Đang tải... (xem toàn văn)
kháng thuốc trừ sâu và kháng thuốc diệt cỏ làm cho ngô phát triển mạnh đem lại năng xuất cao làm cho ngô phát triển một cách tối đa, nâng cao năng xuất, giảm chi phí cho người nông dân. tiết kiệm chi phí, giảm sức lao động con người. giảm thiểu ô nhiễm môi trường do các loại thuốc trong quá trình trồng ngô có thể gây ra
MỤC LỤC MỞ ĐẦU……………………………………………………………………………….2 NỘI DUNG…………………………………………………………………………….3 CHƯƠNG :TỔNG QUAN VỀ BACILLUS THURINGIENSIS I Giới thiệu chung Bacillus thuringiensis : .3 II Sinh trưởng phát triển Bacillus thuringiensis III Các loại độc tố Bacillus thuringiensis .11 IV Hoạt lực diệt sâu Bacillus thuringiensis 14 CHƯƠNG 2: CÔNG NGHỆ TẠO NGÔ CHUYỂN GEN KHÁNG SÂU TỪ BT 15 I Vài nét công nghệ chuyển gen thực vật 15 I.1 Khái niệm thực vật chuyển gen……………………………….………………15 1.2 Tóm tắt lịch sử phát triển công nghệ chuyển gen thực vật 15 1.3 Một số nguyên tắc việc chuyển gen 16 1.4 Vector sử dụng công nghệ chuyển gen thực vật .18 công nghệ tạo ngô chuyển gen kháng sâu từ BT 26 2.1 Giới thiệu ngô 26 2.2 Giới thiệu ngô chuyển gen .27 2.3 bước tạo ngô chuyển gen kháng sâu phòng thí nghiệm 29 II 2.4 Thực trạng sử dụng ngô chuyển gen kháng sâu giới nước ……41 2.5 Tính hữu hiệu trồng chuyển gen Bt 43 KẾT LUẬN …………………………………………………………………….…….44 TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………… …………………….… 45 MỞ ĐẦU Trong tất lớp vi sinh vật, côn trùng có số lượng loài nhiều Côn trùng ảnh hưởng xấu đến người theo nhiều cách khác : phá hoại mùa màng vector truyền bệnh cho người động vật Vào năm 1940, nhiều loại thuốc trừ sâu hóa học phát triển nhằm kiểm soát tăng sinh quần thể côn trùng có hại Nhưng sau đó, nhà khoa học nhận thấy tác động tiêu cực thuốc trừ sâu hóa học : ảnh hưởng lâu dài đến động vật, hệ sinh thái người Thuốc trừ sâu hóa học DDT bền vững môi trường 20 năm tích tụ với hàm lượng ngày tăng qua chuỗi thức ăn gây hậu lâu dài nặng nề cho người động thực vật Thêm vào đó, quần thể sâu hại ngày kháng nhiều thuốc trừ sâu hóa học Thuốc trừ sâu hóa học thiếu tính đặc hiệu tiêu diệt thiên địch loài sâu hại dẫn đến kết xử lý sâu bệnh làm số lượng côn trùng tăng lên Sau xem xét ảnh hưởng tiêu cực thuốc trừ sâu hóa học, thuốc trừ sâu vi sinh có hoạt tính trừ sâu vi khuẩn Bacillus thuringiensis chọn phương án thay không tồn bền vững môi trường an toàn vật nuôi người Nhưng nhược điểm thuốc trừ sâu vi sinh công hiệu thấp, giá thành cao làm hạn chế việc sử dụng Vả lại, số sâu gây hại lại ăn mô tránh ảnh hưởng chế phẩm B thuringiensis phun bên Để khắc phục vấn đề này, gen độc tố Bacillus thuringiensis biểu phương pháp chuyển gen độc tố từ B thuringiensis vào thực vật thông qua plasmid Ti vi khuẩn A tumefaciens dùng súng bắn gen Với chuyển gen này, không cần phun độc tố diệt sâu Điều hạn chế phát tán độc tố vào môi trường, giảm chi phí sử dụng thuốc trừ sâu… Ngô hay bắp ( Zea mays.) trồng quan trọng giới Việt Nam, dùng làm lương thực hay ứng dụng nhiều công nghiệp để làm bánh kẹo, syrup đường nghịch đảo, tinh bột biến hình… Chính điều suất thu hoạch ngô điều cần cải thiện Một biện pháp tăng khả chống chịu sâu bệnh ngô nhằm tăng suất thu hoạch Điều giúp tiết kiệm chi phí sử dụng thuốc trừ sâu mà góp phần hạn chế tác động xấu đến môi trường xung quanh NỘI DUNG Chương :TỔNG QUAN VỀ BACILLUS THURINGIENSIS I Giới thiệu chung Bacillus thuringiensis : 1.1.Tóm tắt lịch sử nghiên cứu ứng dụng Bacillus thuringiensis Lần vào năm 1870, nhà bác học Pasteur người Pháp phát loài vi khuẩn gây bệnh cho tằm đặt tên Bacillus bombycis Sau vào năm 1911, nhà côn trùng học người Đức Berline phát loài vi khuẩn loài sâu xám Thuringia vùng Địa Trung Hải đặt tên Bacillus thuringiensis (viết tắt Bt.) Sau đến khoảng kỷ 20, người ta phát nhiều chủng Bt ký sinh nhiều loài sâu khác sâu xanh, sâu keo, sâu róm thông Từ vi khuẩn Bt chế tạo thành thuốc trừ sâu sử dụng nông nghiệp nhiều nước, mở đầu cho công nghệ thuốc trừ sâu sinh học Chế phẩm Bt nghiên cứu từ năm 1971 ứng dụng rộng rãi nhiều nước thay phần thuốc trừ sâu hóa học để diệt côn trùng Với thành tựu di truyền học công nghệ sinh học, người ta phát nhiều chủng Bt có khả ký sinh mạnh, sản xuất chế phẩm có hàm lượng độc tố tính ổn định cao để tăng hiệu lực diệt sâu mở rộng phổ tác dụng nhiều loài sâu hại thuộc nhiều côn trùng nhiều vùng khí hậu khác Đã xác định có tới 150 loài sâu hại bị nhiễm chủng Bt., bao gồm toàn loài sâu hại có Việt Nam Hiện thuốc trừ sâu từ vi khuẩn Bt chiếm phần lớn thị trường thuốc trừ sâu sinh học giới nước ta Ngoài việc dùng làm thuốc trừ sâu, người ta tách số gen từ vi khuẩn Bt ghép vào hệ thống gen để tạo giống kháng sâu giống kháng sâu xanh, giống lúa kháng sâu đục thân, sâu lá, giống ngô kháng sâu… Gần đây, nhóm nhà khoa học Viện Pasteur TPHCM vừa nghiên cứu thành công chế phẩm vi sinh từ chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis subsp israelensis serotype H14 diệt lăng quăng Hình 1.1 Một số chế phẩm trừ sâu có mặt thị trường từ Trung Quốc, Mỹ, Việt Nam 1.2 Sự phân bố B.thuringiensis Phổ biến tự nhiên, cư trú đất, bề mặt xác sâu.Tần suất B thuringiensis phân bố cao từ nguồn đất 35%, mùn thóc 30% thấp 16% 1.3 Đặc điểm sinh thái B.thuringiensis Từ Bacillus nhằm miêu tả hình dáng nhóm vi khuẩn quan sát kính hiển vi Nó xuất phát từ tiếng Latin có nghĩa hình que Do đó, số nơi gọi khuẩn que trực khuẩn Hình 1.2 Hình thái B.thuringiensis Hình 1.3.Hình dạng kích thước Bt Qua kính hiển vi Bacillus thuringiensis đơn lẻ có hình dạng giống que, kích thước 1-1,2 x 3-5 µm , phủ tiêm mao, di chuyển Bào tử hình oval có khuynh hướng phình đầu Thường người ta quan sát thấy tập đoàn giống sinh vật rộng lớn, có hình dạng bất định phát triển lan rộng 1.4 Đặc điểm sinh hoá B thuringiensis Bacillus vi khuẩn gam dương Catalase dương tính Sử dụng khí oxy làm chất nhận electron trao đổi khí trình trao đổi chất Hiếu khí tùy tiện.Sinh bào tử, kích thước 1,6 – µm Tế bào đứng riêng xếp chuỗi Nhiệt độ sinh trưởng 15º-45ºC Tạo tinh thể protein giai đoạn tạo bào tử, kích thước 0,6 – µm Tinh thể có kích thước 0,6 x µm Bản chất protein Bào tử: hình trứng dài, kích thước 1,6 x µm Bào tử có màng mỏng khó nhuộm màu Có cách dễ dàng để cô lập loại trực khuẩn cho đất tốt vào ống nghiệm với nước, lắc đều, cho vào môi trường muối manitol tan, giữ nhiệt độ phòng ngày 1.5.Phân loại B thuringiensis Giới: Procaryotae Ngành:Firmicutes Họ: Bacillacaeae Chi: Bacillus Loài:thuringiensis Loài phụ… (Khoá phân loại Bergey (1984)) 1.5.1 Phân loại theo typ huyết kháng tiêm mao : Nguyên lí: Kháng nguyên tiêm mao H kết hợp với kháng thể xảy phản ứng ngưng kết → tạo cặn lắng trắng đáy ống nghiệm Quan sát kính hiển vi thấy tế bào không di chuyển Các bước phân loại : Chuẩn bị dịch kháng tiêm mao H tiêm vào thỏ sau thu huyết miễn dịch thử phản ứng ngưng kết Chuẩn bị dịch kháng tiêm mao H Nuôi cấy VK B thuringiensis môi trường bán lỏng NA: cao thịt 5g, agar 2g, nước cất 1000ml, điều chỉnh tới pH = 7,2 Thời gian nuôi 16 – 18 Chuyển sang môi trường NB: nuôi chế độ lắc OD650nm = 0,8 – 1,0 Bổ sung 0,5 ml formaldehyde Thu nhận dịch kháng nguyên tiêm mao H Thu nhận huyết miễn dịch Tiêm dịch kháng nguyên tiêm mao H: - Mũi da - Các mũi tiêm ven, tuần lần, liều lượng lần tăng dần (1ml, 2ml, 3ml), thời gian tiêm tuần Kiểm tra hình thành kháng thể: Sau ngày lần tiêm cuối: lấy 2ml máu từ ven tai thỏ để xác định hiệu giá Nếu HG lớn 25 000 đạt yêu cầu Nếu HG nhỏ 25 000 tiếp tục tiêm thêm – lần để nhận hiệu giá cao - Dùng 02 thỏ cho kháng nguyên để tránh rủi ro - - Huyết tách đièu kiện vô trùng bảo quản 4oC đông khô Thử phản ứng ngưng kết Cho 1,8ml NaCl 1,15M 200ml dịch huyết miễn dịch tiêm mao vào ống nghiệm 5ml Pha loãng với nồng độ giảm dần theo hệ số 2: 1:10; 1:20; 1:40;…; 1:2560 Chuyển 100ml dịch nồng độ pha loãng vào ống nghiệm có chứa 900ml dịch vi khuẩn B thuringiensis, độ pha loãng lúc 1:100; 1:200; 1:400; … ; 1:25600 Mẫu đối chứng thay 100ml dịch huyết 100ml dịch NaCl 1,15M Ủ ống nghiệm 37oC quan sát ngưng kết Hiệu giá thu nồng độ pha loãng cao xảy tương ngưng kết Nhược điểm phân loại theo type huyết Mối liên hệ type huyết với phổ diệt côn trùng không quán: Có loài type huyết có độc tính với côn trùng nhau: loài phụ Kustaki loài phụ alesti biểu độc với côn trùng cánh vẩy Có loài có type huyết giống độc tính với côn trùng khác nhau: loài phụ morisoni (type huyết H8ab) có độc tính với côn trùng hai cánh loài phụ sandiego (type huyết H8ab) có độc tính với côn trùng cánh cứng Không thể thông qua type huyết loài phụ để xác định hoạt tính diệt sâu chúng 1.5.2.Theo gen mã hóa protein tinh thể độc Protein cry hay gọi δ-endotoxin (tinh thể độc) (Ge, A Z., N I Shivarova, and D H Dean, 1989) [19] Tinh thể độc tồn dạng tiền độc tố, cần hoạt hoá để có tác dụng Tinh thể độc tồn nhiều hình dạng: kim tự tháp đôi, thoi phẳng, khối hộp, hỗn hợp loại - Tinh thể độc có kích thước khoảng 230KDa với phần nhân độc 65KDa - Tinh thể độc tan điều kiện pH cao (pH >9,5) Tính độc: gây độc nồng độ picomol (10-12M) Gen cry - Các gen mã hoá cho tiền độc tố thường nằm plasmid - Mỗi tiền độc tố sản phẩm gen - Một số loài phụ có khả tổng hợp nhiều tiền độc tố - 250 gen mã hoá tổng hợp protein cry đọc trình tự xếp vào 40 họ dựa vào tương đồng trình tự xếp nucleotit Bảng 1.1.Phân loại Bt theo gen mã hóa protein tinh thể độc (Hoft Whiteley, 1989) - Kích thước Hình dạng Gen protein Đối tượng diệt sâu tinh thể (kDa) CryI ( Aa, Ab, Ac,B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, L) Lưỡng tháp CryII(A, Hình lập B, C) phương CryIII(A, Phẳng/không B, C, D) CryIV Lưỡng tháp 130-140 Ấu trùng cánh vẩy 69-71 Bộ cánh vẩy hai cánh 73-74 Bộ cánh cứng 73-134 Bộ hai cánh (A,B,C,D) CryV- Đa dạng 35-129 Đa dạng cryIX Tế bào động vật xương sống Cyt 25-28 không xương sống Bảng 1.2.Phân loại Bt theo độc tố diệt sâu 1.5.3 Các cách phân loại khác - Phân loại theo loại hình enzyme lipase Căn vào số lượng vạch enzyme lipase Tương đối thống với loại hình huyết kháng nguyên H, sử dụng để phân biệt loài phụ type huyết - Phân loại theo type huyết kháng protein tinh thể Các tinh thể có cấu trúc khác nhau, thành phần kháng nguyên tinh thể khác Thông qua phản ứng huyết nhận biết type huyết tinh thể Quan hệ mật thiết với phổ diệt sâu - Phân loại theo type huyết kháng nguyên O Kháng nguyên O kháng nguyên bền nhiệt Bt., thu xử lý nhiệt để loại bỏ tiêm mao Được sử dụng để xác định vị trí phân loại Bt tiêm mao - Phân loại theo loại bệnh gây cho côn trùng Căn vào độ nhạy khác côn trùng: Dạng A (nhạy cảm với cánh vẩy) Dạng B (nhạy cảm với hai cánh) Dạng C (nhạy cảm với cánh cứng) Dạng D (nhạy cảm với hai cánh cánh vẩy) • Sinh trưởng phát triển Bacillus thuringiensis Chu trình sống Bacillus thuringiensis Hình 1.4 Chu trình sống B thuringiensis Bacillus thuringiesis trải qua chu trình sống : pha phát triển sinh dưỡng pha tạo bào tử Nội bào tử không hình thành suốt trình sinh trưởng phân chia tế bào Chúng thường hình thành tế bào vượt qua pha log sinh trưởng môi trường cạn kiệt nguồn dinh dưỡng Thường tế bào sinh dưỡng hình thành nội bào tử Khi bào tử trưởng thành tế bào dinh dưỡng tự phân giải, bào tử giải phóng khỏi tế bào mẹ Bào tử trưởng thành trình trao đổi chất chúng tồn trang thái gọi crytobiotic Chúng có sức chống chịu cao với điệu kiện khắc nghiệt môi trường nhiệt độ cao, xạ, axit mạnh, chất tẩy…Khi gặp điều kiện thuận lợi chúng nảy mầm thành té bào sinh dưỡng Bào tử hình thành từ tế bào sinh dưỡng để đáp ứng lại điệu kiện khắc nghiệt môi trường chúng nảy mầm thành tế bào sinh dưỡng điều kiện bớt khắc nghiệt Bào tử vi khuẩn hình thức sinh sản mà chúng hình thức thích nghi để giúp vi khuẩn vượt qua điều kiện sống bất lợi 2.2 Các giai đoạn trình tạo bào tử Hình 1.5 : Các giai đoạn trình tạo bào tử Bước : Nhiễm sắc thể Vi khuẩn phân chia nhân lên làm đôi Bước : Hình thành màng tế bào phân cắt NST vi khuẩn làm phần không Bước : Phần nhỏ phát triển hình thành nhân bào tử Sau phần lớn bao lấy phần nhỏ Kết tế bào chất hợp làm Chính điều mà số người cho trình hình thành bào tử trình sinh sản hình thành bào tử hình thức đổi tế bào kết hợp phần nguyên sinh chất trình hình thành bào tử mà tế bào đổi Bước 4: Vỏ bào tử tổng hợp Bước : Áo bào tử tổng hợp Bước : Màng tế bào NST dần tiêu biến Bước : Bào tử hình thành hoàn chỉnh 2.3 Các giai đoạn trình tạo bào tử tinh thể Bt Tinh thể độc Bào tử Hình 1.6 Các giai đoạn trình tạo bào tử tinh thể Bacillus thuringiensis Trong trình hình thành bào tử tinh thể độc tổng hợp đồng thời không nằm bào tử Tinh thể độc phóng thích môi trường màng tế bào bị tiêu biến 2.4 Động học trình phát triển, tạo bào tử tinh thể độc Tế bào sinh dưỡng (vegetative cells) phát triển nhanh chóng từ 2-8h đầu chu kỳ sinh trưởng giảm dần dừng hẳn sau 10h sinh trường Tiếp theo hình thành tinh thể độc tố khoảng thời gian 10-14h Trong khoảng thứ 12 bào tử bắt đầu hình thành tổng hợp hoàn chỉnh thời điểm 20h Hình 1.7 Động học trình phát triển, tạo bào tử tinh thể độc 2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng hình thành bào tử vi khuẩn Bacillus thuringiensis N - hiệt 10 Để nỗ lực làm tăng mạnh mức biểu hiện, hai cách tiếp cận khác nghiên cứu Ở cách thứ nhất, gen tiền độc tố diệt sâu phân lập cải biến đột biến định hướng vị trí để thay đổi trình tự DNA kìm hãm phiên mã dịch mã hiệu chủ Gen cải biến phần (PM) có 96,5% trình tự nucleotide không thay đổi từ gen kiểu hoang dại (WT) mã hóa protein độc tố diệt sâu giống với kiểu dại Cây chuyển gen biểu trình tự cải biến sản xuất nồng độ protein diệt sâu cao gấp 10 lần so với biến nạp với kiểu gen dại Ở cách thứ hai, dạng cải biến toàn gen độc tố diệt sâu thiết kế tổng hợp hóa học Gen cải biến hoàn toàn (FM) có codon thực vật dùng cách phổ biến Gen cải biến để loại bỏ cấu trúc bậc hai RNA thông tin trình tự polyadenyl hóa mà làm giảm biểu gen Gen chứa hàm lượng G + C 49% (gen kiểu dại 37% G + C) trình tự nucleotide có 78,8% giống với gen kiểu dại Cây chuyển gen biến nạp với gen tiền độc tố tổng hợp cải biến cao có nồng độ protein độc tố cao gấp khoảng 100 lần so với biến nạp gen kiểu dại Hơn mức độ tổng hợp độc tố diệt sâu cao liên quan trực tiếp đến hoạt tính diệt sâu tăng Sự thành công tiếp cận cách hiệu để tăng biểu số gen ngoại lai khác thực vật.( Bernard R Glick & Jack J Pasternak, 2007) Bảng 4.1: Sự biểu số gen độc tố diệt sâu B thuringiensis chuyển gen Cây Gen %Biểu Diệt sâu Thuốc Cry1Ab, đủ 0,0001-0,0005 Không Thuốc Cry1Ab, cắt ngắn 0,003-0,012 Có Thuốc Cry1Aa, đủ Không phát Không Thuốc Cry1Aa, cắt ngắn 0,00125 Có Thuốc Cry1Ac, cắt ngắn