Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu phát hiện và định lượng một số đột biến của hội chứng động kinh, giật cơ với sợi cơ không đều MERRF ở người Việt Nam (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu phát hiện và định lượng một số đột biến của hội chứng động kinh, giật cơ với sợi cơ không đều MERRF ở người Việt Nam (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu phát hiện và định lượng một số đột biến của hội chứng động kinh, giật cơ với sợi cơ không đều MERRF ở người Việt Nam (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu phát hiện và định lượng một số đột biến của hội chứng động kinh, giật cơ với sợi cơ không đều MERRF ở người Việt Nam (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu phát hiện và định lượng một số đột biến của hội chứng động kinh, giật cơ với sợi cơ không đều MERRF ở người Việt Nam (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu phát hiện và định lượng một số đột biến của hội chứng động kinh, giật cơ với sợi cơ không đều MERRF ở người Việt Nam (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu phát hiện và định lượng một số đột biến của hội chứng động kinh, giật cơ với sợi cơ không đều MERRF ở người Việt Nam (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu phát hiện và định lượng một số đột biến của hội chứng động kinh, giật cơ với sợi cơ không đều MERRF ở người Việt Nam (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu phát hiện và định lượng một số đột biến của hội chứng động kinh, giật cơ với sợi cơ không đều MERRF ở người Việt Nam (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu phát hiện và định lượng một số đột biến của hội chứng động kinh, giật cơ với sợi cơ không đều MERRF ở người Việt Nam (luận văn thạc sĩ)
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Bùi Thị Khánh NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƢỢNG MỘT SỐ ĐỘT BIẾN CỦA HỘI CHỨNG ĐỘNG KINH, GIẬT CƠ VỚI SỢI CƠ KHÔNG ĐỀU – MERRF Ở NGƢỜI VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2015 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN … ………………………………………………………… ii MỤC LỤC … …………………………………………………………………… iii DANH MỤC C C K HI U VÀ CHỮ VIẾT TẮT….……………….…….vi DANH MỤC C C BẢNG viii DANH MỤC C C HÌNH……………………………………………… .Error! Bookmark not defined MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LI U 1.1 CẤU TRÚC VÀ CHỨC NĂNG CỦA TY THỂ NGƢỜI 1.1.1 Cấu trúc ty thể 1.1.2 Chức ty thể 10 1.1.2.1 Ty thể hoạt động nhà máy lượng tế bào 10 1.1.2.2 Ty thể trình lão hóa 11 1.1.2.3 Ty thể trình tự chết tế bào 13 1.1.3 Hệ gen ty thể đặc điểm di truyền hệ gen ty thể 14 1.1.3.1 Hệ gen ty thể 14 1.1.3.2 Đặc điểm di truyền hệ gen ty thể 16 1.1.3.3 Tính chất dị tế bào chất tốc độ đột biến ty thể 16 1.2 ĐỘT BIẾN GEN TY THỂ VÀ C C B NH LIÊN QUAN 17 1.2.1 Các loại đột biến gen ty thể 17 1.2.1.1 Đột biến điểm 18 1.2.1.2 Đột biến cấu trúc mtDNA 19 1.2.2 Các bệnh đột biến gen ty thể 19 1.2.2.1 Hội chứng gây đột biến điểm phổ biến gen mã hóa tRNA 21 1.2.2.2 Các hội chứng liên quan đến đột biến điểm phổ biến gen mã hóa protein 23 1.2.2.3 Các bệnh liên quan đến đột biến gen mã hóa rRNA 25 1.2.2.4 Bệnh gây nên đột biến khác mtDNA 26 1.3 HỘI CHỨNG ĐỘNG KINH, GIẬT CƠ VỚI SỢI CƠ KHÔNG ĐỀU (MERRF) 28 1.3.1 Các đột biến hội chứng MERRF 29 1.3.1.1 Đột biến A8344G 29 1.3.1.2 Đột biến T8356C 30 1.3.1.3 Đột biến G8363A 30 1.3.2 Những tác động hội chứng MERRF ngƣời bệnh 31 1.3.3 Các phƣơng pháp phát đột biến MERRF 33 1.3.3.1 Phát đột biến thuộc hội chứng MERRF PCR kết hợp với RFLP ………………………………………………………………33 1.3.3.2 Phân tích đột biến thuộc hội chứng MERRF xác định trình tự gen … …………………………… 34 1.3.3.3 Kỹ thuật đa dạng cấu hình sợi đơn SSCP (single-stranded conformational polymorphism) ……………………………………… 34 1.3.3.4 Định lượng đột biến gen ty thể phương pháp real-time PCR ……………… …………………………………………………………35 1.3.3.5 Phát đột biến DNA ty thể hệ thống cảm biến sinh học35 CHƢƠNG 2: NGUYÊN LI U VÀ PHƢƠNG PH P NGHIÊN CỨU 37 2.1 NGUYÊN LI U 37 2.1.1 Mẫu bệnh phẩm 37 2.1.2 Các hóa chất, nguyên liệu khác 37 2.2 M Y MÓC VÀ TRANG THIẾT BỊ 37 2.3 PHƢƠNG PH P NGHIÊN CỨU 38 2.3.1 Tách chiết DNA tổng số 38 2.3.2 Kiểm tra định lƣợng DNA tách chiết 38 2.3.3 Nhân đoạn gen ty thể kỹ thuật PCR 39 2.3.4 Kỹ thuật PCR kết hợp với kỹ thuật đa hình chiều dài đoạn phân cắt giới hạn (PCR-RFLP) 40 2.2.5 Điện di gel agarose 40 2.2.6 Điện di gel polyacrylamide 41 2.2.7 Kỹ thuật real-time PCR sử dụng mẫu dò huỳnh quang dạng khóa cầu axit nucleic (LNA-locked nucleic acid) 42 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 46 3.1 THU THẬP MẪU M U B NH NHÂN VÀ T CH CHIẾT DNA TỔNG SỐ 46 3.1 Một số đặc điểm mẫu phân tích 46 3.2 Tách chiết DNA tổng số mẫu 46 3.2 SÀNG LỌC C C ĐỘT BIẾN GEN THUỘC HỘI CHỨNG MERRF Ở NGƢỜI VI T NAM BẰNG PHƢƠNG PH P PCR-RFLP 47 3.2.1 Sàng lọc đột biến A8344G 47 3.2.1.1 Nhân đoạn gen từ 8155 - 8366 PCR 47 3.2.1.2 Phân tích có mặt đột biến A8344G PCR-RFLP 48 3.2.2 Sàng lọc đột biến T8356C 50 3.2.1.1 Nhân đoạn gen từ 8166 - 8358 PCR 50 3.2.2.2 Phân tích có mặt đột biến T8356C PCR-RFLP 51 3.2.3 Sàng lọc đột biến G8363A 52 3.2.1.1 Nhân đoạn gen từ 8342 - 8582 52 3.2.2.2 Phân tích có mặt đột biến G8363A PCR-RFLP 54 3.3 XÂY DỰNG ĐƢỜNG CHUẨN ĐỂ ĐỊNH LƢỢNG ĐỘT BIẾN A8344G BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR 56 3.3.1 Thiết kế mẫu dò huỳnh quang Taqman LNA 56 3.3.1.1 Thiết kế mẫu dò huỳnh quang Taqman LNA 56 3.3.1.2 Đánh giá tính đặc hiệu mẫu dò đột biến A8344G 58 3.3.2 Xây dựng đƣờng chuẩn đánh giá độ tin cậy phƣơng pháp realtime PCR để định lƣợng đột biến A8344G 60 3.3.2.1 Định lượng số plasmid mang đoạn gen đột biến không đột biến A8344G 60 3.3.2 Kết xây dựng đường chuẩn đột biến A8344G 60 3.2.4 Thử nghiệm khả phát định lƣợng đột biến A8344G 64 3.4 SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN GEN THUỘC HỘI CHỨNG MERRF BẰNG PHƢƠNG PH P GIẢI TRÌNH TỰ TRỰC TIẾP 65 3.4.1 Kết giải trình tự vùng gen mang đột biến MERRF 8155-9292 hệ gen ty thể 65 KẾT LUẬN 67 TÀI LI U THAM KHẢO 68 PHỤ LỤC ………………………………………………………………………… 79 MỞ ĐẦU Trong hầu hết tế bào, ty thể bào quan quan trọng đảm nhiệm chức cung cấp lƣợng dƣới dạng ATP cho hoạt động tế bào Ty thể sản xuất lƣợng cách oxy hóa hoàn toàn hợp chất trung gian trình chuyển hóa thức ăn thể tạo thành sản phẩm cuối H 2O, CO2, lƣợng dƣới dạng ATP Ty thể có hệ gen riêng, nhân độc lập với hệ gen nhân DNA ty thể ngƣời tồn dạng mạch vòng kép, có kích thƣớc 16.569 bp, với 37 gen, mã hóa cho RNA ribosome, 22 RNA vận chuyển 13 protein thành phần cần thiết phức hợp chuỗi hô hấp DNA ty thể dễ bị tổn thƣơng ty thể môi trƣờng giàu dạng oxy phản ứng thiếu chế sửa chữa hiệu dẫn đến nhiều đột biến xuất hệ gen ty thể Hầu hết hoạt động tế bào dựa vào nguồn lƣợng ổn định ty thể cung cấp, sai hỏng DNA ty thể gây rối loạn đa hệ thống ảnh hƣởng đến nhiều tế bào, mô tổ chức khác Năm 1988, Wallace tập thể công bố đột biến điểm hệ gen ty thể ngƣời gây bệnh liên quan đến thần kinh thị giác di truyền theo Leber (Leber’s hereditary optic neuropathy - LHON) Cho đến nay, 300 đột biến khác hệ gen ty thể ngƣời đƣợc xác định, có 250 đột biến có khả gây bệnh kèm theo nhiều hội chứng khác MERRF (myoclonic epilepsy with ragged-red fibres) hội chứng động kinh giật với sợi không đều, ảnh hƣởng đến hệ thần kinh xƣơng nhƣ hệ thống khác thể, gây nên đột biến gen MT-TK DNA ty thể Ngoài ra, ngƣời mang hội chứng MERRF kèm theo động kinh, điều hòa vận động, suy nhƣợc trí nhớ Triệu chứng thƣờng khởi phát trẻ em sau giai đoạn phát triển bình thƣờng, kết hay gặp điếc, thấp bé, thoái hóa thần kinh thị giác, quan sát đƣợc u mỡ khu trú dƣới da Tế bào bất thƣờng xuất sợi màu đỏ bị xé rách nham nhở nhuộm với Gomori trichrome quan sát dƣới kính hiển vi Hiện nay, giới có nhiều công trình nghiên cứu hội chứng MERRF để xác định nguyên nhân, chế biểu bệnh nhƣ tính di truyền bệnh Tuy nhiên, tính phức tạp tác động lâm sàng, mô bệnh học, chế phát sinh biểu bệnh nên việc chẩn đoán phƣơng pháp thăm khám lâm sàng hay xét nghiệm thƣờng quy khó khăn, nhiều bệnh nhân MERRF chƣa đƣợc phát phƣơng pháp điều trị hiệu Ở Việt Nam, gần nhƣ chƣa có công trình sâu nghiên cứu phát định lƣợng đột biến MERRF ngƣời Việt Nam Nhằm góp phần vào việc chẩn đoán, điều trị tƣ vấn di truyền bệnh nhân, gia đình bệnh nhân mang hội chứng MERRF tiến hành đề tài: “Nghiên cứu phát định lượng số đột biến hội chứng động kinh, giật với sợi không - MERRF người Việt Nam“ CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CẤU TRÚC VÀ CHỨC NĂNG CỦA TY THỂ NGƢỜI 1.1.1 Cấu trúc ty thể Ty thể bào quan phổ biến đƣợc tìm thấy hầu hết tế bào nhân chuẩn Chức ty thể cung cấp lƣợng hóa học cần thiết cho hoạt động sinh tổng hợp vận động tế bào Ty thể đƣợc lần tìm thấy tế bào năm 1857 nhà giải phẫu học ngƣời Thụy Sĩ, Kollier Đến năm 1890, nhà mô học ngƣời Đức, Richard Altmann, phƣơng pháp nhuộm fuchsine quan sát đƣợc ty thể nhiều tế bào khác dƣới kính hiển vi quang học [27].Ty thể có đƣờng kính khoảng 0,5-2 µm chiều dài 7-10 µm Hình dạng số lƣợng ty thể tùy thuộc vào nhu cầu lƣợng loại tế bào khác nhau, tế bào mô xƣơng thận cần lƣợng ty thể lớn tế bào khác thể Ty thể hình cầu, hình que hay hình sợi nhƣng có cấu trúc chung giống Ty thể có khả thay đổi hình dạng, kích thƣớc, liên kết với tạo cấu trúc dài phân thành cấu trúc nhỏ Ngoài ra, ty thể có khả di chuyển để phản ứng với thay đổi sinh lý bên tế bào [35] Hình 1.1 Cấu trúc ty thể [68] Về cấu trúc, ty thể có cấu tạo dạng màng kép, gồm màng màng ngoài, bao lấy khối chất bên trong, khoảng cách hai màng đƣợc gọi xoang gian màng Cả hai màng có chất lipoprotein tƣơng tự nhƣ màng sinh chất, nhƣng có khác biệt hình dạng tính chất lý hóa chuyên trách cho việc thực chức sinh hóa chúng [35] Màng ty thể có độ dày nm, có tỷ lệ protein (P)/ lipid (L) lớn Màng ty thể chứa tỷ lệ cholesterol thấp (bằng 1/6 so với màng tế bào hồng cầu), tỷ lệ phosphatidyl choline cao gấp hai lần so với màng tế bào Màng có nhiệm vụ tiếp thu phần lớn protein sản xuất từ tế bào chất để xây dựng ty thể kiến tạo màng Đặc biệt, màng ty thể có tính bán thấm rộng với ion phân tử lớn cho phép ion di chuyển tự từ nguyên sinh chất vào xoang gian màng ngƣợc lại Màng ty thể chứa nhiều enzyme quan trọng nhƣ transferase, kinase, cytochrome-reductase, acyl CoA synthetase [35] Hình 1.2 Cấu tạo màng ty thể [67] Màng ty thể có độ dày nm, protein chiếm 80%, lipid chiếm 20%, lƣợng nhỏ cholesterol Tỷ lệ cholesterol/phospholipid 1/53 Màng ăn sâu vào chất tạo nên mào lƣợc Cấu trúc “mào” làm tăng diện tích bề mặt màng gấp ba lần so với màng điều liên quan đến chức tăng cƣờng vận chuyển điện tử tổng hợp ATP Màng chứa nhiều protein vận chuyển chủ động ATP, ADP, acid béo protein kênh vận chuyển ion Na +, K+, Ca2+ H+ Màng nơi bám phức hợp thuộc chuỗi hô hấp bao gồm chuỗi vận chuyển điện tử (phức hợp I-IV), ATP synthase (phức hợp V, gọi F 1F0-ATPase) adenine nucleotide translocase (ANT) [9] Xoang gian màng (khoảng xen kẽ hai màng) nơi trung chuyển chất hai màng, môi trƣờng tƣơng tự cân với bào tƣơng tế bào Xoang gian màng chứa nhiều ion H+ từ chất hoạt động chuỗi vận chuyển điện tử, chứa cytochrome c (Cyt c) chất mang điện tử động cho chuỗi hô hấp, giải phóng Cyt c vào bào tƣơng hoạt hóa enzyme caspase có vai trò trình chết theo chƣơng trình tế bào [32] Chất (matrix) vùng vật chất không định hình chứa nhiều cấu trúc đặc biệt Chất phức hệ protein tan nƣớc, tƣơng đối đậm đặc chứa enzyme chu trình Krebs, enzyme trình oxy hóa acid béo, acid amin máy di truyền riêng ty thể Nhƣ vậy, tế bào động vật, thực vật ngƣời hệ gen nhân, có hệ gen tế bào chất nằm ty thể Ty thể có vật chất di truyền máy riêng để tổng hợp nên RNA nhƣ protein chúng Các DNA nhiễm sắc thể mã hóa số peptide ty thể (ở ngƣời 13 loại peptide) Các peptide gắn vào lớp màng với protein khác đƣợc mã hóa nhân tế bào [32] Ty thể nhân lên theo phƣơng thức giống với tế bào vi khuẩn Khi chúng trở nên lớn, chúng bắt đầu chia đôi Quá trình xảy sau DNA ty thể đƣợc nhân đôi hoàn toàn, đƣợc thực tạo thành rãnh bên sau màng thắt lại hình thành hai ty thể Đôi ty thể đƣợc tổng hợp trung tâm giàu protein polyribosome cần thiết Tuy nhiên, nhiều ty thể không phân đôi bị phân hủy lyzosome theo chế tự tiêu (autophagy) Cơ chế giúp trì số lƣợng ty thể đặc trƣng tế bào [9] 1.1.2 Chức ty thể 1.1.2.1 Ty thể hoạt động nhà máy lượng tế bào Ty thể đóng vai trò trung tâm trình chuyển hóa lƣợng tế bào Quá trình hô hấp biến đổi hóa học trao đổi chất ty thể giúp chúng chuyển đổi lƣợng hóa học tiềm tàng hợp chất hữu tạo CO2, H2O giải phóng lƣợng vào phân tử cao ATP ATP đƣợc tạo thành từ trình phosphoryl hóa oxy hóa dựa phức hệ hô hấp (gọi chuỗi vận chuyển điện tử) nằm màng ty thể Quá trình oxy hóa tế bào sử dụng nguồn đƣơng lƣợng khử NADH FADH2 nhƣ nguồn điện tử chuỗi vận chuyển điện tử Các thành phần chuỗi vận chuyển điện tử nằm màng ty thể bao gồm bốn phức hợp I, II, III IV số chất mang điện tử Các điện tử đƣợc vận chuyển dọc theo chuỗi, ba bốn phức hợp hoạt động nhƣ máy bơm proton, đẩy proton từ chất tạo thành dòng chuyển proton Nhờ gradient proton chênh lệch điện qua màng, mà ATP đƣợc tổng hợp từ ADP Pi phức hệ F0F1 synthase, cho phép proton trở lại chất Sự kết hợp vận chuyển điện tử tổng hợp ATP hoạt động theo chế hóa thẩm Có hai giai đoạn tạo ATP ty thể, chu trình Krebs diễn chất trình phosphoryl hóa oxy hóa chuỗi vận chuyển điện tử nằm màng ty thể với xúc tác phức hệ enzyme [23] Nguồn tạo lƣợng ty thể carbohydrate, chất béo protein đƣợc lấy từ thức ăn, chủ yếu carbohydrate Các hợp chất carbohydrate, chủ yếu glucose thông qua trình đƣờng phân (glycolysis) đƣợc phân cắt biến đổi cuối tạo thành pyruvate, chất khử NADH lƣợng ATP Pyruvate đƣợc đƣa vào ty thể bị oxy hóa, decarboxyl hóa để tạo thành acetylCoA (acetyl-CoA tạo từ trình oxy hóa acid béo) tiếp tục đƣợc oxy hóa hoàn toàn qua chu trình Krebs để tạo thành CO 2, H2O lƣợng chủ yếu đƣợc tích trữ dƣới dạng ATP Trong chu trình Krebs, điện tử proton H + đƣợc tách chuyển đến phân tử nhận điện tử NAD + FAD chuỗi vận 10 Trong thí nghiệm này, mẫu dò huỳnh quang Taqman có trình tự bổ sung với trình tự đặc hiệu DNA đích, đầu 5’ mẫu dò có gắn chất phát huỳnh quang (reporter) FAM (495/520 nm) cho mẫu dò đặc hiệu với trình tự đột biến HEX (535/556) cho mẫu dò đặc hiệu với trình tự không đột biến, đầu 3’ mẫu dò có gắn chất hấp phụ tƣơng ứng (quencher) BFQ (Black Fluorescence Quencher) Với mục đích tăng nhiệt độ tách chuỗi (Tm) tính đặc hiệu mẫu dò, mẫu dò bắt cặp bắt cặp sai cần có nhiệt độ tách chuỗi (Tm) cao (Tm) mồi khoảng 10oC mẫu dò phải ngắn tác động thay đổi nucleotide lớn nên mẫu dò bắt cặp đặc hiệu Vì vậy, cải tiến mẫu dò Taqman dƣới dạng Taqman LNA LNA dạng acid nucleic có chứa nucleotide cải biến với cầu methyl vị trí oxy 2’ carbon 4’ gốc đƣờng Liên kết hạn chế tính linh động nucleotide bị khóa nên làm tăng độ bền nhiệt độ đặc hiệu mẫu dò trình lai Điều làm cho mẫu dò Taqman LNA hấp dẫn sử dụng để phát đột biến điểm hệ gen ty thể Dựa nguyên tắc phân tích, thiết kế mẫu dò Taqman LNA đặc hiệu để phát đột biến A8344G real-time PCR (Bảng 3.5) Bảng 3.5: Trình tự mẫu dò dùng cho real-time PCR Mẫu dò/Mồi Trình tự Vị trí DNA ty thể RT8344-Fw 5’ AGC CCA CTG TAA AGC TAA C 3’ 8291 – 8309 RT8344-Rv 5’ GGC ATT TCA CTG TAA AGA GGT 3’ 8370 – 8350 Wt-8344A-FAM Mt-8344G-HEX 6FAM-AGA T+TA +A+GA +GA+A +CCIBFQ HEX-GAT +TA+A +GAG +A+GC C-IBFQ Ghi chú: dấu + nucleotide LNA 57 8332 – 8346 8333 – 8346 3.3.1.2 Đánh giá tính đặc hiệu mẫu dò đột biến A8344G Đoạn DNA chứa đột biến A8344G dài 80 bp từ vị trí 8291-8370 đƣợc nhân với cặp mồi RT8344-Fw RT8344-Rv nucleotide đột biến đƣợc phát mẫu dò đặc hiệu Wt-8344A-FAM Mt-8344G-HEX Các thử nghiệm kiểm tra mẫu dò đƣợc thực sử dụng DNA khuôn plasmid đột biến không đột biến đƣợc pha loãng 5.106 sao/µl Qua nhiều lần thăm dò, xác định đƣợc nồng độ mẫu dò thích hợp cho phản ứng real-time PCR 0,02 µmol/L loại mẫu dò cho 25l thể tích phản ứng; với hàm lƣợng mẫu dò cƣờng độ huỳnh quang đƣợc ghi nhận cao Nhiệt độ bắt cặp mồi mẫu dò 60oC, nhiệt độ bắt cặp tối ƣu mẫu dò Taqman, với nhiệt độ bắt cặp mẫu dò bắt cặp vào sợi đích trƣớc mồi bắt cặp, nhờ enzyme Taq DNA polymerase dễ dàng thủy phân mẫu dò, giúp cho việc phát huỳnh quang reporter Đoạn DNA ty thể chứa đột biến A8344G dài 80 bp từ vị trí 8291-8370 đƣợc khuếch đại PCR sử dụng cặp mồi RT8344-Fw RT8344-Rv nucleotide đột biến đƣợc phát mẫu dò đặc hiệu Mt-8344G-HEX Wt-8344AFAM với plasmid mang đột biến không mang đột biến nồng độ 5x10 để kiểm tra hoạt động mẫu dò tính đặc hiệu probe 58 A: Mẫu dò với plasmid mang đột biến 8344G B: Mẫu dò với plasmid không mang đột biến 8344A Hình 3.8 Kết kiểm tra mẫu dò (probe) 59 Kết phân tích real-time PCR (hình 3.8) cho thấy chạy real-time PCR với plasmid mang đột biến 8344G tín hiệu huỳnh quang lên với kênh HEX phản ứng chứa đồng thời mẫu dò Mt-8344G-HEX Wt-8344AFAM Tƣơng tự, với plasmid không mang đột biến (tức A8344), có tín hiệu FAM Kết khẳng định mẫu dò mà thiết kế có khả phân biệt đặc hiệu mẫu đột biến mẫu không đột biến 3.3.2 Xây dựng đƣờng chuẩn đánh giá độ tin cậy phƣơng pháp realtime PCR để định lƣợng đột biến A8344G 3.3.2.1 Xác định số plasmid mang đoạn gen đột biến không đột biến A8344G Để xây dựng đƣờng chuẩn đoạn gen mang đột biến A8344G thuộc hội chứng MERRF real-time PCR, plasmid mang DNA có đột biến không đột biến A8344G đƣợc chuẩn bị nồng độ khác nhau, dựa kích thƣớc hay trọng lƣợng phân tử nồng độ DNA plasmid thu nhận đƣợc Cụ thể, tính đƣợc số plasmid 8344A = 2,1 x 1010 sao, plasmid 8344G = 1,7 x 1010 Số plasmid đƣợc pha loãng nồng độ x 10 10 sao/µl đƣợc pha loãng theo hệ số 10 dùng cho thí nghiệm 3.3.2 Xây dựng đường chuẩn đột biến A8344G Sử dụng khuôn hỗn hợp plasmid đột biến không đột biến theo tỷ lệ 1:1 có nồng độ 5x107 - 5x102 /l Sau hoàn tất chu kỳ nhiệt, mẫu chuẩn có số chu kỳ ngƣỡng khác tƣơng quan với số lƣợng DNA đích ban đầu (Bảng 3.6) 60 Bảng 3.6: Tƣơng quan nồng độ DNA plasmid mang đột biến không đột biến A8344G ban đầu số chu kỳ ngƣỡng đƣợc xác định real-time PCR Mẫu dò HEX (cho đột biến) Số chu kỳ ngƣỡng Mẫu dò FAM (cho không đột biến) Số chu kỳ ngƣỡng Số copy Số copy 16,03 5.107 17,37 5.107 19,58 5.106 21,1 5.106 22,88 5.105 24,5 5.105 26,52 5.104 27,65 5.104 29,65 5.103 31,66 5.103 32,49 5.102 34,61 5.102 Hình 3.9 Biểu đồ khuếch đại đoạn gen mang đột biến không mang đột biến A8344G real-time PCR A: Các đường cong biểu thị mức độ nhân đoạn gen đích, B: Đồ thị thể tương quan gi a logarit số gen mang đột biến A8344G (đỏ) không mang đột biến (xanh) với giá trị chu kỳ ngư ng 61 Kết phân tích real-time PCR (Hình 3.9) cho thấy đƣờng chuẩn màu xanh DNA không mang đột biến màu đỏ dạng DNA mang đột biến, tạo việc sử dụng tỷ lệ nồng độ khác plasmid chứa đoạn gen ty thể mang đột biến A8344G không mang đột biến có độ tuyến tính cao, giá trị hệ số tƣơng quan R2 số DNA ty thể số chu kỳ ngƣỡng với mẫu dò Wt8344A-FAM (không mang đột biến) 0,999 Mt-8344G-HEX (mang đột biến) 0,999, hiệu PCR nằm khoảng 94-100% Slope probe Wt-8344A-FAM -3,458, probe Mt-8344G-HEX -3,317 Nhằm kiểm tra độ nhạy độ tin cậy phƣơng pháp tiến hành xây dựng đƣờng chuẩn tỷ lệ đột biến cách pha mẫu chuẩn có tỷ lệ đột biến 0,01% - 100% đột biến cách trộn plasmid mang đột biến không đột biến với thể tích nồng độ tƣơng ứng (Bảng 3.7) Sau tiến hành định lƣợng mẫu chuẩn xây dựng đồ thị tƣơng quan tuyến tính phần trăm tỷ lệ độ biến thực tế lí thuyết Đánh giá độ nhạy độ tin cậy phƣơng pháp (Hình 3.10) Bảng 3.7: Tỷ lệ phần trăm plasmid đột biến 8344G pha sẵn Tỷ lệ đột biến (%) Plasmid đột biến (µl) Plasmid không đột biến (µl) 0,01 x 104 99,99 x 106 0,1 x 105 99,9 x 106 1 x 106 99 x 106 10 10 x 106 90 x 106 30 30 x 106 70 x 106 50 50 x 106 50 x 106 70 70 x 106 30x 106 100 100 x 106 x 106 62 Bảng 3.8: Kết thực nghiệm tỷ lệ phần trăm đột biến mẫu chuẩn % đột biến lý thuyết % đột biến thực tế 0,01 0,0 0,1 0,3 1,4 10 8,0 30 34,0 50 51,5 70 74,2 100 100,0 Hình 3.10 Sự tƣơng quan tỷ lệ đột biến thực tế tỷ lệ đột biến lý thuyết Kết thu đƣợc hình 3.10 cho thấy giới hạn phát đột biến phƣơng pháp thiết lập đƣợc 0,1%, tƣơng quan tuyến tính tỷ lệ đột biến thực tế lý thuyết có độ tin cậy cao (R2 = 0,997) Thí nghiệm đƣợc lặp lại lần cho kết giống Nhƣ đƣờng chuẩn thiết lập đƣợc có độ tin cậy độ nhạy tƣơng đƣơng với nghiên cứu Trƣơng Thị Huệ tập thể (2012) việc xây dựng đƣờng chuẩn định lƣợng đột biến A3243G phƣơng pháp real-time PCR sử dụng mẫu dò Taq man LNA (độ nhạy đạt 0,1%, R2=0,999) [1] 63 3.2.4 Thử nghiệm khả phát định lƣợng đột biến A8344G Trong 312 mẫu bệnh phẩm sàng lọc phƣơng pháp PCR-RFLP, không phát đƣợc trƣờng hợp mang đột biến A8344G Để khẳng định thêm kết lựa chọn ngẫu nhiên mẫu bệnh phẩm (kí hiệu BN1, BN2, BN3, BN4, BN5) thử nghiệm phƣơng pháp real-time PCR đƣợc thiết lập Kết định lƣợng hình 3.11 cho thấy mẫu bệnh phẩm đƣợc thử nghiệm thu đƣợc tín hiệu FAM, tín hiệu không đột biến tín hiệu HEX tín hiệu đột biến không phát đƣợc Đƣờng chuẩn đƣợc xây dựng có độ tuyến tính cao (R > 0,99) Thí nghiệm đƣợc lặp lại lần cho kết giống Vì lần khẳng định mẫu bệnh phẩm không mang đột biến A8344G, phù hợp kết hai phƣơng pháp PCRRFLP real-time PCR sử dụng mẫu dò huỳnh quang LNA Hình 3.11 Thử nghiệm định lƣợng mẫu bệnh phẩm không mang đột biến A8344G real-time PCR 64 3.3 SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN GEN THUỘC HỘI CHỨNG MERRF BẰNG PHƢƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ TRỰC TIẾP Nhƣ nêu trên, qua sàng lọc PCR-RFLP, không phát đƣợc trƣờng hợp mang đột biến A8344G, T8356C G8363A thuộc hội chứng MERRF Để lần khẳng định kết nghiên cứu PCRRFLP xác lựa chọn 29 mẫu bệnh nhân nghi ngờ (Phụ lục 1) bị hội chứng MERRF với triệu chứng rõ để giải trình tự đoạn gen 8155 - 9292 thuộc vùng đột biến 3.3.1 Phân tích trình tự vùng gen mang đột biến MERRF 8155 - 9292 hệ gen ty thể Đoạn gen ty thể 8155 - 9292 dài 1137 bp 29 bệnh nhân nghi bị MERRF đƣợc nhân gen từ phản ứng PCR với khuôn mẫu DNA bệnh phẩm đƣợc nhân lên PCR giải trình tự nucleotide sử dụng mồi theo hai chiều Kết phân tích trình tự thu đƣợc cho thấy trƣờng hợp mang đột biến A8344G, T8356C G8363A hội chứng MERRF (Hình 3.12) Nhƣ vậy, kết xác định trình tự lần khẳng định kết phân tích PCR-RFLP xác đáng tin cậy 65 Hình 3.12 Kết blast trình tự đoạn gen ty thể 8155 - 9292 29 mẫu bệnh với trình tự chuẩn J01415.2 66 KẾT LUẬN Đã sàng lọc đột biến thuộc hội chứng MERRF, bệnh nhân nghi mắc bệnh ty thể (312 bệnh nhân đột biến A8344G 182 bệnh nhân đột biến T8356C G8363A) phƣơng pháp PCR-RFLP nhƣng không phát đƣợc trƣờng hợp mang đột biến Đã thiết kế thành công mẫu dò Taqman mang nucleotide dạng khóa cầu methyl thiết lập đƣợc điều kiện để phân tích định lƣợng đột biến A8344G hội chứng MERRF real-time PCR với giới hạn phát đến 0,1% với độ tin cậy cao (hệ số R2 = 0,997) Đã giải trình tự trực tiếp đoạn gen ty thể 8155 - 9292 (1137 bp) 29 mẫu bệnh nhân số bệnh nhân có biểu bệnh thần kinh cho kết âm tính đột biến A8344G, T8356C, G8363A PCR-RFLP tái khẳng định tất bệnh nhân không mang đột biến vừa nêu KIẾN NGHỊ Tiếp tục sàng lọc để phát đột biến MERRF bệnh nhân nghi mắc bệnh thần kinh, não Việt Nam Xây dựng phƣơng pháp phát hiện, định lƣợng đột biến gen ty thể khác nhằm hỗ trợ việc chẩn đoán lâm sàng nghiên cứu mối liên quan mức độ biểu bệnh với tỷ lệ đột biến 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Trƣơng Thị Huệ, Nguyễn Văn Liệu, Phạm Vân Anh, Nguyễn Thị Vân Anh, Phan Tuấn Nghĩa (2012), “Phát định lƣợng đột biến A3243G hệ gen ty thể hội chứng MELAS”, Tạp chí công nghệ sinh học, 10(3), tr 423-429 Phùng Bảo Khánh, Nguyễn Văn Minh, Trần Đức Hiệp, Trần Kiều Anh, Trƣơng Thị Huệ, Phạm Vân Anh, Lê Ngọc Anh, Cao Vũ Hùng, Phan Tuấn Nghĩa (2015), “Phát đột biến gen ty thể A1555G gây bệnh điếc cảm ứng Aminoglycoside số bệnh nhân ngƣời Việt Nam”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN – Khoa học Tự Nhiên Công nghệ , 31(3), tr 1-7 Nguyễn Văn Minh, Phùng Bảo Khánh, Trƣơng Thị Huệ, Cao Vũ Hùng, Phạm Vân Anh, Nguyễn Thị Hồng Loan, Phan Tuấn Nghĩa (2015), “Sàng lọc đột biến G3460A, G11778A phát đột biến đoạn bp hệ gen ty thể bệnh nhân thần kinh Việt Nam”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 13(2), tr 1-7 Trịnh Lê Phƣơng, Chu Văn Mẫn, Phan Tuấn Nghĩa (2009), “Phát đột biến gen A3243G hội chứng MELAS phƣơng pháp PCRRFLP cải tiến”, Tạp chí Di truyền ứng dụng, 4, tr 6-9 Phạm Hùng Vân (2009), PCR real-time PCR – Các vấn đề áp dụng thường gặp, Nhà xuất Y học, Hà Nội Tiếng Anh Abbott J A., Francklyn C S., Robey-Bond S M (2014), “Transfer RNA and human disease”, Frontiers in Genetics, 5(158), pp 1-18 Abreu-Silva R S., Lezirovitz K., Braga M C C., Spinelli M., Pirana S., Della-Rosa V A., Otto P A., Mingroni-Netto R C (2006), “Prevalence of the A1555G (12S rRNA) and tRNASer (UCN) mitochondrial mutations in hearing-impaired Brazilian patients”, 68 Brazilian Journal of Medical and Biological Research, 39, pp 219226 Bai R K., Wong L J C (2004), “Detection and quantification of heteroplasmic mutant mitochondrial DNA by real-time amplification refractory mutation system quantitative PCR analysis: A single-step approach”, Clinical Chemistry, 50, pp 996-1001 Berdanier C D (2005), Mitochondria in healthy and disease, CRC Press 10 Blakely L E., Alston L C., Lecky B., Chakrabart B., Falkous G., Turnbull M D., Taylor W R., Gorman S G (2014), “Distal weakness with respiratory insufficiency caused by the m.8344A > G “MERRF” mutation”, Science Direct, 24, pp 533–536 11 Blasiak J., Glowacki S., Kauppinen A., Kaarniranta K (2013), “Mitochondrial and Nuclear DNA Damage and Repair in Age-Related Macular Degeneration”, International Journal of Molecular Sciences, 14(2), pp 2996-3010 12 Bornsttein B., Mas J A., Patrono C., Fernández-Moreno M A., González-Vioque E., Campos Y., Carrozzo R., Martín M A., Del Hoyo P., Santorelli F M., Arenas J., Garesse R (2005), “Comparative analysis of the pathogenic mechanisms associated with the G8363A and A8296G mutations in the mitochondrial tRNA Lys gene”, Biochemical Journal, 387, pp 773–77 13 Boulet L., Karpati G., Shoubridge E A (1992) “Distribution and threshold expression of the tRNA-lys mutation in skeletal muscle of patients with myoclonic epilepsy and ragged-red fibers (MERRF)”, The American Journal of Human Genetics, 51(6), pp 1187 - 1200 14 Burgstaller J P., Johnston I G., Poulton J (2015), “Mitochondrial DNA disease and developmental implications for reproductive strategies”, Molecular Human Reproduction, 21(1), pp.11-22 69 15 Calabresi P A., Silvestri G., Dimauro S., Grigga R C (1994), “Ekbom’s syndrome: Lipomas, ataxia, and neuropathy with MERRF”, Muscle and Nerve, 17, pp 943-945 16 Cao Y., Ma Y., Zhang Y., Li Y., Fang F., Wang S., Bu D., Xu Y., Pei P., Li L., Xiao Y., Wua H, Yang Y., Zou L., Qi Y (2010), “Detection of eight frequently encountered point mutations in mitochondria in Chinese patients suggestive of mitochondrial encephalomyopathies”, Mitochondrion, 10, pp 330-334 17 Chong J W., Annuar A A, Wong W T., Thong M K., Goh K J (2014), “Single mitochondrial DNA deletions in chronic progressive external ophthalmoplegia (CPEO) and Kearns-Sayre syndrome (KSS) patients from a multiethnic Asian population”, Neurology Asia, 19(1), pp 2736 18 Cohen H B (2013), “Neuromuscular and Systemic Presentations in Adults: diagnoses beyond MERRF and MELAS”, Neurotherapeutics, 10, pp 227–242 19 Craven L., Tuppen H A., Greggains G D., Harbottle S J., Julie L., Murphy, Cree L M., Murdoch A P., Chinnery P F., Taylor R W., Lightowlers R N., Herbert M., Turnbull D M (2010), “Pronuclear transfer in human embryos to prevent transmission of mitochondrial DNA disease”, Nature, 465(7294), pp 82-85 20 De la Mata M., Garrido-Maraver J., Cotán D., Cordero M D., OropesaÁvila M., Izquierdo L G., De Miguel M., Lorite J B., Infante E R., Ybot P., Jackson S., Sánchez-Alcázar J A (2012), “Recovery of MERRF Fibroblasts and Cybrids Pathophysiology by Coenzyme Q10”, Neurotherapeutics, 9, pp 446-463 21 Detmer S A., Chan D C (2007), “Functions and dysfunctions of mitochondrial dynamics”, Nature Publishing Group, 8, pp 870-879 22 Duchen M R (2004), “Roles of Mitochondria in Health and Disease”, Diabetes, 53, pp 96-102 70 23 Duchen M R., Szabadkai G (2010), “Role of mitochondria in human disease”, Essay in Biochemistry, 47, pp 118-136 24 El-Hattab A W., Scaglia F (2013), “Mitochondrial DNA Depletion Syndromes: Review and Updates of Genetic Basis, Manifestations, and Therapeutic Options”, Neurotherapeutics, 10, pp 186-198 25 Emmanuele V., Silvers D S., Sotiriou E., Tanji K., DiMauro S., Hirano M (2011), “MERRF and Kearns-Sayre overlap syndrome due to the mtDNA m.3291T>C mutation”, Muscle Nerve., 44(3), pp 448–451 26 Fan H., Civalier C., Booker J K., Gulley M L., Prior T W., Farber R A (2006), “Detection of common disease-causing mutations in mitochondrial DNA (Mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis with stroke-like episodes MTTL1 A3243G and myoclonic epilepsy associated with ragged-red fibers MTTK A8344G) by realtime polymerase chain reaction”, Journal of Molecular Diagnostics, 8, pp 277-281 27 Fawcett D W (1981), The Cell, W B Saunders Company, NewYork 28 Fukuhara N., Tokiguchi S., Shirakawa K., Tsubaki T (1980), “Myoclonus epilepsy associated with ragged-red fibers (mitochondrial abnormalities) disease entity or a syndrome”, Journal Neurol Science, 4791, pp 117-133 29 Giles R E (1980), “Maternal inheritance of human mitochondria DNA”, Genetics, 77, pp 6715-6719 30 Graf W.D., Sumi S M., Copass M K., Ojemann L M., Longstreth W T., Shanske S., Lombes A., DiMauro S (1993), “Phenotypic Heterogeneity in families with the Myoclonic Epilepsy and RaggedRed Fiber Disease Point Mutation in Mitochondrial DNA”, American Neurological Association, 33, pp 640-645 71 [...]... nhân cơ não tuy nhiên các tác giả không phát hiện đƣợc trƣờng hợp nào mang đột biến thuộc hội chứng MERRF Nhƣ vậy đột biến MERRF ở bệnh nhân Việt Nam đã đƣợc nghiên cứu tuy nhiên các thông tin có đƣợc còn hạn chế Vì thế, việc mở rộng nghiên cứu phát hiện đột biến này ở ngƣời Việt Nam, đặc biệt là việc định lƣợng mức độ không đồng nhất về kiểu gen đột biến để đƣa ra mối tƣơng quan giữa tỷ lệ đột biến và. .. Mặc dù đƣợc mô tả với các triệu chứng lâm sàng cơ bản của hội chứng MERRF bao gồm rung giật cơ, mất điều hoà, động kinh và sợi cơ màu đỏ rách nham nhở nhƣng đột biến A8344G có những biểu hiện kiểu hình không đồng nhất Một nghiên cứu ở ngƣời phụ nữ 42 tuổi, ngoài các tính năng chính của hội chứng MERRF còn có nhiều triệu chứng khác nhƣ suy hô hấp và loạn dƣỡng cơ Một số trƣờng hợp biểu hiện tầm vóc ngắn,... ĐỘNG KINH, GIẬT CƠ VỚI SỢI CƠ KHÔNG ĐỀU (MERRF) Năm 1973, một nhóm bệnh nhân mắc bệnh ty thể có triệu chứng lâm sàng liên quan đến động kinh, giật cơ lần đầu tiên đƣợc mô tả Sau đó các trƣờng hợp khác tiếp tục đƣợc mô tả, Fukuhara và cộng sự [28] đã đƣa ra các tính năng cơ bản của bệnh bao gồm: giật cơ, động kinh kết hợp với sợi cơ không đều đƣợc gọi là hội chứng MERRF Bệnh nhân MERRF đƣợc chẩn đoán bởi... Nguyên nhân phổ biến của hội chứng MERRF là do đột biến A8344G, T8356C và G8363A nằm trên gen MT-TK mã hóa cho tRNALys gây ra, tất cả đột biến đều tồn tại ở dạng không đồng nhất Đột biến A8344G là phổ biến nhất, chiếm 80-90% số ca mang hội chứng MERRF [9, 42] MERRF cũng đƣợc mô tả ở bệnh nhân bị mất đoạn mtDNA Các hội chứng gối nhau với đặc điểm MELAS /MERRF đã đƣợc báo cáo ở đột biến T7572C và T8356C trên... xác định vào năm 1988 Kể từ đó, hơn 250 đột biến mtDNA gây bệnh đã đƣợc phát hiện và nghiên cứu, bao gồm hai loại đột biến chính là đột biến điểm và đột biến cấu trúc Các đột biến mtDNA có tính không đồng nhất về biểu hiện lâm sàng và tuổi khởi phát bệnh, do đó việc xác định tỷ lệ của bệnh đột biến gen ty thể là rất khó khăn Ƣớc tính ở phía Đông Bắc nƣớc Anh có tỷ lệ 1/10.000 ngƣời đã có biểu hiện. .. bệnh 29 cơ tim hoặc rối loạn chức năng ống thận Kết quả nghiên cứu mối tƣơng quan giữa kiểu gen đột biến A8344G với kiểu hình MERRF cho thấy rằng đột biến này có thể biểu hiện kiểu hình khác, bao gồm cả triệu chứng lâm sàng của hội chứng Leigh, rung giật cơ kết hợp với u mỡ đối xứng và các bệnh đầu múi cơ [30] 1.3.1.2 Đột biến T8356C Hội chứng MERRF thƣờng đƣợc biết đến với đột biến A8344G, nhƣng không. .. não giật cơ, tăng acid lactic máu và giả tai biến mạch, đƣợc di truyền từ mẹ sang con Bệnh có ảnh hƣởng đến nhiều hệ thống của cơ thể, đặc biệt là não bộ, hệ thần kinh và cơ bắp Các dấu hiệu và triệu chứng của rối loạn này thƣờng xuất hiện ở trẻ em sau một thời gian phát triển bình thƣờng, có thể khởi phát ở mọi lứa tuổi Triệu chứng của bệnh bao gồm yếu cơ, đau cơ, đau đầu, nôn, và co giật, một số cá... IV của chuỗi hô hấp Nghiên cứu sâu hơn cho thấy sự hiện diện của các peptid bất thƣờng trong nguyên bào sợi da của một bệnh nhân mang đột biến G8363A [45, 49, 57] Những biểu hiện lâm sàng của bệnh nhân mang đột biến A8363G cũng không đồng nhất, ở một số bệnh nhân có triệu chứng tâm thần chậm phát triển, mất thính giác, nhiều u mỡ, đƣợc chẩn đoán giống hội chứng Leigh 1.3.2 Những tác động của hội chứng. .. sàng bệnh ty thể và 1/6000 ngƣời có nguy cơ mắc bệnh Một nghiên cứu gần đây đã cho thấy tần số đột biến là 0,14% 17 đối với đột biến A3243G và 0,2% đối với đột biến A1555G liên quan đến MTRNR1 aminoglycoside gây ra mất thính giác, điều này chứng tỏ rằng những hiểu biết về đột biến gen ty thể còn nhiều hạn chế [31, 56] 1.2.1.1 Đột biến điểm Đột biến điểm là đột biến thay thế, mất hoặc thêm một nucleotide... - 20% số bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng tiêu biểu của hội chứng MERRF Một nghiên cứu giải trình tự gen tRNAlys của năm bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng đƣợc xác định là rung giật cơ (hoặc động kinh), mất điều hòa và sợi cơ đỏ bị rách nham nhở, tiền sử gia đình tƣơng thích với sự kế thừa bệnh từ mẹ, nghiên cứu tiền lâm sàng thấy tăng hàm lƣợng acid lactic, sinh thiết cơ cho thấy nhiều sợi cơ đỏ ... mang hội chứng MERRF tiến hành đề tài: Nghiên cứu phát định lượng số đột biến hội chứng động kinh, giật với sợi không - MERRF người Việt Nam CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CẤU TRÚC VÀ CHỨC... đến đột biến gen mã hóa rRNA 25 1.2.2.4 Bệnh gây nên đột biến khác mtDNA 26 1.3 HỘI CHỨNG ĐỘNG KINH, GIẬT CƠ VỚI SỢI CƠ KHÔNG ĐỀU (MERRF) 28 1.3.1 Các đột biến hội chứng MERRF. .. ngƣời Những đột biến mtDNA gây bệnh đƣợc xác định vào năm 1988 Kể từ đó, 250 đột biến mtDNA gây bệnh đƣợc phát nghiên cứu, bao gồm hai loại đột biến đột biến điểm đột biến cấu trúc Các đột biến mtDNA