MỤC LỤC  Trang Trang phụ bìa Trang chấp nhận Hội Đồng i Lời cảm tạ ii Tóm tắt ii i Trang cam kết i v Mục lục v Dang sách bảng v ii Danh sách hình v iii Danh sách từ viết tắt từ thay i x CHƢƠNG – GIỚI THIỆU 1.1 Lý chọn đề tài 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Đối tượng nghiên cứu 1.4 Nội dung nghiên cứu 1.5 Những đóng góp đề tài CHƢƠNG – TỔNG QUAN ĐỀ TÀI 2.1 Vi khuẩn lactic 2.1.1 Giới thiệu đặc điểm hình thái 2.1.2 Đặc điểm sinh lý – sinh hóa v 2.1.3 Vai trò vi khuẩn lactic 2.2 Acid lactic 2.3 Quá trình lên men lactic 2.4 Dưa muối sản phẩm lên men lactic truyền thống Việt Nam 2.4.1 Quy trình sản xuất theo phương pháp truyền thống 2.4.2 Ưu điểm nhược điểm phương pháp truyền thống CHƢƠNG – PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Hóa chất, thiết bị vật liệu nghiên cứu 3.1.1 Thiết bị dụng cụ 3.1.2 Môi trường VL 3.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Phương pháp thu mẫu 3.2.2 Phương pháp phân lập 3.2.3 Phương pháp bảo quản 3.2.4 Phương pháp định tính, định lượng acid lactic 1 3.2.5 Phương pháp định danh vi khuẩn lactic 3.2.6 Phương pháp khảo sát yếu tố ảnh hưởng trình lên men lactic 14 3.2.7 Phương pháp sử dụng phần mềm thống kê để xử lý số liệu 15 CHƢƠNG – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết phân lập, tuyển chọn vi khuẩn lactic vi 4.2 Đặc điểm sinh học hai chủng lactic 4.2.1 Đặc điểm hình thái 4.2.2 Đặc điểm sinh lý – sinh hóa 4.3 Kết khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh acid lactic chủng vi khuẩn lactic 4.3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh acid lactic 4.3.2 Ảnh hưởng pH đến khả sinh acid lactic 4.3.3 Ảnh hưởng nồng độ NaCl đến khả sinh acid lactic 4.3.4 Ảnh hưởng thời gian đến khả sinh acid lactic CHƢƠNG – KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ 5.1 Kết luận 5.2 Khuyến nghị vii 5.3 Hạn chế TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 3 viii DANH SÁCH BẢNG  Trang Bảng – Khuẩn lạc hình thái 12 chủng vi khuẩn phân lập Bảng – Kết định lượng 12 chủng vi khuẩn lactic Bảng – Kết định lượng chủng vi khuẩn lactic Bảng – Một số đặc điểm sinh lý – sinh hóa chủng L1 L2 Bảng – Kết định danh sơ chủng L1 L2 Bảng – Kết khảo sát nhiệt độ Bảng – Kết khảo sát độ mặn Bảng – Kết khảo sát pH Bảng – Kết khảo sát thời gian Bảng 10 – Kết khảo sát yếu ảnh hưởng chủng L1 L2 Bảng 11 – Kết phân tích thống kê Descriptives ANOVA theo nồng độ NaCl chủng L1 ix Bảng 12 – Kết phân tích thống kê Descriptives ANOVA theo nhiệt độ chủng L1 Bảng 13 – Kết phân tích thống kê Descriptives ANOVA theo pH chủng L1 Bảng 14 – Kết phân tích thống kê Descriptives ANOVA theo thời gian chủng L1 Bảng 15 – Kết phân tích thống kê Descriptives ANOVA theo NaCl chủng L2 Bảng 16 – Kết phân tích thống kê Descriptives ANOVA theo nhiệt độ chủng L2 Bảng 17 – Kết phân tích thống kê Descriptives ANOVA theo pH chủng L2 Bảng 18 – Kết phân tích thống kê Descriptives ANOVA theo thời gian chủng L2 4 DANH SÁCH HÌNH  Trang Hình – Kết định tính 12 chủng vi khuẩn lactic x Hình – Hàm lượng acid lactic 12 chủng vi khuẩn lactic Hình – Hàm lượng acid lactic chủng vi khuẩn lactic Hình – Khuẩn lạc chủng L1 Hình – Tế bào chủng L1 kính hiển vi 40X 2 Hình – Khuẩn lạc chủng L2 2 Hình – Tế bào chủng L2 kính hiển vi 40X Hình – Khả sinh khí chủng L1 L2 Hình – Hàm lượng acid lactic sinh theo nhiệt độ chủng L1 L2 Hình 10 – Hàm lượng acid lactic sinh theo pH chủng L1 L2 Hình 11 – Hàm lượng acid lactic sinh theo NaCl chủng L1 L2 Hình 12 – Hàm lượng acid lactic sinh theo thời gian xi chủng L1 L2 Hình 13 – Khuẩn lạc 20 mẫu vi khuẩn phân lập lần đầu 3 Hình 14 – Dịch lên men khuẩn lạc chủng L1 môi trường VL lỏng 3 Hình 15 – Kết định lượng acid lactic phương pháp chuẩn độ DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT VÀ TỪ THAY THẾ  Vi khuẩn lactic LAB Vi sinh vật VSV Lame Phiến kính Lamel Lamen, kính Oxy O2 Độ mặn Nồng độ NaCl Glycolysise Đường phân xii CHƢƠNG GIỚI THIỆU 1.1 LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI Ngộ độc thực phẩm năm gần ghi nhận thường xuyên trở thành mối quan tâm toàn xã hội Có nhiều nguyên nhân khác gây ngộ độc thực phẩm phần lớn trường hợp có nguồn gốc từ vi sinh vật, diện vi sinh vật gây bệnh hay có mặt độc tố tiết vi sinh vật nước uống, thực phẩm (Trần Linh Thước, 2012) Nguồn gốc trình bảo quản rau phương pháp lên men có từ thời cổ đại Trên giới, hầu hết rau lên men với qui mô nhỏ, có số mặt hàng sản xuất dưa chuột muối chua, bắp cải muối chua… có ý nghĩa thương mại quan trọng Việc nghiên cứu vi sinh vật trình lên men rau sớm bắt đầu vào năm đầu 1990 Nhiều công trình nghiên cứu có giá trị đến ngày nay, có nhiều thay đổi trình lên men rau với qui mô thương mại Sử dụng vi khuẩn lactic làm chất bảo quản thức ăn tự nhiên với mục đích làm tăng độ an toàn bảo đảm chất lượng thực phẩm Việc tăng hàm lượng acid lactic sản phẩm thức ăn bảo quản có tác dụng chống lại hoạt động vi sinh vật gây hư hỏng Vấn đề quan tâm loại bỏ việc sử dụng chất bảo quản nhân tạo mà thường xuyên gây nên nhiều mối lo ngại từ phía người tiêu dùng Ngoài ra, vi khuẩn lactic sử dụng cho lên men, dùng vi khuẩn lactic cho lên men thu acid lactic có độ tinh khiết cao (trên 90%) Acid sau dùng vào nhiều ngành, nhiều lĩnh vực khác như: công nghiệp thực phẩm, công nghiệp thuộc da, công nghiệp dệt, công nghiệp chất dẻo, y dược nông nghiệp Qua đó, việc nghiên cứu số chủng vi khuẩn lactic cần thiết Đề tài thực nhằm tìm chủng vi khuẩn lactic đồng thời tìm điều kiện môi trường thích hợp để vi khuẩn lactic sinh trưởng tối ưu có khả sinh acid lactic cao Đó sở để chế biến dưa muối rút ngắn thời gian chế biến an toàn vệ sinh Cũng lí lựa chọn đề tài “Nghiên cứu khả sinh acid lactic số chủng vi khuẩn lactic phân lập từ dƣa muối” 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic tìm điều kiện môi trường tối ưu để vi khuẩn sinh acid lactic cao 1.3 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU Một số chủng vi khuẩn lactic có dưa muối 1.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU  Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có khả sinh acid lactic cao  Nghiên cứu đặc điểm sinh thái, sinh lí, sinh hóa định danh chủng chọn  Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh acid lactic chủng tuyển chọn 1.5 NHỮNG ĐÓNG GÓP CỦA ĐỀ TÀI  Đóng góp mặt khoa học: Đóng góp vào bảo tàng giống vi sinh vật lên men lactic có khả ứng dụng cao thực tiễn  Đóng góp công tác đào tạo: Bổ sung vào đặc điểm sinh lí, hình thái vi khuẩn lactic cho sinh viên tìm hiểu, học tập nghiên cứu sâu vi khuẩn lactic  Đóng góp phát triển kinh tế xã hội: Tạo môi trường nuôi cấy thuận lợi để vi khuẩn lên men lactic hoạt động tốt nhằm rút ngắn thời gian chế biến, đảm bảo dinh dưỡng vệ sinh an toàn Khắc phục thiếu sót trình chế biến dưa muối CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Dựa kết nghiên cứu rút kết luận sau:  Phân lập 12 chủng vi khuẩn lactic Tuyển chọn định danh chủng vi khuẩn sinh acid lactic cao:  Chủng L1 thuộc chi Leuconostoc  Chủng L2 thuộc chi Pediococcus  Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh acid lactic chủng chọn, kết điều kiện môi trường phù hợp để chủng phát triển tốt Bảng 10 - Kết khảo sát yếu ảnh hƣởng chủng L1 L2 Chủng Thời gian Nhiệt độ ( 0C) NaCl (%) pH L1 ngày 25 – 30 0C 6% L2 ngày 25 – 30 0C [...]... pháp chuẩn độ 3.2.6 Phƣơng pháp khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng quá trình lên men lactic 3.2.6.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh acid lactic của chủng vi khuẩn lactic phân lập Mục đích: tìm ra nhiệt độ tối ưu cho vi khuẩn lactic hoạt động mạnh để sinh acid lactic cao nhất Cách tiến hành  Lấy khuẩn lạc có đường kính 2 μm từ 2 chủng đã phân lập, cấy vào 2 ống nghiệm có sẵn... định lượng acid lactic bằng phương pháp chuẩn độ  Bố trí thí nghiệm với 1 nhân tố, 3 nghiệm thức và 2 đơn vị thí nghiệm 3.2.6.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh acid lactic của chủng vi khuẩn lactic phân lập Mục đích: tìm ra pH thích hợp cho vi khuẩn lactic hoạt động mạnh để sinh acid lactic cao nhất Cách thực hiện  Lấy khuẩn lạc có đường kính 2 μm từ 2 chủng đã phân lập, cấy... lượng acid lactic bằng phương pháp chuẩn độ  Bố trí thí nghiệm với 1 nhân tố, 3 nghiệm thức và 2 đơn vị thí nghiệm 14 3.2.6.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của độ mặn đến khả năng sinh acid lactic của chủng vi khuẩn lactic phân lập Mục đích: tìm ra độ mặn thích hợp cho vi khuẩn lactic hoạt động mạnh để sinh acid lactic cao nhất Cách thực hiện  Lấy khuẩn lạc có đường kính 2 μm từ 2 chủng đã phân lập, ... tụ được acid lactic trong nước dưa sẽ ức chế các vi khuẩn khác Quá trình lên men lactic trong dưa muối có thể chia thành ba giai đoạn: Giai đoạn đầu vi khuẩn lactic phát triển cùng với tạp khuẩn Muối dùng trong muối dưa vào khoảng từ 3 – 4% Ở nồng độ chưa đủ diệt các vi khuẩn hoại sinh Nếu nồng độ muối cao hơn thì có thể ức chế tạp khuẩn phát triển và cũng kìm hãm vi khuẩn lactic sinh trưởng Muối ở... glucose sinh acid, không sinh khí, không sinh trưởng ở 450C Kị khí không bắt buộc Pediococcus 4.3 KẾT QUẢ KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH ACID LACTIC CỦA 2 CHỦNG VI KHUẨN LACTIC 4.3.1 Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng sinh acid lactic Để kiểm tra nhiệt độ thích hợp cho 2 chủng vi khuẩn lactic tuyển chọn có thể sinh trưởng tốt và sinh acid lactic cao, tiến hành nuôi trong môi trường... Khuẩn lạc màu trắng đục, nổi Tế bào hình cầu, kết thành đám 18 Khuẩn lạc màu trắng đục, nổi Trực khuẩn, kết thành đám 19 Sau 3 ngày nuôi 12 chủng vi khuẩn phân lập được, tiến hành định tính Kết quả cho thấy 12 chủng đều là vi khuẩn lactic 1 2 5 9 10 11 12 13 14 15 17 19 Hình 1 – Kết quả định tính của 12 chủng vi khuẩn lactic Để tuyển chọn được 2 chủng vi khuẩn lactic sinh acid lactic cao trong 12 chủng. .. 0.007 Hàm lƣợng acid lactic (g) 0.006 0.005 0.004 Chủng 0.003 0.002 0.001 0 11 22 35 49 10 5 11 6 12 7 13 8 14 9 10 15 11 17 12 19 Hình 2 – Hàm lƣợng acid lactic của 12 chủng vi khuẩn lactic Dựa trên kết quả định lượng ở bảng 2 và hình 2, nhận thấy trong 12 chủng vi khuẩn lactic phân lập có 4 chủng vi khuẩn 1, 2, 5 và 12 sinh acid lactic với hàm lượng cao so với các chủng còn lại Từ 4 chủng này tiến... thống Muối dưa là quá trình lên men lactic do vi khuẩn lactic Các vi khuẩn này phát triển mạnh ở khoảng nhiệt độ 34 – 40 0C Khoảng nhiệt độ thích hợp cho muối dưa là 20 – 22 0C Trong rau dưa thường có sẵn các vi khuẩn lactic và những tạp khuẩn gây hỏng quá trình muối chua (vi khuẩn acetic, butyric, vi khuẩn hoại sinh và nấm mốc) Vì vậy, trong vi c này cần tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn lactic. .. đoạn này acid lactic dần dần được tích tụ và ức chế các vi khuẩn hoại sinh Giai đoạn thứ hai – lên men chính, chỉ có các vi khuẩn lactic phát triển và acid lactic tích tụ đến mức xác định Hàm lượng acid lactic trong nước dưa chua thường vào khoảng 0,8 – 2% Mùi vị dưa tốt nhất khi hàm lượng acid 0,8 – 1,2% Giai đoạn thứ ba : các vi khuẩn lactic bắt đầu bị ức chế bởi chính acid lactic Các vi khuẩn này... quan sát các đặc điểm sinh lý – sinh hóa của 2 chủng vi khuẩn lactic L1 và L2 như thử catalase, khảo sát lên men đường, khảo sát lên men ở nhiệt độ 4 0C và 45 0C và dựa trên các yếu tố khảo sát nhằm định danh 2 chủng vi khuẩn lactic tuyển chọn Kết quả được trình bày ở bảng 4 Bảng 4 – Một số đặc tính sinh lý – sinh hóa của 2 chủng L1, L2 Đặc điểm Sinh trƣởng Chủng L1 Chủng L2 ở 4 0C - - ở 30 0C + + ... MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic tìm điều kiện môi trường tối ưu để vi khuẩn sinh acid lactic cao 1.3 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU Một số chủng vi khuẩn lactic có dưa muối 1.4... thấy 12 chủng vi khuẩn lactic 10 11 12 13 14 15 17 19 Hình – Kết định tính 12 chủng vi khuẩn lactic Để tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic sinh acid lactic cao 12 chủng vi khuẩn lactic phân lập được,... DUNG NGHIÊN CỨU  Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có khả sinh acid lactic cao  Nghiên cứu đặc điểm sinh thái, sinh lí, sinh hóa định danh chủng chọn  Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến khả