Đang tải... (xem toàn văn)
Thiết Kế Thang Chuẩn ADN (luận văn thạc sĩ)Thiết Kế Thang Chuẩn ADN (luận văn thạc sĩ)Thiết Kế Thang Chuẩn ADN (luận văn thạc sĩ)Thiết Kế Thang Chuẩn ADN (luận văn thạc sĩ)Thiết Kế Thang Chuẩn ADN (luận văn thạc sĩ)Thiết Kế Thang Chuẩn ADN (luận văn thạc sĩ)Thiết Kế Thang Chuẩn ADN (luận văn thạc sĩ)Thiết Kế Thang Chuẩn ADN (luận văn thạc sĩ)Thiết Kế Thang Chuẩn ADN (luận văn thạc sĩ)Thiết Kế Thang Chuẩn ADN (luận văn thạc sĩ)Thiết Kế Thang Chuẩn ADN (luận văn thạc sĩ)Thiết Kế Thang Chuẩn ADN (luận văn thạc sĩ)Thiết Kế Thang Chuẩn ADN (luận văn thạc sĩ)Thiết Kế Thang Chuẩn ADN (luận văn thạc sĩ)Thiết Kế Thang Chuẩn ADN (luận văn thạc sĩ)Thiết Kế Thang Chuẩn ADN (luận văn thạc sĩ)Thiết Kế Thang Chuẩn ADN (luận văn thạc sĩ)Thiết Kế Thang Chuẩn ADN (luận văn thạc sĩ)Thiết Kế Thang Chuẩn ADN (luận văn thạc sĩ)Thiết Kế Thang Chuẩn ADN (luận văn thạc sĩ)
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - - HOÀNG THỊ HUYỀN THIẾT KẾ THANG CHUẨN ADN LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2014 MỞ ĐẦU Công nghệ sinh học đƣợc định nghĩa “sự sản xuất hàng hóa dịch vụ quy mô công nghiệp nhờ việc sử dụng sinh vật, hệ thống sinh học trình sinh học” Hơn kỷ qua, công nghệ sinh học đƣợc trọng phát triển hầu hết quốc gia giới với nhiều thành tựu đáng kinh ngạc Để thúc đẩy phát triển công nghệ sinh học Việt Nam, phòng thí nghiệm sinh học ngày đƣợc trang bị máy móc đại, nguồn nhân lực trình độ chuyên môn tốt Do đó, chế phẩm sinh học phục vụ cho lĩnh vực nghiên cứu đòi hỏi phải đảm bảo chất lƣợng độ xác cao Một chế phẩm sinh học thƣờng dùng nghiên cứu sinh học thang chuẩn ADN Đây công cụ hữu ích đƣợc sử dụng để đánh giá kích thƣớc nồng độ đoạn ADN Tuy nhiên, thang chuẩn phải nhập với giá thành cao, thiếu tính chủ động nguồn cung cấp Nhƣợc điểm gây nhiều khó khăn trình triển khai nghiên cứu phòng thí nghiệm Việt Nam Một mặt hàng thang chuẩn có nhu cầu sử dụng cao thuận tiện phòng thí nghiệm sinh học phân tử thang chuẩn ADN 100 bp, thƣờng gồm dải băng có kích thƣớc từ 100 bp đến 3000 bp Mặc dù sản phẩm có nhu cầu sử dụng lớn, nhƣng lại phải nhập với giá thành cao, phụ thuộc thời gian đặt hàng vận chuyển phần nhiều ảnh hƣởng tới tính chủ động thí nghiệm Để khắc phục khó khăn thực đề tài “Thiết Kế Thang Chuẩn ADN” Mục tiêu đề tài là: thiết kế đƣợc thang chuẩn ADN 100 bp đảm bảo chất lƣợng tốt, giá hợp lí, đáp ứng nhu cầu sử dụng nhƣ phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm nƣớc Đề tài đƣợc thực Phòng thí nghiệm Sinh Y - Khoa Sinh học, Phòng Genomic thuộc Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzyme - Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 THANG CHUẨN ADN 1.1.1 Thang chuẩn ADN o Định nghĩa thang chuẩn ADN Thang chuẩn ADN đƣợc định nghĩa hỗn hợp phân tử ADN có kích thƣớc khác nhau, đƣợc sử dụng điện di nhằm đánh giá kích thƣớc nồng độ đoạn ADN chƣa biết [26] o Phân loại thang chuẩn ADN Có nhiều cách gọi tên phân chia nhóm thang chuẩn ADN khác nhƣ: dựa bƣớc nhảy thang chuẩn (thang chuẩn ADN bp, 10 bp, hay 50 bp,…); dựa vào kỹ thuật sản xuất (thang chuẩn PCR, thang chuẩn tái tổ hợp,…) [1] Tuy nhiên, phân biệt ADN ladder ADN marker cách phân chia thang chuẩn thông dụng thuận tiện nhất, dựa chất nguyên liệu ADN đƣợc sử dụng trình sản xuất: - ADN Ladder: Để tạo ADN ladder ngƣời ta thƣờng sử dụng enzyme giới hạn có vị trí nhận biết đặc hiệu phân tử ADN kích thƣớc lớn, nguồn gốc tự nhiên (ví dụ nhƣ plasmid bị biến đổi kỹ thuật di truyền, đoạn ADN kích thƣớc lớn) ADN ladder gồm đoạn ADN có kích thƣớc đặc trƣng, với bƣớc nhảy mong muốn (Hình 1) [16] Hình Ảnh ADN ladder 500 bp (Takara) [45]; ADN ladder 200 bp (Fermentas) [33] ADN ladder 10 bp (Invitrogen) [35] - ADN Marker: Cũng nhƣ ADN ladder, để sản xuất ADN marker ngƣời ta sử dụng enzyme cắt giới hạn có vị trí nhận biết đặc hiệu phân tử ADN kích thƣớc lớn, nhƣng phân tử ADN có sẵn tự nhiên nhƣ: ADN genome thực khuẩn thể lambda, plasmid pBR322, hay ΦX174 (Hình 2) [16] Thang chuẩn loại gồm đoạn ADN có kích thƣớc khác với bƣớc nhảy ngẫu nhiên Hình ADN marker thƣơng mại đƣợc tạo từ ΦX174; pBR322 pUC19 [33] 1.1.2 Vai trò thang chuẩn ADN nghiên cứu sinh học phân tử Trong lĩnh vực nghiên cứu sinh học phân tử việc tiến hành xác định nồng độ kích thƣớc đoạn ADN cần thiết thí nghiệm nhƣ: sử dụng kít tinh sạch, tách chiết ADN hay nhân dòng gen… Thông thƣờng để xác định xác kích thƣớc nồng độ ADN cần phải sử dụng đến phƣơng pháp giải trình tự xác định nồng độ ADN máy đo quang phổ Cả hai phƣơng pháp cần nhiều thời gian, thao tác thí nghiệm tƣơng đối phức tạp, đặc biệt giá thành để giải trình tự mẫu ADN cao, lại lúc cần thiết Cách đơn giản, nhanh chóng để xác định nồng độ kích thƣớc đoạn ADN nghiên cứu so sánh với đoạn ADN biết nồng độ kích thƣớc [24] Để thực mục đích kỹ thuật điện di đƣợc sử dụng cách thƣờng xuyên Với mục đích phân tách đoạn ADN gel agarose polyacrylamide, thang chuẩn ADN trở thành công cụ hữu ích để đánh giá chất lƣợng, kích thƣớc nồng độ mẫu ADN Thang chuẩn thƣờng chạy lúc gel với mẫu ADN, so sánh băng ADN mẫu với băng ADN thang chuẩn cho phép ƣớc tính kích thƣớc nồng độ đoạn ADN chƣa biết [16] Để thang chuẩn thực vai trò quan trọng băng thang chuẩn ADN thƣơng mại đƣợc mô tả xác kích thƣớc nồng độ ADN tƣơng ứng với lƣợng thể tích [40] 1.1.3 Sản xuất thang chuẩn ADN 1.1.3.1 Cung ứng sản xuất thang chuẩn ADN giới Thị trƣờng thang chuẩn ADN giới có góp mặt nhiều hãng sản xuất cung ứng danh tiếng nhƣ Fermentas - Đức [33]; Takara - Nhật Bản [46]; Invitrogen - Mỹ [35]… Kích thƣớc đoạn ADN thí nghiệm khác nhau, mà thang chuẩn ADN bán thị trƣờng phân thành nhiều loại, tùy thuộc số lƣợng băng, kích thƣớc băng hãng sản xuất [38, 47] Những khác biệt góp phần tạo thị trƣờng thang chuẩn đa dạng phong phú (Hình 3) Các thang chuẩn có mặt thị trƣờng thƣờng gồm băng khoảng từ bp đến 50.000 bp [43, 44] Hình Một số thang chuẩn ADN thƣơng mại bán thị trƣờng [33, 34] 1.1.3.2 Tiềm sản xuất thang chuẩn ADN Việt Nam Sự phát triển phòng thí nghiệm sinh học phân tử Việt Nam góp phần làm tăng nhu cầu sử dụng thang chuẩn ADN Tuy nhiên, chƣa có sở nƣớc đăng ký cung ứng sản phẩm Thang chuẩn phải nhập từ hãng sản xuất lớn giới với giá thành cao, phụ thuộc thời gian đóng gói vận chuyển ảnh hƣởng đến tính chủ động thí nghiệm nguồn cung cấp Trong năm gần đây, đƣợc biết Viện Vi sinh vật Công nghệ Sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội thực đề tài thiết kế thang chuẩn [2, 6] Tại Phòng thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội sản xuất thành công thang chuẩn ADN 4,6 kb với bƣớc nhảy 500 bp trình dùng thử [1] Tuy nhiên, sản phẩm thang chuẩn chƣa đƣợc thƣơng mại hóa Chính vậy, thang chuẩn Việt Nam có nhu cầu sử dụng lớn, nhƣng chƣa có góp mặt nhà sản xuất nƣớc 1.1.3.3 Phương pháp sản xuất thang chuẩn ADN Thang chuẩn ADN sản phẩm mang tính chất thƣơng mại Vì vậy, mặt hàng đƣợc bán rộng rãi thị trƣờng nhƣng kỹ thuật liên quan đến thiết kế sản xuất lại không đƣợc công bố Do đó, khó để có đƣợc tài liệu tham khảo quy trình sản xuất thang chuẩn ADN Từ tài liệu hoi mà tổng hợp đƣợc cho thấy có bốn phƣơng pháp chủ yếu đƣợc áp dụng để thiết kế thang chuẩn ADN với ƣu nhƣợc điểm riêng [1, 2] o Phương pháp hóa tổng hợp Oligonucleotide polymer ngắn acid nucleic, thông thƣờng dài khoảng 50 base trở xuống Mặc dù oligonucleotide đƣợc tạo cách cắt liên kết phân tử dài, nhƣng chúng thƣờng đƣợc tổng hợp với trình tự đặc hiệu từ nucleoside phosphoramidite [30] Các oligonucleotide đƣợc sử dụng nhiều nghiên cứu khác di truyền học phân tử, chẳng hạn nhƣ: sử dụng làm mồi phản ứng PCR; dùng làm mẫu dò phƣơng pháp lai phân tử; nghiên cứu tạo đột biến điểm xác định vị trí hay giải mã trình tự ADN [5] Phản ứng kéo dài chuỗi oligonucleotide diễn việc gắn thêm tiền chất nucleotide vào phía đầu 5’, nhƣ ngƣợc chiều với phản ứng kéo dài chuỗi ADN sử dụng enzyme ADN polymerase [4] Phƣơng pháp tổng hợp hóa học sử dụng thiết bị đại, dễ thực hiện, nhanh chóng tổng hợp đƣợc trình tự ADN ngắn với độ tinh xác cao (thông thƣờng đạt độ xác cao tiến hành tổng hợp phân tử ADN mạch đơn có độ dài tới 30 nucleotide [15]) Tuy nhiên, mặt hạn chế phƣơng pháp khó tổng hợp đƣợc trình tự dài 100 nucleotide mà đảm bảo đƣợc số lƣợng chất lƣợng mong muốn Máy móc hóa chất tổng hợp có giá thành cao, thang chuẩn tạo phải qua bƣớc tạo cặp bổ sung để chuyển ADN sợi đơn thành dạng sợi kép Do đó, phƣơng pháp thƣờng áp dụng để tạo thang chuẩn có kích thƣớc nhỏ, nhƣ thang chuẩn bp hay 10 bp với nhu cầu sử dụng không cao (Hình 4) [1] Hình Ảnh ADN ladder bp (Fermentas) điện di agarose 5% gel polyacrylamide 10% [33] o Phương pháp áp dụng kỹ thuật PCR Một phƣơng pháp nhân dòng gen in vitro đơn giản, hiệu quả, đƣợc sử dụng phổ biến hầu hết phòng thí nghiệm sinh học phân tử phản ứng chuỗi trùng hợp - PCR (polymerase chain reaction) Kỹ thuật đƣợc Kary Mullis tìm vào năm 1983, nhờ việc khuếch đại đoạn ADN mong muốn trở nên dễ dàng, nhanh chóng xác [8] Kỹ thuật đƣợc sử dụng để phát trình tự nucleotide đặc hiệu mẫu sinh học, thu nhận số lƣợng lớn đoạn ADN đích cho trình nhân dòng, phân đoạn kết thúc dideoxynucleotide phƣơng pháp giải trình tự, hay lắp ráp gen tổng hợp Một phản ứng PCR đặc trƣng bao gồm nhiều chu kỳ, chu kỳ gồm ba bƣớc [15]: - Bƣớc biến tính: ADN khuôn dạng sợi đôi đƣợc biến tính nhiệt độ để tách thành hai sợi đơn [3] - Bƣớc hồi tính: Nhiệt độ hỗn hợp phản ứng đƣợc làm nguội dần xuống, cho phép mồi liên kết bắt cặp bổ sung với hai sợi đơn ADN khuôn - Bƣớc tổng hợp: Nhiệt độ hỗn hợp phản ứng đƣợc tăng lên đến nhiệt độ tối ƣu cho hoạt động enzyme ADN polymerase Quá trình tổng hợp ADN đƣợc diễn theo chiều từ 3’ đến 5’ (Hình 5) [4, 8] Hình Kéo dài mồi Taq ADN polymerase Mồi đƣợc gắn vào trình tự bổ sung sợi khuôn Taq ADN polymerase kéo dài mồi cách gắn xác deoxynucleotide (dNTP) theo nguyên tắc bắt cặp bổ sung với sợi ADN khuôn, trình tổng hợp diễn theo chiều 3’ - 5’ Các ADN polymerase bền nhiệt sử dụng phản ứng PCR đƣợc tách chiết từ số loại vi khuẩn chịu nhiệt nhƣ Sulfolobus solfataricus, Bacillus steriotherphilus, Pyrococus fumaricus Tuy nhiên loại enzyme sử dụng phổ biến Taq ADN polymerase đƣợc tách chiết từ loại vi khuẩn suối nƣớc nóng Thermus aquaticus [8, 23] Các mồi đƣợc thiết kế phải tuân thủ số nguyên tắc sau: (1) Có tỷ lệ GC chiếm từ 40 - 75%, khoảng cách hai mồi thƣờng không dài kb, mồi không đƣợc tạo cấu trúc bậc hai liên kết nucleotide mồi [3] Nhiệt độ gắn mồi (Tm) đóng vai trò quan trọng phản ứng PCR Dựa trình tự biết phân tử ADN kích thƣớc lớn, cặp mồi khác đƣợc thiết kế tùy thuộc kích thƣớc băng, số lƣợng băng bƣớc nhảy băng ADN thang chuẩn sản xuất Thông qua phản ứng PCR hay Multiplex PCR sử dụng cặp mồi khuếch đại đoạn ADN kích thƣớc mong muốn Các đoạn ADN đƣợc tinh phối trộn theo tỷ lệ nồng độ định tạo thang chuẩn ADN Loại thang chuẩn có kích thƣớc băng bƣớc nhảy mong muốn, phƣơng pháp thực đơn giản, dễ ứng dụng điều kiện nhiều phòng thí nghiệm Tuy nhiên, mặt hạn chế phƣơng pháp hóa chất kèm có giá thành cao, băng thang chuẩn thƣờng không rõ nét [1, 7] o Phương pháp sử dụng enzyme cắt giới hạn Các endonuclease hay enzyme cắt giới hạn phần hệ thống cải biến giới hạn (restriction modification - RM đƣợc sử dụng vi khuẩn số sinh vật nhân sơ khác để bảo vệ chúng khỏi ADN ngoại lai) [27] Các enzyme nhận biết trình tự đặc hiệu phân tử ADN cắt đối xứng liên kết phosphodieste sợi vị trí nhận biết Đồng thời đóng vai trò quan trọng việc bảo vệ tế bào vi khuẩn chống lại xâm nhiễm virus (bacteriophage) [13, 15] Dựa vào cấu tạo nhu cầu cofactor mà enzyme cắt giới hạn đƣợc phân chia thành ba loại khác type I, II III [32, 39] Trong đó, enzyme có vị trí cắt trình tự nhận biết đặc hiệu gọi enzyme cắt giới hạn type II Đây nhóm enzyme cắt giới hạn đƣợc sử dụng phổ biến nghiên cứu sinh học phân tử [18] Các enzyme cắt giới hạn type II đóng vai trò quan trọng quy trình nhân dòng gen Khi mẫu ADN đƣợc xử lý với enzyme điều kiện, thành phần phản ứng không đổi tạo tổ hợp đoạn ADN lần cắt khác Do đó, enzyme cắt giới hạn type II trở thành 10 Hình 18 Điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 1000 bp bốn độ pha loãng khuôn ADN agarose 1% L: ADN ladder 500 bp; 1: Khuôn pha loãng 10-4; 2: Khuôn pha loãng 10-3; 3: Khuôn pha loãng 10-2; 4: Khuôn pha loãng 10-1; 5: Đối chứng âm Ảnh điện di Hình 18 cho thấy sản phẩm khuếch đại đoạn 1000 bp có nhiều băng phụ Phản ứng PCR đƣợc tăng nhiệt độ gắn mồi lên 660C với độ pha loãng khuôn ADN: 10-1; 10-2; 10-3; 10-4; 10-5; 10-6 lần Thành phần điều kiện phản ứng đƣợc thiết lập nhƣ sau: Thành phần phản ứng H2O Đệm Taq ADN polymerase 10X MgCl2 (25 mM) dNTP mix (2 mM loại) Taq ADN polymerase (1 u/µl ) Mồi pJET1.2-800-F (10 µM) Mồi pJET1.2-800-R (10 µM) ADN Tổng thể tích Thể tích (µl) 10,6 1,5 0,3 0,5 0,5 0,3 0,3 1,0 15,0 Điều kiện - Biến tính 940C phút giai đoạn đầu - Chu trình lặp lại 40 lần: o Biến tính 940C 30 giây o Gắn mồi 660C 30 giây o Tổng hợp 720C 60 giây - Tổng hợp 720C phút giai đoạn sau Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra agarose 1% (Hình 19) 39 Hình 19 Kết điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 1000 bp nhiệt độ gắn mồi 660C sử dụng độ pha loãng khuôn ADN L: ADN ladder 500 bp; 1: Khuôn pha loãng 10-1; 2: Khuôn pha loãng 10-2; 3: Khuôn pha loãng 10-3; 4: Khuôn pha loãng 10-4; 5: Khuôn pha loãng 10-5; 6: Khuôn pha loãng 10-6; 7: Đối chứng âm Từ ảnh điện di nhận thấy độ pha loãng 10-6 tƣơng ứng với nồng độ ADN khoảng pg/µl (6), nhiệt độ gắn mồi 660C hoàn toàn tối ƣu Sản phẩm PCR mang tính đặc hiệu cao, hoàn toàn băng phụ, băng 1000 bp sáng rõ Nhƣ vậy, chuẩn hóa đƣợc điều kiện PCR tối ƣu, với thành phần phản ứng đƣợc trình bày cụ thể nhƣ sau: Thành phần phản ứng H2 O Đệm Taq ADN polymerase 10X MgCl2 (25 mM) dNTP mix (2 mM loại) Taq ADN polymerase (1 u/µl ) Mồi pJET-800-F (10 µM) Mồi pJET-800-R (10 µM) ADN Tổng thể tích Thể tích (µl) 10,6 1,5 0,3 0,5 0,5 0,3 0,3 1,0 15,0 Điều kiện - Biến tính 940C phút giai đoạn đầu - Chu trình lặp lại 40 lần: o Biến tính 940C 30 giây o Gắn mồi 660C 30 giây o Tổng hợp 720C 60 giây - Tổng hợp 720C phút giai đoạn sau Sản phẩm PCR đƣợc điện di agarose 1% (Hình 20) 40 Hình 20 Kết điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 1000 bp sử dụng cặp mồi pJET-800-F/R với khuôn plasmid pJET1.2-8×100-2 agarose 1% L: ADN ladder 500 bp; 1: Sản phẩm PCR; 2: Đối chứng âm Nhƣ khuếch đại thành công lƣợng lớn đoạn ADN kích thƣớc 1000 bp Sản phẩm PCR đƣợc tinh theo kít QIAGEN [20] loại bỏ dimer thành phần khác, sau đƣợc cắt không hoàn toàn tạo thang chuẩn 100 bp 3.4.2 Phản ứng cắt không hoàn toàn đoạn 1000 bp Đoạn ADN kích thƣớc 1000 bp sau tinh qua cột đƣợc xác định nồng độ thích hợp cho phản ứng cắt không hoàn toàn enzyme HpaII Phản ứng đƣợc thực nồng độ ADN thời gian ủ khác nhau, để tìm thành phần điều kiện tối ƣu cho phản ứng cắt không hoàn toàn đoạn 1000 bp tạo thang chuẩn 100 bp o Chuẩn thời gian cắt Trƣớc tiên tiến hành tìm thời gian thực phản ứng cắt không hoàn toàn đoạn 1000 bp cho sản phẩm có đủ 10 băng ADN kích thƣớc từ 100 bp đến 1000 bp Dựa vào nồng độ đoạn ADN ADN ladder 100 bp Takara New England Biolab, ƣớc tính băng ADN thang chuẩn sản xuất có nồng độ 15 ng, nồng độ ADN đƣợc chọn ban đầu 150 ng Hỗn hợp phản ứng đƣợc thiết lập với thành phần gồm: 41 Đệm 10X 1,5 µl ADN kích thƣớc 1000 bp 3,0 µl (150 ng) HpaII 10 u/µl 0,05 µl Thêm nƣớc để có tổng thể tích 15,0 µl Phản ứng đƣợc diễn 370C ba thời gian: phút, phút phút, enzyme sau bị bất hoạt 700C, 10 phút Sản phẩm đƣợc điện di gel polyacrylamide 6% (Hình 21) Hình 21 Ảnh điện di sản phẩm cắt không hoàn toàn đoạn 1000 bp enzyme HpaII gel polyacrylamide 6% thời gian phản ứng khác 1: Phản ứng cắt phút; 2: Phản ứng cắt phút; 3: Phản ứng cắt phút; L: ADN ladder 100 bp Hình 21 cho thấy thời điểm phút (1), đoạn ADN kích thƣớc lớn chƣa đƣợc cắt nhiều, đoạn ADN kích thƣớc nhỏ mờ Tại thời điểm phút (3), đoạn ADN lớn tham gia hoàn toàn vào phản ứng cắt, băng ADN kích thƣớc nhỏ rõ nét, nhƣng băng ADN kích thƣớc lớn 600 bp hầu nhƣ quan sát Thời gian diễn phản ứng cắt phút (2) điều kiện thích hợp để quan sát đƣợc băng ADN kích thƣớc từ 100 bp đến 1000 bp 42 o Chuẩn nồng độ ADN Nồng độ ADN 150 ng đƣợc sử dụng phản ứng cắt cho băng sáng, định lặp lại phản ứng sử dụng bốn nồng độ ADN khác nhau: 50 ng (1,0 µl); 100 ng (2,0 µl); 150 ng (3,0 µl); 250 ng (5,0 µl) với mong muốn chọn đƣợc nồng độ ADN nhất, nhƣng sản phẩm cắt lại cho băng sáng rõ nét Phản ứng diễn 370C, phút bất hoạt enzyme 700C, 10 phút Thành phần phản ứng trình bày Bảng Bảng Thành phần phản ứng cắt không hoàn toàn đoạn 1000 bp HpaII nồng độ ADN Đệm 10X 1,5 µl 1,0 µl (50 ng) 2,0 µl (100 ng) ADN kích thƣớc 1000 bp 3,0 µl (150 ng) 5,0 µl (250 ng) HpaII 10 u/µl 0,05 µl Thêm nƣớc để có tổng thể tích 15,0 µl Sản phẩm cắt đƣợc điện di gel polyacrylamide 6% (Hình 22) 43 Hình 22 Điện di sản phẩm cắt không hoàn toàn đoạn 1000 bp HpaII nồng độ ADN khác gel polyacrylamide 6% L: ADN ladder 100 bp; 1: Nồng độ ADN 250 ng; 2: Nồng độ ADN 150 ng; 3: Nồng độ ADN 100 ng; 4: Nồng độ ADN 50 ng Từ nồng độ 150 ng (2) trở lên quan sát rõ băng ADN hỗn hợp sản phẩm cắt Để đảm bảo độ nét băng ADN thang chuẩn sản xuất, định chọn nồng độ ADN 200 ng cho phản ứng cắt o Điều kiện cắt tối ưu Chúng thiết lập đƣợc thành phần điều kiện phản ứng cắt tối ƣu đoạn ADN 1000 bp enzyme HpaII nhƣ sau: Đệm 10X 1,5 µl ADN kích thƣớc 1000 bp 4,0 µl (200 ng) HpaII 10 u/µl 0,05 µl Thêm nƣớc để có tổng thể tích 15,0 µl Phản ứng diễn 370C, phút sau đƣợc bất hoạt 700C, 10 phút Kết đƣợc điện di kiểm tra gel polyacrylamide 6% (Hình 23) 44 Hình 23 Ảnh điện di sản phẩm phản ứng cắt không hoàn toàn đoạn 1000 bp HpaII gel polyacrylamide 6% 1: Sản phẩm phản ứng cắt không hoàn toàn đoạn 1000 bp HpaII; L: ADN ladder 100 bp Từ ảnh điện di cho thấy băng ADN sản phẩm cắt không rõ nét có chênh lệch đáng kể kích thƣớc băng so với thang chuẩn thƣơng mại Hiện tƣợng sản phẩm phản ứng cắt đƣợc điện di mà chƣa tinh loại muối thành phần khác Để thu đƣợc thang chuẩn 100 bp hoàn chỉnh, sản phẩm cắt phải đƣợc qua bƣớc tinh loại hoàn toàn thành phần phản ứng 3.4.3 Tinh sản phẩm cắt tạo thang chuẩn ADN SY - 100 Sản phẩm cắt không hoàn toàn đoạn 1000 bp HpaII sau tinh (kít Qiagen [20]) tạo thang chuẩn ADN kí hiệu SY - 100 Sản phẩm thang chuẩn ADN SY - 100 đƣợc điện di gel polyacrylamide 6% Kết thể Hình 24 45 Hình 24 Ảnh điện di thang chuẩn ADN SY - 100 sau tinh gel polyacrylamide 6% 1: Thang chuẩn ADN SY - 100 tinh sạch; L: ADN ladder 100 bp Kết điện di chứng minh cần loại bỏ thành phần có phản ứng cắt để băng ADN điện di với kích thƣớc chúng Chúng thiết kế thành công thang chuẩn ADN SY - 100 gồm tổ hợp 18 băng ADN đƣợc trình bày Bảng Bảng Tổ hợp băng thang chuẩn ADN SY - 100 Enzyme HpaII Trình tự cắt CˇCGG Các băng thang chuẩn (bp) 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 Tổ hợp băng (bp) 106 203 305 395 499 596 698 802 907 1009 107 211 315 604 700 805 909 708 Sự chênh lệch lớn băng kích thƣớc 10 nucleotide, chênh lệch quan sát đƣợc điện di nồng độ gel thích hợp cho 46 thang chuẩn 100 bp: gel agarose 1,7% đến 2,5%; gel polyacrylamide 4% đến 8% [33, 45] (Hình 25) Hình 25 Ảnh điện di 200 ng thang chuẩn ADN SY - 100 (1) 125 ng ADN ladder 100 bp Takara (L) bốn nồng độ gel khác A: Agarose 1,7%; B: Agarose 2,5%; C: Polyacrylamide 4%; D: Polyacrylamide 8% Thang chuẩn 100 bp mà thiết kế kết hợp phƣơng pháp ADN tái tổ hợp phƣơng pháp PCR Áp dụng phản ứng PCR, Multiplex PCR sản xuất thang chuẩn 100 bp, thƣờng phải sử dụng tới 10 cặp mồi khác để khuếch đại 10 đoạn ADN với kích thƣớc từ 100 bp đến 1000 bp, sau tinh sạch, xác định tỷ lệ nồng độ để phối trộn tạo thang chuẩn hoàn chỉnh [7, 24] Trong nghiên cứu này, đoạn 1000 bp đƣợc khuếch đại cặp mồi sử dụng khuôn ADN vector tái tổ hợp, sau tinh đƣợc cắt không hoàn toàn enzyme cắt giới hạn tạo thang chuẩn ADN 100 bp Do rút gọn đƣợc thao tác thí nghiệm, hóa chất tiêu hao, chủ động đƣợc nguyên liệu đóng vai trò quan trọng việc hạ giá thành sản phẩm 47 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Từ nghiên cứu trên, đƣa số kết luận nhƣ sau: Tạo vector tái tổ hợp pJET1.2-8×100 mang đoạn ADN 827 bp Thiết kế thành công cặp mồi pJET-800-F/R khuếch đại đoạn 1009 bp Chuẩn hóa thành công thành phần, điều kiện phản ứng khuếch đại cắt không hoàn toàn đoạn 1009 bp enzyme HpaII Thiết kế thành công thang chuẩn ADN SY - 100 gồm tổ hợp băng: 106 bp/107 bp; 203 bp/211 bp; 305 bp/315 bp; 395 bp; 499 bp; 596 bp/604 bp; 698 bp/700 bp/708 bp; 802 bp/805 bp; 907 bp/909 bp; 1009 bp KIẾN NGHỊ Gửi thang chuẩn sản xuất tới số phòng thí nghiệm sinh học phân tử nƣớc để kiểm định chất lƣợng Chuẩn hóa quy trình sản xuất thang chuẩn 100 bp quy mô pilot 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tiếng Việt Phạm Anh Thùy Dƣơng (2008), Nghiên cứu thiết kế thang chuẩn ADN chất lượng cao, Luận văn thạc sĩ khoa học, Đại học Quốc gia Hà Nội, Trƣờng đại học Khoa học Tự nhiên, Hà Nội Dƣơng Văn Hợp (2005), Nghiên cứu ứng dụng quy trình sản xuất số chế phẩm chuyên dụng chất lượng cao dùng cho nghiên cứu sinh học phân tử, Báo cáo tổng kết Khoa học Kỹ thuật, Trung tâm Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội Võ Thị Thƣơng Lan (2007), Một số vấn đề sinh học phân tử, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, Hà Nội Đinh Đoàn Long, Đỗ Lê Thăng (2008), Cơ sở di truyền học phân tử tế bào, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, Hà Nội Phạm Hùng Vân (2008), PCR real-time PCR vấn đề áp dụng thường gặp, NXB Y Học, Thành phố Hồ Chí Minh Hoàng Văn Vinh (2007), Nghiên cứu thiết kế thang chuẩn ADN phương pháp tái tổ hợp, Luận văn Thạc sĩ Khoa học, Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật, Hà Nội II Tiếng Anh Abdel-fattah Y.R, Gaballa A.A, Berekkaa M.M (2007), “Methods for Preparation of DNA Ladder using PCR and Its Optimization by Numerical Modeling Thereof”, World Intellectual Property Organization, WO/2007/016929 Bartlett J M S., Stirling D (2003), Methods in Molecular Biology, Vol 226: PCR Protocols, Second Edition, Humana Press Bioneer Corporation (2007), AccuPrep® Gel Purification Kit 10 Bioneer Corporation (2007), AccuPrep® PCR Purification Kit 49 11 Cranenburgh R M (2004), “An equation for calculating the volumetric ratios required in a ligation reaction”, Applied Genetics and Molecular Biotechnology, 65(10), pp 200-202 12 Fermentas (2006), Clone JETTM PCR Cloning Kit 13 Fermentas (2010-2011), FastDigest® & Conventional Restriction Enzymes 14 Fermentas (2006), Gene JETTM PCR Cloning Kit procedure 15 Glick B R., Pasternak J J (2003), Molecular Biotechnology, Third Edition, American Society for Microbiology, Washington, DC 20036-2904 16 Hu A W., Hartley J L., Jordan H J., Acid nucleic ladders, Patent No 6924098B2, US Patent Issued on January 25, 2007 17 Hyman E D., Method of making DNA ladders, Patent No 5939293, US Patent Issued on August 17, 1999 18 Pingoud A., Jeltsch A (1997), “Recognition ang cleavage of DNA by typ-II restriction endonucleases”, Eur J Biochem, 246, pp.1-22 19 QIAGEN (2006), QIAprep® Miniprep Hand book 20 QIAGEN (2008), QIAquick® PCR Purification Kit (50) 21 Sambrook J., Russell D W (2001), Molecular Cloning, Third Edition, Volume Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York 22 Sambrook J., Russell D W (2001), Molecular Cloning, Third Edition, Volume Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York 23 Sambrook J., Russell D W (2001), Molecular Cloning, Third Edition, Volume 3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York 24 Wang T., Guo L., Zhang J (2010), “Preparation of DNA Ladder Based on Multiplex PCR Technique”, Journal of Nucleic Acids, vol 2010, pp 1-3 III Trang Web 25 http://ecoliwiki.net/colipedia/index.php/DH5_alpha 26 http://en.wikipedia.org/wiki/DNA_ladder 50 27 http://en.wikipedia.org/wiki/Restriction_enzyme 28 http://en.wikipedia.org/wiki/Agarose_gel_electrophoresis 29 http://en.wikipedia.org/wiki/Gel_electrophoresis 30 http://en.wikipedia.org/wiki/Oligonucleotide 31 http://openwetware.org/wiki/E._coli_genotypes#BL21 32 http://www.ebi.ac.uk/interpro/IPR0069355restriction endonuclease, type I, R subunit/Type III, Res subunit 33 http://www.fermentas.com 34 http://www.fermentas.com/en/products/all/dna-electrophoresis 35 http://www.invitrogen.com 36 http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-andServices/Applications/Nucleic-Acid-Purification-and-Analysis/Nucleic-Acid-GelElectrophoresis/Agarose-Gel-Electrophoresis/Nuclei Acid Ladder-E-Gel® Systems & Pre-Cast Gels/DNA ladders 37 http://www.lablife.org 38 http://www.molecularstation.com/agarose-gel-electrophoresis 39 http://www.molecular-plant-biotechnology.info/recombinant-DNAtechnology/types-of-restriction-endonucleases 40 http://www.neb.com 41 http://www.neb.com/nebecomm/tech_reference/markers_ladders/ DNA_markers.asp 42 http://www.neb.com/nebecomm/tech_reference/markers_ladders/ ladder_marker_selection_chart.asp 43 http://www.promega.com/catalog/catalogproducts.asp 44 http://www.roche-appied-science.com/productcatalog 45 http://www.takara.com 51 46 http://www.takara.com.cn/markers/DNA maker 47 http://www.uoftmedstore.com 52 53 [...]... xut thang chun ADN [15] Thang chun loi ny ch yu s dng cỏc phõn t ADN kớch thc ln cú sn trong t nhiờn, thao tỏc n gin d thc hin, giỏ thnh r Tuy nhiờn chớnh vic s dng cỏc phõn t ADN cú sn trong t nhiờn li tr thnh mt nhc im ln ca phng phỏp ny, vỡ v trớ nhn bit ca enzyme ct gii hn l ngu nhiờn, nờn cỏc bng ca thang chun loi ny cú bc nhy khụng xỏc nh [16] o K thut ADN tỏi t hp ADN tỏi t hp l phõn t ADN c... Roche - Thy S; Promega - M ADN ladder 100 bp ca tng hóng sn xut li cú s lng bng v giỏ thnh sn phm khỏc nhau (Hỡnh 6 A, Bng 2) Mt s hóng thng mi cũn kt hp s dng ADN ladder 100 bp vi loi thang chun ADN khỏc (ADN ladder 500 bp; High Range ADN ladder,), nhm tng di kớch thc bng ADN cng nh tng tớnh ng dng ca loi sn phm ny (Hỡnh 6 B) [33, 36] Chớnh nhng iu ú ó gúp phn to ra mt th trng thang chun 100 bp a dng... on sau cựng 2.3.5 Xỏc nh nng ADN bng mỏy o quang ph Nng v tinh sch ca ADN trong cỏc thớ nghim c xỏc nh bng quang ph k, vi hp th bc súng 260 nm (l hp th ca ADN) v 280 nm (l hp th ca protein) Nng ADN c tớnh theo cụng thc: [ADN ] = A260 ì n ì 50 (àg/ml) 21 Trong ú: A260 : hp th ca ADN bc súng 260 nm n : s ln pha loóng mu 50 àg/ml : nng ADN si ụi ng vi A260 = 1 ADN t tinh sch khi t l A260/A280... trong thang chun õy l phng phỏp c ỏp dng nhiu nht trong sn xut thang chun ti cỏc trung tõm sn xut ch phm sinh hc ln hin nay [6] Cng chớnh t nhng u im ca phng phỏp ADN tỏi t hp cú th khc phc nhng nhc im ca phng phỏp PCR, chỳng tụi ó kt hp hai phng 11 phỏp ny mt cỏch linh hot trong nghiờn cu ca mỡnh vi mc tiờu thit k thang chun ADN 100 bp 1.1.3.4 Nhng thun li v khú khn trong sn xut thang chun ADN bc... thut ADN tỏi t hp [17] Giỏ thnh ADN ladder 100 bp thng mi tng i cao [7, 24] Ti phũng thớ nghim ca chỳng tụi thang chun ADN 100 bp cú nhu cu s dng hng ngy Chỳng tụi t mua thang chun t nc ngoi nờn khụng ch ng c ngun cung cp, ph thuc thi gian vn chuyn, giỏ thnh cao do phi chu thờm thu nhp khu v chi phớ vn chuyn Xut phỏt t nhu cu s dng v nhng khú khn khi t hng chỳng tụi tin hnh ti Thit k thang chun ADN. .. thun li v khú khn trong sn xut thang chun ADN bc nhy nh o Thun li Thang chun 5 bp n khụng quỏ 200 bp l nhng thang chun ADN bc nhy nh, vi di bng ADN ph bin trong khong t 5 bp n 4000 bp d dng s dng trong nhiu mc ớch thớ nghim khỏc nhau nh: nghiờn cu cỏc on ADN kớch thc bộ (ADN satellite, ); kim tra sn phm phn ng PCR; kim tra sn phm phn ng ct ADN bng enzyme gii hn; kim tra kớch thc on chốn trong nhõn dũng;... nhúm thang chun ny cú th thy õy l b sn phm c nhiu cụng ty u t sn xut, cung ng vi tim nng kinh t cao [43, 44] o Khú khn Sn xut thang chun bc nhy nh hu ht ỏp dng phng phỏp húa tng hp cho cỏc on ADN cú kớch thc khụng quỏ 100 bp [4] v phng phỏp PCR cho cỏc on ADN kớch thc ln hn [7, 24] Cỏc on ADN kớch thc mong mun sau khi c tng hp, phi tri qua bc tinh sch, xỏc nh nng v phi trn theo t l xỏc nh to thang. .. Miniprep Handbook [19] 2.3.2 K thut ni cỏc on ADN Mt phn ng ni cỏc on ADN thng din ra trong tng th tớch t 10 - 20 àl 40C n 370C, s dng enzyme T4 ADN ligase, dung dch m cha Mg2+ v ATP [11, 14] T4 ADN ligase tham gia xỳc tỏc hỡnh thnh liờn kt phosphodiester gia cỏc u tn cựng (cú th l u bng hoc u so le) ca cỏc on ADN [11] Trong nghiờn cu ca chỳng tụi, on ADN kớch thc 108 bp khuch i t phn ng PCR s dng... 500 bp (Fermentas) [33] 1.2.2 Sn xut ADN ladder 100 bp ADN ladder 100 bp thng mi hin bỏn trờn th trng thng gm di bng kớch thc rng, bc nhy gia hai bng k tip l 100 bp giỳp thang chun ADN loi ny c s dng rng rói trong nhiu nghiờn cu khỏc nhau ADN ladder 100 bp c u t, sn xut v cung ng bi nhiu hóng sn xut trờn th gii [37, 47] T nhng ti liu m chỳng tụi cú c cho thy hu ht thang chun loi ny c sn xut nh ỏp dng... phõn t ADN trờn gel sau khi in di [3, 28] Do in tớch õm ca khung phosphate (phosphate backbone), cỏc on ADN dch chuyn t in cc õm sang cc dng (qua cỏc l gel trong phng phỏp in di trờn gel) Cỏc on ADN kớch thc nh cú th d dng di chuyn qua cỏc l gel vỡ vy dch chuyn ti cc dng nhanh hn cỏc on ADN kớch thc ln [16] 23 CHNG 3 KT QU V THO LUN 3.1 KHUCH I V TO ON ADN Cể KCH THC 100 bp 3.1.1 Khuch i on ADN bng ... LIU 1.1 THANG CHUN ADN 1.1.1 Thang chun ADN o nh ngha thang chun ADN Thang chun ADN c nh ngha l mt hn hp cỏc phõn t ADN cú kớch thc khỏc nhau, c s dng in di nhm ỏnh giỏ kớch thc v nng on ADN cha... loi thang chun ADN Cú nhiu cỏch gi tờn v phõn chia cỏc nhúm thang chun ADN khỏc nh: da trờn bc nhy ca thang chun (thang chun ADN bp, 10 bp, hay 50 bp,); da vo k thut sn xut (thang chun PCR, thang. .. sỏnh gia cỏc bng ADN mu vi cỏc bng ADN thang chun cho phộp c tớnh kớch thc v nng cỏc on ADN cha bit [16] thang chun cú th thc hin vai trũ quan trng ny thỡ mi bng thang chun ADN thng mi luụn