ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM HOÀNG VĂN TRÌNH PHÂN LẬP VÀ TỐI ƢU MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN SINH TRƢỞNG CỦA VI KHUẨN PHẢN NITRATE HÓA TRONG MẪU NƢỚC THẢI TẠI TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÁI NGUYÊN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính qui Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2012 – 2016 Thái Nguyên – năm 2016 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM HOÀNG VĂN TRÌNH Tên đề tài: PHÂN LẬP VÀ TỐI ƢU MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN SINH TRƢỞNG CỦA VI KHUẨN PHẢN NITRATE HÓA TRONG MẪU NƢỚC THẢI TẠI TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÁI NGUYÊN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính qui Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Lớp : K45 - CNSH Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2012-2016 Giảng viên hƣớng dẫn: ThS Dương Mạnh Cường Thái Nguyên – năm 2016 LỜI CẢM ƠN Được đồng ý Ban Giám hiệu nhà trường, Ban Chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học-Công nghệ Thực phẩm, thời gian thực tập tốt nghiệp, em tiến hành thực đề tài “phân lập tối ưu số điều kiện sinh trưởng vi khuẩn phản Nitrate hóa mẫu nước thải trường Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên” Sau thời gian tham gia nghiên cứu thực đề tài, đến em hoàn thành đề tài nghiên cứu Nhân dịp em xin bày tỏ lòng biết ơn tới: ThS Dương Mạnh Cường, Khoa Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em thực đề tài Em xin gửi lời cảm ơn tới ThS Vi Đại Lâm giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho em suốt trình thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn thầy cô Khoa Công nghệ Sinh Học Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên dạy dỗ, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm nghiên cứu khoa học suốt thời gian học tập Cuối em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè ủng hộ, động viên để em có tự tin học tập thực tập tốt nghiệp Dù cố gắng nhiều, xong khóa luận tránh khỏi thiếu sót hạn chế Kính mong nhận bảo, đóng góp ý kiến quý Thầy Cô toàn thể bạn Em xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày tháng năm 2016 Sinh viên Hoàng Văn Trình i DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Các thiết bị sử dụng phòng thí nghiệm 20 Bảng 3.2 Các hóa chất sử dụng nghiên cứu 21 Bảng 4.1 Dấu hiệu phát triển dòng vi khuẩn môi trường Giltay 29 Bảng 4.2 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc dòng vi khuẩn nghiên cứu 31 Bảng 4.3 Đặc điểm tế bào dòng vi khuẩn nghiên cứu 32 Bảng 4.4 Ảnh hưởng pH đến sinh trưởng dòng vi khuẩn A1 34 Bảng 4.5 Ảnh hưởng pH đến sinh trưởng dòng vi khuẩn A2 36 Bảng 4.6 Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng dòng vi khuẩn A1 37 Bảng 4.7 Ảnh hưởng nhiệt độ đến dòng vi khuẩn A2 39 Bảng 4.8 Ảnh hưởng nguồn carbon khác đến sinh trưởng dòng vi khuẩn A1 41 Bảng 4.9 Ảnh hưởng nguồn carbon khác đến sinh trưởng dòng vi khuẩn A2 42 ii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1 Chu trình nitơ tự nhiên(Alfred Brown, Heidi Smith, 2014) Hình 2.2 Quá trình chuyển hóa nito nước(nguồn:acc-biotech.com) Hình 2.3 Hiện tượng tảo nở hoa (nguồn: vast.ac.vn) 10 Hình 2.4 Nguồn nước ô nhiễm suối sau khu ký túc K ao thủy sảnkhoa Chăn Nuôi Thú Y, trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên (Chụp ngày 05/04/2016) 18 Hình 4.1 Các dòng vi khuẩn phản nitrate hóa môi trường Giltay 27 Hình 4.2 Dòng vi khuẩn phản nitrate hóa môi trường chứa thuốc thử Diphenylamine 29 Hình 4.3 Các dòng vi khuẩn A1, A2,A3, A4 môi trường đối chứng sau 120 nuôi cấy 30 Hình 4.4 Hình thái khuẩn lạc dòng vi khuẩn A1 A2 32 Hình 4.5 Hình thái tế bào dòng vi khuẩn A1 A2 32 Hình 4.6 Thử nghiệm khả hiếu khí, kỵ khí dòng vi khuẩn phân lập 34 Hình 4.7 Biểu đồ ảnh hưởng pH đến sinh trưởng dòng vi khuẩn A1 35 Hình 4.8 Biểu đồ ảnh hưởng pH đến sinh trưởng dòng vi khuẩn A2 36 Hình 4.9 Biểu đồ ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng dòng vi khuẩn A1 38 Hình 4.10 biểu đồ ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng dòng vi khuẩn A2 39 Hình 4.11 Biểu đồ ảnh hưởng nguồn carbon khác đến sinh trưởng dòng vi khuẩn A1 42 Hình 4.12 Biểu đồ ảnh hưởng nguồn carbon khác đến sinh trưởng dòng vi khuẩn A2 42 iii DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT Từ thuật ngữ viết tắt Nghĩa đầy đủ CO2 Cacbonic N2 Nito NO2- Nitrit NO3- Nitrat NH4+ Amoni NH3 Amoniac O2 Oxy DO Dissolved Oxygen iv MỤC LỤC PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu yêu cầu đề tài 1.2.1 Mục tiêu đề tài 1.2.2 Yêu cầu đề tài 1.3 Ý nghĩa đề tài 1.3.1 Ý nghĩa khoa học 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Cơ sở khoa học đề tài 2.1.1 Tổng quan chu trình nitơ tự nhiên 2.1.2 Chuyển hóa nito tác hại việc dư thừa nito nước thải 2.1.3 Xử lý nước thải giàu hợp chất chứa nitơ ứng dụng vi khuẩn phản nitrat hóa 12 2.1.4 Thực trạng nước thải trường Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên 17 2.2 Tình hình nghiên cứu nước giới 18 2.2.1 Tình hình nghiên cứu nước 18 2.2.2 Tình hình nghiên cứu giới 19 PHẦN 3: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 3.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 20 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 20 3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 20 3.2 Địa điểm thời gian tiến hành 20 3.2.1 Địa điểm nghiên cứu 20 3.2.2 Thời gian nghiên cứu 20 3.3 Dụng cụ, hóa chất 20 3.3.1 Dụng vụ, thiết bị 20 3.3.2 Hóa chất sử dụng 21 v 3.3.3 Môi trường sử dụng 22 3.4 Nội dung nghiên cứu 22 3.5 Phương pháp nghiên cứu 22 3.5.1 Phương pháp thu thập mẫu 22 3.5.2 Phương pháp Phân lập tuyển chọn vi khuẩn phản nitrate hóa 23 3.5.3 Phương pháp mô tả đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh học dòng vi khuẩn phản nitrate hóa 24 3.5.4 Phương pháp giữ giống 25 3.5.5 Phương pháp nghiên cứu tối ưu số điều kiện môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng dòng vi khuẩn phản nitrate hóa 26 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 4.1 Kết phân lập vi khuẩn nitrate hóa 27 4.2 Kết tuyển chọn dòng vi khuẩn có hoạt tính phản nitrate hóa (khử nitrate) 27 4.2.1 Tuyển chọn dòng vi khuẩn có hoạt tính phản nitrate hóa phản ứng với thuốc thử diphenylamine 28 4.2.2 Tuyển chọn dòng vi khuẩn có hoạt tính phản nitrate hóa dựa đặc điểm sinh trưởng dòng vi khuẩn 29 4.3 Kết Định danh sơ dòng vi khuẩn tuyển chọn 31 4.3.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc 31 4.3.2 Đặc điểm hình dạng tế bào 32 4.3.3 Khả sinh trưởng môi trường hiếu khí, kỵ khí 33 4.4 Kết nghiên cứu tối ưu số yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh trưởng vi khuẩn phản nitrate hóa 34 4.4.1 Ảnh hưởng pH đến sinh trưởng dòng vi khuẩn A1 A2 34 4.4.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng dòng vi khuẩn A1 A2 37 4.3.3 Ảnh hưởng nguồn carbon khác đến sinh trưởng hai dòng vi khuẩn A1 A2 40 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 5.1 Kết luận 45 vi 5.2 Kiến nghị 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 I Tài liệu Tiếng Việt 46 II Tài liệu tiếng anh 46 III Tài liệu tham khảo từ Internet 47 PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Ô nhiễm môi trường vấn đề nóng bỏng, đáng lo ngại quốc gia toàn giới nay, có Việt Nam Tình trạng ô nhiễm môi trường sinh thái chủ yếu hoạt động sản xuất sinh hoạt người gây Vấn đề ngày trầm trọn đe dọa trực tiếp tới phát triển kinh tế - xã hội, tồn phát triển hệ tương lai Ô nhiễm môi trường bao gồm loại là: ô nhiễm không khí, ô nhiễm đất ô nhiễm nguồn nước Trong ba loại ô nhiễm ô nhiễm nước vấn đề nghiêm trọng, đặc biệt khu vực tập trung đông dân cư khu công nghiệp Nguyên nhân gây ô nhiễm môi trường nước chủ yếu nước thải sinh hoạt chưa qua xử lý xử lý chưa triệt để, đổ môi trường gây ô nhiễm nguồn nước ao hồ sông suối xung quanh Đặc trưng nước thải sinh hoạt chứa nhiều tạp chất khác nhau, khoảng 52% chất hữu cơ, 48% chất vô lượng lớn vi sinh vật (Trần văn Nhân, Ngô Thị Nga, 2002), hàm lượng nitơ nước thải cao, đổ môi trường nước kênh, mương, ao, hồ, sông suối tác động tiêu cực đến hệ sinh thái nước quần thể thủy sinh vật gây ảnh hưởng như: Hiện tượng phú dưỡng hệ sinh thái nước dẫn tới phát triển bùng nổ tảo vi sinh vật gọi tượng tảo nở hoa, làm cạn kiệt nguồn oxy nước, gây độc với hệ sinh thái nước, xâm nhập vào nước ngầm dạng ion nitrite nitrate người sử dụng nguồn nước ngầm sinh hoạt đun nấu,lượng chất xâm nhập vào thể gây ảnh hưởng đến sức khỏe người hội chứng trẻ da xanh (methahemoglobin), nguy gây ung thư Để giải vấn đề trên, việc nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật để xử lý nước bị ô nhiễm ngày phổ biến Các phương pháp vật lý, hóa học… gây tác dụng phụ, tác hại sau không an toàn thân thiện với môi trường,ưu điểm việc sử dụng vi sinh vật giúp tăng cường khả phục hồi, khả tự làm môi trường, có tính ổn định cao thân thiện với môi trường 33 4.3.3 Khả sinh trưởng môi trường hiếu khí, kỵ khí Ngoài để định danh sơ dòng vi khuẩn A1, A2 thuộc dòng vi khuẩn chúng tối tiến hành nghiên cứu khả sinh trưởng hai điều kiện môi trường kỵ khí hiếu khí hai dòng vi khuẩn A1 A2 Chúng tiến hành nuôi cấy hai dòng vi khuẩn A1 A2 môi trường giltay có pha agar dạng thạch đứng bán lỏng (0,5% Agar) Môi trường đổ vào ống nghiệm để thẳng đứng, dùng que cấy hình kim, sau lấy sinh khối vi khuẩn dòng A1, A2 đâm sâu vào giũa khối thạch bán lỏng, xuống tận sát đáy ống nghiệm, đường cấy thẳng, nhẹ nhàng, không gây nứt, vỡ môi trường Sau 72 nuôi cấy môi trường thạch đứng hai dòng vi khuẩn A1 A2 sinh trưởng bề mặt sâu bên khối thạch đứng Điều chứng tỏ hai dòng vi khuẩn vi khuẩn kỵ khí không bắt buộc (Hình 4.6) 34 Hình 4.6 Thử nghiệm khả hiếu khí, kỵ khí dòng vi khuẩn phân lập Từ kết đặc điểm hình thái khuẩn lạc, đặc điểm hình thái tế bào khả sinh trưởng điều kiện hiếu khí kỵ khí mà nghiên cứu trên, so sánh với đặc điểm phân loại Martin Dworkin cs, (2002), dựa theo giáo trình vi sinh vật học(Nguyễn Lân Dũng cs, 2000), dựa theo giảng Thực Hành vi sinh ứng dụng (Nguyễn hoài hương, 2009) đưa kết luận kết định danh sơ sau: - Dòng A1 có đặc điểm giống chi vi khuẩn Paracoccus - Dòng A2 có đặc điểm giống chi vi khuẩn Pseudomonas 4.4 Kết nghiên cứu tối ƣu số yếu tố ảnh hƣởng đến khả sinh trƣởng vi khuẩn phản nitrate hóa 4.4.1 Ảnh hưởng pH đến sinh trưởng dòng vi khuẩn A1 A2 Để tối ưu pH môi trường dòng vi khuẩn A1 A2 tiến hành khảo sát ảnh hưởng pH đến sinh trưởng dòng A1 A2 cách nuôi cấy hai dòng vi khuẩn môi trường Giltay lỏng, PH 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 9,0 Nuôi cấy tĩnh kỵ khí nhiệt độ 300C, sau mốc thời gian 0h, 24h, 48h, 72h, 96h, 120h,144h tiến hành đo OD620nm để xác định sinh khối tế bào Kết ghi nhận bảng 4.4 bảng 4.5 thể qua hai biểu đồ hình 4.7 hình 4.8 Bảng 4.4 Ảnh hƣởng pH đến sinh trƣởng dòng vi khuẩn A1 24 48 72 96 120 144 pH=5 0,010 0,126 0,349 0,646 0,734 0,641 0,512 pH=6 0,009 0,257 0,843 1,017 0,968 0,860 0,723 pH=7 0,010 0,378 1,048 1,241 1,179 1,044 0,809 pH=8 0,008 0,336 1,105 1,336 1,249 1,138 0,885 pH=9 0,009 0,290 0,768 0,941 1,045 0,943 0,823 Thời gian (h) Mật độ (OD620nm) Từ giá trị đo bảng 4.4 tiến hành vẽ biểu đồ thể ảnh hưởng pH đến sinh trưởng dòng vi khuẩn A1 qua biểu đồ sau: 35 Hình 4.7 Biểu đồ ảnh hưởng pH đến sinh trưởng dòng vi khuẩn A1 36 Bảng 4.5 Ảnh hƣởng pH đến sinh trƣởng dòng vi khuẩn A2 Thời gian (h) Mật độ (OD620nm) pH=5 pH=6 pH=7 pH=8 pH=9 24 48 72 96 120 144 0,009 0,011 0,010 0,009 0,010 0,046 0,072 0,124 0,148 0,081 0,287 0,368 0,507 0,483 0,359 0,424 0,632 0,845 0,818 0,628 0,450 0,746 0,903 0,915 0,804 0,416 0,678 0,796 0,824 0,732 0,307 0,553 0,652 0,619 0,561 Từ giá trị đo bảng 4.5 tiến hành vẽ biểu đồ thể ảnh hưởng pH đến sinh trưởng dòng vi khuẩn A2 qua biểu đồ sau: Hình 4.8 Biểu đồ ảnh hưởng pH đến sinh trưởng dòng vi khuẩn A2 Dựa vào bảng 4.4 bảng 4.5 (thể hai biểu đồ hình 4.7 4.8) ta thấy có khác giá trị mật độ tế bào dòng A1 A2 mức pH khác theo mốc thời gian đo,chúng nhận xét sau: hai dòng A1 A2 sinh trưởng tốt dải pH rộng từ PH=6 đến PH=9, sinh trưởng tốt hai giá trị pH=7 pH=8 (từ trung tính đến kiềm) giá trị OD giảm rõ rệt pH giảm xuống giá trị pH[...]... nghiên cứu 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu Các chủng vi khuẩn phản nitrate hóa trong mẫu nước thải tại trường đại học Nông Lâm Thái Nguyên 3.1.2 Phạm vi nghiên cứu Nghiên cứu khả năng sinh trưởng, đặc điểm hình thái và tối ưu một số điều kiện sinh trưởng của vi khuẩn phản nirate hóa trong một số mẫu nước thải tại trường Đại Học Nông lâm Thái Nguyên 3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành 3.2.1 Địa điểm nghiên... tài phân lập và tối ưu một số điều kiện sinh trưởng của vi khuẩn phản Nitrate hóa trong mẫu nước thải tại trường Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên Nhằm tiến tới xây dựng quy trình phục hồi sinh học trong xử lý nitơ, góp phần cải tạo môi trường, giảm thiểu ô nhiễm và bảo vệ cảnh quan nhà trường 3 1.2 Mục tiêu và yêu cầu của đề tài 1.2.1 Mục tiêu của đề tài Phân lập một số dòng vi khuẩn phản nitrat hóa trong. .. một số mẫu nước, làm cơ sở để tiến hành định danh các chủng và xây dựng các quy trình phục hồi sinh học nhằm giảm thiểu lượng Nitơ trong các mẫu nước thải 1.2.2 Yêu cầu của đề tài - Thu thập một số mẫu nước tại một số địa điểm trong trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên - Phân lập, tuyển chọn được một số dòng vi khuẩn phản Nitrate hóa trong các mẫu nước thải - Định danh sơ bộ các dòng vi khuẩn phản nitrate. .. khuẩn phản nitrate hóa và ứng dụng trong hệ thống xử lý nước thải Một số nghiên cứu của trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên Hà Nội đã phân lập và định danh được nhiều loài vi khuẩn có khả năng phản nitrate hóa bằng sinh học phân tử Đó là một tiềm năng lớn hướng tới xây dựng các hệ thống xử lý kỵ khí sinh học trong nước thải và nước tự nhiên bị ô nhiễm Ngoài ra còn một số đề tài nghiên cứu về ảnh hưởng của. .. thể giữ giống được 6 tháng 3.5.5 Phương pháp nghiên cứu tối ưu một số điều kiện của môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng của các dòng vi khuẩn phản nitrate hóa 3.5.5.1 Nghiên cứu tối ưu pH đến sinh trưởng của vi khuẩn phản nitrate hóa Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của vi khuẩn phản nitrate hóa bằng cách nuôi cấy trên môi trường Giltay lỏng, PH lần lượt là 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 9,0... trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên (Chụp ngày 05/04/2016) 2.2 Tình hình nghiên cứu trong nƣớc và trên thế giới 2.2.1 Tình hình nghiên cứu trong nước Tại Vi t Nam đã có rất nhiều đề tài, công trình nghiên cứu về các chủng vi khuẩn có khả năng phản nitrate hóa như Tại trường đại học Bách Khoa Hà Nội, các sinh vi n thuộc bộ môn Hóa sinh và Sinh học phân tử đã tiến hành nghiên cứu và phân lập các vi khuẩn. .. vi lượng cần thiết cho sự sinh trưởng của vi khuẩn sẽ làm giảm hoạt tính của vi khuẩn phản nitrate hóa, thậm trí ngừng sinh trưởng Do đó vi c bổ sung cá nguyên tố đa, vi lượng trong nuôi cấy vi khuẩn phản nitrate hóa là điều cần thiết và phải có những tỉ lệ được thử nghiệm để tránh tình trạng dý thừa gây ra những tác dụng không mong muốn 2.1.4 Thực trạng nước thải tại trường Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên. .. có một số ít loài vi khuẩn phản nitrate tự 13 dưỡng, chúng không sử dụng nguồn cacbon hữu cơ mà sử dụng nguồn cacbon vô cơ để tổng hợp tế bào 2.1.3.2 Đặc điểm sinh học của một số vi khuẩn phản nitrate hóa a Đặc điểm sinh học của vi khuẩn Pseudomonas Pseudomonas là chi vi khuẩn sống tự do, có mặt ở hầu hết mọi nơi trong môi trường sống, là vi khuẩn dị dưỡng hóa năng có khả năng sử dụng linh hoạt một. .. động, trong quá trình phản nitrate hóa xảy ra pH môi trường không thay đổi nhiều bởi quá trình phản nitrate hóa sinh ra acid nhưng đồng thời cũng sinh ra kiềm để trung hòa c Ảnh hưởng của nguồn carbon đến quá trình phản nitrate hóa 16 Là nguồn vật chất cung cấp chất C trong quá trình sinh trưởng tổng hợp sinh khối của vi khuẩn phản nitrate hóa (Nguyễn Lân Dũng và cs, 2000) Các vi khuẩn phản nitrate hóa. .. môi trường nước vào Năm 1882 (Gayon, 1882) khi ông nhận thấy sự suy giảm của hàm lượng nitrate trong quá trình phân hủy nước thải, ông gọi đó là sự “khử” và ông cũng là người đầu tiên phân lập được vi khuẩn có khả năng khử nitrate (Gayyon, 1886) Năm 1977 hai nhà vi sinh vật học là Christensen và Harremoes đã nghiên cứu phân lập vi khuẩn phản nitrate hóa trong mẫu nước thải, Christensen và Harremoes