Đang tải... (xem toàn văn)
TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1. Tên đề tài Nhân nhanh in vitro cây hoắc hương qua giai đoạn mô sẹo 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu Thí nghiệm được tiến hành trên cây hoắc hương (Pogostemon cablin (Blanco) Benth.) 3. Mục tiêu Nhằm tạo được nguồn giống cây trồng đồng đều, sạch bệnh, giữ được các đặc tính quý của nguyên liệu ban đầu. 4. Kết quả chính 1. Trong các môi trường sử dụng để nghiên cứu tạo mô sẹo từ thân và lá cây hoắc hương thì môi trường MS + 20 gl đường + 10 gl agar + 1,5 mgl 2,4D là môi trường tốt nhất cho tạo mô sẹo. 2. Môi trường MS + 20 gl đường + 10 gl agar + 1,5 mgl 2,4D + 0,5 gl THT là môi trường chứa than hoạt tính với nồng độ tốt nhất cho tạo mô sẹo. 3. Môi trường phù hợp nhất cho nhân nhanh mô sẹo là môi trường MS + 20 gl đường + 10 gl agar + 1,5 mgl 2,4D + 0,5 gl THT + 1,0 mgl BAP. 4. Môi trường thích hợp nhất cho tái sinh chồi từ mô sẹo là môi trường MS+ 20 gl đường + 10gl agar + 0,5 mgl THT + 1 mgl kinetin.
TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Tên đề tài Nhân nhanh in vitro hoắc hương qua giai đoạn mô sẹo Đối tượng và phương pháp nghiên cứu Thí nghiệm được tiến hành hoắc hương (Pogostemon cablin (Blanco) Benth.) Mục tiêu Nhằm tạo được nguồn giống trồng đồng đều, sạch bệnh, giữ được các đặc tính quý của nguyên liệu ban đầu Kết quả chính Trong các môi trường sử dụng để nghiên cứu tạo mô sẹo từ thân và lá hoắc hương thì môi trường MS + 20 g/l đường + 10 g/l agar + 1,5 mg/l 2,4-D là môi trường tốt nhất cho tạo mô sẹo Môi trường MS + 20 g/l đường + 10 g/l agar + 1,5 mg/l 2,4-D + 0,5 g/l THT là môi trường chứa than hoạt tính với nồng độ tốt nhất cho tạo mô sẹo Môi trường phù hợp nhất cho nhân nhanh mô sẹo là môi trường MS + 20 g/l đường + 10 g/l agar + 1,5 mg/l 2,4-D + 0,5 g/l THT + 1,0 mg/l BAP Môi trường thích hợp nhất cho tái sinh chồi từ mô sẹo là môi trường MS+ 20 g/l đường + 10g/l agar + 0,5 mg/l THT + mg/l kinetin MỞ ĐẦU Hiện nay, nhu cầu người nguồn dược liệu ngày tăng Nguồn dược liệu người sử dụng tổng hợp từ nhiều đường khác tổng hợp hóa học, tổng hợp từ vi sinh vật… song nguồn dược liệu từ thực vật sử dụng từ lâu giữ vị trí quan trọng Tuy nhiên, loài dược liệu tự nhiên bị giảm số lượng chất lượng khai thác mức người điều kiện môi trường tự nhiên ngày bất lợi, nhiều loài dược liệu quý bị tuyệt chủng đe dọa tuyệt chủng, ảnh hưởng đến nguồn cung cấp dược liệu bền vững cho người [14] Hoắc hương có tên khoa học Pogostemon cablin (Blanco) Benth có nguồn gốc từ Philippin Hiện chúng trồng vùng nhiệt đới Châu Á Châu Phi với qui mô lớn để lấy tinh dầu Tinh dầu hoắc hương nguyên liệu tự nhiên quan trọng sử dụng làm nước hoa nhiều sản phẩm khác [5] Ngoài tác dụng lấy tinh dầu, hoắc hương có mặt hàng trăm đơn thuốc với nhiều công dụng, đặc tính chữa bệnh khác như: kháng khuẩn, kháng nấm, chống viêm, chống nôn, điều hòa tì vị, chữa đau bụng, ợ khan, hôi miệng, thổ tả, ỉa chảy, khó tiêu, sôi bụng…[5] Ở Việt Nam, hoắc hương phân bố khắp nước, song tập trung nhiều số tỉnh miền bắc như: Hà Nội, Hưng Yên, Vĩnh Phúc… Nhìn chung, điều kiện nước ta phù hợp cho sinh trưởng, phát triển hoắc hương cho chất lượng tinh dầu cao so với nước sản xuất tinh dầu hoắc hương giới [10] Tuy nhiên, nhiều năm qua việc nghiên cứu, trồng sử dụng hoắc hương hạn chế Vì vậy, vấn đề đặt phải cung cấp đủ nguồn nguyên liệu đáp ứng số lượng chất lượng cho việc sản xuất sản phẩm từ hoắc hương Với lợi định việc nghiên cứu quy trình nhân nhanh in vitro giống lựa chọn quan trọng mang lại thành công cho việc nhân nhanh bảo quản bảo tồn nhiều loài có giá trị Hơn từ nguyên liệu mô sẹo nuôi cấy sử dụng để tái sinh phục vụ mục đích nhân nhanh giống hay sử dụng làm nguyên liệu trực tiếp để sản xuất tinh dầu, nuôi cấy tế bào trần, chọn dòng tế bào… Xuất phát từ vấn đề thực tế với hy vọng tiếp tục đóng góp phần vào nghiên cứu hoắc hương Việt Nam, lựa chọn đề tài: “Nhân nhanh in vitro hoắc hương qua giai đoạn mô sẹo” với mục đích tạo mô sẹo phục vụ cho mục đích nhân giống in vitro và thu nhận tinh dầu hoắc hương từ mô sẹo Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu khái quát hoắc hương 1.1.1 Đặc điểm phân loại Hoắc hương (Pogostemon cablin (Blanco) Benth.) tên tiếng Anh Patchouli oil plant Blanco mô tả vào năm 1837 Bentham xác định tên năm 1848 Về vị trí phân loại, hoắc hương thuộc: - Giới: Plantae (thực vật) - Giới phụ: Tracheobionta (thực vật có mạch) - Trên ngành: Spermatophyta (thực vật có hạt) - Ngành: Magnoliophyta (thực vật có hoa) - Lớp: Magnoliopsida (hai mầm) - Lớp phụ: Asteridae (phân lớp hoa môi) - Bộ: Lamiales (hoa môi) - Họ: Lamiaceae (bạc hà) - Chi: Pogostemon Desf - Loài: Pogostemon cablin ( Blanco) Benth Trong y học, hoắc hương biết đến với nhiều tên gọi khác như: Hợp hương, Tô hợp hương, Hoắc khử bệnh, Linh lung hoắc khử bệnh (Hòa hán dược khảo), Đầu lâu bà hương (Lăng nghiêm kinh), Đa ma la bạt hương (Pháp hoa kinh), Bát đát la hương (Kim quang minh kinh), Gia toán hương (Niết bàn kinh), Quảng hoắc hương, Quảng hoắc ngạnh, Tiên hoắc hương (Trung Quốc dược học đại từ điển), Thổ hoắc hương (Trấn nam thảo), Thanh kinh bạc hà (Quảng Tây thảo tuyển biên), Miêu vĩ ba hương, Miêu ba hổ (Liễu Ninh thảo dược), Lục hà hà (Phúc Kiến dược vật chí), Ngư hương, Kê tô, Thủy ma diệp (Tứ Xuyên trung dược) Tuy nhiên, cần phải lưu ý để phân biệt hoắc hương với hoắc hương núi có tên khoa học là: Agastache rugosus (fisch et meyer) O Katze, tên tiếng anh là: wrrinkle giant [26] Hình 1.1 Cây và hoa hoắc hương (Pogostemon cablin (Blanco) Benth.) tự nhiên 1.1.2 Đặc điểm hình thái Hoắc hương thảo sống lâu năm, cao 30-60 cm Thân non hình trụ vuông, phân nhiều cành, cành cong, dài 30-60 cm, đường kính 2-7 mm Thân già hình trụ, đường kính 10-12 mm, lớp bần màu nâu xám Lá đơn mọc đối, hình trứng hình elip, dài - 12 cm, rộng 2,5 - cm, hai mặt màu trắng xám, có lông mượt nhung, chóp nhọn tròn, gốc vát nhọn tròn, mép có cưa ngắn, mùi thơm đặc biệt, vị đắng [2], [26] Cụm hoa hình chùm, gồm mọc đối đầu cành kẽ lá, dài - cm, hoa nhỏ cuống màu hồng tím nhạt Lá bắc nhỏ, hình mác, có lông dày Đài hoa hình ống dài - mm, mặt phủ nhiều lông, mặt lông Tràng hoa chia thành hai môi, môi kéo dài, nhị bốn thò khỏi tràng, nhị rời, phần có lông [1], [2], [27] Quả gần hình cầu, dẹt, có hạt cứng Cây thấy hoa Hạt có nội nhũ 1.1.3 Điều kiện sinh thái Nhiệt độ: hoắc hương nhiệt đới, nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng phát triển từ 22-28oC Nhiệt độ cao thấp kéo dài làm bị chết nhanh chóng Do đó, việc lựa chọn thời gian trồng hoắc hương có ảnh hưởng lớn đến suất chất lượng tinh dầu Nếu trồng vào cuối đông thời gian sinh trưởng kéo dài Nếu trồng vào mùa hè (tháng tháng 4) sinh trưởng nhanh, sớm cho thu hoạch suất thấp rút ngắn thời gian tổng hợp tích lũy chất thứ cấp Vì vậy, thời vụ tốt để trồng hoắc hương nước ta vào mùa xuân hay đầu hè [1] Độ ẩm: hoắc hương ưa ẩm, lượng mưa trung bình từ 1500-3000 mm, độ ẩm tương đối 75% thích hợp cho sinh trưởng hoắc hương [9] Thiếu độ ẩm thường dẫn đến khô cằn, nhỏ quăn, điều kiện mùa hè (tháng , tháng 7) nhiệt độ cao, tưới tiêu không tốt bị chết Ngược lại thời tiết mưa nhiều hay ngập úng thường ngả sang màu vàng chết nhanh chóng [10] Ánh sáng: ánh sáng tác dụng trực tiếp lên trình tổng hợp tinh dầu song có tác dụng lên trình tích lũy tinh dầu Màu sắc lá, độ dày kích thước thay đổi trồng vùng ánh sáng khác Vùng có cường độ chiếu sáng mạnh thường có màu xanh tím, nhỏ dày Còn nơi có cường độ chiếu sáng yếu thường có màu xanh tươi, to mỏng [10] Điều phần thể thích nghi cây, mặt khác ảnh hưởng đến tích lũy chất lượng tinh dầu hoắc hương [10] Nhìn chung hoắc hương ưa bóng, với điều kiện nước ta che khoảng 50% ánh sáng tự nhiên sinh trưởng nhanh cho chất lượng tinh dầu ổn định Do nhân dân địa phương thường trồng xen hoắc hương với chuối, chanh hay ăn khác [5], [10] Ngoài yếu tố đất yếu tố quan trọng Đất phù hợp cho hoắc hương đất mùn, giàu chất hữu cơ, độ pH = 5,5 - 6,2 Các loại đất có khả giữ nước đất cát không phù hợp cho sinh trưởng của hoắc hương [26] 1.1.4 Phân bố, thu hái chế biến a) Phân bố Hoắc hương loài trồng tương đối phổ biến vùng nhiệt đới châu Phi châu Á Ở Ấn Độ, Malaixia, Philippin, Mangat Indonexia, người ta trồng hoắc hương để chưng cất tinh dầu làm hương liệu [27] Ở Việt Nam, hoắc hương coi thuốc có từ lâu đời có mặt sách “ Nam dược thần liệu” Tuệ Tĩnh “ Dược phẩm vạng yếu” Hải Thượng Lãn Ông Hoắc hương nhân dân trồng vườn nhà làm thuốc phổ biến suốt từ Bắc vào Nam Một số vùng sử dụng hoắc hương thuốc dùng cho việc sản xuất nguyên liệu thương phẩm như: Hưng Yên, Hải Dương, Hà Nội, Vĩnh Phúc… [10] b) Thu hái chế biến Thu hái: phần hoắc hương dùng làm thuốc phần khô phần nằm mặt đất, có mùi thơm nồng tốt Hoắc hương thu hái quanh năm trước hoa, người ta thường thu vào tháng - 6, phơi râm cho khô, sấy nhẹ khô [26] Chế biến: khô đem thái nhỏ dùng thuốc thang tán bột nhỏ để làm hoàn tán (Trung Quốc dược học đại từ điển) phun nước cho ngấm đều, thái phiến, phơi khô để dùng (Đông dược học yếu) [9] 1.1.5 Thành phần hóa học Thành phần hóa học hoắc hương gồm nhiều hợp chất khác như: methylchavicol, anethole, anisaldehyde, limonene, β-methoxinnamaldehyde, pinene, 3-octanone, 1-octen-3-ol, linalool, 1-caryphyllene, β-emelene, γhumulene, β-farnenene, α-ylangene, γ-cardinene, calamenene, β-hexenal , acacetin, tilianin, linarin, agastachoside, isoagastachoside, agastachin maslinic acid, crategolic acid, oleanolic acid, 3-o-acetyloleanolic aldehyde, daucostool, γsitosterol, dehydroagastol, methylchavicol, anethole, anisaldehyde, d-limonene, β-methoxycinamaldehyde, α-pinene, 3-octanone, 3-octanol, β-cymene, 1-octen3-ol, β-humulene, α-ylangene, β-farnesene…[10] Trong thành phần hóa học hoắc hương tinh dầu hoắc hương thành phần quan trọng ý nhiều Tinh dầu hoắc hương chất lỏng màu vàng, mùi mạnh bền vững Thành phần hóa học tinh dầu hoắc hương Việt Nam gồm có: patchouli alcohol (37,80%), β-caryophyllene( 2,77%), βpatchoulene (3,2%), β-elemene (0,69%), α-guaiene (13,47%), β-guaiene (3,47%), α-patchoulene (8,03%), α-bulnesene (14,67%), seychellene (7,74%), pogostol (2,47%), ledene (1,6%), viriflorol (0,30%), salilene cyclo (1,4%), δcadinene (1,16%), oxydcaryophullene (1,10%) [27] Tinh dầu hoắc hương tích lũy chủ yếu (85%), non nhiều nhất, hàm lượng tinh dầu giảm dần với tăng tuổi Thành phần, hàm lượng tinh dầu hoắc hương có thay đổi tùy thuộc vào phận cây, tuổi cây, yếu tố môi trường, thời điểm thu hoạch, cách thức bảo quản tách chiết So với nước và sản xuất tinh dầu hoắc hương giới tinh dầu hoắc hương Việt Nam thuộc loại sản phẩm có chất lượng cao [10] 1.1.6 Tác dụng dược lý a) Tác dụng chữa bệnh Trừ rễ ra, tất phận lại hoắc hương sử dụng để bào chế thuốc dùng hai dạng nguyên liệu khô tươi [5] Do hoắc hương có tác dụng kháng khuẩn rộng, có tác dụng ức chế loại nấm gây bệnh, trực khuẩn mủ xanh, trực khuẩn lị, liên cầu khuẩn, song cầu khuẩn…[2], [5] Nên, y học dân gian hoắc hương sử dụng điều trị bệnh tiêu chảy, đầy hơi, khó tiêu, buồn nôn, đau đầu, trị viêm mũi, viêm xoang, chàm lở, chống viêm, chống nhiễm trùng, chống nấm…[27] Ngoài tinh dầu hoắc hương còn có tác dụng trị côn trùng, kích thích mọc tóc, tăng tiết dịch vị dày, giúp tiêu hóa, làm giảm bớt căng thẳng, trấn tĩnh tinh thần, giúp tinh thần thoải mái làm việc hiệu [9], [19] b) Tác dụng khử mùi Đây công dụng tốt hoắc hương mà khai thác mạnh Nhờ có tính kháng khuẩn rộng mùi hương dễ chịu nên hoắc hương có tác dụng khử mùi hôi, mùi ẩm mốc, chống thối tốt Do nhiều sản phẩm chứa tinh dầu hoắc hương sản xuất như: nước khử hôi miệng, sữa tắm khử mùi hôi thể, nước rửa tay, lau chùi vật dụng dễ bị ẩm mốc…[10] c) Tác dụng chất định liệu Hoắc hương có mùi hương nặng, bền, đặc trưng hấp dẫn Do hoắc hương sử dụng nhiều công nghiệp sản xuất nước hoa, hóa mĩ phẩm (phấn, sữa tắm, dầu masage…), công nghiệp sản xuất bánh kẹo… 1.2 Tình hình sử dụng hoắc hương giới Việt Nam 1.2.1 Trên giới Theo ước tính, mức tiêu thụ tinh dầu hoắc hương giới khoảng 2000 năm [26] Trong đó, hoắc hương sản xuất sử dụng nhiều nước Đông Nam Á (Indonexia, Malaixia, Philippin), Ấn Độ, Trung Quốc, Brazil, Hoa Kỳ, Châu Âu… Ở nước này, hoắc hương sản xuất quy mô công nghiệp tạo nguyên liệu thô hàng trăm sản phẩm liên quan đến tinh dầu hoắc hương 10 Khi tăng hàm lượng NAA lên cao tỉ lệ tạo mô sẹo lại giảm cách nhanh chóng xuống thấp 44,45% nồng độ 3,0 mg/l Như vậy, nồng độ NAA cao ức chế trình tạo mô sẹo thân hoắc hương ♦ Ảnh hưởng IBA đến khả tạo mô sẹo thân hoắc hương vô trùng IBA cảm ứng hình thành mô sẹo thân hoắc hương tốt NAA lại 2,4 D Tỷ lệ tạo mô sẹo công thức thí nghiệm đồng Sau 45 ngày nuôi cấy, tỷ lệ tạo mô sẹo tăng từ 45% công thức bổ sung 0,5 mg/l lên đến 75% công thức bổ sung 2,0 mg/l sau giảm xuống thấp 40% công thức bổ sung 2,0 mg/l Sau 60 ngày, tỷ lệ tạo mô sẹo tăng dần tương ứng với tăng dần hàm lượng IBA môi trường đạt cao 85% mức hàm lượng 2,0 mg/l Tiếp tục tăng hàm lượng IBA tỷ lệ tạo mô sẹo lại giảm xuống thấp 50% nồng độ 3,0 mg/l Hình 3.3: Ảnh hưởng của auxin đến khả tạo mô sẹo ở thân hoắc hương 34 45 ngày 60 ngày Hình 3.4: Kết quả tạo mô sẹo từ thân hoắc hương sau 45 ngày và 60 ngày Kết luận: So sánh mô sẹo hình thành từ thân và từ lá hoắc hương chúng nhận thấy: tạo mô sẹo từ lá, thời gian hình thành mô sẹo nhanh so với tạo mô sẹo từ thân, sau 10 ngày cho vào môi trường mẫu bắt đầu cảm ứng mẫu thân, thời gian cảm ứng lên tới 25 ngày Tuy nhiên, mô sẹo hình thành từ lá lại xốp, mô sẹo có màu trắng rời rạc mô sẹo hình thành từ thân cứng, Như vậy, nếu cần tạo mô sẹo thời gian ngắn thì ta nên sử dụng lá hoắc hương để tạo mô sẹo Nếu cần sử dụng mô sẹo cho các nghiên cứu tiếp theo thì ta nên sử dụng mô sẹo tạo từ thân Công thức tạo mô sẹo tốt nhất cho cả lá và thân hoắc hương là: MS bổ sung 20 g/l đường, 10 g/l agar, 1,5 mg/l 2,4-D 3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả tạo mô sẹo ở lá hoắc hương 35 Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, hay thấy tượng hóa nâu hay hoá đen mẫu làm sinh trưởng mẫu bị ngăn chặn hay hư mẫu Hiện tượng mẫu nuôi cấy có chứa hợp chất tannin hydroxyphenol có mẫu Người ta thường bổ sung THT vào môi trường nuôi cấy để ngăn chặn sự hóa nâu hay hóa đen của mẫu nuôi cấy THT có ảnh hưởng đến sự hấp thụ và giải phóng các chất của mẫu nuôi cấy, hấp thụ các chất bẩn của môi trường, làm giảm sự ức chế sinh trưởng của các sản phẩm trao đổi chất từ mẫu nuôi cấy, làm tăng hiệu suất sinh khối làm tối môi trường( Winkle Van S.C.,1995) Chúng sử dụng môi trường bản là MS bổ sung 20 g/l đường, 10 g/l agar, 1,5 mg/l 2,4-D, THT ở các hàm lượng khác Mẫu nuôi cấy là lá hoắc hương in vitro được cấy lên các môi trường thử nghiệm và theo dõi 40 ngày Kết quả thu được sau: Bảng 3.3: Ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả tạo mô sẹo từ hoắc hương Nồng độ THT (g/l) Số mẫu Tỷ lệ tạo mô sẹo(%) Sau 20 ngày Sau 40 ngày 0,5 12 50,56 ± 0,68 97,67 ± 0,47 1,0 12 43,26 ± 0,57 76,89 ± 0,79 1,5 12 25,38 ± 0,95 58,32 ± 0,47 2,0 12 18,75 ± 1,21 43,68 ± 0,65 Từ bảng kết quả chúng nhận thấy, THT làm tăng tỷ lệ tạo mô sẹo Sau 20 ngày nuôi cấy mô sẹo bắt đầu hình thành, tỷ lệ mẫu tạo tạo mô sẹo cao nhất đạt 50,56% môi trường bổ sung 1,5 mg/l 2,4- D + 0,5 g/l THT và thấp nhất là 18,75% môi trường bổ xung 1,5 mg/l 2,4-D + 2,0 g/l THT Sau 40 ngày nuôi 36 cấy tỷ lệ tạo mô sẹo đều tăng lên ở tất cả các môi trường, tỷ lệ tạo mô sẹo đạt cao nhất là 97,67% môi trường bổ sung 1,5 mg/l 2,4-D + 0,5 g/l THT và thấp nhất là 43,68% môi trường bổ sung 1,5 mg/l 2,4-D + 2,0 g/l THT Khi nồng độ THT tăng lên kéo theo tỷ lệ tạo mô sẹo giảm rõ rệt Về trạng thái của mẫu nuôi cấy, nhận thấy khác biệt rõ rệt là, mới hình thành mô sẹo màu vàng môi trường không bổ sung THT mà có màu trắng Sau 20 ngày, mô sẹo bắt đầu chuyển sang màu trắng nâu Nếu tiếp tục để mô sẹo môi trường thời gian hóa nâu của mô sẹo kéo dài so với mô sẹo nuôi cấy môi trường không có THT Hình 3.5: Ảnh hưởng của THT đến khả tạo mô sẹo từ hoắc hương 37 Sau 20 ngày sau 40 ngày Hình 3.6: Kết quả tạo mô sẹo môi trường bổ sung 0,5 mg/l THT Như vậy, than hoạt tính có ảnh hưởng tốt đến quá trình hình thành mô sẹo, làm tăng tỷ lệ tạo mô sẹo và kéo dài thời gian hóa nâu của mẫu Tuy nhiên, sử dụng THT ở nồng độ cao nó lại ức chế sự tạo thành mô sẹo Hàm lượng THT tốt cho tạo mô sẹo 0,5 mg/l 3.3 Nghiên cứu nhân sinh khối mô sẹo hoắc hương Mẫu được chúng sử dụng thí nghiệm này là mô sẹo tạo từ thân hoắc hương thí nghiệm trước Mẫu được cấy lên môi trường MS bổ sung 20 g/l đường, 10g/l agar, 1,5 mg/l 2,4-D, 0,5 g/l THT, BAP, kinetin ở các nồng độ khác Mẫu nuôi cấy được chúng theo dõi 45 ngày và thu được kết quả bảng sau: Bảng 3.4: Ảnh hưởng của BAP kinetin đến khả nhân sinh khối mô sẹo hoắc hương Nồng độ cytokinin bổ sung (mg/l) BAP Kinetin 0,5 ― 3,20 13,30 38 4.16 1,0 1.5 2,0 ― ― ― ― ― ― ― 0,5 1,0 1,5 2,0 4,10 3,50 2,70 3,30 3,10 2,90 2,60 20,20 12,90 8,80 11,40 12,00 11,80 9,30 4,93 3,68 3,26 3,45 3,87 4,07 3,58 Từ kết quả thu được, chúng nhận thấy, BAP kinetin có ảnh hưởng tích cực đến hệ số nhân sinh khối mô sẹo Cụ thể: Đối với BAP, bổ sung 0,5 mg/l BAP cho khối lượng mô sẹo tăng 4,16 lần; tăng lượng BAP lên 1,0 mg/l thì hệ số nhân sinh khối mô sẹo đạt cao nhất là 4,93 lần Tiếp tục tăng hàm lượng BAP lên 1,5 mg/l thì hệ số nhân mô sẹo lại giảm xuống 3,68 lần và thấp nhất là 3,26 lần môi trường bổ sung mg/l BAP Đối với kinetin, nhận thấy trình cảm ứng tăng sinh mô sẹo BAP Kết cao nồng độ 1,5 mg/l sau 45 ngày nuôi cấy cho khối lượng mô sẹo tăng 4,07 lần Sau tăng hàm lượng kinetin lên cảm ứng tăng sinh mô sẹo giảm thấp nồng độ mg/l với tỷ lệ đạt 3,58 lần Trên hình ảnh nhận thấy, mô sẹo chuyển sang môi trường tăng sinh khối có màu trắng hơn, xốp Như môi trường tốt cho tăng sinh khối mô sẹo hoắc hương môi trường bổ sung 1,5 mg/l 2,4-D, 39 0,5 g/l THT, 1,0 mg/l BAP Hình 3.7: Ảnh hưởng của BAP và kinetin đến nhân sinh khối mô sẹo hoắc hương 30 ngày 45 ngày Hình 3.8: Sinh khối mô sẹo sau 30 ngày và sau 45 ngày 3.4 Nghiên cứu tái sinh chồi từ mô sẹo hoắc hương Môi trường tạo mô sẹo thường có nồng độ chất KTST nghiêng vế phía auxin, để tái sinh chồi từ mô sẹo người ta thường bổ sung chất KTST thuộc nhóm cytokinin vào môi trường nuôi cấy Trong thí nghiệm, sử dụng môi 40 trường Msbổ sung 20 g/l đường, 10g/l agar, 0,5 mg/l THT, BAP, kinetin ở các nồng độ khác Kết thu sau 30 ngày nuôi cấy thu bảng sau Bảng 3.5: Ảnh hưởng của BAP và kinetin đến khả tạo chồi từ mô sẹo Nồng độ cytokinin bổ sung (mg/l) BAP Kinetin 0,5 1,0 1.5 2,0 ― ― ― ― 22,38 ± 3,62 36,07 ± 0,49 50,45 ± 0,56 46,78 ± 1,67 Xanh nhạt, mảnh ― ― ― ― 0,5 1,0 1,5 2,0 45,78 ± 0,32 80,56 ± 0,73 66,47 ± 0,23 52,39± 1,84 Xanh đậm, mập Theo dõi hình thành chồi, sau 10 ngày, nhận thấy khối mô bắt đầu chuyển sang màu xanh, một số điểm xuất chồi nhỏ chưa phân hóa rõ Sau 30 ngày chồi hình thành rõ rệt Cả BAP kinetin hoạt hóa tái sinh chồi từ mô sẹo kinetin cho kết tái sinh chồi tốt BAP Cụ thể: Đối với BAP, bổ sung 0,5 mg/l BAP cho cho tỷ lệ tái sinh chồi đạt 22,38%; tăng lượng BAP lên 1,0 mg/l thì tỷ lệ tái sinh chồi tăng lên 36,07% Tiếp tục tăng hàm lượng BAP lên 1,5 mg/l tỷ lệ tái sinh chồi đạt giá trị cao 50,47% sau tỷ lệ giảm xuống 46,78% môi trường bổ sung mg/l BAP Tuy nhiên, chất lượng chồi môi trường bổ sung BAP lại không đảm bảo, chồi có màu xanh nhạt mảnh Đối với kinetin, chất lượng số lượng chồi tốt bổ sung BAP Kết cao nồng độ mg/l cho tỷ lệ tái sinh chồi đạt 80,56% Khi tăng 41 hàm lượng kinetin lên 1,5 mg/l tỷ lệ tái sinh mô sẹo bắt đầu giảm xuống 66,47% Tiếp tục tăng hàm lượng kinetin tỷ lệ tái sinh chồi giảm xuống thấp đạt 52,39% nồng độ mg/l Nhưng chồi tái sinh có màu xanh đậm mập Như môi trường tốt để tái sinh chồi từ mô sẹo môi trường MS bổ sung 20 g/l đường, 10g/l agar, 0,5 mg/l THT, mg/l kinetin Các chồi mập xanh đậm Hình 3.9: Ảnh hưởng của BAP và kinetin đến khả tái sinh chồi từ mô sẹo 42 Hình 3.10: Chồi tái sinh từ mô sẹo KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 Kết luận Môi trường phù hợp cho tạo mô sẹo từ lá thân hoắc hương là môi trường MS + 20 g/l đường + 10 g/l agar + 1,5 mg/l 2,4-D Tỷ lệ tạo mô sẹo từ đạt 94,44% từ thân đạt 95% Nồng độ THT thích hợp nhất cho tạo mô sẹo hoắc hương là 0,5 g/l ứng với môi trường MS + 1,5 mg/l 2,4-D + 0,5 g/l THT, cho tỷ lệ tạo mô sẹo là 97,67% Môi trường phù hợp nhất cho nhân sinh khối mô sẹo hoắc hương là MS + 1,5 mg/l 2,4-D + 0,5 g/l THT + 1,0 BAP Hệ số nhân nhanh mô sẹo đạt 4,93 Môi trường tốt nhất cho tái sinh chồi mô sẹo hoắc hương là MS+ 20 g/l đường + 10g/l agar + 0,5 mg/l THT + mg/l kinetin Sử dụng môi trường nuôi cấy cho tỷ lệ tái sinh chồi đạt 80,56% chồi có chất lượng tốt Kiến nghị Trên là những kết quả nghiên cứu mà chúng thu được Tuy nhiên, điều kiện thời gian và phòng thí nghiệm còn hạn hẹp nên chúng chưa đánh giá được hàm lượng tinh dầu chứa mô sẹo in vitro và so sánh hàm lượng tinh dầu mô sẹo in vitro và hoắc hương Hiện nay, nhu cầu về tinh dầu hoắc hương rất lớn nên chúng rất mong rằng sẽ có những nghiên cứu tiếp theo để đánh giá hàm lượng và thu nhận tinh dầu từ mô sẹo in vitro hoắc hương để phục vụ nhu cầu về tinh dầu hoắc hương hiện TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 Tài liệu tiếng Việt Đỗ Huy Bích và cộng sự, Tài nguyên thuốc Việt Nam, NXB Khoa học và Kỹ thuật, tr: 46-48, 1993 Lê Đình Bích, Trần Văn Ơn, Hoàng Quỳnh Hoa, Thực vật học, Bộ môn thực vật, Trường Đại học Dược Hà nội, tr: 13-17, 2005 Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội, Công nghệ sinh học thực vật cải tiến giống trồng, NXB Nông Nghiệp Hà Nội, tr: 94-104, 2005 Trần Thị Lệ, Trương Thị Bích Phượng, Trần Thị Triêu Hà, giáo trình công nghệ sinh học thực vật, NXB Nông Nghiệp, tr: 35-47, 2008 Đỗ Tất Lợi, Những thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học Hà Nội, tr: 134-112, 1999 Nguyễn Văn Nghi, Chuyên đề sinh lý và công nghệ tế bào thực vật, ĐHQG Hà Nội – Đại học Khoa Học Tự Nhiên, tr: 54-65, 1998 Nguyễn Hoàng Nghĩa, nhân giống vô tính và trồng rừng dòng vô tính, NXB Nông Nghiệp Hà Nội, tr: 96-134, 2001 Vũ Ngọc Phương, Đoàn Thị Áng Thuyên, Lưu Việt Dũng, Thái Xuân Du, Nguyễn văn Uyển, “ Quy trình ươm hồng (Paulownia fortunei) giai đoạn sau ống nghiệm”, Kết quả nghiên cứu khoa học Viện Sinh Học Nhiệt Đới, NXB Nông Nghiệp Tp Hồ Chí Minh, tr: 72-86, 2000 Phạm Xuân Sinh, Phương pháp chế biến thuốc cổ truyền, NXB Y học, tr: 4475, 2006 10.Trần Huy Thái, nghiên cứu đặc điểm sinh học và tích lũy tinh dầu của hoắc hương ( Pogostemon cablin (Blanco) Benth.) ở Việt Nam, LA.PTS, Hà Nội, tr: 49-53, 2005 11 Nguyễn Đức Thành, Nuôi cấy mô tế bào thực vật – Nghiên cứu và ứng dụng, NXB Nông Nghiệp Hà Nội, tr: 95-201, 2000 12.Nguyễn Văn Uyển và các tác giả, Nuôi cấy mô thực vật phục vụ công tác giống trồng, NXB Nông nghiệp, tr: 24-38, 1993 45 13.Bùi Trang Việt, Sinh lý thực vật đại cương phần II, NXB Đại Học Quốc Gia, Tp Hồ Chí Minh, tr: 75-89, 2007 14.Đỗ Vịnh, công nghệ tế bào thực vật và ứng dụng, NXB Nông Nghiệp Hà Nội, tr: 105-136, 2005 15.Vũ Văn Vụ, Sinh lý học thực vật, NXB Giáo Dục Hà Nội, tr: 134-148, 2007 16.Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp, công nghệ sinh học tập II, NXB Giáo Dục, tr: 112-134, 2006 17.Vũ Văn Vụ, Vũ Thanh Tâm, Hoàng Minh Tấn, sinh lý học thực vật, NXB Giáo Dục, Hà Nội, tr: 79-85, 2007 Tài liệu tiếng Anh 18 Bhojwani and Krazan, Plant Tissue culture: theory and practice, Amsterdam, Oxford, New Jork, Tokyo,p.421 – 449, 1983 19 Bunrathep, Lockwood, Songsak , ruangrungsi, “ Chemical constituents from leaves and cell cultures of pogostemon cablin and use of precursor feeding to improve patchouli alcohol level”, ScianceAsia 32, 2006 20 Colin, Bhojwanis and Rozdal, Plant cell culture, Biose scientific publishers, 1998 21 Colin, Plant Tissue Culture, Springer Bios scientific publisters, UK, 1998 22 Herblas, Pathchouli in Indian, 10/11/208 23 Narayanaswamy, Plant cell and Tissue Culture, Tataca Mc Graw Hill, Publishing company litimted, New Delhi, 1994 24 North Eastern Development Finance Corporation Ltd of India, Hand Book on Medicinal & Aromatic Plants (Package of Practices), 2005 25 Simth, Plant tissue culture, Departmen of soil and crop science, 1992 Một số trang web 26 http://dongyvietbac.com.vn/H/Hoac-huong-934.html 27 http:// my.opera.com/thuydt03/blog/tinh-dau-hoac-huong-patchouli-oil 28 http://www.indg.gov.in/agriculture/cropproduction 46 29 http://thietbiyte-u.com/Product.aspx?url=DetailProduct&ID=424&Cat=54 47 48 ... nghiên cứu hoắc hương Việt Nam, lựa chọn đề tài: Nhân nhanh in vitro hoắc hương qua giai đoạn mô sẹo với mục đích tạo mô sẹo phục vụ cho mục đích nhân giống in vitro và thu nhận tinh dầu... tạo mô sẹo: Tỷ lệ tạo mô sẹo (%) = ( số mẫu tạo mô sẹo/ tổng số mẫu cấy) x 100 - Đánh giá kết nhân nhanh mô sẹo: Hệ số nhân mô sẹo (lần) = khối lượng mô sẹo sau nhân nhanh/ khối lượng mô sẹo. .. 2.3.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm a) Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng auxin đến khả tạo mô sẹo in vitro hoắc hương ♦ Nghiên cứu ảnh hưởng auxin đến khả tạo mô sẹo từ lá hoắc hương Các mẫu hoắc