Đang tải... (xem toàn văn)
Hướng dẫn các bước pha chế môi trường nuôi cấy vi sinh vật y học, công thức pha chế một số môi trường nuôi cấy. 1. Trình bày được các yêu cầu cơ bản, phân loại, các bước tiến hành điều chế môi trường. 2. Chuẩn bị được dụng cụ tiến hành điều chế môi trường. 3. Tiến hành điều chế được một số môi trường thông dụng.
MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VÀ PHÂN LẬP VI KHUẨN,NẤM GÂY BỆNH 1.Tầm quan trọng môi trường: Muốn nuôi cấy vi khuẩn gây bệnh phòng thí nghiệm cần phải có môi trường dinh dưỡng,đó hỗn hợp chất đạm,đường,muối khoáng vitamin thích hợp,đảm bảo cho sinh sản phát triển vi khuẩn Việc pha chế môi trường dinh dưỡng khâu quan trọng công tác xét nghiệm vi khuẩn môi trường không đảm bảo chất lượng cho kết sai lệch việc chẩn đoán,xác định vi khuẩn gây bệnh.Vì để đảm bảo chất lượng môi trường, việc pha chế môi trường phải tiến hành cách thận trọng Các loại môi trường: 2.1 Dựa vào thành phần: Môi trường chia làm loại: Môi trường tự nhiên môi trường tổng hợp Môi trường tự nhiên môi trường điều chế từ sản phẩm có nguồn gốc động vật thực vật, ví dụ: môi trường khoai tây, môi trường nước mạch nha… Môi trường tổng hợp môi trường điều chế từ chất hoá học tinh khiết, xác định lấy với nồng độ cho trước 2.2 Dựa vào trạng thái vật lý: Môi trường chia làm loại: Môi trường lỏng, ví dụ: môi trường canh thang… Môi trường nửa lỏng nửa đặc, ví dụ: môi trường thạch mềm… Môi trường đặc, ví dụ: môi trường thạch thường… 2.3 Dựa vào công dụng: Dựa vào công dụng môi trường chia làm loại: 2.3.1 Môi trường bản: Môi trường môi trường phần lớn vi khuẩn phát triển nguyên liệu để điều chế môi trường khác Môi trường hay sử dụng môi trường thạch thường canh thang 2.3.2 Môi trường vận chuyển bảo quản bệnh phẩm: Trong trường hợp sau lấy bệnh phẩm điều kiện cấy vào môi trường nuôi cấy thích hợp mà phải vận chuyển xa với thời gian định, bệnh phẩm phải bảo quản môi trường vận chuyển phòng xét nghiệm môi trường hay sử dụng môi trường Cary – Blair 2.3.3 Môi trường tăng sinh: Môi trường tăng sinh sử dụng số trường hợp vi khuẩn bệnh phẩm ít, cần làm tăng số lượng trước vào môi trường phân lập ví dụ: môi trường Mueller – Kauffman… 2.3.4.Môi trường phân lập: Môi trường phân lập nhằm mục đích tách vi khuẩn cần tìm khỏi bệnh phẩm có lẫn tạp khuẩn vi môi trường phân lập chất dinh dưỡng có chất đảm bảo phát triển ưu cho loài nhóm vi khuẩn đó, đồng thời lại có chất hạn chế ức chế phát triển loài vi sinh vật khác (môi trường ức chế chọn lọc) loài nhóm vi khuẩn có môi trường phân lập khác Vi dụ: môi trường Endo, MC… sử dụng để phân lập vi khuẩn đường ruột, môi trường Chapman để phân lập tụ cầu, môi trường Schoer phân lập vi khuẩn bạch hầu… 2.3.5 Môi trường xác định tính chất sinh vật hoá học: Đây môi trường sử dụng để phân biệt loài vi khuẩn với loài vi khuẩn khác vi vây thành phần môi trường chất dinh dưỡng có hoá chất đặc biệt để phát khả chuyển hoá loại vi khuẩn cần định danh Các bước pha chế môi trường 3.1 Pha chế từ hóa chất riêng lẻ Chuẩn bị dụng cụ hóa chất: Phải có dụng cụ pha chế men sứ thủy tinh.Thường dung bình nón thủy tinh có dung tích gấp đôi thể tích môi trường đủ để lắc kĩ.Không pha đến lít môi trường cho bình.Các dụng cụ phải rửa thật không lẫn chất khác: Hóa chất dung pha chế phải tinh khiết,khô,không vốn cục,không đổi màu Cân đong: Phải cân xác,đặc biệt hóa chất gây ức chế cho vi khuẩn(muối mật,selenit,v.v.v.) phải dung cân có độ xác tới milligram Để tránh bỏ sót cân nhiều lần,mỗi cân xong thứ để riêng thứ sang bên Hòa tan Phải dung nước cất nước khử khoáng để pha chế.Tùy theo tính chất hóa chất mà hòa tan nóng lạnh.Môi trường thạch gelatin cần hòa tan nước lạnh nóng để đảm bảo môi trường pha chế điều kiện êm dịu,nên nhớ môi trường dễ hỏng đun cần thiết Nếu môi trường có thạch gelatin phải đun nóng để hòa tan hoàn toàn,khi không tiểu phần thạch dính thành bình Điều chỉnh PH môi trường Mỗi loại vi khuẩn phát triển độ PH định,vì làm môi trường thiết phải Điều chỉnh PH thích hợp Việc Điều chỉnh PH môi trường tiến hành 45-50 độ C để PH cuối môi trường sau hấp để nguội không bị thay đổi nhiều Hóa chất dùng để thay đổi PH Natri Hydroxit ( NaOH) 10-20% axit Clohidric 10-12%.Chỉ thị màu phenol Bromphenol Cách pha thị màu xem phần kĩ thuật pha chế - Làm sáng môi trường Môi trường phải làm sáng để quan sát tốt phát triển vi khuẩn Các phương pháp làm thông thường là: Đối với môi trường lỏng: lọc qua vải mịn giấy lọc Đối với môi trường thịt: muốn môi trường suốt không lờ đục phải dùng Natri hydroxit điều chỉnh pH = 7,8- hấp 120 độ C 30 phút, để lắng cặn hấp 120 độ C 30 phút, để lắng cặn lọc qua lần giấy lọc Phương pháp làm sáng mầu là: số môi trường có màu sẫm môi trường casein thủy ngân, canh thang, ding than hoạt để loại màu tùy theo môi trường sẫm màu nhiều hay mà dùng từ đến 10g than hoạt tính cho lít môi trường; đun sôi 10 phút lọc qua giấy lọc vải dày Đóng ống môi trường: Tùy theo yêu cầu sử dụng mà đóng môi trường vào ống 12, 16 18mm bình cầu Dụng cụ đơn giản để đóng môi trường phễu có vòi cao su bình lắng gạn có van đóng mở Các dụng cụ đóng môi trường phải vô trùng Khi đóng ý không để môi trường dính vào miệng ống, lọ Khử trùng môi trường - Phải khử trùng sau đóng vào ống vào bình, để lâu nhiệt độ thích hợp tạp trùng phát triển làm ảnh hưởng đến chất lượng môi trường - Các môi trường có ure, hyposulfite dễ bị phân hủy nhiệt độ cao phải khử trùng cách lọc qua Seitz hấp cách thủy nhiệt độ 60-70 độ C - Các môi trường có trứng huyết khử trùng nhiệt độ 70-80 độ C - Các môi trường thông thường khác thường khử trùng 110độC 30 phút 121độ C 15 phút Nếu bình môi trường lít khử trùng 121độ C 20 phút - Sau khử trùng áp suet lò giảm xuống không chuyển môi trường lò , không nên để môi trường hâm nóng lâu lò, không nên để môi trường qua đêm lò, môi trường bị sẫm màu chất lượng - huyện, xã lò hấp môi trường đun sôi cách thủy 100độ C 30 phút lion ngày, nha bào bị phá hủy tỷ lệ cao Đổ đĩa môi trường: - Một số môi trường cần đổ đĩa sau hấp khử trùng, để nguội 45- 50độ C đổ lên đĩa môi trường nóng 50 độ C để tránh nước đọng lại mặt nắp hộp lồng - Trước rót môi trường đĩa, phải quay tròn bình môi trường để trộn - Các bọt khí bề mặt môi trường phá cách dùng đèn ga lia nhẹ mặt bọt khí dùng dầu piopet đốt nóng, châm vào bọt khí - Nếu bề mặt môi trường ướt phải làm khô tủ ấm nhiệt độ 30-40 độ C 20-30 phút trước cấy Kiểm tra vô trùng: Môi trường để vào tủ ấm qua đêm để kiểm tra vô trùng (3 – 5% số lượng đĩa sản xuất) Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất Cân đong Hoà tan Điều chỉnh pH Làm sáng môi trường Đóng ống môi trường Khử trùng môi trường Đổ đĩa Kiểm tra vô trùng Các bước pha chế môi trường từ chất riêng lẻ 3.2 Pha chế bột từ môi trường khô Hiện nhiều phòng xét nghiệm vi sinh cung cấp loại môi trường chế sẵn dạng bột khô Các môi trường làm từ nguyện liệu, hóa chất tinh khiết nên chất lượng môi trường đảm bảo ổn định việc cân đong pha chế đơn giản tiện lợi Tuy nhiên việc pha chế môi trường từ bột khô phải làm theo bước cần ý số điểm sau: - Phải dùng nước cất nước khoáng trung tính để pha chế - Nếu môi trường pha với nước trung tính điều chỉnh lại PH, môi trường cũ, cần kiểm tra điều chỉnh PH quy định lọ môi trường 3.3 Các tượng nguyên nhân gây sai hỏng môi trường Có nhiều tường nguyên nhân gây sai hong môi trường, cần biết để tìm cách khắc phục Dưới số tượng nguyên nhân chính: 3.3.1.Môi trường cứng - Thạch không thích hợp cân đong không xác, làm tăng lượng thạch quy định 3.3.2 Môi trường có độ cứng thấp - Thạch không thích hợp lượng thạch - Thạch chưa tan hoàn toàn 3.3.3.Vi khuẩn phát triển do: - Có chất úc chế bình chứa, mẫu thử - Vi khuẩn mẫu thử bị phá hủy trước cấy - Liều lượng thành phần môi trường không 3.3.4 Vi khuẩn phát triển mạnh - môi trường sấy, hấp nhiệt đọ quy định ,làm hỏng chất ức chế tạp khuẩn - cấy vào nhiều chất thử 3.3.5.Khuẩn lạc bị nhòe - bề mặt môi trường ẩm ướt - cấy vào môi trường nhiều chất thử - hấp môi trường nhiệt độ quy định, làm hỏng chất ức chế 3.4.Bảo quản môi trường 3.4.1 môi trường khô - bảo quản nôi khô, tránh ánh sang, nhiệt độ từ 10 đến 12 độ c - Lọ môi trường phải luôn đậy chặt sau dùng bị hở môi trương hấp thụ nước làm thay đổi độ PH bị vón cục Trong điều kiện lý tưởng( khô mát tối) lọ môi trường năm, kể từ sản xuất 3.4.2 môi trường pha chế - Bảo quàn túi băng chất dẻo nhiệt độ 4-10°C ống môi trường có Thể đẻ từ 1-2 tháng - Nếu nhiệt độ phòng 1-2 tuần Tài liệu thâm khảo : Kỹ thuật đảm bảo chất lượng xét nghiệm vi sinh y học – NXB Y Học2008 Các kỹ thuật xét nghiệm vi sinh – Viện vệ sinh dịch tễ trung ương KỸ THUẬT PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG 2.1 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn 2.1.1 môi trường + môi trường cấy vi khuẩn ưa khí nước thịt ½ Thịt bò trâu 500g Nước cất 1000ml - Thịt bò trâu loại tốt, lọc gân, mở, xay băm nhỏ, lấy 500g ngâm vào l000ml nước đựng nồi nhôm men để tủ lạnh qua đêm (nếu trời lạnh để bên ngoài) -Sáng hôm sau lấy đun từ từ sôi, vớt hết bọt khuấy Duy trì độ sôi âm ỉ vứi lửa nhỏ, khuấy - lọc qua giấy lọc để loại mỡ - them nước cất vào cho đủ 1000ml Có thể dùng ngay, muốn để dành đóng chai hấp khử trùng 110độ c 30 phút Để giảm thể tích làm nước thịt 1/1( kg thịt với l nước) dùng pha đôi phần nước thịt, phần nước cất Nước thịt tốt phải có từ 500 – 600 mg axitamin lít Nước thịt môi trường sở đẻ pha chế canh thang thường, thạch thường v.v canh thang thường Pha chế từ nước thịt bò - nước thịt bò 1000ml - peptone bột 10g - muối tinh khiết (NACL) 5g - đun nóng khuấy cho tan hết muối peptone - điều chỉnh ph 7,8 – dung dịch NAOH - hấp 120 độ c 30 phút để nguội cho lắng cặn - chắt lấy phần nước trong, điều chỉnh PH 7,4 – 7,6 - đun sôi lại lọc qua giấy lọc cho - đóng ống 16mm, ống 5mm hấp khử trùng 110độ c 30 phút Pha chế từ cao thịt bò: - cao thịt bò 5g - peptone bột 10g - muối tinh khiết 5g - nước cất 1000ml - đun nóng, khuấy cho tan hết chất - điều chỉnh ph 7,4-7,6 lọc - đóng ống 16mm, ống 5ml, hấp khử trùng 110độc 30phut Canh thường dùng để cấy loại vị khuẩn ưa khí nói chung, thường dùng để kiểm tra vô khuẩn Thạch thường Pha chế từ nước thịt bò: - nước thịt bò 1000ml - peptone bột 10g - muối tinh khiết 5g - thạch sợi 20g ph=7- 7,2 - đun nóng nước thịt, peptone, muối cho tan - điều chỉnh ph từ 7,8-8 dung dich NAOH 20% - cho thạch rửa sạch, cắt nhỏ vào - hấp 120độ c 30 phút - kiểm tra lại ph xem đạt yêu cầu chưa 7,4-7,6 - lọc qua bong gạc môi trường nóng phân phối vào bình cầu 250ml vào ống nghiệm ống từ 5-6ml - hấp 110độ c 30 phút, ống nghiệm phải để nằm nghiêng cho thật đông Pha chế từ cao thịt bò - Cao thịt bò 5g - Pepton bột lOg - Muôi tinh khiết (NaCỈ) 5g - Thạch bộl 18-20g - Nước cất 1000 ml Đun sôi hóa chất tan hoàn toàn Chú ý khuấy để thạch không bị khô cháy (có the làm tan thạch nồi hấp 100°c 10 phút) Đicu chỉnh pH 7,4 - 7,6 đóng ống nghiộm ống 5,6 ml binh cầu 250 ml Hấp khử trùng 110°c 30 phút, đem để ống môi trường nằm nghiêng cho thạch dông Môi trường làm từ cao thịt tinh khiết nước thịt tươi nên qua giai đoạn hẩp lắng cặn 120°c 30 phút Thạch thường môi trường sở để chế nhiều loại môi trường khác canh thang glucoza 1% Canh thang thường1000 ml Glucoza 10g Hòa tan glucoza canh thang, điều chinh pH = 7,6.Đóng ống môi ông 5-6 ml Hấp 110°c 30 phút Môi trường dùng nuôi cấy vi khuần ưa glucoza thạch mềm giữ chủng - Pepton 10g - Muối tinh khiết 5g * Cao thịt 3g - Cao mcn 6g - Thạch 6g đun sôi khuấy hòa tan hoàn toàn chất Điều chinh pH = 7,6 Đóng ông 12 mm, mỗỉ 3-4 ml Hấp 110°c 30 phút 2.1.Môi trường cấy vi khuẩn kị khí 2.1.1.Canh thang V.F (Thịt-Gan, Viandc Foỉc) : Thịt bò xay Gan bò xay Pcpsin hiệu giá 5o0 Axít clohydric nguyên chất Nước cất nóng 600C Cho tất cà vào nồi men, để tủ ấm 48-50°C 18 giờ, khuấy lần, sau đem đun sôi từ từ lên 80°c 20 phút để hủy mcn pepsin Diều chỉnh pH = 7,4, lọc hấp 120°c 30 phút Cứ lít môi trường thêm vào 2g glucoza, lọc trong, đóng vào ống co, mỏi ống cho bi thủy linh Hấp 110°c 15 phút Chú ý : Nếu pcpsin, có the thay lOg pcpsin 2000g dày lợn băm nhỏ Trước dùng nên đun sôi cách thủy ống môi trường đê làm không khí sinh môi trường trình bào quản 2.1.2.- M ôi trường thịt băm : Canh (thang V.F (ph = 7,4) 12 ml Thịt băm nấu chín 0,5g Đóng vào ống nghiệm, hấp 110°c 30 phút Thịt băm có khả khử oxy môi trường Cách làm thịt băm : Thịt bò ép hết nước, cho vào chai rộng miệng, đậy nút gạc, hấp 120°c 30 phút Bảo quản 4°c Trước dùng phải luộc bã thịt nước cất, ép thừa cho vào ống môi trường độ 0,5g Môi trường gan cục: Canh thang V.F (pH = 7,4) 12ml Gan bò luộc chín thái nhỏ hạt lựu 0,5g Đóng vào ống nghiệm Hấp 110°c 30 phút Gan bò cỏ khả khử oxy môi trường 2.1.3.Thạch Veillon (Vây-ông) : Thạch thường lít Glucoza 15 g Kalinitrat 0,5 g Đun sôi thạch, cho glucoza kali nitrat vào Lắc lọc phân phối vào ống 15ml (nếu ống có đường kính nhỏ 8mm cho vào ml) Hấp 110°c 20 phút Để ống thẳng đứng cho thạch đông không để nghiêng Trước dùng phải tái sinh cách đun sôi cách thủy 10 phút + Môi trường dùng nuôi cấy chung cho vi khuần ưa khí ki khí 2.1.4 Môi trưòng thiognicolat: - Pcpton bột 15g - Cao mcn 5g - Glucoza 5g - L-cystin ' 0,5g - Muối tinh khiết (NaCl) *• 2,5g - Natri thioglycolat 0,5g - Thạch 0,5g - Rcsa/urin 0,001 g - Nước cất lít đun nóng để hòa lan chất, trừ glucoza, thiognicolat rcsazurin Riêng L-cyslin hòa lan nước cất có pha thêm - 6ml dung dịch natri hydroxyt 10% đồ vào hỗn hợp Kiềm hóa pH = - 8,2 natri hiydroxyt Đun sôi - phút, khuấy cho tan hết thạch bù nước vào cho đủ thể tích ban đầu; thêm glucoza, thioglycolat, Lọc qua lăn giấy lọc qua vải Điều chỉnh ph = 7,2 - 7,3, thêm rcsa/urin đóng ống lOml.hấp khử trùng 110°c 30 phút Hiệnn nhiều phòng thí nghỉệm lớn giới môi trường thioglycolat dùng đẻ thử vô trùng chế phẩm sinh vật học dược phẩm để tìm vi khuần ưa khí kị khí Chú ý: Môi trường không đề ngày nhiệt độ phòng - Nếu môi trường pha đun lại Trước dùng, nếuu môi trường để - ngày phải đun lại Môi trường không dùng nếuu trở nên hồng mầu hồng không di đun sôi b/ CÁC MÔI TRƯỜNG PHÂN LẬP : + Môi trường phân lập vi khuẩn ưa khí 7- Môi trường phân lập tụ cầu : Môi trường Chapman (Sápman) Thạch thường lít Muối tinh khiết (NaCl) 65 g : Dường manìt 10 g Đỏ phcnol DD 1% - ml đun sôi thạch, điều chỉnh pH = 7,0 - 7,2, cho muối đường manit dung dịch đỏ phcnol vào đóng vào ống nghiệm đóng ống thạch thường Hấp 110°c 30 phút Ống môi trường có màu đỏ da cam Tụ cầu gây bệnh có khả sử dụng đường manil làm cho môi trường bỉ axit hóa màu môi trưởng chuyển sang vàng Cách pha dung dịch đỏ phenol: -Đỏ phenol • lg -Nước cất 100 ml Hòa tan đỏ phcnol nước căt nóng 70°c, lọc qua giấy lọc, đựng lọ nút kín 2« môi trường phân lập liên cầu phế cầu: Thạch máu: Thạch thường 150 ml Máu thỏ cừu 15 ml Đun cho thạch tan chảy ra, để nguội 50°c, thêm máu đá loại tơ huyết vô khuẩn vào bình thạch Quay tròn bình cho máu hòa tan thạc Màu thạch đỏ tươi tốt Nếu màu ngả đen máu chín Đóng vào ống nghiệm l8mm pipete vô khuần, ống 10 ml Thạch máu có Gentainyxin : Cách làm thạch máu có thêm gêntamyxin mcg ml môi trường 3- Môi trường phân lộp não mô cầu lậu cầu : Canh thang máu Một ống canh thang thường + 15-20 giọt máu thỏ cừu vô khuẩn Thạch máu Sôcôla (Chocolate) : Làm thạch máu đun cách thủy 80°c 10 phút Chú ý lắc tròn bình thạch để nguội 45 - 50°c đồ đĩa 4Môi trường phân lập Pasteurella tularensis : 10 Môi trường trứng Dung đjch Natri clorua 9% 40 ml Lồng đỏ trứng' 60 ml Cho vào bình nón vô khuằn lắc kĩ, đóng 10 ml đề nghiêng hấp 75°c Thạch natri sunlfit Thạch thường pH = 7,4 100 mỉ Dung dịch natri sulíit 10% 0,25 ml Dung dịch tím gcnlian %o - ml ' Máu cừu huyết ml Cho dung dịch hóa chất vào bình thạch đun cho tan hết để nguội 45 – 50 c, cho thêm máu cừu huyết lắc tránh bọt, đổ đĩa đóng vào ống nghiệm Chú ý : lượng tím gentian không cho qui định ức chế loại vỉ khuẩn, kề vi khuẩn dich hạch không mọc Môi trường phân ìập Brucella: Thạch Tryptosc (Tryptô): - Tryptosc 20g - Glucoza lg - Natrỉ Clorua 5g - Thiamỉn Clorhyđrat 0,005g - Thạch 15g - Nước cất vừa đủ lít Đun cho tan thạch cho hóa chất vào, điều chỉnh pH = 7,2 - 7,4 Hấp 110°c 30 phút 6-Môi trường phân lập Hacmophilus: Thạch máu Socola có bacitraxin Làm thạch máu socola có thêm bacitraxỉn 300 mcg ml môi trường 7- Môi trường phân lập vi khuẩn đường ruột: Các vi khuẩn đường ruột lẩy từ bệnh phẩm trước đưa vào phân lập cần cấy truyền qua số môi trường vận chuyển bảo quản môi trường tăng sinh + Môi trường vận chuyền bảo quản Môi trrờng Cary - Bỉair: Natri thioglycolat Dinalri Pholíat (Na2HPƠ4) Nalri Clorua Thạch Dung dịch Canxi Clorua (CaCb) 1% Nước cốt vừa dủ 11 pH = 8-8,2 Đun sôi cách thủy cho tan hết chất môi trường trở nên (không đun sôi trực tiếp) Đề nguội 50°c thêm 9ml dung dịch Canxi Clorua 1% pha nước Điểu chỉnh pH = 8,4 với Natri Hydroxyt 10% Đóng ống 16 mm, ống ml Khử trừng lò hấp 100°c đun sôi cách thủy 15 phút Môi trường Cary - Blair dùng đểbảo quản vận chuyển vi khuẩn Salmonclla, Shigclỉa, E.Coli, Vibrio Dung dịch đệm Glyxerin Glyxerin trung tính 1000 ml Nước muối sinh lí 8,5%0 2000 ml Điều chỉnh pH = với dinatriphotíat (Na2HPƠ4) Hấp khử trùng 110°c 30 phút Dung dịch đệm glyxcrin dùng đề vận chuyển Salmonclla, Shigclla, E.Coli Không dùng cho Vibrio Campylobacter + Môi trường tăng sinh : Môi trường Mueller - KauỊf mann Chuẩn bị dung dịch Dung dịch I: Canh thang thường 90 ml Canxi cacbonat 5g Cho canxi cacbonal vào bình cầu có canh thang Hấp 110°c 30 phút Dung dịch II: Natri hyposunif 50g Nước cất 100 ml Hòa tan, lọc qua nến lọc, dựng vào lọ vô trùng Nếu nến lọc khử trùng lò hấp 100°c 30 phút - Dung dịch III: Iot 25 g Kaliuni Iodua 20 g Nước cất 100 rnl Trộn iot kali iodua cối sứ, cho dẫn nước vào khuấy cho tan hết, đựng lọ màu có nút thủy tinh dùng dần Dung dịch IV: Xanh brilỉan (Vert Briỉỉiant) Nước cất Cho Xanh brilỉan vào cối, nghiền nhỏ, đồ dần nước cất vào khuấy cho tan 0,1 g 100 ml hết Pha môi trường hoàn chinh Trong bình cầu đựng dung dịch I, dùng ống hút lấy lOml dung dịch II, ml dung dịch III, ml dung dịch IV, lắc đều, đề lắng cặn 24 giờ, sau đóng vào ống nghiệm, ống ml Môi trường có tác dụng hạn chế phần lớn tạp khuằn thích hợp cho Salmonella phát triền Từ môi trường cấy truyền qua môi trường đặc ss, Endo để có khuần lạc riêng biệt Muốn tìm Shigella cấy thẳng vào môi trường đặc nói trên, không cần qua môi trường Mueller KauíTmann 12 + Môi trường Tetrathionat: Dung dịch : I Pepton 5g Muối mật g Canxicacbonat 10 g Natrihyposuníìt 30 g Nước cất Đun nhỏ để hòa tan, điều chỉnh pH - 7,2 - 7,4 Hấp 100°c 30 phút Trước dùng cho ml dung dịch iot vào 100 ml dung dịch Dung dịch iot: -Iot 6g - Kali iodua 5g - Nước cất 20ml Môi trường tctrathionat dùng để làm phong phú Salmonclla Nước peplon kỉềmt mặn : Pcpton 10g Natri Clorua 15g Glyxerỉn 1,25g Nước cất 1000ml Hòa tan chất, điều chỉnh pH = - 9,2 với dung dịch nalri hydroxyt 40% Đóng Ống, hấp 110°c 30 phút Nước pcptone kiềm mặn dùng để làm phong phú ỉbrỉo Môi trường Seỉcnil Pcpton 5g Lactoza 4g Photíat bipotasic (K2HPO4) 10g Natrỉ sclcnỉt 4g L-cyslin 0.01g Nước cất 1000ml Hòa (tan chất nước cẩt, lọc qua nến lọc Đóng vào ống nghiệm vô khuẩn, ống 10 ml Môi trường có khả tìm thấy Salmonclla nhiều môi trường Mucllcr Kauíímann + môi trương phân lập: Thạch Bitmut sun/ lí (Wilson Blaỉr): - Cao thịt 5g - Pepton 10 g - Glucoza 5g 13 - Natri photíal disodic (Na2HPƠ4) 4g • Fcrơ suníat 03 g - Bỉlmut suníit 8g - Xanh brilian (dang dịch 0,5% nước) ml * Thạch 20g - Nước cất 1000 ml Cho tất chất vào nước, đun sôi khuấy liên tục tới chất hòa tan hoàn loàn, điều chỉnh pH 7,4 - 7,6 chất kết tủa tạo thành mà không hòa tan, để nguội 45 - 50°c, trộn đồ đĩa Môi trường dùng dề phát vi khuẩn nhóm Salmonella Môi trường Dezaxicolat Xiírat Lactoza (DCL Agar): Pcpton 5g Cao thịt 5g Lactoza 10 s Nalri Xitrat 8,5 g Nalrỉ hyposuníit 8.5g Feric Xilrat Natrỉ dczoxycolat g Đỏ trung tính dung dịch 1% 2,5 ml Thạch20 g Nước cất 1000 ml - Cho peplon, cao thịt, thạch vào nước đun tan hoàn toàn, thêm lactoza, nalri Xỉtrat, Fcric Xitrat, dczoxycolat Điều chỉnh pH = 7,3 - 7,5 thêm đỏ trung tính vào Đóng bình cầu 200 ml Hấp 110°c 15 phút đề nguội 80°c thêm cách vô khuẩn 10 ml dung dịch Natri hyposunttl 17% (17g Na hyposuníit pha 100 ml nước cất) Trộn đồ đĩa Môi trường dùng đc phân lập Samonella Shigclỉa Môi trường En : Pepton 10 g K2HPO4 3,5 g Natri suníìt 2,5 g Lactoza 10 g Thạch 20 g Dung dịch Fuchsỉn 10% cồn 90° ml 14 Đun sôi hòa tan chất Điều chinh pH = 7,6 Đóng bình cầu bình 100 ml Hấp 110°c 20 phút Đề nguội 45 - 50°c đồ hộp lồng Môi trường có màu hồng nhạt Môi trường Endo dừng để phân lập E.Coli Trên môi trường E.Coli có khuẩn lạc màu đỏ với nước bóng kim loại Môi trường McConkey (MăcConkây) : * ■ - Pepton 20g - Lactoza 10 g - Muối mật 1,5 g - Natrỉ Clorua 5g - Thạch 20g - Dung dịch đỏ trung tính 1% 0,6 mỉ - Nước cất 1000 ml Đun nhỏ lửa, khuẩy để hòa tan chất Điều chinh pH = 7,2 - 7,4 cho đỏ trung tính tím tinh thề vào Phân phối vào bình cầu, hấp 110°c Irong 30 phút Đc nguội 45 - 50°c hộp lồng Môi trường dùng để phân lập Samonclla, Shlgell; Môi trường ss (Salmonclla - Shigcỉla Algar) : E.Coli - Cao thịt 5g - Pcpton • 'V 5g - Lacto/a 10g - Muối mật 8,5 g - Natri Xỉtrat 8,5 g - Natri hyposuníỉt 8,5 g 15 -SátXitrat 1g - Xanh brilian (dung dịch 0,1% nước) 0,3 ml • • Đỏ trung tính (dung dịch 1% nước) 2,5 ml - Nước cất 1000 ml đun sôi nhỏ lửa, khuẩy để hòa tan chất Điều chỉnh pH = - 7,2 Để nguội 45 - 50°c đổ hộp lồng Không hấp Môi trường dùng để phân lập Salmonclla Shỉgclla Môi trường TCBS (Thiosulíate - Citratc Bile Saks) : - Pcpton 10 g - Cao men 5g - Natri Xitrat 10 g - Nalri ihiosuníat 10g - Mật bò khô 5g - Natri cholatc 3g - Feric Xitrat ig - Natri Clorua 10 g - Sacaroza 20g - Xanh bromothymol (dung dịch 0,2%) 20 ml - Xanh ihymol (dung dịch 1%) ml - Thạch 15 g - Nước cất vừa đủ lít Đun sôi khuấy tới tan hoàn toàn chất Không hấp Để nguội 45-50°c, điều chỉnh pH = 8,6 đồ hộp Môi trường dùng đè phân lập Vibrio cholerae có khuẩn lạc mầu vàng Pha dung dịch xanh bromthymol 0,2%: Cho 2,5 ml dung dịch NaOH 0,1N vào 47,5 ml nước cất thêm 0,lg xanh bromolhymol Pha dung dịch xanh thymoy 1%: Cho 2,2 ml dung dịch NaOH 0,1N vào 7,8 ml nước cấl thêm 0,lg xanh thymoy - Pcpton 10g 16 - Natrỉ Clorua 5g - Cao thịt 4g - Thạch 20g - Nước cất lít Đun sôi khuấy để hòa tan hoàn toàn chất Điều chỉnh pH = 8,4, đóng vào bình câu, hấp 110°c 30 phút Đề nguội 45-50°C dồ hộp tông Môi trường dùng để phân lập Vibrio cholerae Trên môi trường khuẩn lạc V cholerac suốt Còn vi khuẩn đường ruột khác cỏ khuẩn lạc đục lớn Mói trường xanh brillian - Cao thịt 3g - Pcpton 10g - Natri clorua 5g - Lactoza lOg - Sacaroza lOg - Đỏ phenol (dung dịch 0,2%) 40 ml •Xanh brilian (dungdịch 0,5%) 2,5 ml - Thạch 20g - Nước cất 960 ml Cho tất thành phần vào nước, đun sôi khuấy liên tục tới chất hòa tan hoàn toàn Đề nguội 50-60°C, điều chỉnh pH = 7-7,2, đóng bình cầu hấp 110°c 30 phuts, đc nguội 45-50°C đổ hộp pctric Môi trường xanh briliar dùng để phân lập Salmonclla Trênn môi trường Salmonclla có khuẩn lạc mầu hồng nhạt mờ, đường kính 1-3 mm 8- Môi trường phân lập trực khuẩn bạch hầu: Môi trường huyết đông (Lô’eff icr) : Huyết bò300 ml Canh thang glucoza 1% 100 ml Pha canh thang glucoza 1%, lọc trong, hấp 110°c 30 phút Hỗn hợp canh thang huyết theo công thức, lọc qua phễu có gạc hấp khử trùng Đóng ống 18 mm, tránh bọt ống, xếp nghiêng vào lò hấp, ngày đầu 75°c giờ, ngày hôm sau 75°c 30 phút 17 Kiểm tra vô trùng 37°c 24 Bảo quàn tủ lạnh Chú ý: Nhiệt độ nóng môi trường bị sủi bọt Môi trường Schroer (Xkrô-e) : Thạch thường pH — 7,5-7,6 Dung dịch Máu cừu loại tơ huyết Dung dịch kali tcnlurit 5% Dung dịch gồm có: Canh thang thường 100ml Pepton bột 18g Natri axetat 0,62g Glyxcrin 4ml Hấp 110°c 30 phút Cách làm môi trường: Đun sôi thạch cho tan đều, cho dung dịch vào nhiệt độ xuống 45°c cho dung dịch Kali tenlurit máu cừu vào lắc thật đều, đổ hộp lồng Tất công tác pha chế môi trường thực đicu kiện vô khuẩn Sau để tủ ấm 37°c 24 để kiểm tra vô khuẩn đề tủ lạnh dùng dần Dung dịch kali tenlurit pha với nước cất vô khuẩn, pha xong không cần khử khuẩn, bảo quản tủ lạnh Môi trường phân lập trực khuân lao: Môi trường Lơvcnxlen (Lổwenstein): * Dung dịch 150 ml - Bột khoai tây hấp 6g - Dung dịch xanh malachit 2% 12 ml -Trứng gà 9-10 Dung dịc gõm có: - Asparagin - Kali hydrophoơa! (KII2PO4) 1g - Manhcgi sunfat 1g - Natri Xitral 1g - Glyxcerin 10 ml g 18 - Nước cất lít Đun nhỏ lửa khuấy tan hết hóa chất Điều chỉnh pH = 7,2 (nếu pH cao hạ axit xilric, thấp cho ammoniac) Lọc qua giấy lọc cho thật Phân phối vào bình cầu bình 150 ml hấp 110°c 30 phút Cách làm môi trường : Trứng gà tươi, soi qua đèn soi trứng để kiểm tra đốm đen loại Dùng bàn chải xà phòng cọ thật sạch, để nước ngầm cồn 90° 30 phút Lấy ống có 6g bột khoai tây hấp khừ trùng 110°C/30 phút, đổ vào bình cầu có 150 ml dung dịch lắc dun sôi cách thủy bột hòa tan dung dịch trờ nên sền sệt lấy Vớt trứng ra, đập vào cốc thủy tinh sấy, đánh tan đổ vào bình cầu có dung dịch bột khoai tây Thêm xanh malachil dã hẫp lác Lọc qua vải gạc khử khuẩn đỏng vào ống nghiệm l8mm, ống 6-7 ml, tránh có bọt ống Để nằm nghiêng lò hấp cho nhiệt độ lên 85°c 45 phút Để tủ ấm 37°c 24 Kiểm tra vô khuẩn, để tủ lạnh dùng đần + Môi trường phân lập vi khuẩn kị khí /- Môi trường Wilson Blair Môi trường chọn lọc Beercns để phân lập Risiclla Thạch V.F glucoza800 ml Mật bò lọc 200 ml Natri azit 0,lg Điều chỉnh pH = 7,4, phân phối vào ống nghiệm 18mm ống 6-7 ml Hấp 110°c 30 phút Môi trường natri azit lục ánh : Để phân lập vi khuẩn loài Sphacrotilus, Vcillonella Fusobacterium Cứ ống thạch đũa V.F glucoza đun chảy, cho thêm 0,5 ml dung dịch Natri azit lục ánh Cách pha: Nalri azit 0,10g Lục ánh mg Nước cất 100 ml C/MÔI TRƯƠNG PHÂN BIỆT HAY XÁC ĐỊNH: Môi trường phân biệt loại môi trường dùng để nghiên cứu đặc tính sinh vật hóa học để xác định loại vi khuẩn gây bệnh Một số môi trường dược dùng : - Môi trường Kligler ( K I A ) : I Cao thịt 3g Cao men 3g 19 - Pepton 2()g Natri Clorua 5g Lactoza lOg Fcric Xitrat 0,5g Glucoza lg Natri thiosunfat 5g Đỏ phenol dung dịch 0,5% ml Thạch 2g -Nước cất lít Cho thạch vào nước, đun sôi khuấy liên tục tan hoàn toàn (hoặc hấp 100°C), thêm hóa chất vào để hòa tan Điều chỉnh pH = 7,4, thêm ml dung dịch đỏ phenol 0,5%, khuấy đều, phân phối vào ống nghiệm 12 mm ống đóng ml, hấp 110°c 30 phút, để ống môi trường nằm nghiêng, cho mặt nghiêng dài khoảng cm Môi trường dùng để tìm tính phân giải đường lactoza, glucoza, tìm khí hydro sunfua sinh 2- Môi trường Ure Indol: - L-Tryptophan 3g - Photfat monopotasic lg - Photfat dipotasic 1g - Nalri Clorua 5g - ure 20g - Dung dịch đỏ phenol cồn ml - Nước cất lít Cách pha dung dịch đỏ phenol: hòa lan 0,25g đỏ phenol 50 ml cồn 90° c thêm 50 ml nước cất Cách pha môi trường: đun nóng 50-60°C để hòa tan hóa chất, điều chỉnh ph = 7,2, thêm dung dịch dỏ phenol, lọc qua Seitz đóng vào ống nghiệm vô khuẩn ống 1-2 ml Có thể khử khuẩn lò hấp : 75°c giờ, hôm sau : 65°c 30 phút Môi trường dùng đề tìm tính phân giải ure tìm indol Sau cấy 24 gỉờ mầu đỏ da cam trở thành đỏ cánh sen dương tính, đỏ da cam cũ âm tính, sau 20 nhỏ giọt thuốc thừ côvắc vào có ỉndol thấy vòng đỏ tươi xuất Nếu không cố ỉndol vòng màu xuất 3'Môi trường mannit di dộng: Phepton 20g Kali natri 1g Manittol 10g Dung dịch dỏ phenol 1%trong nước 4ml Thạch 4g Nước cất 1lit đun sôi khuấy để hòa tan hoàn toàn hóa chất Điều chỉnh pH = 7,6 Thêm dung dịch đỏ phenol, đóng vào ống 12mm, ống ml, Hấp 1l0°c phút Môi trường dùng để tìm tính di dộng tính phân giải đường mannit Nếu đường mannit bị phân giải môi trường bị axit hóa màu môi trường chuyển từ đỏ sang vàng Môi trường Ornithin Decacboxylaza (ODC) Acginin dehydrolaza (ADH) môi trường lysine decacboxylaza (LDC): ODC ADH LDC L- lysine monoclohydray 5g L- ocnithin 5g l- acginin 5g cao men 3g 3g 3g glucoza 1g 1g 1g bromocresol( 1,6g/100ml cồn 95°) 1ml 1ml 1ml Đun nóng nhẹ để hòa tan hóa chất Điều chỉnh pH = 6,5 Thêm thị bromocresol, môi trường có màu đỏ ánh tím Lọc trong, đóng vào ống 12mm ống 1-2 ml Hấp 10°c 15 phút Những môi trường dùng để tìm tính khử cacboxyl khử hydro Nếu phản ứng dương tính môi trường bi kiềm hóa chuyển sang màu tím - Nalri Clorua 5g - Manhesi sunfat 0,2g - Amoni photfat (NH4)2HPƠ4 1g - Dipotasic photfat (K2HPO4) 1g - Natri Xitrat 2g - Thạch 20g - Nước cất vừa đủ tít 21 - Xanh bromolhymọl (dung dịch.10 ml 1,5% cồn 90°) Đun sôi nhỏ lửa, khuấy tới hóa chất tan hoàn toàn Điều chỉnh pH = 7,2 Thêm dung dịch xanh bromothymol Môi trường có màu xanh Đóng ống12mm ống ml Hấp 110°c 30 phút Đem để nghiêng cho môi trường đông lại Môi trường dùng để tìm vi khuẩn chuyển hóa Xitrat Nếu phản ứng dương tính môi trường chuyển sang màu xanh nước biển 6/ Môi trường Basikow: Cao thịt 5g Pcpton 10g Natri Clorua 5g Xanh bromothymol (dung dịch 1,5% rong cồn) 1,5 mỉ Đun nóng, khuấy để hòa tan hóa chất Điều chỉnh pH = 7,2 Thêm xanh bromothymol, môi trường có màu xanh .Lọc, đóng ông 12mm, ống ml cố ống Hấp 110°c 30 phút Môi trường Basikow dùng để thử tính lên men đường sinh Khi dùng thêm 0,2 ml dung dịch đường, để 37°c 24 Nếu phảm ứng dương tính môi trưởng chuyển sang màu vàng Phải theo dõi tuần tượng dứt khoát vi khuẩn lên men chậm Nồng độ dung dịch đuờng cần pha để dùng với môi trường Baslkovv Đường Mannil: 20% Đường Lactoza : 20% Glucoza: 20% - Mannoza: 20% Makoza: 30% - Ramnoza: 10% Sacarôza: 30% - Arabinoza: 30% 7- Môi trường Clark-Lubs Pepton 5g Bipotasic pholíat (K2HPO4) 5g Glucoza 5g Nước cất lít đun sôi để hòa tan hóa chất, điều chỉnh pH = 7,5 lọc Đóng ống 12mm, ống ml, hấp 110°c 30 phút Môi trường Clark-Lubs dùng để tìm phản ứng đỏ melhyl phản ứng axctyỉ melhyl cacbinol (AMC) Cách tìm phản ứng đỏ metliyl Cấy vi khuẩn vào môi trường Clark-Lubs, để tủ ấm 37°c ngày, nhỏ 2-3 giọt dung dịch đỏ methyl 0,5% cồn 60°, dương tính có màu đỏ, âm tính có màu vàng nhạt không màu 22 Cách tìm phản ứng Axetyl Meihyl Cacbinol (A MC) Cấy vi khuẩn vào môi trường Clark-Lubs, đề tủ ấm 37°c 24 giờ, thêm giọt dung dịch NaOH 16% nước, lắc nhẹ Nếu dương tính sẻ có màu đỏ, âm tính có màu vàng nhạt B- MỒI TRƯỜNG DÙNG TRONG CÔNG TÁC KIỀM TRA NƯỚC, THỰC PHẦM Canh thang lactoza loãng Cao thịt 5g - Pepton 10g Natri Clorua 5g Latza 5g -Nước cất lít đun sôi hòa tan hóa chất Điều chỉnh pH = 7,2 Lọc trong, phân phối, vào ống nghiệm, ống 10 ml, có ống Dơ- Ham Hấp 110°c 30 phút 2/Canh thang Lactoza đặc Cao thịt 5g Pepton 10g Natri Clorua 5g lactoza lOg Nước cất lít Pha chế canh thang loãng Canh thang zactoza - mật bò loãng: - Cao thịt 5g - Pcpton 10g - Natri Clorua 5g - Loctoza 10g - Mật bò khô 1.5g - Nước cất lít - Xanh brilian (dung dịch 1% trong0,2 ml cồn) đun sôi hòa tan chất điều chỉnh pH = 7,4 Thêm dung dịch xanh brilian Lọc trong, đóng ống 16mm, ống 5-6 ml có ống Đơ-han Hấp 110 c 20 phút 4- Canh thang lactoza mật bò đặc: - Cao thịt 5g 23 - Pepton 10g - Natri Clorua 5g - Giucoza 20g - Mật bò khô 3g - Xanh briỉian (dung dịch 1% Irong côn) 0,4 m! - Nước cất lít Pha chế canh thang loãng đóng ống 18 mm ống 10 ml có ống Dơ-ham Hấp 110°c 20 phút 5/Môi trường Uyn-xơn-Dle (wilson Blair) (xct nghiệm nước uổng tìm CL Welchi) : Thạch thường lít Glucoza 20g Đun thạch glucoza cho tan đều, đóng ống to 20 ml ống Hấp 110 c 30 phút 6/Thạch Bilniut sunf it Wiỉson Blair C- MÔI TRƯỜNG NƯỒI CẤY NẤM MỐC I/Môi trường Saboiiraud 2% (Saburô) : Pepton 10g Glucoza 20g Thạch20g Nước cất lít đun sôi, khuấy tan hoàn toàn hóa chất Điều chỉnh pH = Đóng ống 16mm, ống 5-6 ml Hấp 110°c 30 phút Đem để nghiêng cho môi trường đông lại 2- Môi trường giữ giống : Pcpton 30g Thạch 20g Nước cất lít Làm môi trường sabouraud CÁCH PIIA DUNG DỊCH CHỈ THỊ MÀU ĐO PHI MÔI TRƯỜNG Dung dịch mẹ: Đỏ phenol 0,4%: Đỏ phenol 0,1g NaOH N/20 5,7ml Nước cất vừa đủ 25ml Nghiền đỏ phenol với NaOH, thêm nước cất 24 Đo pH từ 6,8 - 8,4 Khi đo pH phải pha loãng 10 lần dung dịch mẹ đựng chai thủy tinh trung tính Thỉnh thoảng màu dung dịch pha loãng ngà vàng nhúng NaOH N/20 đầu ống hút Pasteur cho vào lọ chi thị, màu đỏ lại có 5Dung dịch mẹ xanh Bromothymol 0,4%: Xanh Bromothymoỉ 0,1g NaOH N/20 3,2ml Nước cất vừa đủ 25ml Đề đo pH từ 6-7,6 Khi đo pH pha loãng 10 lần dung dịch mẹ TÀI LIỆU THAM KHẢO - Kĩ thuật xét nghiệm vi sinh vật kí sinh trùng NXBYhọc, 1972 - Một số phương pháp nghiên cúu vi sinhvật NXB Khoa học kĩ thuật, 1972 -Handbook Culture Media, Merk, 1983 -Manual for laboratory Investỉgations of Acute Kntcric Inĩections, 1983 25 ... đong pha chế đơn giản tiện lợi Tuy nhiên việc pha chế môi trường từ bột khô phải làm theo bước cần ý số điểm sau: - Phải dùng nước cất nước khoáng trung tính để pha chế - Nếu môi trường pha với... chuyển hoá loại vi khuẩn cần định danh Các bước pha chế môi trường 3.1 Pha chế từ hóa chất riêng lẻ Chuẩn bị dụng cụ hóa chất: Phải có dụng cụ pha chế men sứ thủy tinh.Thường dung bình nón thủy... dùng pha đôi phần nước thịt, phần nước cất Nước thịt tốt phải có từ 500 – 600 mg axitamin lít Nước thịt môi trường sở đẻ pha chế canh thang thường, thạch thường v.v canh thang thường Pha chế