LỜI CẢM ƠN Luận văn đƣợc hoàn thành Phòng thí nghiệm Khoa Hoá pháp Viện Pháp Y Quốc Gia Em xin bày tỏ lòng biết ơn đến TS Trần Thị Thúy PGS Trần Việt Hùng,ThS.Phạm Quốc Chinh ngƣời tạo điều kiện, hƣớng dẫn, tận tình bảo em suốt trình học tập nghiên cứu Em xin trân trọng cám ơn tới Ban Giám đốc Viện Pháp y Quốc gia Ban chủ nhiệm Viện Kỹ thuật Hóa học thầy cô giáo tổ môn Hóa phân tích giúp đỡ tạo điều kiện để em hoàn thành luận văn Em xin chân thành cảm ơn bạn bè, ngƣời thân ủng hộ động viên em suốt trình em thực đề tài Hà Nội, ngày tháng Lê Thu Thảo năm2015 AM DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Amphetamin MA-d5 Methamphetamine-d5 ATS Các chất kích thích thần kinh dạng amphetamin (Amphetamine Type Stimulants) CTPT Công thức phân tử DMA 2,5-Dimethoxyamphetamin GC Sắc ký khí (Gas Chromatography) GC-FID Sắc ký khí với detector ion hóa lửa (Gas Chromatography – Flame Ionization Detector) GC-MS Sắc ký khí khối phổ (Gas Chromatography–Mass Spectrometry) HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao (High Performance Liquid Chromatography) KLPT Khối lƣợng phân tử LC-MS Sắc ký lỏng khối phổ (Liquid Chromatography–Mass Spectrometry) LOD Giới hạn phát (Limit Of Detection) LOQ Giới hạn định lƣợng (Limit Of Quantitation) MA Methamphetamin MDMA 3,4-Methylendioxymethamphetamin MS Khối phổ (Mass Spectrometry) RSD Độ lệch chuẩn tƣơng đối (Relative Standard Deviation) HFBA Hepta Fluoro Butyric Acid TLC Sắc kí lớp mỏng (Thin Layer Chromatography) MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Đặt vấn đề CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan ma túy 1.1.1 Định nghĩa [2] 1.1.2 Phân loại chất ma túy:[3-4] 1.2.Tổng quan nhóm ATS 1.3 Tổng quan methamphetamine Methylendioxymethamphetamin [9-10];[23] 1.3.1 Công thức cấu tạo tính chất lý hóa MA: 1.3.2 Công thức cấu tạo tính chất hóa lý MDMA 1.3.3 Tác dụng dược lý dược động học MA, MDMA [11];[5];[20-21] 1.3.3.1 Tác dụng dƣợc lý 1.3.3.2 Dƣợc động học 1.4 Tổng quan kỹ thuật xử lý mẫu thƣờng dùng phân tích ma túy 11 1.4.1 Kỹ thuật chiết lỏng -lỏng 11 1.4.2 Kỹ thuật chiết pha rắn [33];[31] 11 1.4.3 Kỹ thuật vi chiết pha rắn 13 1.4.4 Kỹ thuật dẫn xuất hóa tác nhân acyl 14 1.4.5.Các phương pháp xử lý để chiết MA,MDMA tóc [28-30] 14 1.5 Tổng quan sắc kí khí khối phổ (GC-MS) 15 1.5.1 Khái niệm 15 1.5.2 Hệ thống GC-MS 15 1.5.3 Một số kỹ thuật MS 18 1.6 Các phương pháp xác định MA,MDMA tóc 19 1.6.1 Phương pháp sắc ký khí khối phổ: 19 1.6.2 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS): 19 1.6.3 Phương pháp miễn dịch 19 CHƢƠNG II: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Nguyên liệu, thiết bị: 20 2.2 Nội dung nghiên cứu: 21 2.2.1 Xây dựng phương pháp định lượng MA, MDMA tóc 21 2.2.2 Ứng dụng phân tích MA, MDMA mẫu thực 21 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu: 21 2.3.1 Lấy mẫu bảo quản mẫu 21 2.3.2 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu 21 2.3.3 Xử lý mẫu 21 2.3.4 Định tính định lượng MA MDMA 22 2.3.4.1 Lựa chọn nội chuẩn chất tạo dẫn xuất 22 2.3.4.2 Khảo sát phổ khối MA, MDMA MA-d5 22 2.3.4.3 Khảo sát xây dựng chương trình sắc ký 23 2.3.4.4 Khảo sát nhiệt độ tạo dẫn xuất 23 2.3.4.5 Thẩm định phương pháp phân tích 23 2.3.4.6 Phân tích mẫu tính kết 25 2.4 Áp dụng quy trình để phân tích mẫu thực tế 25 2.5 phƣơng pháp xử lý số liệu 25 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ ẬN .26 3.1 Khảo sát phổ khối MA-HFBA,MDMA-HFBA MA-d5-HFBA 26 3.2 Khảo sát chƣơng trình 27 3.3.Khảo sát nhiệt độ tạo dẫn xuất 29 3.4 Thiết lập chƣơng trình GC/MS định tính, định lƣợng MA, MDMA 30 3.5 Thẩm định phƣơng pháp: 31 3.5.1.Tính phù hợp hệ thống 31 3.5.2 Đánh giá độ đặc hiệu tính chọn lọc phương pháp 32 3.5.3 Khoảng tuyến tính 33 3.5.4 Độ phương pháp 35 36 3.5.6.Hiệu suất chiết 37 Ứng dụng phân tích mẫu tóc thực tế 38 THẢO LUẬN .41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Công thức số ATS điểm hình Bảng 3.1: Mảnh phổ MA, MDMA, MA-d5 sau dẫn xuất với HFBA 27 Bảng 3.2: Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống phƣơng pháp 31 Bả 34 Bảng 3.4 Kết khảo sát độ độ xác 35 Bảng 3.5 Kết khảo sát hiệu suất chiết 37 Bảng 3.6 Kết định lƣợng số mẫu thực 38 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Một số dạng ma túy tổng hợp ATS thị trƣờng ma túy Việt Nam Hình 1.2: Methylamphetamin dạng tinh thể Hình1.3 Sơ đồ chuyển hoá methamphetamin Hình 1.4 Sơ đồ chuyển hóa MDMA .9 Hình 1.5 Cấu trúc tóc 10 ết bị vi chiết pha rắn .13 Hình 1.7 Sơ đồ máy sắc ký khí khối phổ .16 Hình 1.8 Sơ đồ khối máy khối phổ 18 Hình 2.1 Máy sắc ký khí khối phổ Agligent Technologies 6980N 20 Hình 3.1 Hình phổ khối MA – HFBA 26 Hình 3.2 Hình phổ khối MDMA- HFBA 26 Hình 3.3:Hình phổ khối MA-d5- HFBA 26 Hình 3.4:Sắc kí đồ mẫu chuẩn chạy chƣơng trình số 27 Hình 3.5: Sắc kí đồ mẫu chuẩn chạy chƣơng trình số 28 Hình 3.6: Sắc kí đồ mẫu chuẩn chạy chƣơng trình số 28 Hình 3.8: Sắc kí đồ ghi MA-HFBA ,MDMA-HFBA 600C 29 Hình 3.9: Sắc kí đồ ghi MA-HFBA ,MDMA-HFBA 700C 29 Hình 3.10: Sắc kí đồ ghi MA-HFBA ,MDMA-HFBA 800C 29 Hình 3.11 Sắc ký đồ TIC chất chuẩn (MA, MDMA MA-d5) tạo dẫn xuất với HFBA 30 Hình 3.12 Sắc ký đồ SIM chất chuẩn (MA, MDMA MA-d5) tạo dẫn xuất với HFBA 31 Hình 3.13 : Sắc ký đồ mẫu tóc trắng 32 Hình 3.14.Sắc ký đồ mẫu tóc trắng thêm chuẩn 33 Hình 3.15 : Đồ thị biểu diễn phụ thuộc tuyến tính tín hiệu đáp ứng (tỷ số diện tích pic MA/MA-d5) với hàm lƣợng mẫu nhiễm 34 Hình 3.16: Đồ thị biểu diễn phụ thuộc tuyến tính tín hiệu đáp ứng (tỷ số diện tích pic MDMA/MA-d5) với hàm lƣợng mẫu nhiễm 35 Hình 3.17: Khảo sát LOD LOQ MA 37 Hình 3.18: Khảo sát LOD LOQ MDMA 37 Hình 3.19 :Sắc kí đồ phân tích mẫu Nguyễn Quang A 38 Hình 3.20 :Sắc kí đồ phân tích mẫu Lê Mạnh Q 39 Hình 3.21 : Sắc kí đồ phân tích mẫu Trần Ngọc T .39 Hình 3.22 : Sắc kí đồ phân tích mẫu Phạm Bình D 39 Hình 3.23 : Sắc kí đồ phân tích mẫu Trần Văn T 40 Đặt vấn đề Tệ nạn ma túy hiểm họa lớn nhân loại Tình hình tệ nạn ma túy diễn phức tạp tiềm ẩn khó lƣờng có xu hƣớng gia tăng số lƣợng ngƣời nghiện tội phạm ma túy, tính chất hành động ngày tinh vi, xảo quyệt manh động Ma túy làm suy thoái nhân cách, phẩm giá, tàn phá sống gia đình gây xói mòn đạo lý, làm gia tăng tội phạm,bạo lực, tham nhũng, vắt kiệt nguồn nhân lực, tài quốc gia, dân tộc Theo số liệu Cơ quan Phòng chống ma túy tội phạm Liên Hiệp Quốc- UNODC (United Nations Office on Drugs and Crime), có tới 4% dân số thƣờng xuyên sử dụng ma túy, tức khoảng 230 triệu ngƣời, khoảng 37 triệu ngƣời lạm dụng ma tuý tổng hợp ATS (amphetamine type stimulants) số có tới 60% thuộc khu vực Đông Đông Nam Á Ở Việt Nam, nƣớc có khoảng 171.000 ngƣời nghiện ma túy Đối tƣợng sử dụng ATS chiếm khoảng 25-30% tổng số ngƣời nghiện Trong chủ yếu học sinh, sinh viên, niên độ tuổi 16-30, nhƣng có tham gia nhiều cán bộ, công chức, văn nghệ sỹ, vận động viên… Từ năm 2008 đến nay, tình trạng mua bán, vận chuyển sử dụng trái phép ATS ngày gia tăng mạnh Số vụ đối tƣợng bị bắt giữ tăng khoảng 30% hàng năm ATS xâm nhập sâu vào xã hội, không vũ trƣờng, quán bar, nhà nghỉ thành phố lớn mà lan đến khu vực nông thôn, vùng sâu, vùng xa Để thực hiên tốt công tác phòng chống hành vi bất hợp pháp liên quan tới loại ma túy trên, công việc kiểm nghiệm phát ATS đóng vai trò không nhỏ Ở Việt Nam phổ biến dùng test thử nhanh, sắc kí lỏng hay sắc kí khí; số quan giám định bắt đầu nghiên cứu dùng sắc kí khí khối phổ GCMS, sắc kí lỏng khối phổ LC-MS để phân tích mẫu vật máu, nƣớc tiểu, nhiên chƣa có nghiên cứu sử dụng GC-MS phân tích mẫu tóc mẫu tóc mẫu vật tiện lợi để xác định nhanh chóng ATS Những kết nghiên cứu gần cho thấy qua sợi tóc, thầy thuốc phát đƣợc không tình trạng sức khoẻ mà tình hình sử dụng ma túy ngƣời sử dụng Sợi tóc cho biết loại ma túy chủ nhân sử dụng mức độ nghiện hút ngƣời khứ lẫn Đây bí mật mà nhiều xét nghiệm máu nƣớc tiểu tinh vi không phát đƣợc Xuất phát từ lý tiến hành đề tài “ Nghiên cứu chất ma túy tổng hợp methamphetamin(MA) methylenedioxymethamphetamin(MDMA) ” Nội dung nghiên cứu đề tài: 1 Xây dựng quy trình xử lí mẫu chƣơng trình sắc kí khí khối phổ để định tính, định lƣợng MA MDMA tóc Thẩm định phƣơng pháp đề áp dụng phân tích mẫu tóc thực tế đƣợc gửi tới khoa Hóa Pháp Viện Pháp Y Quốc Gia TB 6,892 408686 8,706 289830 SD 0,024 2350,243 0,0028 2063,338 RSD (%) 0,359 0,5728 0,325 0,7119 bảng cho thấy thời gian lƣu có (RSD Hình 3.13 : Sắc ký đồ mẫu tóc trắng 32 0 Abundance 25000 I o n 0 (2 t o ): 0 0 D \ d a t a m s 20000 15000 10000 5000 0 6 6 0 7 7 8 0 8 8 0 9 T im e > Abundance 25000 I o n 0 (2 t o ): 0 0 D \ d a t a m s 20000 15000 10000 5000 0 6 6 0 7 7 8 0 8 8 0 9 T im e > Hình 3.14.Sắc ký đồ mẫu tóc trắng thêm chuẩn Nhận xét: Trên sắc ký đồ mẫu trắng, thời gian lƣu MA, MDMA MA-d5 không thấy xuất pic Sắc ký đồ mẫu tóc trắng thêm MA, MDMA MA-d5 có pic xuất 6,873 phút, 8,702 phút 6,859 phút ứng với giá trị sắc ký đồ chất chuẩn MA, MDMA MA-d5 khảo sát Kết xác nhận phƣơng pháp sắc ký có tính chọn lọc độ đặc hiệu 3.5.3 Khoảng tuyến tính Khoảng tuyến tính MA, MDMA đƣợc khả ảng nồng độ 5ng/ml đến 200ng/ml, nồng độ chất nội chuẩn cố định 100ng/ml Trong khoảng nồng độ tiến hành phân tích điểm chuẩn Mỗi điểm nồng độ có chứa hỗn hợp chất chuẩn MA, MDMA, MA-d5, sau kh ẫu 1ml ethylacetate, giá trị trung bình Kết khảo sát khoảng tuyến tính đƣa đƣợc đồ thị biểu diễn mối tƣơng quan tuyến tính tỷ lệ diện tích chất phân tích (MA, MDMA) chất nội chuẩn (MA-d5) nồng độ chất phân tích chất phân tích chia cho chất nội chuẩn Từ xác định đƣợc phƣơng trình hồi quy chất sở để định lƣợng chất phân tích 33 Bảng 3.3 n Nồng độ chất (ng/ml) ,MDMA Tỉ lệ diện tich pic MA, MDMA MA-HFBA/MA-d5-HFBA MDMA-HFBA/MA-d5-HFBA 0,05843 0,05108 10 0,09451 0,07679 50 0,46958 0,36285 100 0,98808 0,77427 200 1,88467 1,45539 Hình 3.15 : Đồ thị biểu diễn phụ thuộc tuyến tính tín hiệu đáp ứng (tỷ số diện tích pic MA/MA-d5) với hàm lƣợng mẫu nhiễm 34 Hình 3.16: Đồ thị biểu diễn phụ thuộc tuyến tính tín hiệu đáp ứng (tỷ số diện tích pic MDMA/MA-d5) với hàm lƣợng mẫu nhiễm  Nhận xét: Kết cho thấy khoảng hàm lƣợng 5ng-200ng, có tƣơng quan tuyến tính chặt chẽ tín hiệu đáp ứng với hàm lƣợng mẫu nhiễm với hệ số tƣơng quan lần lƣợt là: R12= 0,9993 R22=0,9989 3.5.4 Độ phương pháp Độ thể mức độ gần giá trị trung bình kết thử nghiệm với giá trị thực giá trị đƣợc chấp nhận Độ khảo sát qua độ thu hồi Độ thu hồi (R %) quy trình phân tích đƣợc thực cách thêm mẫu chuẩn hỗn hợp MA, MDMA, MA-d5 vào mẫu máu, Bảng 3.4 Kết khảo sát độ độ xác Bảng độ đúng, độ xác Lƣợng thêm vào lần tiêm tỉ số MA/MA d5 Tỉ số MDMA/MAd5 0.0575 0.0526 0.0566 0.0501 0.0593 0.0514 Tổng 0.1734 0.1541 Trung bình 0.0578 0.0514 lƣợng tìm lại (ng) 5.11 5.28 5ng 35 Độ thu hồi(%) 102.13 105.66 SD 0.00137 0.00125 RSD(%) 2.38 2.43 0.4858 0.3644 0.4677 0.3867 0.4552 0.3709 Tổng 1.4087 1.122 Trung bình 0.4695 0.3740 lƣợng tìm lại (ng) 48.91 49.48 Độ thu hồi(%) 97.82 98.96 SD 0.01538 0.01146 RSD(%) 3.28 3.07 1.905 1.469 1.867 1.425 1.828 1.442 Tổng 5.6 4.336 Trung bình 1.867 1.445 lƣợng tìm lại (ng) 197.54 196.24 Độ thu hồi(%) 98.77 98.12 SD 0.03850 0.02218 RSD(%) 2.06 1.54 50ng 200ng  Kết luận: Độ lệch chuẩn tƣơng đối hàm lƣợng bé 5% Nhƣ phƣơng pháp có độ xác tốt Độ thu hồi trung bình nằm khoảng 98,12- 105,66% 3.5.5 Khảo sát tín hiệu (chiều cao pic MA, MDMA) hàm lƣợng nhỏ dần, nhận thấy hàm lƣợng 2ng tín hiệu thu đƣợc có S/N xấp xỉ 12 MA MDMA Vậy giới hạn phát hiệ ới hạn định lƣợ 0,15ng/mg Giới hạn phát hiệ ới hạn định lƣợ 36 Abundanc e Io n 0 (2 to ): 0 0 D \ d a ta ms 800 700 S /N=1 600 500 400 300 200 100 0 6 6 6 6 0 7 T ime > Hình 3.17: Khảo sát LOD LOQ MA A b u n d a n c e I o n 0 (2 to ): N G L D \ d a t a m s 0 6 0 5 5 0 0 S /N = 0 0 0 7 0 T im e - - > Hình 3.18: Khảo sát LOD LOQ MDMA 3.5.6.Hiệu suất chiết Mục đích: Hiệu suất chiết thể khả chiết MA,MDMA từ mẫu tóc phƣơng pháp đƣợc chọn Tiến hành: Khảo sát hiệu suất chiết nồng độ 100ng 100ng Bảng 3.5 Kết khảo sát hiệu suất chiết Stt TB(%) RSD (%) Nhận xét: MA Hàm lƣợng 10ng(%) 85,54 92,11 87,78 90,99 86,72 84,62 87,96 3.41 Hàm lƣợng 100ng(%) 87,74 93,12 91,77 89,33 87,82 88,02 89,63 2.56 37 MDMA Hàm lƣợng Hàm lƣợng 10ng(%) 100ng(%) 86,76 93,75 89,22 92,74 92,05 89,03 92,88 91,95 87,61 88,77 85,52 93,88 89,01 91,68 3.31 2.48 Hiệu suất chiết từ 87,96-91,68% chấp nhận đƣợc vơi độ lặp lại tốt Ứng dụng phân tích mẫu tóc thực tế Dựa quy trình xây dựng, áp dụng định lƣợng số mẫu thực Mỗi mẫu đƣợc tiến hành lặp lại lần, tính kết trung bình Cách lấy mẫu tóc :Do tóc mọc dài thêm tháng khoảng 1cm nên qua phân tích đoạn tóc có chất độc ngừơi ta tính đƣợc ngày bị đầu độc.Do lấy mẫu tóc cần lấy kéo nhẹ nhàng cắt sát phần chân tóc.Vùng tóc thƣờng lấy vùng đỉnh đầu phần tóc thƣờng mọc nhanh ổn định Sau đặt sợi tóc lên mẫu giấy cho riêng mẫu ngƣời vào phong bì riêng, dán lại, ghi tên phong bì để khỏi nhầm Bảng 3.6 Kết định lƣợng số mẫu thực Mẫu thực Tuổi Hàm lƣợng MA/mg tóc (ng) Hàm lƣợng MDMA/mg tóc (ng) Trịnh Thanh T 35 6.04 (-) Phạm Bình D 21 0.15 (-) Trần Ngọc T 36 0.62 (-) Lê Mạnh Q 35 9.19 (-) Nguyễn Quang A 27 8.67 (-) Trần Văn T 24 22.48 22.43 Họ tên Từ kết phân tích mẫu thực tế nhận thấy có mẫu dƣơng tính với MA, có mẫu vừa dƣơng tính với MA vừa dƣơng tính MDMA A b u n d a n c e 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 I o i m e - - > b u n d a n c i m e 0 ( 0 ( t o t o ) : ) : 0 0 D 0 D \ d a t a m s 0 0 0 0 \ d a t a m s 0 0 0 e 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 n 0 0 T I o 0 T A n 0 8 9 - - > Hình 3.19 :Sắc kí đồ phân tích mẫu Nguyễn Quang A 38 A b u n d a n c e 0 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 I o n 0 ( t o ) : 0 0 D \ d a t a m s 0 T A i m e - - > b u n d a n c e 0 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 I o n 0 0 ( 7 t o 8 0 ) : 0 0 D \ d a t a m 0 0 s 0 T i m A b e 0 0 0 0 - - > Hình 3.20 :Sắc kí đồ phân tích mẫu Lê Mạnh Q u n d a n c e 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 c e I o n I o n 0 ( 0 ( 5 7 t o t o ) : 0 ) : 0 0 D 0 D \ d a t a m s t a m s T A i m e - - > b u n d a n 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 \ d a 0 0 T i m A b e 0 8 0 - - > Hình 3.21 : Sắc kí đồ phân tích mẫu Trần Ngọc T u n d a n c e 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 c e I o n I o n 0 ( 0 ( 5 7 t o t o ) : 0 ) : 0 0 D 0 D \ d a t a m s t a m s T A i m e - - > b u n d a n 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 \ d a 0 0 T i m e 0 8 0 - - > Hình 3.22 : Sắc kí đồ phân tích mẫu Phạm Bình D 39 A b u n d a n c e 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 I o n 0 0 0 ( t o ) : 0 0 D \ d a t a m s 0 T A i m e - - > b u n d a n c e 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 I o n 0 ( t o 0 ) : 0 0 D \ d a t a m s 0 T i m e 7 0 0 - - > Hình 3.23 : Sắc kí đồ phân tích mẫu Trần Văn T 40 THẢO LUẬN  Về quy trình phân tích : Quy trình phân tích dùng sử dụng phƣơng pháp thủy phân tóc methanol chiết pha rắn Quy trình đƣợc thực tiện lợi,tiết kiệm dung môi, tiết kiệm thời gian, độc hại hơn, xử lí mẫu cao Qui trình phân tích sử dụng tác nhân dẫn xuất HFBA để tạo dẫn xuất vớ  Về quy trình định lƣợng thẩm định: Phƣơng pháp GC-MS phƣơng pháp phân tích độc chất Phƣơng pháp có độ nhạy xác cao Qua kết khảo sát thu đƣợc tính phù hợp hệ thống GC/MS thời gian lƣu diện tích pic cho thấy thông số RSD