HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SỸ NÔNG NGHIỆP TÊN ĐỀ TÀI: “So sánh số đặc tính sinh học, sinh học phân tử tính kháng nguyên chủ yếu 02 chủng virus KTY-PRRS-01 KTY-PRRS-02” Chuyên ngành: Thú y Mã số: Người hướng dẫn khoa học: Người thực hiện: NGÔ THỊ HẠNH Mã số học viên: 24150610 Lớp: CH25TYB Hà Nội – 2016 I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn (Porcine reproductive and respiratory syndrome – PRRS) hay gọi “Bệnh tai xanh lợn” gây thiệt hại vô to lớn cho ngành chăn nuôi lợn toàn giới Lợn tất lứa tuổi cảm nhiễm, lợn lợn nái mang thai thường mẫn cảm với biểu sốt cao, da mẩn đỏ, tỷ lệ ốm tỷ lệ chết cao (Gao cs, 2004; Chen cs, 2006) Loài lợn rừng mắc bệnh, coi nguồn dịch thiên nhiên Từ năm 2007 đến nay, Việt Nam, dịch PRRS xảy liên miên, có diễn biến phức tạp có nguy bùng phát tất địa phương nước Theo báo cáo kết Hội thảo khoa học phòng chống hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn Cục Thú y năm 2008 Việt Nam tồn hai chủng virus PRRS thuộc dòng Bắc Mỹ: Chủng cổ điển độc lực thấp chủng biến thể độc lực cao Trong đó, chủng virus độc lực cao gây bệnh Việt Nam thuộc dòng Bắc Mỹ Hiện Khoa thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam phân lập số chủng virus PRRS từ lợn có triệu chứng, bệnh tích điển hình lợn mắc PRRS,với tỷ lệ ốm tỷ lệ chết cao số tỉnh Việt Nam, có 02 chủng virus KTY-PRRS-01 KTY-PRRS-02 Để phục vụ mục đích lựa chọn chủng chế tạo vacxin, đánh giá hiệu vacxin sản xuất chế phẩm sinh học phòng trị bệnh cho vật nuôi việc nghiên cứu đặc tính sinh học, sinh học phân tử tính kháng nguyên chủng virus phân lập đượclà điều vô quan trọng Chính tiến hành đề xuất nghiên cứu đề tài: “So sánh số đặc tính sinh học, sinh học phân tử tính kháng nguyên chủ yếu 02 chủng virus KTY-PRRS-01 KTY-PRRS-02” 2 1.2 Mục tiêu nghiên cứu - Xác định số đặc tính sinh học, sinh học phân tử tính kháng nguyên 02 chủng virus KTY-PRRS-01 KTY-PRRS-02 phân lập, nhằm phục vụ cho việc chọn chủng chế tạo vacxin, đánh giá hiệu vacxin sản xuất chế phẩm sinh học phòng trị bệnh cho lợn 3 II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản (PRRS) 2.2 Lịch sử tình hình dịch bệnh PRRS lợn 2.2.1 Lịch sử xuất bệnh 2.2.2 Dịch bệnh giới 2.2.3 Tình hình bệnh tai xanh Việt Nam 2.3 Căn bệnh 2.3.1 Hình thái cấu tạo virus PRRS 2.3.2 Phân loại virus PRRS 2.3.3 Tính chất nuôi cấy virus PRRS 2.3.4 Sức đề kháng virus 2.3.5 Khả gây bệnh độc lực virus PRRS 2.4 Cơ chế sinh bệnh phương thức truyền lây 2.5 Triệu chứng bệnh tích 2.5.1 Triệu chứng 2.5.2 Bệnh tích 2.6 Chẩn đoán 2.6.1 Chẩn đoán lâm sàng 2.6.2 Chẩn đoán phương pháp giải phẫu bệnh 2.6.3 Phát virus 2.6.4 Chẩn đoán huyết học 2.6.5 Chẩn đoán phân biệt 2.7 Các biện pháp phòng trị hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn 2.7.1 Phòng bệnh 4 2.7.2 Trị bệnh III 3.1 ĐỐI TƯỢNG - NỘI DUNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu, địa điểm nghiên cứu Vật liệu nghiên cứu: - Virus: 02 chủng virus KTY-PRRS-01 KTY-PRRS-02 phân lập từ đàn lợn mắc PRRS tự nhiên miền Bắc Việt Nam - Địa điểm: Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học Thú y, phòng thí nghiệm môn Bệnh lý thú y, trại nuôi động vật thí nghiệm – Khoa Thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu, so sánh số đặc tính sinh học 02 chủng virus KTY-PRRS3.2 3.2.1 01 KTY-PRRS-02 - Xác định hiệu giá 02 chủng virus PRRS nghiên cứu - Xác định khả gây bệnh tích tế bào 02 chủng virus PRRS nghiên cứu - Xác định ổn định số đặc tính sinh học 02 chủng virus PRRS nghiên cứu qua đời cấy chuyển - Xác định đường biểu diễn nhân lên 02 chủng virus nghiên cứu 3.2.2 Nghiên cứu, so sánh đặc tính sinh học phân tử 02 chủng virus KTYPRRS-01 KTY-PRRS-02 - Giải trình tự gen 02 chủng virus PRRS nghiên cứu - So sánh trình tự gen 02 chủng virus PRRS nghiên cứu với với chủng virus tham chiếu ngân hàng gen - Xây dựng sinh học phân tử cho thấy mối quan hệ di truyền 02 chủng virus PRRS nghiên cứu với chủng virus khác ngân hàng gen 3.2.3 Nghiên cứu, so sánh tính kháng nguyên 02 chủng virus KTY-PRRS01 KTY-PRRS-02 - Gây bệnh cho lợn thực nghiệm 02 chủng virus nghiên cứu - Theo dõi triệu chứng lâm sàng lợn thực nghiệm 5 - Nghiên cứu tiêu virus huyết lợn thực nghiệm - Nghiên cứu biến đổi bệnh lý lợn thí nghiệm - Nghiên cứu phân bố virus PRRS lợn thực nghiệm 3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Phương pháp nuôi cấy tế bào - Khôi phục tế bào - Cấy chuyển tế bào - Thu tế bào 3.3.2 Phương pháp phân lập virus PRRS tế bào tổ chức 3.3.3 Phương pháp xác định TCID50 3.3.4 Phương pháp xác định đường biểu biễn nhân lên virus 3.3.5 Phương pháp tách chiết RNA 3.3.6 Phương pháp tiến hành phản ứng RT – PCR - Tiến hành phản ứng RT- PCR - Điện di kiểm tra sản phẩm PCR 3.3.7 Phương pháp giải trình tự gen 3.3.8 Phương pháp xử lý số liệu 3.3.9 Phương pháp gây bệnh thực nghiệm 3.3.10 Phương pháp ELISA 3.3.11 Phương pháp mổ khám kiểm tra bệnh tích đại thể 3.3.12 Phương pháp làm tiêu bệnh lý kiểm tra bệnh tích vi thể IV KẾT QUẢ DỰ KIẾN ĐẠT ĐƯỢC 4.1 Kết nghiên cứu, so sánh số đặc tính sinh học 02 chủng virus KTY-PRRS-01 KTY-PRRS-02 4.1.1 Kết xác định hiệu giá 02 chủng virus PRRS nghiên cứu Bảng 4.1 Thông tin sơ nguồn gốc 02 chủng virus KTY-PRRS-01 KTY-PRRS-02 6 Tên chủng STT Nguồn gốc mẫu phân lập virus KTY-PRRS-01 KTY-PRRS-02 Triệu chứng chủ yếu Bảng 4.2 Kết xác định hiệu giá 03 chủng virus PRRS Hua 01, PRRS Hua 02 chủng virus PRRS vắc-xin Hiệu giá virus STT Tên chủng virus KTY-PRRS-01 KTY-PRRS-02 Chủng virus PRRS vắc-xin TCID50/25µl 4.1.2 Kết xác định khả gây bệnh tích tế bào 02 chủng virus PRRS nghiên cứu Bảng 4.3 Khả gây bệnh tích tế bào 02 chủng virus KTY-PRRS-01 KTY-PRRS-02 (tính theo% diện tích tế bào bị phá hủy so với tổng số diện tích đáy bình nuôi cấy) Mẫu KTY-PRRS-01 CPE theo thời 24h gian sau 36h gây nhiễm 48h virus 60h 72h 7 KTY-PRRS-02 Chủng vắcxin 84h 96h 108h 4.1.3 Kết xác định ổn định đặc tính sinh học 02 chủng virus PRRS nghiên cứu qua đời cấy chuyển Bảng 4.4 Khả gây bệnh tích tế bào 02 chủng virus KTY-PRRS-01 KTY-PRRS-02 qua đời cấy chuyển CPE (%) Virus Virus PRRS vắc-xin KTY-PRRS01 KTY-PRRS02 Giờ Đời 24h 36h 48h 60h 72h 84h 96h 24h 36h 48h 60h 72h 84h 96h 24h 36h 48h 60h 72h 84h 96h Đời Đời 4.1.4 Kết xác định đường biểu diễn nhân lên 02 chủng virus PRRS nghiên cứu Bảng 4.6 Hiệu giá chủng virus KTY-PRRS-01 (lgTCID50) Thời gian lg TCID50 Virus tế bào 24hpi 36hpi 48hpi 60hpi 72hpi 84hpi 96hpi KTY-PRRS-01 Virus giải phóng tế bào KTY-PRRS-01 Virus tế bào chủng vắc-xin Virus dịch tế bào chủng vắcxin Bảng 4.6 Hiệu giá chủng virus KTY-PRRS-02 (lgTCID50) Thời gian lg TCID50 Virus tế bào 24hpi 36hpi 48hpi KTY-PRRS-02 Virus giải phóng tế bào KTY-PRRS-02 Virus tế bào chủng vắc-xin Virus dịch 9 60hpi 72hpi 84hpi 96hpi tế bào chủng vắcxin 4.2 Kết nghiên cứu, so sánh đặc tính sinh học phân tử 02 chủng virus KTY-PRRS-01 KTY-PRRS-02 4.2.1 Kết giải trình tự gen chủng virus PRRS nghiên cứu 4.2.2 Kết so sánh trình tự gen chủng virus PRRS nghiên cứu với với chủng virus tham chiếu ngân hàng gen Bảng 4.7 Các vị trí sai khác nucleotide đoạn gen ORF7 chủng virus nghiên cứu với chủng virus tham chiếu TT Vị Trí Nucleotide TT Vị Trí Nucleotide sai khác TT Vị Trí sai khác Nucleotide sai khác Bảng 4.8 Các vị trí sai khác nucleotide đoạn gen ORF5 chủng virus nghiên cứu với chủng virus tham chiếu TT Vị Trí Nucleotide TT Vị Trí Nucleotide sai khác sai khác TT Vị Trí Nucleotide sai khác 4.2.3 Kết xây dựng sinh học phân tử cho thấy mối quan hệ di truyền chủng virus PRRS phân lập với chủng virus khác ngân hàng gen 4.3 Kết nghiên cứu, so sánh tính kháng nguyên 02 chủng virus KTYPRRS-01 KTY-PRRS-02 4.3.1 Kết gây bệnh cho lợn thực nghiệm 10 10 4.3.2 Kết theo dõi triệu chứng lâm sàng lợn thực nghiệm Bảng 4.9 Kết kiểm tra hàm lượng kháng thể lợn thí nghiệm phương pháp ELISA Lô thí nghiệm TN1.1 TN1.2 TN1.3 Lô thí nghiệm TN2.1 TN2.2 TN2.3 Lô đối chứng ĐC1 ĐC2 S/P Kết 4.3.3 Kết nghiên cứu tiêu virus huyết lợn thực nghiệm Bảng 4.10 Kết xét nghiệm PRRSV phương pháp RT-PCR Ngày gây nhiễm Lô TN1 gây nhiễm Lô TN2 gây nhiễm chủng KTY-PRRS-01 Máu Swab chủng KTY-PRRS-02 Máu Swab 11 13 15 17 19 21 11 11 Lô đối chứng Máu Swab 12 12 4.3.4 Kết theo dõi hàm lượng kháng thể PRRS lợn thực nghiệm Bảng 4.11 Hàm lượng kháng thể kháng PRRSV số ngày sau gây nhiễm tính theo S/P Lô Lô Lô Lô Đ C Ngày Lợn S/P KQ S/P KQ S/P KQ S/P KQ S/P 11 KQ TN1.1 TN1.2 TN1.3 TN2.1 TN2.2 TN2.3 ĐC1 ĐC2 13 13 S/P 13 KQ S/P 15 KQ S/P 17 KQ S/P 19 KQ S/P 21 KQ S/P KQ 4.3.5 Kết nghiên cứu biến đổi bệnh lý lợn thí nghiệm Bảng 4.12 Bệnh tích đại thể lợn thí nghiệm gây nhiễm chủng KTYPRRS-01 KTY-PRRS-02 Lợn STT Cơ quan Bệnh tích quan Gây nhiễm KTY-PRRS- 01 Gây nhiễm KTY-PRRS- 02 TN1.1 TN2.1 TN1.2 TN1.3 TN2.2 TN2.3 Đối chứng ĐC ĐC Hạch lâm ba Phổi Tim Lách Ruột Thận Dạ dày Não Gan Bảng 4.13 Bệnh tích vi thể lợn thí nghiệm gây nhiễm chủng KTYPRRS-01 KTY-PRRS-02 Lợn STT Cơ quan Bệnh tích quan Gây nhiễm KTY-PRRS- 01 Gây nhiễm KTY-PRRS- 02 TN1.1 TN2.1 TN1.2 TN1.3 Hạch lâm ba Phổi Tim Lách Ruột Thận Dạ dày Não Gan 14 14 TN2.2 TN2.3 Đối chứng ĐC ĐC 15 15 V KẾ HOẠCH THỰC HIỆN STT NỘI DUNG Thông qua đề cương Kết nghiên cứu, so sánh số đặc tính sinh học 02 chủng virus KTY-P Nghiên cứu, so sánh đặc tính sinh học phân tử 02 chủng virus KTY-PRRS-0 Nghiên cứu, so sánh tính kháng nguyên 02 chủng virus KTY-PRRS-01 K Báo cáo tiến độ Phân tích số liệu viết luận văn Bảo vệ luận văn Giáo viên hướng dẫn (Ký ghi rõ họ tên) Học viên thực đề tài (Ký ghi rõ họ tên) 16 16 17 17 [...]... học của 02 chủng virus KTY-P 2 Nghiên cứu, so sánh đặc tính sinh học phân tử của 02 chủng virus KTY-PRRS-0 3 Nghiên cứu, so sánh tính kháng nguyên của 02 chủng virus KTY-PRRS-01 và K 4 Báo cáo tiến độ 5 Phân tích số liệu và viết luận văn 6 Bảo vệ luận văn Giáo viên hướng dẫn (Ký và ghi rõ họ tên) Học viên thực hiện đề tài (Ký và ghi rõ họ tên) 16 16 17 17 ... KTY-PRRS -02 Lợn STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Cơ quan Bệnh tích các cơ quan Gây nhiễm KTY-PRRS- 01 Gây nhiễm KTY-PRRS- 02 TN1.1 TN2.1 TN1.2 TN1.3 Hạch lâm ba Phổi Tim Lách Ruột Thận Dạ dày Não Gan 14 14 TN2.2 TN2.3 Đối chứng ĐC 1 ĐC 2 15 15 V KẾ HOẠCH THỰC HIỆN STT NỘI DUNG 1 Thông qua đề cương 1 Kết quả nghiên cứu, so sánh một số đặc tính sinh học của 02 chủng virus KTY-P 2 Nghiên cứu, so sánh đặc tính sinh học phân. .. lý của lợn thí nghiệm Bảng 4.12 Bệnh tích đại thể của lợn thí nghiệm gây nhiễm 2 chủng KTYPRRS-01 và KTY-PRRS -02 Lợn STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Cơ quan Bệnh tích các cơ quan Gây nhiễm KTY-PRRS- 01 Gây nhiễm KTY-PRRS- 02 TN1.1 TN2.1 TN1.2 TN1.3 TN2.2 TN2.3 Đối chứng ĐC 1 ĐC 2 Hạch lâm ba Phổi Tim Lách Ruột Thận Dạ dày Não Gan Bảng 4.13 Bệnh tích vi thể của lợn thí nghiệm gây nhiễm 2 chủng KTYPRRS-01 và KTY-PRRS -02. .. pháp RT-PCR Ngày gây nhiễm Lô TN1 gây nhiễm Lô TN2 gây nhiễm chủng KTY-PRRS-01 Máu Swab chủng KTY-PRRS -02 Máu Swab 0 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 11 11 Lô đối chứng Máu Swab 12 12 4.3.4 Kết quả theo dõi hàm lượng kháng thể PRRS ở lợn thực nghiệm Bảng 4.11 Hàm lượng kháng thể kháng PRRSV của một số ngày sau gây nhiễm tính theo S/P Lô Lô 1 Lô 2 Lô Đ C Ngày Lợn 1 S/P 3 KQ S/P 5 KQ S/P 7 KQ S/P 9 KQ S/P... chứng lâm sàng của lợn thực nghiệm Bảng 4.9 Kết quả kiểm tra hàm lượng kháng thể của lợn thí nghiệm bằng phương pháp ELISA Lô thí nghiệm 1 TN1.1 TN1.2 TN1.3 Lô thí nghiệm 2 TN2.1 TN2.2 TN2.3 Lô đối chứng ĐC1 ĐC2 S/P Kết quả 4.3.3 Kết quả nghiên cứu chỉ tiêu virus huyết ở lợn thực nghiệm Bảng 4.10 Kết quả xét nghiệm PRRSV bằng phương pháp RT-PCR Ngày gây nhiễm Lô TN1 gây nhiễm Lô TN2 gây nhiễm chủng KTY-PRRS-01 ... nghiên cứu, so sánh số đặc tính sinh học 02 chủng virus KTY-P Nghiên cứu, so sánh đặc tính sinh học phân tử 02 chủng virus KTY-PRRS-0 Nghiên cứu, so sánh tính kháng nguyên 02 chủng virus KTY-PRRS-01... cứu đặc tính sinh học, sinh học phân tử tính kháng nguyên chủng virus phân lập đượclà điều vô quan trọng Chính tiến hành đề xuất nghiên cứu đề tài: So sánh số đặc tính sinh học, sinh học phân tử. .. học phân tử tính kháng nguyên chủ yếu 02 chủng virus KTY-PRRS-01 KTY-PRRS -02 2 1.2 Mục tiêu nghiên cứu - Xác định số đặc tính sinh học, sinh học phân tử tính kháng nguyên 02 chủng virus KTY-PRRS-01