BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Tên đề tài: NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TẠO RỄ BẤT ĐỊNH CỦA CÀ GAI LEO (SOLANUM HAINANENSE HANCE) IN VITRO VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG CHỐNG OXI HÓA CỦA CAO CHIẾT TỪ RỄ CÂY KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: NÔNG NGHIỆP – DƯỢC – MÔI TRƯỜNG CBHD: ThS Nguyễn Trần Đông Phương ThS Lao Đức Thuận SVTH: Đồng Văn Trọng MSSV: 1153010926 Khóa: 2011-2015 Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2015 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học trường Đại học Mở Tp.HCM tạo điều kiện cho em học tập rèn luyện môi trường tốt Em xin chân thành gửi cảm ơn tất quý thầy cô giáo môn khoa Công nghệ sinh học tận tình giảng dạy trang bị cho em kiến thức cần thiết suốt thời gian học đại học Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô Nguyễn Trần Đông Phương trực tiếp hướng dẫn truyền đạt cho em kiến thức kinh nghiệm quý báu suốt trình thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn thầy Lao Đức Thuận hướng dẫn, bảo em, giúp em hoàn thành khóa luận thật tốt Chân thành cảm ơn chị thành viên phòng thí nghiệm Công Nghệ Tế Bào Thực Vật, bạn nhóm thực đề tài thầy Thuận phòng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử nhiệt tình giúp đỡ suốt thời gian thực đề tài Cuối cùng, xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình Cảm ơn tình cảm mà ba mẹ anh chị dành cho con, ủng hộ động viên gia đình giúp vững bước đường học tập đường đời ii CÁC CHỮ VIẾT TẮT DPPH : 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl MS : Murashige & Skoog IAA : Indol-3-acetic NAA : 𝛼-naphthalen acetic acid Cs : Cộng iii DANH MỤC BẢNG Bảng II.1: Ảnh hưởng IAA trình tạo rễ bất định từ đoạn thân Cà gai leo in vitro 27 Bảng II.2: Ảnh hưởng NAA trình tạo rễ bất định từ đoạn thân Cà gai leo in vitro 28 Bảng II.3: Ảnh hưởng IAA trình tạo rễ bất định từ Cà gai leo in vitro 29 Bảng II.4: Ảnh hưởng NAA trình tạo rễ bất định từ Cà gai leo in vitro 30 Bảng III.1: Ảnh hưởng nồng độ IAA lên hình thành rễ bất định từ đoạn thân Cà gai leo in vitro 33 Bảng III.2: Ảnh hưởng nồng độ IAA lên hình thành rễ bất định từ Cà gai leo in vitro 35 Bảng III.3: Ảnh hưởng nồng độ NAA lên hình thành rễ bất định từ đoạn thân Cà gai leo in vitro 37 Bảng III.4: Ảnh hưởng nồng độ NAA lên hình thành rễ bất định từ Cà gai leo in vitro 39 Bảng III.5: Kết hoạt tính kháng oxi hóa mẫu cao chiết rễ Cà gai leo in vitro 43 iv DANH MỤC HÌNH Hình I.1: Cây Cà gai leo Hình 1.2: Công thức cấu tạo α-solasonine Hình 1.1: Mối quan hệ chất sơ cấp chất thứ cấp thực vật Hình 5.1 Phản ứng trung hòa gốc DPPH 22 Hình II.1: Ảnh minh họa vị trí lấy đoạn thân Cà gai leo mang nách 25 Hình III.1: Rễ bất định hình thành từ thân Cà gai leo in vitro sau tuần tuổi 34 Hình III.2: Rễ bất định hình thành từ Cà gai leo in vitro sau tuần tuổi 36 Hình III.3: Rễ bất định hình thành từ đoạn thân Cà gai leo in vitro sau tuần tuổi 38 Hình III.4: Rễ bất định hình thành từ Cà gai leo in vitro sau tuần tuổi 40 Hình III.5: Lá Cà gai leo in vitro 41 Hình III.6: Các giai đoạn hình thành rễ bất định Cà gai leo in vitro 42 Hình III.7: Bộ Soxhlet dịch cao chiết 44 v MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ii CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC BẢNG .iv DANH MỤC HÌNH v MỤC LỤC .vi ĐẶT VẤN ĐỀ I TỔNG QUAN TÀI LIỆU I.1 Giới thiệu Cà gai leo I.1.1 Sơ lược họ Solanaceae I.1.2 Vị trí phân loại Cà gai leo I.1.3 Đặc điểm hình thái Cà gai leo I.2 Hợp chất thứ cấp I.2.1 Giới thiệu I.2.2 Ứng dụng công nghệ tế bào thu nhận hợp chất thứ cấp I.2.3 Những yếu tố ảnh hưởng đến tạo hợp chất thứ cấp 10 I.2.4 Alkaloid 12 I.3 Nuôi cấy mô 13 I.3.1 Vai trò chất điều hòa sinh trưởng thực vật 13 I.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình nuôi cấy mô 14 I.3.3 Mô sẹo 16 I.3.4 Sự phát sinh hình thái 17 I.4 Sự kháng ôxi hóa 19 I.4.1 Khái niệm gốc tự 19 I.4.2 Lợi ích gốc tự thể 20 I.4.3 Tác hại gốc tự thể 20 I.5 Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa thử hoạt tính ức chế gốc tự DPPH 21 I.5.1 Nguyên tắc 22 vi II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY 23 II.1 Vật liệu 23 II.1.1 Địa điểm thời gian thực 23 II.1.2 Đối tượng nghiên cứu 23 II.1.3 Thiết bị dụng cụ 23 II.1.4 Môi trường nuôi cấy 24 II.1.5 Điều kiện nuôi cấy 24 II.1.6 Hoá chất dùng nuôi cấy mô 24 II.1.7 Hóa chất khảo sát khả kháng oxy hóa 24 II.2 Phương pháp nghiên cứu 25 II.2.1 Tạo rễ bất định Cà gai leo Solanum hainanense Hance 25 II.2.2 Khảo sát tạo rễ bất định từ 28 II.2.3 Khảo sát khả chống oxy hóa dịch chiết cao thô từ rễ Cà gai leo 30 III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 III.1 Khảo sát hình thành rễ bất định từ đoạn thân Cà gai leo in vitro môi trường có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật IAA 33 III.1.1 Khảo sát hình thành rễ bất định từ đoạn thân 33 III.1.2 Khảo sát hình thành rễ bất định từ 35 III.2 Khảo sát hình thành rễ bất định từ đoạn thân Cà gai leo in vitro môi trường có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật NAA 36 III.2.1 Khảo sát hình thành rễ bất định từ đoạn thân 37 III.2.2 Khảo sát hình thành rễ bất định từ 39 III.3 Khảo sát khả chống oxy hóa cao chiết từ rễ Cà gai leo 42 III.4 Thảo luận 44 IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46 IV.1 Kết luận 46 IV.2 Đề nghị 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 PHỤ LỤC i vii ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, song song với phát triển đất nước vấn đề đáng lo ngại tình trạng sức khỏe người bị đe dọa cách nghiêm trọng vấn nạn ô nhiễm môi trường hay nóng lên toàn cầu Trước mối nguy hại này, bệnh tật người ngày gia tăng, số ca bệnh liên quan đến nhóm bệnh truyền nhiễm (như nhiễm trùng đường hô hấp, cúm, viêm phổi …) tăng lên cách rõ rệt Nhằm đảm bảo sức khỏe điều trị nhu cầu sử dụng thuốc ngày gia tăng Tuy nhiên, loại thuốc sử dụng có nguồn gốc tổng hợp phương pháp hóa học nên nhiều mang lại tác dụng phụ không mong muốn cho người sử dụng Đặc biệt, việc tổng hợp hóa học phải tốn nhiều thời gian, trải qua nhiều công đoạn nhiều phản ứng tổng hợp để có hợp chất có tính dược lý trị bệnh Do đó, phương pháp tách chiết dược liệu có nguồn gốc tự nhiên nghiên cứu để khắc phục nhược điểm Thực vật nguồn dược liệu quý có sẵn tự nhiên, cung cấp hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học ứng dụng việc sản xuất dược phẩm Những hợp chất coi chất trao đổi thứ cấp diện với hàm lượng nhỏ Trong tự nhiên, hợp chất có vai trò việc chống lại tác nhân ngoại xâm vi sinh vật động vật (Nguyễn Hoàng Lộc, 2011) Trong năm gần đây, việc khai thác nguồn dược liệu tự nhiên từ thực vật trở thành vấn đề quan trọng mang tính toàn cầu Vấn đề đặt nơi sống tự nhiên loài thuốc bị biến nhanh chóng biến động điều kiện môi trường, địa lý khai thác bừa bãi người Kết dẫn đến cạn kiệt nguồn dược liệu thiên nhiên (Nguyễn Hoàng Lộc, 2011) Một giải pháp cho việc khắc phục vấn đề ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật, coi thay trì nguồn nguyên liệu cung cấp cho việc thu nhận hợp chất thứ cấp cho việc sản xuất sinh dược phẩm Việc lựa chọn phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật có nhiều ưu điểm (1) Cung cấp liên tục nguồn nguyên liệu cho việc tách chiết hoạt chất theo quy mô công nghiệp mà không phụ thuộc vào điều kiện tự nhiên; (2) Các nghiên cứu nuôi cấy tế bào thực vật cho thấy hàm lượng hoạt chất sinh học tích lũy tế bào thường cao nhiều lần so với quan tích lũy chúng tự nhiên Cà gai leo (Solanum hainanense Hance) thuốc quý, phân bố nhiều Việt Nam Trung Quốc, rễ chúng thường dùng làm thuốc chữa bệnh phong thấp, đau nhức xương, ho, rắn cắn,… (Đỗ Tất Lợi, 2004) Gần đây, nhiều tác dụng dược lý khác Cà gai leo phát chống viêm, chống oxy hóa, bảo vệ gan, ức chế tạo thành xơ gan, hạn chế phát triển khối u, làm bất hoạt virus gây bệnh mụn giộp người Herpes simplex, Herpes zoster Herpes genitalis, bảo vệ chuột chống lại xâm nhiễm vi khuẩn Salmonella typhimurium, giảm lượng cholesterol máu (Nguyễn Hoàng Lộc cs, 2010) Tuy nhiên, chưa có nhiều nghiên cứu khả tạo rễ bất định Cà gai leo in vitro Vì vậy, thực đề tài: “Nghiên cứu khả tạo rễ bất định Cà gai leo (Solanum hainanense Hance) in vitro khảo sát khả chống oxy hóa cao chiết từ rễ cây” nhằm tìm môi trường thích hợp để tạo nhiều rễ Từ tạo nguồn nguyên liệu thu nhận hợp chất thứ cấp alkaloid để sản xuất dược phẩm Đồng thời, bước đầu khảo sát khả chống oxi hóa cao chiết có rễ I TỔNG QUAN TÀI LIỆU I.1 Giới thiệu Cà gai leo Cây Cà gai leo thuộc họ Cà (Solanaceae) loại thân bụi ưa nắng, sống nhiều năm, thường trồng nước nhiệt đới I.1.1 Sơ lược họ Solanaceae [3] Họ Solanaceae gồm thân cỏ, sống một, hai năm hay nhiều năm bụi; gỗ nhỏ, gỗ to Lá mọc cách, kèm Hoa đều, lưỡng tính, mẫu Quả mọng mang đài lại nang Hạt nhiều, có nội nhũ, mầm cong hay thẳng Ở Việt Nam có 16 chi: Atrichodendron, Browallia, Brugmasia, Capsicum, Cestrum, Cyphomandra, Datura, Lycianthes, Lycium, Lycopersicon, Nicotiana, Petunia, Physalis, Solanum, Tubocapsicum; gần 50 loài I.1.2 Vị trí phân loại Cà gai leo [2] Giới: Plantae Ngành: Magnoliophyta Lớp: Magnoliopsida Bộ: Solanales Họ: Solanaceae Chi: Solanum Loài: Solanum hainanense Hance Tên đồng nghĩa: Solanum procumbens Lour Hình I.1: Cây Cà gai leo Tên thông thường: Cà gai dây, Cà vạnh, Cà quýnh, Cà lù, gai cườm, chẻ nam (Tày), b’ rongoon (Ba Na) thành cụm chồi nguyên nhân IAA (hormone thực vật nội sinh) nhạy cảm với nhiệt dễ bị phân hủy trình hấp tiệt trùng dẫn đến nồng độ IAA giảm thời gian nuôi cấy IAA sau cảm ứng mẫu kích thích tạo chồi phôi hàm lượng mô giảm dần (Nguyễn Đức Lượng, 2006) Ở nghiệm thức bổ sung NAA 0,4 mg/l vào môi trường nuôi cấy số rễ trung bình, chiều dài trung bình rễ cao so với nghiệm thức lại mẫu hình thành mô sẹo Nguyên nhân hình thành mô sẹo NAA hormone thực vật tổng hợp bền với nhiệt, không bị biến tính môi trường nuôi cấy, mô thực vật hấp thụ tốc độ phân tách xảy nhanh chóng, hoạt động gián tiếp mô thực vât (Nguyễn Đức Lượng, 2006) kết hoạt động gián tiếp hình thành mô sẹo Theo Bùi Trang Việt, auxin nồng độ cao kích thích tạo sơ khởi rễ, cản tăng trưởng sơ khởi Trong tạo rễ, auxin cần phối hợp với vitamin (như thiamin mà rễ không tổng hợp được), acid amin (như arginin), hợp chất ortho-diphenolic (như acid cafeic, acid cholorogenic) với kết hợp cho thấy IAA NAA kích thích tạo rễ mẫu Cà gai leo, làm hình thành rễ bất định so với đối chứng không tạo rễ Sự hình thành rễ bất định ẩn giấu biến đổi sâu sắc hoạt động mô học, tế bào chung tổ chức tách khỏi kiểm soát vào chức cho phép hình thành cấu trúc đỉnh sinh trưởng sơ khởi (Võ Thị Bạch Mai, 2004) Sự biến đổi thấy quan sát kính hiển vi, phẫu thức cho thấy tượng tạo rễ bất định từ Cà gai leo gồm hai giai đoạn điều phù hợp với kết nghiên cứu Bùi Trang Việt, 2000; Mai Trần Ngọc Tiếng, 1980: Giai đoạn một: hình thành sơ khởi rễ, tế bào hoạt hóa bó mạch với kích thước lớn, chứa thông tin di truyền cần thiết cho phân chia tế bào xảy mạnh mẽ để hình thành tế bào mô phân sinh rễ Auxin kích thích mạnh phân chia tế bào tượng tầng (tầng phát sinh libe – mộc) Giai đoạn hai: giai đoạn kéo dài tế bào sơ khởi Sự kéo dài rễ bao gồm kéo dài tế bào sẵn có tiếp tục phân chia tế bào sơ khởi rễ Giai đoạn hoạt hóa tế bào cần auxin nồng độ cao, giai đoạn kéo dài lại cần nồng độ auxin thấp (Bùi Trang Việt, 2000) Như rễ bất định khởi từ nhóm tế 45 bào sơ khởi nhỏ, nhóm tế bào phân chia, kéo dài phân ranh thành vùng cô lập với nhu mô bó dẫn truyền Vitamine tiến hành chọn làm đối chứng, vitamin nhiều công trình nghiên cứu khẳng định hoạt tính kháng oxy hóa, chẳng hạn theo công trình nghiên cứu Mammadov cs Về mẫu thử nghiệm, kết thu từ phương pháp bẫy gốc oxy hóa tự cho thấy cao methanol rễ Cà gai leo có khả kháng oxy hóa cao hoạt tính kháng oxy hóa vitamin C Khả kháng oxy cà gai leo Việt Nam nghiên cứu nhiều nhóm tác giả khác, chẳng hạn, Nguyen Quang Vinh cs, (năm 2011) công kết kháng oxy hóa với %I đạt 9.937% So sánh với kết này, kết kháng oxy thí nghiệm đạt 36,42% cao gấp gần lần kết Nguyen Quang Vinh cs Điều giải thích rằng, thực nghiệm chúng tôi, mẫu thử nghiệm thu nhận mẫu rễ bất định từ nuôi cấy in vitro, Nguyen Quang Vinh cs nghiên cứu mẫu thí nghiệm toàn Hơn nữa, theo nghiên cứu Srinivas K cs (2007) công bố hợp chất chủ yếu Cà gai leo solasodine Hợp chất thành phần có hoạt tính kháng oxy hóa mạnh thành phần khác Điều đáng ghi nhận hợp chất solasodine lại tập trung vào phần rễ nhiều có khả tan cồn Do đó, mẫu thí nghiệm rễ bất định chứa phần lớn hợp chất nên hoạt tính kháng oxy hóa cao so với công bố Nguyen Quang Vinh cs Tuy nhiên, kết ban đầu nghiên cứu này, việc định lượng xác hàm lượng thành phần solasodine chưa thực Đây hướng tiếp cận để phát triển khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa đặc tính khác hợp chất solasodine thu nhận từ rễ bất định Cà gai leo nuôi cấy theo phương pháp in vitro IV IV.1 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Từ kết thu qua thí nghiệm, rút kết luận sau: Lá tách từ chồi in vitro Cà gai leo có khả tạo rễ bất định tốt môi trường có bổ sung IAA 5,0 mg/l Hầu hết mẫu nuôi cấy môi trường 46 phân hóa tạo rễ bất định với nhiều rễ nhánh Rễ thu từ mẫu nuôi cấy đạt trung bình 17 rễ với chiều dài 5,115 cm Ngoài ra, mẫu hình thành cụm chồi, dùng cụm chồi để làm nguyên liệu cho việc nhân giống in vitro sử dụng để tiếp tục tạo rễ bất định, nhân sinh khối rễ để làm nguồn dược liệu Rễ bất định Cà gai leo hình thành in vitro trải qua giai đoạn giai đoạn hình thành sơ khởi rễ giai đoạn kéo dài Rễ bất định phát sinh từ tầng phát sinh libe-mộc Lá tách từ chồi in vitro Cà gai leo có khả tạo rễ bất định tốt môi trường có bổ sung NAA 0,4 mg/l Hầu hết mẫu nuôi cấy môi trường phân hóa tạo rễ bất định Rễ thu từ mẫu nuôi cấy đạt trung bình 17 rễ với chiều dài 1,962 cm Rễ bất định môi trường bổ sung NAA có kích thước lớn rễ nhánh, chiều dài ngắn Ngoài hình thành rễ mẫu hình thành mô sẹo với sinh khối lớn Cao chiết cồn từ rễ Cà gai leo in vitro có khả kháng oxi hóa phương pháp bẫy gốc tự DPPH với % ức chế 36,42 IV.2 Đề nghị Nếu có điều kiện, tiếp tục nghiên cứu: Thực quy trình tách chiết hợp chất solasodine từ rễ Cà gai leo Khảo sát khả chống oxi hóa solasodine 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Bộ môn dược liệu, (2010), Giáo trình nhận thức dược liệu, Trường Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh [2] Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Thu, Nguyễn Tập, Trần Toàn, (2006), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, tập I, NXB Khoa học kỹ thuật [3] Trương Thị Đẹp, (2011), Thực vật dược, NXB Giáo dục Việt Nam [4] Nguyễn Hoàng Lộc, (2010), “Nghiên cứu khả tích lũy số hoạt chất sinh học có giá trị từ nuôi cấy tế bào thực vật”, Bản tin khoa học công nghệ tỉnh Thừa Thiên Huế, trang 9-12 [5] Nguyễn Hoàng Lộc, Nguyễn Hữu Thuần Anh, (2014), “Công nghệ sinh khối giàu hoạt chất”, Hợp tác khoa học công nghệ phát triển bền vững nông nghiệp Lâm Đông-Tây Nguyên, trang 219-225 [6] Nguyễn Hoàng Lộc, (2006), Sản xuất hợp chất thứ cấp từ nuôi cấy tế bào thực vật, Viện tài nguyên khoa học công nghệ môi trường, Đại học Huế [7] Đỗ Tất Lợi, (2004), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, trang 546 [8] Nguyễn Đức Lượng, (2011), Công nghệ tế bào, NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh [9] Võ Thị Bạch Mai, (2004), Sự phát triển chồi rễ, NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh [10] Nguyễn Kim Phi Phụng, (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, NXB ĐH Quốc Gia TP HCM [11] Võ Thị Phước, Nguyễn Trần Đông Phương, (2013), Nhân giống in vitro định tính anthraquinon Hà thủ ô đỏ (Polygonum multiflorum Thunb), Khóa luận tốt nghiệp, Trường Đại học Mở TP.HCM 48 [12] Lê Thanh Tâm, (2010), Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa độc tính tế bào số hợp chất Lignan Stilbene, Luận văn thạc sỹ, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP.Hồ Chí Minh [13] Ngô Văn Thu, (2011), Bài giảng dược liệu , tập I, Trường đại học Dược Hà Nội [14] Mai Trần Ngọc Tiếng cs, (1980), Kích Thích Tố Giâm Cành, Phần II: Cơ chế tạo rễ bất định, Thông báo khoa học số 4, Đại học Tổng hợp TP Hồ Chí Minh, Trang 93-98 [15] Nguyễn Văn Uyển, (1993), Nuôi cấy mô thực vật phục vụ công tác giống trồng, NXB Nông nghiệp, TP Hồ Chí Minh [16] Bùi Trang Việt, (2000), Sinh lý thực vật đại cương, Phần II: Phát triển, NXB Đại học Quốc gia, TP Hồ Chí Minh [17] Amin I., Norazaidah Y., Hainida K.I., (2006), “Antioxidant Activity and Phenolic Content of Raw and Blanched Amaranthus Species”, Food Chem, 94, p47 [18] Connan S., Delisle F., Deslandes E., Gall A.E., (2006), “Intra-Thallus Phlorotannins content and antioxidant activity in phaeophyceae of temperate waters”, Bot Mar, 49, p39 [19] Donald Armstrong, (2002), “ Oxidants and Antioxidants”, Ultrastructure and Molecular Biology Protocols, Humana Press, Volume 196, 3-12 [20] Diouf P.N., Stevanovic T., Cloutier A., (2009) , “Antioxidant and AntiInflammatory Activities of Hot Water Extract from Picea Mariana Bark and Its Proanthocyanidin-Rich Fractions”, Food Chem, 113, p 897 [21] Gálvez M., Cordero C.M., Houghton P.J, Ayuso M.J, (2005), “Antioxidant Activity of Plantago bellardi”, All Phytother Res, 19, p 1074 [22] Hallibene B., (1991), “Reactive oxygen species in living systems”, Am.J.Med, 91: 14S [23] Jenifer Burns, Takao Yokota, Hiroshi Ashihara, Michael E J Lean, Alan Crozier, (2002), “Plant Foods and Herbal Sources of Resveratrol”, J Agric Food Chem, 50, p3337-3340 [24] Mammadov, Ramazan, Ili, Pinar, Ertem Vaizogullar, Havser, (2011), “Antioxidant Activity and Total Phenolic Content of Gagea fibrosa and Romulea ramiflora”, Faculty of Science and Art, Vol 30, No [25] Nguyen Hoang Loc, Nguyen Huu Thuan Anh, Doan Huu Nhat Binh, Moon-Sik Yang, Tae-Geum Kim, (2010), “Production of glycoalkaloid from callus 49 cultures of Solanum hainanense Hance”, Journal of Plant Biotechnology, 37, p96101 [26] Nguyen Hoang Loc, Le Thi Ha Thanh, (2011), “Solasodine production from cell culture of Solanum hainanense Hance”, Biotechnology and Bioprocess Engineering, 16, p581-586 [27] Nguyen Hoang Loc, Huynh Van Kiet, (2011), “Micropropagation of Solanum hainanense Hance”, Annals of Biological Research ,2(2), p394-398 [28] Paul M Dewick, (2009), Medicinal natural products, John Wiley & Sons, Ltd ISBN: 978-0-470-74168-9, p270 [29] Patrick C., Eklund, Otto K., L’angvik, Johan P., W’arn A., Tapio O., Salmi, Stefna M., Willf , Rainer E., SJ’ OHOLM, (2005), “Chemical studies on antioxidant mechanisms and free radical scavenging properties of lignans”, Org Biomol Chem, (3), 3336-3347 [30] Quang Vinh Nguyen, Jong-Bang Eun, (2011), “Antioxidant activity of solvent extracts from Vietnamese medicinal plants”, Journal of Medicinal Plant Research, vol 5(13), p 2798-2811 [31] Srinivas Koduru, F.O Jimoh, D.S Grierson, A.J.Afolayan, (2007), “Antioxidant activity of two steroid alkaloids extracted from Solanum aculeastrum”, Journal of Pharmacology and Toxicology, (2), p160-167 [32] Tejas Sharma, Vishal Airao, Nimesh Panara, Devendra Vaishnav, Vishavas Ranpariya, Navin Sheth, Sachin Parmar, (2014), “Solasodine protects rat brain against ischemia/reperfusion injury through its antioxidant activity”, European journal of Pharmacology, 725, p40-46 [33] Turkmen N., Velioglu Y.S., Sari F., (2007), “Effect of extraction condition on Measured total Polyphenol Contents and antioxidant and antibacterial activities of Black Tea”, Molecules, 12, p484 50 PHỤ LỤC I Thành phần môi trường MS (Murashige Skoog) BẢNG 1: THÀNH PHẦN MUỐI KHOÁNG CƠ BẢN (mg/l) Skoog I Skoog II Skoog III NH4NO3 1650,00 KNO3 1900,00 KH2PO4 170,00 MgSO4.7H2O 370,00 CaCl2.2H2O 440,00 Na2EDTA 37,30 FeSO4.7H2O 27,80 Mn2SO4.4H2O 22,30 H3BO3 6,20 ZnSO4.7H2O 8,60 KI 0,83 Na2MoO4.2H2O 0,25 CuSO4.5H2O 0,025 CoCl2.6H2O 0,025 BẢNG 2: THÀNH PHẦN VITAMIN CỦA MOREL (mg/l) Morel’s Vitamin Pirydoxine (B6) 1,00 Biotin (II) 0,01 Meso-inositol 100,00 Nicotinic Acid (P.P) 1,00 Thiamin-HCl (B1) 1,00 Pantotheate-Ca 1,00 i II Phân tích thống kê ANOVA II.1 Kết xử lý thống kê thí nghiệm tạo rễ bất định Cà gao leo môi trường MS bổ sung IAA II.1.1 Thống kê số rễ từ đoạn thân Cà gai leo môi bổ trường MS sung IAA a/ ANOVA Table for SC by NT ANOVA Table for so luong re by nghiem thuc Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 1080.99 216.197 6.56 0.0000 Within groups 2373.85 72 32.9701 Total (Corr.) 3454.83 77 b/ Table of Means for KL by NT with 95.0 percent LSD intervals Table of Means for so luong re by nghiem thuc with 95.0 percent LSD intervals -Stnd error nghiem thuc Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit -1 13 2.46154 1.59253 0.216713 4.70636 13 1.23077 1.59253 -1.01406 3.47559 13 1.23077 1.59253 -1.01406 3.47559 13 2.84615 1.59253 0.601329 5.09098 13 11.2308 1.59253 8.98594 13.4756 doi chung 13 0.0 1.59253 -2.24483 2.24483 -Total 78 3.16667 c/ Multiple Range Tests for SC by NT Multiple Range Tests for so luong re by nghiem thuc -Method: 95.0 percent Duncan nghiem thuc Count Mean Homogeneous Groups -doi chung 13 0.0 X 13 1.23077 X 13 1.23077 X 13 2.46154 X 13 2.84615 X 13 11.2308 X -Contrast Difference -1 - 1.23077 ii II.1.2 Thống kê chiều dài rễ từ đoạn thân Cà gai leo môi trường MS bổ sung IAA a/ ANOVA Table for SC by NT ANOVA Table for chieu dai re by nghiem thuc Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 184.211 36.8423 2.39 0.0462 Within groups 1110.6 72 15.425 Total (Corr.) 1294.81 77 b/ Table of Means for KL by NT with 95.0 percent LSD intervals Table of Means for chieu dai re by nghiem thuc with 95.0 percent LSD intervals -Stnd error nghiem thuc Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit -1 13 3.34615 1.08928 1.8107 4.8816 13 2.24615 1.08928 0.710704 3.7816 13 0.846154 1.08928 -0.689296 2.3816 13 2.82308 1.08928 1.28763 4.35853 13 4.62308 1.08928 3.08763 6.15853 doi chung 13 0.0 1.08928 -1.53545 1.53545 -Total 78 2.3141 c/ Multiple Range Tests for SC by NT Multiple Range Tests for chieu dai re by nghiem thuc -Method: 95.0 percent LSD nghiem thuc Count Mean Homogeneous Groups -doi chung 13 0.0 X 13 0.846154 XX 13 2.24615 XXX 13 2.82308 XXX 13 3.34615 XX 13 4.62308 X -Contrast Difference +/- Limits iii II.1.3 Thống kê số lượng rễ từ Cà gai leo môi trường MS bổ sung IAA a/ ANOVA Table for SC by NT ANOVA Table for so luong re by nghiem thuc Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 5722.87 1144.57 6.55 0.0000 Within groups 12588.9 72 174.846 Total (Corr.) 18311.8 77 b/ Table of Means for KL by NT with 95.0 percent LSD intervals Table of Means for so luong re by nghiem thuc with 95.0 percent LSD intervals -Stnd error nghiem thuc Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit -1 13 25.1538 3.66738 19.9843 30.3234 13 16.3077 3.66738 11.1382 21.4772 13 7.69231 3.66738 2.52278 12.8618 13 4.15385 3.66738 -1.01568 9.32337 13 17.0 3.66738 11.8305 22.1695 doi chung 13 0.0 3.66738 -5.16952 5.16952 -Total 78 11.7179 c/ Multiple Range Tests for SC by NT Multiple Range Tests for so luong re by nghiem thuc -Method: 95.0 percent Duncan nghiem thuc Count Mean Homogeneous Groups -doi chung 13 0.0 X 13 4.15385 X 13 7.69231 XX 13 16.3077 XX 13 17.0 XX 13 25.1538 X iv II.1.4 Thống kê chiều dài rễ từ Cà gai leo môi trường MS bổ sung IAA a/ ANOVA Table for SC by NT ANOVA Table for chieu dai re by nghiem thuc Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 245.036 49.0073 3.08 0.0141 Within groups 1144.33 72 15.8935 Total (Corr.) 1389.37 77 b/ Table of Means for KL by NT with 95.0 percent LSD intervals Table of Means for chieu dai re by nghiem thuc with 95.0 percent LSD intervals -Stnd error nghiem thuc Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit -1 13 3.87692 1.1057 2.31833 5.43551 13 4.86923 1.1057 3.31064 6.42782 13 4.66923 1.1057 3.11064 6.22782 13 2.71538 1.1057 1.15679 4.27398 13 5.11538 1.1057 3.55679 6.67398 doi chung 13 0.0 1.1057 -1.55859 1.55859 -Total 78 3.54103 c/ Multiple Range Tests for SC by NT Multiple Range Tests for chieu dai re by nghiem thuc -Method: 95.0 percent Duncan nghiem thuc Count Mean Homogeneous Groups -doi chung 13 0.0 X 13 2.71538 XX 13 3.87692 X 13 4.66923 X 13 4.86923 X 13 5.11538 X v II.2 Kết xử lý thống kê thí nghiệm tạo rễ bất định Cà gao leo môi trường MS bổ sung NAA II.2.1 Thống kê số rễ từ đoạn thân Cà gai leo môi bổ trường MS sung NAA a/ ANOVA Table for SC by NT ANOVA Table for SO LUONG RE by NGHIEM THUC Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 2562.72 512.544 5.75 0.0002 Within groups 6414.62 72 89.0919 Total (Corr.) 8977.33 77 b/ Table of Means for KL by NT with 95.0 percent LSD intervals Table of Means for SO LUONG RE by NGHIEM THUC with 95.0 percent LSD intervals -Stnd error NGHIEM THUC Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit -0.2 13 18.0 2.61787 14.3099 21.6901 0.4 13 10.6154 2.61787 6.92526 14.3055 0.6 13 5.46154 2.61787 1.77141 9.15167 0.8 13 3.53846 2.61787 -0.151667 7.22859 1.0 13 6.38462 2.61787 2.69449 10.0747 DOI CHUNG 13 0.0 2.61787 -3.69013 3.69013 -Total 78 7.33333 c/ Multiple Range Tests for SC by NT Multiple Range Tests for SO LUONG RE by NGHIEM THUC -Method: 95.0 percent Duncan NGHIEM THUC Count Mean Homogeneous Groups -DOI CHUNG 13 0.0 X 0.8 13 3.53846 XX 0.6 13 5.46154 XX 1.0 13 6.38462 XX 0.4 13 10.6154 X 0.2 13 18.0 X -Contrast Difference vi II.2.2 Thống kê chiều dài rễ từ đoạn thân Cà gai leo môi bổ trường MS sung NAA a/ ANOVA Table for SC by NT ANOVA Table for CHIEU DAI RE by NGHIEM THUC Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 215.093 43.0187 11.80 0.0000 Within groups 262.545 72 3.64645 Total (Corr.) 477.638 77 b/ Table of Means for KL by NT with 95.0 percent LSD intervals Table of Means for CHIEU DAI RE by NGHIEM THUC with 95.0 percent LSD intervals -Stnd error NGHIEM THUC Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit -0.2 13 3.41538 0.529619 2.66884 4.16193 0.4 13 4.59231 0.529619 3.84576 5.33886 0.6 13 2.05385 0.529619 1.3073 2.80039 0.8 13 1.01538 0.529619 0.268837 1.76193 1.0 13 0.292308 0.529619 -0.45424 1.03886 DOI CHUNG 13 0.0 0.529619 -0.746548 0.746548 -Total 78 1.89487 c/ Multiple Range Tests for SC by NT Multiple Range Tests for CHIEU DAI RE by NGHIEM THUC -Method: 95.0 percent LSD NGHIEM THUC Count Mean Homogeneous Groups -DOI CHUNG 13 0.0 X 1.0 13 0.292308 X 0.8 13 1.01538 XX 0.6 13 2.05385 XX 0.2 13 3.41538 XX 0.4 13 4.59231 X vii II.2.3 Thống kê số lượng rễ từ Cà gai leo môi bổ trường MS sung NAA a/ ANOVA Table for SC by NT ANOVA Table for SO LUONG RE by NGHIEM THUC Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 2981.03 596.205 3.56 0.0062 Within groups 12041.8 72 167.248 Total (Corr.) 15022.9 77 b/ Table of Means for KL by NT with 95.0 percent LSD intervals Table of Means for SO LUONG RE by NGHIEM THUC with 95.0 percent LSD intervals -Stnd error NGHIEM THUC Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit -0.2 13 3.38462 3.58681 -1.67133 8.44057 0.4 13 17.0 3.58681 11.944 22.056 0.6 13 14.0769 3.58681 9.02097 19.1329 0.8 13 14.3846 3.58681 9.32867 19.4406 1.0 13 8.69231 3.58681 3.63636 13.7483 DOI CHUNG 13 0.0 3.58681 -5.05595 5.05595 -Total 78 9.58974 c/ Multiple Range Tests for SC by NT Multiple Range Tests for SO LUONG RE by NGHIEM THUC -Method: 95.0 percent Duncan NGHIEM THUC Count Mean Homogeneous Groups -DOI CHUNG 13 0.0 X 0.2 13 3.38462 X 1.0 13 8.69231 XX 0.6 13 14.0769 X 0.8 13 14.3846 X 0.4 13 17.0 X viii II.2.4 Thống kê chiều dài rễ từ Cà gai leo môi bổ trường MS sung NAA a/ ANOVA Table for SC by NT ANOVA Table for CHIEU DAI RE by NGHIEM THUC Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 74.756 14.9512 9.54 0.0000 Within groups 112.794 72 1.56658 Total (Corr.) 187.55 77 b/ Table of Means for KL by NT with 95.0 percent LSD intervals Table of Means for CHIEU DAI RE by NGHIEM THUC with 95.0 percent LSD intervals -Stnd error NGHIEM THUC Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit -0.2 13 0.376923 0.34714 -0.112404 0.86625 0.4 13 1.96154 0.34714 1.47221 2.45087 0.6 13 2.8 0.34714 2.31067 3.28933 0.8 13 1.49231 0.34714 1.00298 1.98163 1.0 13 0.561538 0.34714 0.0722117 1.05087 DOI CHUNG 13 0.0 0.34714 -0.489327 0.489327 -Total 78 1.19872 c/ Multiple Range Tests for SC by NT Multiple Range Tests for CHIEU DAI RE by NGHIEM THUC -Method: 95.0 percent Duncan NGHIEM THUC Count Mean Homogeneous Groups -DOI CHUNG 13 0.0 X 0.2 13 0.376923 X 1.0 13 0.561538 XX 0.8 13 1.49231 XX 0.4 13 1.96154 XX 0.6 13 2.8 X ix [...]... minh họa vị trí lấy đoạn thân Cà gai leo mang nách lá Thí nghiệm 1: Khảo sát khả năng tạo rễ bất định từ đoạn thân Cà Gai Leo trong môi trường MS có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật IAA Mục đích thí nghiệm: Khảo sát nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật IAA trong môi trường MS ảnh hưởng đến khả năng tạo rễ bất định của đoạn thân 25 Mô tả thí nghiệm: Cấy đoạn thân Cà gai leo in vitro vào... hưởng của IAA trong quá trình tạo rễ bất định từ đoạn thân Cà gai leo in vitro NT Nồng độ IAA mg/l DC 0 I1 1 I2 2 I3 3 I4 4 I5 5 Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng tạo rễ bất định từ đoạn thân Cà gai leo trong môi trường MS có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật NAA Mục đích thí nghiệm: Khảo sát nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật NAA trong môi trường MS ảnh hưởng đến khả năng tạo rễ bất định. .. 4 N5 5 Khảo sát sự tạo rễ bất định từ lá Mục đích thí nghiệm: Khảo sát nồng độ chất điều hòa tăng trưởng thực vật nhằm tìm ra môi trường tạo ra nhiều rễ nhất từ đoạn thân in vitro Vật liệu thí nghiệm: Lá ở vị trí thứ 2, 3, 4 từ chồi in vitro từ chồi Cà gai leo in vitro sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường MS cơ bản Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng tạo rễ bất định từ lá Cà gai leo trong môi trường MS... 2013, Statgraphic Plus 3.0 II.2.1 Tạo rễ bất định cây Cà gai leo Solanum hainanense Hance II.2.1.1 Khảo sát sự tạo rễ bất định từ đoạn thân Mục đích thí nghiệm: Khảo sát nồng độ chất điều hòa tăng trưởng thực vật nhằm tìm ra môi trường tạo ra nhiều rễ nhất từ đoạn thân in vitro Vật liệu thí nghiệm: Đoạn thân dài 1-1,5 cm ở vị trí thứ 2, 3, 4 của cây Cà gai leo in vitro sau 4 tuần nuôi cấy trong môi... gốc của cây bị tiêu hủy Ở các cây Đa, rễ phụ nảy sinh từ những nhánh trên cao, lúc đầu nhỏ, nhưng khi đụng đất rễ ấy phù to ra thành cột nâng đỡ cành Rễ bất định có thể có ở trụ hạ diệp của một cây con, ở các mấu và lóng của thân và ở rễ Hầu hết rễ bất định phát sinh kiểu nội sinh, mặc dù vẫn có những trường hợp phát sinh ngoại sinh Các rễ bất định sinh trên thân tạo ra hệ thống rễ chính ở các cây. .. là 13 Cà gai leo tỏ ra không độc trong thí nghiệm về độc tính cấp và bán cấp - Sơ đồ nghiên cứu định lượng sinh học hoạt lực chống viêm thấy 1g rễ Cà gai leo khô tương ứng với 2,5mg hydrocortisone, và 1g thân lá Cà gai leo tương ứng 1,3mg hydrocortisone Rễ Cà gai leo chống độc lực của nọc rắn cobra trên chuột nhắt trắng và thấy Cà gai leo có tác dụng bảo vệ chuột thí nghiệm chống độc lực liều cao nọc... nghiệm 4: Khảo sát khả năng tạo rễ bất định từ lá Cà gai leo trong môi trường MS có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật NAA Vật liệu thí nghiệm: Lá ở vị trí thứ 2, 3, 4 từ chồi in vitro từ chồi Cà gai leo in vitro sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường MS cơ bản Môi trường nuôi cấy: Môi trường MS bổ sung chất điều hòa tăng trưởng NAA theo bảng II.4 Mô tả thí nghiệm: Cấy lá Cà gai leo in vitro vào môi... thấp, hầu hết cây một lá mầm, cây hai lá mầm nhân giống bằng thân và rễ hoặc thân bò, các cây thủy sinh, các cây sống hoại sinh và ký sinh Rễ được hình thành trên cành giâm cũng là những rễ bất định Sự hình thành rễ bất định gồm ít ra là hai giai đoạn có thể phân biệt được dưới kính hiển vi (Mai Trần Ngọc Tiếng và cộng sự, 1980): giai đoạn tạo sơ 18 khởi rễ từ vài tế bào của tầng phát sinh libe - mộc... 2000) Auxin ở nồng độ cao kích thích sự tạo sơ khởi rễ nhưng cản sự tăng trưởng của các sơ khởi rễ này (Mai Trần Ngọc Tiếng và Cs, 1980) Auxin được vận chuyển hướng gốc, tích lũy ở phần gốc của khúc cắt trụ hạ diệp của cà chua và cảm ứng sự hình thành rễ bất định (Kuroha và Cs, 2002) Trong sự tạo rễ, auxin cần phối hợp với các vitamin (như thiamin mà rễ không tổng hợp được), acid amin (như arginin), nhất... không uống Cà gai leo Các nghiên cứu thăm dò khả năng chống co thắt phế quản của một số thuốc chữa hen cổ truyền bằng phương pháp khí dung histamine của armitage và thấy Cà gai leo có tác dụng kéo dài thời gian chịu đựng của chuột được uống thuốc và đặt trong buồng khí dung, làm thời gian triệu chứng khó thở chậm hơn so với chuột đối chứng không uống Cà gai leo Việc nghiên cứu thăm dò khả năng ngăn