Đang tải... (xem toàn văn)
Bài 1: TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ TỪ THỰC VẬT Ngô là cây lương thực và là thức ăn chăn nuôi quan trọng của nhiều nước trên thế giới. Vì vậy, việc cải thiện chất lượng và năng suất cây ngô hiện nay mang tính thời sự được rất nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu. Tạo cây ngô chuyển gen mang những đặc tính tốt như: chịu hạn, chịu lạnh, chống mọt…là một giải pháp hiệu quả. Để thực hiện chuyển gen trước hết phải thu nhận DNA tổng số từ cây ngô. Trong bài thực hành này chúng tôi tiến hành tách chiết DNA tổng số từ lá ngô. Tế bào lá ngô là tế bào nhân chuẩn vì vậy mà DNA tổng số của nó bao gồm: DNA trong nhân tế bào (có dạng thẳng, kép) và DNA trong các bào quan là ty thể và lạp thể (DNA có dạng vòng, kép). Bài 2: ĐIỆN DI NUCLEIC ACID Bài 3: KỸ THUẬT PCR Bài 4: TẠO DÒNG GEN rRNA 16s
MỞ ĐẦU Sinh học phân tử hiện đại phát triển mạnh và đã trở thành nòng cốt của công nghệ sinh học Ở Việt Nam, thành tựu nghiên cứu sinh học phân tử và áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử nghiên cứu khoa học sự sống và công nghệ sinh học đã có nhiều đóng góp việc chăm sóc, bảo vệ sức khỏe nggười; đánh giá tài nguyên sinh vật; chọn giống và sản xuất nông lâm ngư nghiệp Thành tựu của sinh học hiện đại và những hiểu biết về di truyền học phân tử làm sở cho việc nghiên cứu, xây dựng các kỹ thuật sinh học hiện đại Những kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng nghiên cứu genome của sinh vật ngày càng phát triển, đặc biệt là ứng dụng của kỹ thuật chuyển gen có ứng dụng rất lớn việc nâng cao phẩm chất giống Kỹ thuật chuyển gen được bắt đầu từ việc thu nhận dịch chiết DNA từ tế bào sống sau đó PCR để nhân đoạn gen mong muốn, gắn vào vector tách dòng để chọn lọc lấy dòng mang gen rồi gắn vào vector biểu hiện để biến nạp vào thể sinh vật cần chuyển gen, phân tích thể đó xem có mang đoạn gen mong muốn hay không Trong bài thực hành này chúng chỉ thực hiện đến bước tách dòng gen Bài thực hành được tiến hành tại phòng thí nghiệm sinh học phân tử, trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên dưới sự hướng dẫn trực tiếp của tiến sĩ Hoàng Thị Thu Yến, với những máy móc và thiết bị khá hiện đại như: máy PCR, máy li tâm, nồi hấp tiệt trùng, hệ thống điện di… Bài 1: TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ TỪ THỰC VẬT Ngô là lương thực và là thức ăn chăn nuôi quan trọng của nhiều nước thế giới Vì vậy, việc cải thiện chất lượng và suất ngô hiện mang tính thời sự được rất nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu Tạo ngô chuyển gen mang những đặc tính tốt như: chịu hạn, chịu lạnh, chống mọt…là một giải pháp hiệu quả Để thực hiện chuyển gen trước hết phải thu nhận DNA tổng số từ ngô Trong bài thực hành này chúng tiến hành tách chiết DNA tổng số từ lá ngô Tế bào lá ngô là tế bào nhân chuẩn vì vậy mà DNA tổng số của nó bao gồm: DNA nhân tế bào (có dạng thẳng, kép) và DNA các bào quan là ty thể và lạp thể (DNA có dạng vòng, kép) Mục đích Tách chiết DNA tổng số nhằm mục đích thu nhận DNA khỏi cấu trúc bao bọc I tế bào, để phục vụ cho nghiên cứu ứng dụng sinh học phân tử Điều quan tâm thu nhận phân tử DNA trạng thái nguyên vẹn không bị phân hủy II Hóa chất và thiết bị Tris HCl 1M, PH=8 EDTA 0,5M, PH=8 Sorbitol 2M NaH2PO4 0,4% Chloroform Isoamyl ancohol NaHCl 5M CTAB 4% III CH3COONa 3M, PH=5,2 Cồn tuyệt đối, nước khử ion Pipetman và đầu côn các loại Cối chày sứ Máy li tâm Bể ổn nhiệt Tủ lạnh sâu Ống eppendorf 1,5 µl và µl Tiến hành Quy trình thu nhận DNA tổng số từ tế bào lá ngô trải qua các bước chính sau: thu mẫu, nghiền mẫu, phá vỡ tế bào và thu nhận DNA - Phá vớ màng tế bào và màng nhân: bước này ta nghiền mẫu nitơ lỏng để cho mẫu giòn, dễ nghiền, DNA ít bị đứt gãy và nhiệt độ thấp sẽ làm cho các enzyme không hoạt động đó nó sẽ không cắt DNA Sau nghiền màng tế bào và màng nhân sẽ bị phá vỡ, giải phóng DNA để chúng ta - có thể thu nhận ở các bước tiếp theo Loại bỏ các thành phần không mong muốn: bước này bổ sung các dung dịch đệm rửa, đệm chiết sau đó li tâm để loại bỏ các thành phần không mong muốn Sau bổ sung chloroform : isoamyl alcohol (24:1), li tâm sẽ thu được dung dịch chia thành lớp rõ ràng Lớp dưới cùng là các tạp chất diệp lục, hydratcacbon…, lớp ở giữa màu trắng là Protein và lớp - cùng là dịch chúng ta cần thu đó chứa DNA chúng ta cần tách chiết Tủa DNA bằng cồn tuyệt đối ta sẽ quan sát thấy có vẩn kết tủa DNA màu trắng đục Sau li tâm thu được tủa DNA, rửa tủa sau đó mang làm khô để loại hết cồn để không ảnh hưởng đến kết quả của các bước tiếp theo Hòa tan tủa nước khử ion vô trùng rồi bảo quản -20oC cho đến sử IV dụng Giải thích Nguyên lí trình tách chiết phá vỡ tế bào ngô: - Phá vỡ tế bào , màng tế bào mô - Loại bỏ tạp chất DNA ( Protein, lipid, đường…) - CTAB : Chất tẩy rửa thường dùng để phá vỡ màng tế bào, bào mòn màng tế bào Màng tế bào lớp kép phospholipid, CTAB làm biến tính protein, phospholipid bị hòa tan Trong dung dịch đệm có thành phần: - Tris- HCl: ổn định pH - EDTA: Có lực cao với ion kim loại hóa trị II hấp thụ kim loại nặng, bảo vệ DNA khỏi phân hủy enzyme DNase, enzyme nội bào hấp thụ Ca+ , Mg+ canh tranh với enzyme làm enzyme không hoạt động - Khi bổ sung CTAB ủ 65ºC 1h 10 phút đảo trộn lần - CTAB hoạt động mạnh hiệu nhiệt độ khoảng 60- 70ºC, mạnh có lực học tác động vào ( CTAB hoạt động trường hợp có NaCl) - Isoamyalcohol: Loại bỏ, giảm khả tạo bọt, đồng thời giúp tăng cường hỗ trợ khả kết tủa protein, hỗ trợ phân pha Sau bổ sung ly tâm có tượng phân pha ( pha) + Pha : Là DNA + Pha giữa: Chứa protein + Pha dưới: Chứa xác cặn tế bào dung dịch chloroform - CH3 COONa 3M pH 5.5 : ion Na+ vào trung hòa DNA triệt tiêu khả hòa tan DNA, bổ sung isopropanol kết tủa DNA, phân tách thu DNA ( CH3 COONa, CH3 COOK, NaCl : hỗ trợ kết tủa nhanh hơn) - Rửa tủa cồn 70%, không sử dụng nước cất để rửa để rửa tủa DNA bị hòa tan nước không hòa tan cồn Nếu tủa lẫn muối : Muối hòa tan cồn 70%, cồn 100% muối không tan, cồn kết tủa protein cậy rửa tủa cồn xong hút hết hết cồn làm bay hết cồn Nếu cồn làm biến tính enzyme không thực phản ứng sinh học phân tử - Hòa tan DNA nước khử ion, nước khử ion hòa tan tủa DNA để dùng cho các phản ứng sau Bài 2: ĐIỆN DI NUCLEIC ACID Sau tiến hành tách chiết DNA tổng số từ lá ngô chúng tiến hành điện di sản phẩm thu được để kiểm tra xem dung dịch có chứa DNA hay không và dự đoán hàm lượng DNA dung dịch tách chiết Chúng tiến hành điện qua các bước bản sau: Bước 1: hòa tan 0,8g agarose 100 ml TAE 1X bình thủy tinh chịu nhiệt, đun sôi lò vi sóng khoảng phút sau đó bỏ ra, lắc đều cho agarose tan rồi tuêps tục đun lò vi sóng khoảng 30 giây Lưu ý quá trình đun bằng bình chịu nhiệt có nắp thì không được đậy nắp kín nhắm tránh tràn sôi Bước 2: để agarose nguội đến khoảng 600C thì đổ vào khuôn gel Đổ khuôn gel cao khoảng bằng 2/3 lược Khi đổ thì nên đổ nhanh, dứt khoát tránh tạo thành nhiều lớp gel sẽ ảnh hưởng đến kết quả điện di Bước 3: đặt bản gel bể điện di, đổ đẹm TEA 1X vào bể điện di cho đến mức đệm cao mặt gel từ 1-2 mm Bước 4: trộn µl mẫu với µl dye tra vào một giếng nhỏ gel Ghi lại thứ tự của ống mẫu tương ứng với thứ tự của giếng Mỗi mẫu được dùng đầu côn hút riêng Khi tra mẫu vào giếng, tay tỳ lên thành giá điện di làm điểm dựa, tay đưa micropipet cho đầu côn vừa sát miệng giếng bơm từ micropipet Cần lưu ý thao tác không cẩn thận làm tràn giếng vỡ miệng giếng Chạy điện di điện 100V 30 phút Lúc quan sát mắt thường thấy hỗn hợp mẫu giếng điện di dịch chuyển chậm từ phía cực âm sang cực dương Bước 5: Lấy gel từ bể điện di nhuộm ethydium bromid 0,5μl/ml 10 phút Lưu ý mang gel nhuộm cần cẩn thận ethydium bromid độc hại với người môi trường Do đó, để giảm thiểu việc tiếp xúc trực tiếp, cần dùng thìa to, dạng bản, có cán dài để đưa gel vào khay nhuộm, lấy khỏi khay, mang rửa lại nước sạch, đến đưa gel lên máy soi Bước 8: Soi gel máy tia tử ngoại, axít nucleic gel agarose hình tia tử ngoại (UV) có bước sóng λ ≈ 300 nm nhờ ethydium bromid Chất có khả xen gắn vào bazơ axít nucleic làm chúng phát sáng dạng vạch màu đỏ cam, dễ quan sát chụp ảnh Kết quả thu được là hình ảnh điện di sau: Hình 1: Hình ảnh điện di sản phẩm tách DNA tổng số Kết quả tách DNA của các mẫu hầu không tốt vì hình ảnh không có băng rõ ràng Các giếng 4, và ta thấy DNA bị đứt gãy nhiều, có các vệt sáng ở đuôi đó chỉ là RNA và các đoạn DNA bị đứt gãy Tuy nhiên dải sáng cách miệng giếng một đoạn nên ở đó có thể sẽ có DNA mà ta mong muốn tách Vì bình thường nếu DNA đứt gãy quá nhiều thì dải sáng sẽ bắt đầu từ miệng giếng Giếng và là giếng tra mẫu dung dịch tách chiết từ lá ngô của nhóm Tuy nhiên nó cũng giống các giếng còn lại khác, không có hoặc chỉ có dải sáng rất mờ phần lớn nằm ở đuôi Đó cũng là các RNA hoặc các đoạn DNA bị đứt gãy Nhưng các mẫu này vẫn có thể có chứa DNA với một lượng rất ít mà ta không thể nhìn thấy được Các mẫu này làm phản ứng PCR có thể vẫn sản phẩm mà ta mong muốn PCR không nên pha loãng Bài 3: KỸ THUẬT PCR Sau tách chiết DNA tổng số, chúng tiến hành nhân bản một phần vùng gen rRNA 16s có kích thước 600bp bằng kỹ thuật PCR sử dụng taq polymerase Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra gel agarose 0,8%, băng điện di đúng kích thước sẽ được cắt và tinh sạch Các bước thực Bước 1: Làm tan băng hóa chất cho phản ứng PCR - Các hóa chất sử dụng cho phản ứng PCR bảo quản -20oc, trước thực phản ứng cần phải làm tan băng loại hóa chất cách đưa ống hóa chất môi trường Để tan từ từ nhiệt độ phòng toàn khối hóa chất trạng thái dung dịch Bước 2: Chuẩn bị thành phần phản ứng PCR - Mỗi mẫu chuẩn bị eppendorf mới, vô trùng - Sử dụng bút đánh dấu tên mẫu lên nắp ống thân ống - Sử dụng micropipet phù hợp để lấy hóa chất cho phản ứng PCR với thành phần bảng Thành phần phản ứng Buffer Dream taq (10X) dNTPs (10mM) Primer F (10mM) Primer R (10mM) Taq polymerase (5unit/µl) Template (AND khuôn) H2O Tổng Thể tích (µl) 2,5 2,5 1,0 1,0 0,3 2,0 14,7 25 - đó PCR M đã được pha trộn thành phần: Buffer Dream taq (10X), dNTPs (10mM), Taq polymerase (5unit/µl) Ta lấy lần lượt các thành phần sau: H2O, PCR M, Primer F, Primer R, Template (AND khuôn) + enzyme Taq polymerase tổng hợp sợi mới có thêm nu A nhô ở đầu 3’ + dNTPs là các nucleotide tự ở dạng triphotphat + mồi: gồm có mồi xuôi (có chiều cùng với chiều phiên mã) và mồi ngược (có chiều ngược chiều phiên mã) Mồi thường dài 18-24 nucleotide vì khả lặp lại gen thấp đó mồi mang tính đặc hiệu + nồng độ của các chất phản ứng PCR phải vừa đủ - Trộn thành phần nêu ống eppedorp loại 1,5ml đưa vào ống PCR với thể tích 25μl đến 50μl, cho vào máy ly tâm tốc độ nhẹ (spin) 3000 vòng/phút Bước nhằm để thành phần nêu lắng xuống đáy ống PCR Bước 3: Thiết lập chu trình nhiệt cho phản ứng PCR Thiết lập chu trình nhiệt cho phản ứng PCR sau: - Biến tính ban đầu: 94oC phút - Khuếch đại: 32 chu kỳ gồm bước: + Biến tính: 94oC phút + Gắn mồi: 54oC 45 giây + Kéo dài: 72oC phút - Kéo dài cuối cùng: 72oC 10 phút - Ủ bảo quản: 4oC Bước 4: Kiểm tra sản phẩm nhân gen phương pháp điện di agarose 0,8% 30 phút Bước 5: Nhuộm gel ethydium bromid phút Bước 6: Soi chụp ảnh Kết quả điện di sản phẩm PCR ta thu được hình ảnh sau: Hình 2: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR Ảnh điện di sản phẩm PCR cho thấy phản ứng PCR được thực hiện không thành công lắm xuất hiện nhiều băng có kích thước khác nhau, nữa không lên hình ảnh macker 10 - Ở giếng và giếng cùng nhân một phần gen rRNA 16s có kích thước 600bp nên đều xuất hiện băng giống Hai băng này ở rất sát nhau, nhiên macker không lên nên ta không thể dự đoán được băng nào là băng - 600bp Do đó gel ta cắt cả băng mang gel Ở giếng và cùng nhân gen rRNA 18s có kích thước 1800bp, ở hai giếng này xuất hiện băng dự đoán băng đầu tiên sẽ là đoạn gen ta khuếch đại vì nó ở cùng nên có kích thước lớn nhất Các băng bên dưới là các sản phẩm kéo dài không hết hoặc mồi thừa Như vậy gel ta sẽ cắt băng cùng để gel 11 Thôi gel sản phẩm PCR Do các thành phần sản phẩm PCR ảnh hưởng đến phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector làm giảm hiệu quả tách dòng Do đó sản phẩm PCR cần được tinh sạch, hỗn hợp sản phẩm PCR được đưa vào cột chứa dung dịch có vai trò biến tính protein và làm cho DAN bám vào màng silica cột Sau đó DNA được thu lại từ màng - Dụng cụ và hóa chất Nguyên liệu: sản phẩm PCR điện di gel agarose Dụng cụ: bể ổn nhiệt, máy li tâm, pipet, đầu côn, dao cắt gel Hóa chất: kit gel GeneJET gel extraction kit từ hãng Fermentas Quy trình thực hiện bước 1: điện di sản phẩm khuếch đại gen, cắt băng gel cho vào ống eppendorf 2ml nếu điện di sản phẩm PCR cho nhiều băng thì ta so với - macker và chỉ cắt lấy băng đúng kích thước của đoạn gen ta mong muốn Bước 2: bổ sung dung dịch bám (binding solution) theo tỉ lệ 1:1 Tức là cứ đơn vị mẫu ta bổ sung đơn vị dung dịch bám Ta cân lượng gel ban đầu cho vào ống là 0,35g tương ứng 350µl đó ta bổ sung 350µl dung dịch - bám Bước 3: Ủ ở nhiệt độ khoảng 50-60oC cho đến gel tan hoàn toàn Bước 4: hút dịch sang cột gel, li tâm 12000v/phút phút, bỏ dịch Trên cột gel có chứa ion + đó DNA sẽ bị giữ lại màng cột và các - hợp chất khác bị rửa trôi qua cột Bước 5: bổ sung 700 µl dung dịch rửa vào cột, li tâm 12000v/p, phút Trong dung dịch rửa có chứa cồn để rửa trôi các tạp chất Để ở nhiệt độ - phòng phút Bước 6: li tâm cột tiếp 12000v/ph, phút Sau đó đặt cột sang ống mới để phút ở nhiệt độ phòng để mẫu bay hết cồn để không ảnh hưởng đến các thí - nghiệm tiếp theo Bước 7: cho 15 µl H2O vào cột, để một lúc cho ngấm rồi mới li tâm 12 - Bước 8: li tâm 12000v/p, phút Thu dịch, loại bỏ cột Vì DNA tan nước nên sau li tâm ta thu được dung dịch chứa DNA tinh sạch được giữ ở 4oC hoặc -20 oC 13 Bài 4: TẠO DÒNG GEN rRNA 16s Gắn sản phẩm PCR vào vector Với nguyên liệu là một phần trình tự vùng gen rRNA 16s có kích thước 600bp đã được tinh sạch, chúng tiến hành gắn trình tự gen này vào vector pTZ57RT pTZ57RT là vector tồn tại dưới dạng mạch thẳng, có kích thước 2886bp với điểm khởi đầu chép F1 ori, dấu chuẩn chọn lọc là gen lac Z (gen mã hóa cho betagalactosidase, một enzim phân hủy chất X-gal từ màu trắng thành màu xanh) và gen kháng kháng sinh ampicillin, điểm nhận biết của enzim giới hạn thuộc gen lac Z vì sản phẩm của phản ứng PCR nhô nu A ở đầu 3’ còn vector nhô nu T ở đầu đó dưới tác dụng của enzim nối T4 ligase sẽ tạo nên vector tái tổ hợp Biến nạp vector vào tế bào chủ Sau tạo thành vector tái tổ hợp chúng tiến hành biến nạp vector vào tế bào chủ Tế bào chủ được chọn là vi khuẩn E.coli vì chúng có khả sinh sản rất nhanh nên số lượng bản tạo lớn, dễ dàng tiếp nhận vector, vector tế bào có khả nhân lên một cách độc lập không phụ thuộc vào sự nhân lên của hệ gen tế bào chủ Sau biến nạp vetor vào tế bào chủ E.coli, chúng tiến hành nuôi lắc LB lỏng giờ để tạo nhiều tế bào Sau đó cấy trải môi trường LB đặc có bổ sung ampicillin Nuôi qua đêm ở 370C thu được kết quả hình ảnh dưới 14 Hình 3: Hình ảnh khuẩn lạc mọc lên môi trường chọn lọc Khuẩn lạc mọc lên đĩa thạch toàn màu trắng vì môi trường không bổ sung chất X-gal nên ta không thể dùng dấu chuẩn chọn lọc này để chọn được dòng mang vector tái tổ hợp Trên môi trường nuôi cấy có bổ sung kháng sinh ampicillin nên chỉ những tế bào mang vector tái tổ hợp có chứa gen kháng ampicillin mới có khả tạo thành khuẩn lạc môi trường nuôi cấy này Tuy nhiên, cũng có thể có dòng tế bào đột biến có khả kháng ampicillin cũng sẽ tạo thành khuẩn lạc Chọn khuẩn lạc bất kì, nuôi dịch lỏng ống khác ta được dòng vi khuẩn khác Phân tích sản phẩm tạo dòng Sau chọn được các dòng vi khuẩn khác có khả mang vector tái tổ hợp, ta tiến hành phân tích sản phẩm tạo dòng xem dòng nào có mang vector tái tổ 15 hợp mà ta mong muốn Có nhiều hướng có thể phân tích sản phẩm tạo dòng đó có tách chiết DNA plasmid hoặc dùng enzim cắt giới hạn (RE) tách chiết DNA plasmid Vector tái tổ hợp sau ta gắn đoạn DNA vào chúng đóng vòng và tế bào E.coli chúng tồn tại giống một phân tử Plasmid, có khả nhân lên độc lập Vector pTZ57RT có kích thước 2886bp, sau chèn đoạn 600 bp chúng có kích thước 3486bp Như vậy plasmid mà ta tách được sau điện di kiểm tra nếu có kích thước 3486bp thì có nghĩa là dòng tế này có mang vector tái tổ hợp Sau tách chiết DNA plasmid và điện di kiểm tra chúng thu được kết quả hình ảnh: Hình 4: Hình ảnh điện di sản phẩm tách plasmid Từ hình ảnh điện di ta có thể thấy: - Dòng 1: việc tách chiết DNA plasmid không thành công, không nhìn thấy băng vạch nào 16 - Dòng 2,3 và 4: hình ảnh điện di xuất hiện băng khá mờ, nữa không có macker để so sánh kích thước nên ta dự đoán băng cùng có thể là vector tái tổ hợp mà ta đưa vào, chúng có kích thước lớn kích thước vector ban đầu 600bp nên di chuyển chậm nhất Băng thứ hai mờ là các vector tự đóng vòng mà không mang gen ta muốn chèn, chúng có kích thước bằng với kích thước vector ban đầu,hoặc có thể là các vector tái tổ hợp ở dạng dãn xoắn nên chúng có kích thước nhỏ vector tái tổ hợp nên chúng di chuyển nhanh Vạch dưới cùng sáng nhất là các phân tử RNA chưa bị loại bỏ hết Kết luận: dòng 2,3 và có thể mang vector tái tổ hợp Tuy nhiên để chắc chắn nữa ta có thể kiểm tra bằng enzim cắt giới hạn (RE) 3.2 phân tích DNA tái tổ hợp bằng enzim giới hạn Plasmid tách chiết được từ thí nghiệm có thể mang vector tái tổ hợp ở dòng 2,3,và được sử dụng thí nghiệm này Theo nguyên tắc, đoạn gen chúng ta chèn vào vector sẽ được chèn vào vùng gen lac-Z mà ở đó cũng có chứa điểm nhận biết của các enzim giới hạn khác Ta chọn enzim nằm ở đầu của gen chèn vào và chỉ có điểm nhận biết nhất để sau phản ứng cắt gen không bị cắt thành nhiều đoạn Sau xem bản đồ vector pTZ57RT ta chọn được enzim EcoRI và BamHI, đó BamHI nằm sát đầu gen, EcoRI nằm cách đầu gen 30 bp Phản ứng được thực hiện buffer tango Nếu kết quả điện di sản phẩm cắt có xuất hiện băng khoảng 630 bp tức là vector chắc chắn mang đoạn gen ta cần chèn Sau tiến hành phản ứng cắt và điện di sản phẩm cắt ta thu được hình ảnh sau: 17 Hình5:Hình ảnh điện di sản phẩm cắt plasmid bằng RE Theo hình ảnh điện di sản phẩm cắt thì ta thấy việc cắt plasmid bằng enzim không thành công, ở cả mẫu đều không xuất hiện băng 630bp hoặc cũng có thể có đoạn 630bp mà ta mong muốn cắt với hàm lượng rất ít nên ta không thể nhìn thấy ảnh điện di Có các băng sáng chồng lên đó là các RNA hoặc các sản phẩm thừa quá trình tách plasmid KẾT LUẬN: Ta không tách được dòng gen rRNA 16s 18 [...]... 4 ống khác nhau ta được 4 dòng vi khuẩn khác nhau 3 Phân tích sản phẩm tạo dòng Sau khi chọn được các dòng vi khuẩn khác nhau có khả năng mang vector tái tổ hợp, ta tiến hành phân tích sản phẩm tạo dòng xem dòng nào có mang vector tái tổ 15 hợp mà ta mong muốn Có nhiều hướng có thể phân tích sản phẩm tạo dòng trong đó có tách chiết DNA plasmid hoặc... 4: TẠO 1 DÒNG GEN rRNA 16s Gắn sản phẩm PCR vào vector Với nguyên liệu là một phần trình tự vùng gen rRNA 16s có kích thước 600bp đã được tinh sạch, chúng tôi tiến hành gắn trình tự gen này vào vector pTZ57RT pTZ57RT là vector tồn tại dưới dạng mạch thẳng, có kích thước 2886bp với điểm khởi đầu sao chép F1 ori, dấu chuẩn chọn lọc là gen lac Z (gen mã hóa... thước 3486bp thì có nghĩa là dòng tế này có mang vector tái tổ hợp Sau khi tách chiết DNA plasmid và điện di kiểm tra chúng tôi thu được kết quả như hình ảnh: Hình 4: Hình ảnh điện di sản phẩm tách plasmid Từ hình ảnh điện di ta có thể thấy: - Dòng 1: việc tách chiết DNA plasmid không thành công, không nhìn thấy băng vạch nào 16 - Dòng 2,3 và 4: hình ảnh... phản ứng cắt gen không bị cắt thành nhiều đoạn Sau khi xem bản đồ vector pTZ57RT ta chọn được 2 enzim EcoRI và BamHI, trong đó BamHI nằm sát đầu gen, EcoRI nằm cách đầu gen 30 bp Phản ứng được thực hiện trong buffer tango Nếu kết quả điện di sản phẩm cắt có xuất hiện băng khoảng 630 bp tức là vector chắc chắn mang đoạn gen ta cần chèn Sau khi tiến hành phản... lọc này để chọn được dòng mang vector tái tổ hợp Trên môi trường nuôi cấy có bổ sung kháng sinh ampicillin nên chỉ những tế bào mang vector tái tổ hợp có chứa gen kháng ampicillin mới có khả năng tạo thành khuẩn lạc trên môi trường nuôi cấy này Tuy nhiên, cũng có thể có dòng tế bào đột biến có khả năng kháng ampicillin cũng sẽ tạo thành khuẩn lạc Chọn... bằng enzim giới hạn Plasmid tách chiết được từ thí nghiệm trên có thể mang vector tái tổ hợp ở dòng 2,3,và 4 được sử dụng trong thí nghiệm này Theo nguyên tắc, đoạn gen chúng ta chèn vào vector sẽ được chèn vào vùng gen lac-Z mà ở đó cũng có chứa điểm nhận biết của các enzim giới hạn khác nhau Ta chọn 2 enzim nằm ở 2 đầu của gen chèn vào và chỉ có... trắng thành màu xanh) và gen kháng kháng sinh ampicillin, điểm nhận biết của enzim giới hạn thuộc gen lac Z vì sản phẩm của phản ứng PCR nhô ra nu A ở đầu 3’ còn vector nhô ra nu T ở đầu 3 do đó dưới tác dụng của enzim nối T4 ligase sẽ tạo nên vector tái tổ hợp 2 Biến nạp vector vào tế bào chủ Sau khi tạo thành vector tái tổ hợp chúng tôi tiến hành biến... plasmid bằng enzim không thành công, ở cả 4 mẫu đều không xuất hiện băng 630bp hoặc cũng có thể có đoạn 630bp mà ta mong muốn cắt nhưng với hàm lượng rất ít nên ta không thể nhìn thấy trên ảnh điện di Có các băng sáng chồng lên nhau đó là các RNA hoặc các sản phẩm thừa trong quá trình tách plasmid KẾT LUẬN: Ta không tách được dòng gen rRNA 16s 18 ... sẽ là đoạn gen ta khuếch đại vì nó ở trên cùng nên có kích thước lớn nhất Các băng bên dưới là các sản phẩm kéo dài không hết hoặc mồi thừa Như vậy khi thôi gel ta sẽ cắt băng trên cùng để thôi gel 11 Thôi gel sản phẩm PCR Do các thành phần trong sản phẩm PCR ảnh hưởng đến phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector làm giảm hiệu quả tách dòng Do đó sản... tâm, pipet, đầu côn, dao cắt gel Hóa chất: kit thôi gel GeneJET gel extraction kit từ hãng Fermentas Quy trình thực hiện bước 1: điện di sản phẩm khuếch đại gen, cắt băng gel cho vào ống eppendorf 2ml nếu điện di sản phẩm PCR cho ra nhiều băng thì ta so với - macker và chỉ cắt lấy băng đúng kích thước của đoạn gen ta mong muốn Bước 2: bổ sung dung dịch bám (binding ... được dòng vi khuẩn khác Phân tích sản phẩm tạo dòng Sau chọn được các dòng vi khuẩn khác có khả mang vector tái tổ hợp, ta tiến hành phân tích sản phẩm tạo dòng xem dòng. .. điện di sản phẩm tách plasmid Từ hình ảnh điện di ta có thể thấy: - Dòng 1: việc tách chiết DNA plasmid không thành công, không nhìn thấy băng vạch nào 16 - Dòng 2,3 và 4:... cắt gen không bị cắt thành nhiều đoạn Sau xem bản đồ vector pTZ57RT ta chọn được enzim EcoRI và BamHI, đó BamHI nằm sát đầu gen, EcoRI nằm cách đầu gen 30 bp Phản ứng được thực