp cấy, dao mổ, đèn cồn, bông gòn thấm Hình 15 Dụng cụ III/ Tiến hành nuôi cấy + Chuẩn bị môi trường Môi trường MS đối chứng có sucrose 20g/l và agar 8g/l Môi trường MS gồm sucrose 20g/l, agar 8g/l, NAA 10mg/l Môi trường MS gồm sucrose 20g/l, agar ... việc, tay, dụng cụ cấy, dụng cụ chứa môi trường nuôi chai, lọ II CÁCH PHA MÔI TRƯỜNG: Môi trường nuôi cấy phù hợp thành công thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật Thành phần môi trường dinh dưỡng... thực vật có khả hình thành tế bào để hàn kín chỗ tổn thương Những tế bào hình thành mô sẹo Mô sẹo khối tế bào nhu mô phát triển vô tổ chức, diện giai đoạn hóa ligin khác thực vật, thường tế bào. .. qua giai đoạn tạo mô sẹo A Mô sẹo sau tuần nuôi cấy B Mô sẹo sau tuần nuôi cấy C Tạo chồi từ mô sẹo D Cây tái sinh từ mô sẹo E Thu từ nuôi cấy mô thông qua tạo mô sẹo II/ Mẫu vật, hóa chất, dụng