ĐẠI HỌC THÁI NGUN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM HỒNG VĂN TÀI Tên đề tài: NGHIÊN CỨU TỐI ƢU ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VI KHUẨN LACTOBACILLUS REUTERI BẰNG PHƢƠNG PHÁP TỐI ƢU BỀ MẶT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chun ngành: Cơng nghệ sinh học Khoa : CNSH & CNTP Lớp : 44 - CNSH Khóa học : 2012 – 2016 Thái Nguyên - 2016 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM HOÀNG VĂN TÀI Tên đề tài: NGHIÊN CỨU TỐI ƢU ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VI KHUẨN LACTOBACILLUS REUTERI BẰNG PHƢƠNG PHÁP TỐI ƢU BỀ MẶT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Khoa : CNSH & CNTP Lớp : 44 - CNSH Khóa học : 2012 – 2016 Giảng viên hƣớng dẫn: Th.S Bùi Tuấn Hà Thái Nguyên - 2016 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu khoa học thân tơi, khơng chép Nội dung khóa luận có tham khảo sử dụng tài liệu, thông tin đăng tải tác phẩm, tạp chí trang web theo danh mục tài liệu tham khảo khóa luận Thái nguyên, ngày 19 tháng năm 2016 Ngƣời viết cam đoan Hoàng Văn Tài ii LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình thực tập phịng Cơng nghệ Lên men, Khoa Cơng nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, em nhận nhiều giúp đỡ từ Ban chủ nhiệm Khoa CNSH - CNTP, thầy hướng dẫn, bạn bè gia đình Trước hết, em xin chân thành cảm ơn Th.S Bùi Tuấn Hà, giảng viên Khoa CNSH - CNTP, tạo điều kiện, hướng dẫn tận tình giúp đỡ em hồn thành khoá luận Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới ThS Dương Mạnh Cường, ThS Vi Đại Lâm giảng viên Khoa CNSH - CNTP, người hướng dẫn em thao tác thực hành cho em sai lầm giúp em hoàn thành tốt khoá luận Em xin chân thành cảm ơn đến thầy cô Khoa CNSH - CNTP, trường Đại học Nơng Lâm Thái Ngun tận tình bảo, giúp đỡ em q trình học tập hồn thành khoá luận Cuối em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, người ln bên cạnh động viên giúp đỡ em suốt thời gian thực khoá luận Do thời gian thực đề tài có giới hạn nên đề tài khơng tránh khỏi sai sót Em mong nhận đóng góp ý kiến thầy bạn để đề tài em hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Thái nguyên, ngày 19 tháng 05 năm 2016 Sinh viên thực Hoàng Văn Tài iii DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 3.1 Các hoá chất sử dụng nghiên cứu 25 Bảng 3.2 Các thiết bị sử dụng thí nghiệm 25 Bảng 3.3 Môi trường thạch MRS (de Man,Rogosa and Sharpes) (g/l) 26 Bảng 3.4 pH nuôi cấy 31 Bảng 3.5 Nhiệt độ nuôi cấy ( 0C ) 32 Bảng 3.6 Tốc độ lắc ( vòng/phút) 32 Bảng 3.7 Bảng mã hóa điều kiện tối ưu 33 Bảng 3.8 Bảng thiết kế thí nghiệm tối ưu chất lượng sản phẩm 33 Bảng 4.1: Khả đồng hóa vi khuẩn Lactobacillus reuteri môi trường đường 36 Bảng 4.2: Ảnh hưởng nhiệt độ đên nuôi cấy vi khuẩn L reuteri 37 Bảng 4.3: Ảnh hưởng pH đến nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus reuteri 39 Bảng 4.4 : Ảnh hưởng tốc độ lắc đên nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus reuteri 40 Bảng 4.5 Kết mật độ vi khuẩn L reuteri sản phẩm 42 Bảng 4.6 Lack of Fit tests ( Kiểm tra tính phù hợp mơ hình) 43 Bảng 4.7 Tổng hợp phân tích mơ hình ( model summary statistics) 43 Bảng 4.8 Kết phân tích ANOVA cho mơ hình mật độ vi sinh vật q trình ni cấy 44 Bảng 4.9 Các giá trị biến độc lập để đạt giá trị tối ưu tiêu 45 iv DANH MỤC HÌNH Trang Hình 2.1 Hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn L reuteri Hình 2.2 Hình thái tế bào vi khuẩn L reuteri qua kính hiển vi Hình 2.3 Bề mặt đáp ứng khơng có độ cong 19 Hình 2.4 Bề mặt đáp ứng có độ cong 19 Hình 4.1 Hình thái khuẩn lạc L reuteri 35 Hình 4.2 Hình thái tế bào vi khuẩn L reuteri 35 Hình 4.3 Biểu đồ mật độ tế bào vi khuẩn môi trường đường 36 Hình 4.4 Biểu đồ ảnh hưởng nhiệt độ đến mật đố vi khuẩn L reuteri 38 Hình 4.5 Biểu đồ ảnh hưởng pH đến mật độ tế bào vi khuẩn L reuteri 39 Hình 4.6 Biểu đồ ảnh hưởng tốc độ lắc đến mật độ vi khuẩn L reuteri 41 Hình 4.7 a b : ảnh hưởng nhiệt độ,pH tốc độ lắc đến mật độ vi khuẩn Lactobaciluss reuteri 46 v DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT MRS : de Man, Rogosa and Sharpes LAB : Lactic acid Bacteria FAD : Flavin Adenin Dinuclecotit EC : Ủy ban khoa học châu Âu VSV : Vi sinh vật vi MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC BẢNG iii DANH MỤC HÌNH iv DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT v MỤC LỤC vi Phần 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu yêu cầu đề tài 1.2.1 Mục tiêu đề tài 1.2.2 Mục đích nghiên cứu 1.3 Ý nghĩa đề tài 1.3.1 Ý nghĩa khoa học 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan vi khuẩn Lactobacillus reuteri 2.1.1 Lịch sử phát 2.1.2 Đặc điểm phân loại phân bố vi khuẩn Lactobacillus reuteri 2.1.3 Đặc điểm sinh hóa vi khuẩn Lactobacillus reuteri 2.1.4 Đặc điểm hình thái vi khuẩn Lactobacillus reuteri 2.1.5 Đặc điểm nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus reuteri 2.1.6 Tác đụng Lactobacillus reuteri 10 2.2 Ứng dụng vi khuẩn Lactobacillus reuteri - Probiotics 12 2.2.1 Lịch sử nghiên cứu Probiotics 12 2.2.2 Ứng dụng probiotic 14 vii 2.3 Khả tạo probiotic vi khuẩn Lactobacillus reuteri 16 2.4 Phương pháp bề mặt tiêu 17 2.5 Tình hình nghiên cứu nước 20 2.5.1 Tình hình nghiên cứu nước 20 2.5.2 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 23 Phần 3: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 3.1 Đối tượng nghiên cứu 25 3.2 Địa điểm thời gian tiến hành 25 3.3 Hóa chất thiết bị sử dụng 25 3.3.1 Hóa chất 25 3.3.2 Thiết bị sử dụng 25 3.4 Môi trường sử dụng 26 3.5 Nội dung nghiên cứu 26 3.6 Phương pháp nghiên cứu 27 3.6.1 Thí nghiệm cho nội dung 1: Phương pháp nghên cứu đặc điểm sinh học vi khuẩn L.reuteri 27 3.6.2 Thí nghiệm cho nội dung 2: Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng pH tới phát triển vi khuẩn Lactobacillus reuteri 31 3.6.3 Thí nghiệm cho nội dung 3: Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ tới phát triển vi khuẩn Lactobacillus reuteri 32 3.6.4 Thí nghiệm cho nội dung 4: Phương pháp kiểm tra tốc độ lắc tới phát triển vi khuẩn Lactobacillus reuteri 32 3.6.5 Thí nghiệm cho nội dung 5: Tối ưu hóa điều kiện ni cấy vi khuẩn Lactobacillus reuteri 32 3.7 Phương pháp xử lý số liệu 34 Phần 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 35 viii 4.1 Hình thái vi khuẩn Lactobacillus reuteri 35 4.1.1 Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn Lactobacillus reuteri 35 4.1.2 Hình thái tế bào vi khuẩn L reuteri 35 Ảnh hưởng nhiệt độ đến nuôi cấy vi khuẩn L reuteri 37 4.3 Ảnh hưởng pH đến nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus reuteri 38 4.4 Ảnh hưởng tốc độ lắc đên nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus reuteri 40 4.5 Kết tối ưu hóa điều kiện ni cấy vi khuẩn Lactobacillus reuteri phương pháp bề mặt tiêu 41 Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47 5.1 Kết luận 47 5.2 Kiến nghị 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 Hình 4.4 Biểu đồ ảnh hƣởng nhiệt độ đến mật đố vi khuẩn L reuteri Qua bảng 4.2 hình 4.4, cho thấy vi khuẩn L reuteri sinh trưởng phát triển nhiệt độ khác ( 35 0C đến 390C ) Tuy nhiên, mức nhiệt độ 370C vi khuẩn L reuteri sinh trưởng phát triển tốt 4.3 Ảnh hƣởng pH đến nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus reuteri Lấy bình tam giác 250ml, bình chứa 50ml môi trường RMS lỏng với mức pH 5, 6, 7, đem hấp khử trùng Lấy ống nghiệm giữ giống, cho vào ống 50ml nước cất khử trùng mix(trộn) nhẹ cho tế bào vi khuẩn tách khỏi thạch nghiêng ống giữ giống tạo thành dung dịch Sau đó, hút tất dịch ống giữ giống cho vào bình tam giác chứa 50 ml môi trường RMS lỏng trên, lúc thể tích bình tam giác 100ml Đem bình tam giác ni tăng sinh khối máy lắc ( tốc độ lắc 100v/phút ), 370C 24 Sau đó, lấy dịch vừa lắc xong pha loãng 10-7 lần đem cấy trang lên đĩa peptri có mơi trường MRS thạch ni 370C 24 – 48 đếm số lượng khuẩn lạc 39 Bảng 4.3: Ảnh hƣởng pH đến ni cấy vi khuẩn Lactobacillus reuteri pH Thể tích mẫu Số lƣợng trung Mật độ tế Thể tích pha lỗng bình khuẩn lạc bào vi mẫu pha cấy vào đĩa L reuteri đếm khuẩn loãng peptri đƣợc nồng độ ( 109 pha loãng 10-7 CFU/ml ) 1ml 0.1ml 215 2.15 x 109 1ml 0.1ml 248 2.48 x 109 1ml 0.1ml 145 1.45 x 109 1ml 0.1ml 55 0.55 x 109 Hình 4.5 Biểu đồ ảnh hƣởng pH đến mật độ tế bào vi khuẩn L reuteri Qua bảng 4.3 hình 4.5, cho thấy vi khuẩn L.reuteri sinh trưởng phát triển mức pH khác ( 5, 6, 7, ) Tuy nhiên, mức pH = tốt cho vi khuẩn L reuteri pát triển 40 4.4 Ảnh hƣởng tốc độ lắc đên nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus reuteri Lấy bình tam giác 250ml, bình chứa 50ml mơi trường RMS lỏng đem hấp khử trùng Lấy ống nghiệm giữ giống, cho vào ống 50ml nước cất khử trùng mix(trộn) nhẹ cho tế bào vi khuẩn tách khỏi thạch nghiêng ống giữ giống tạo thành dung dịch Sau đó, hút tất dịch ống giữ giống cho vào bình tam giác chứa 50 ml mơi trường RMS lỏng trên, lúc thể tích bình tam giác 100ml Đem bình tam giác nuôi tăng sinh khối máy lắc (với tốc độ lắc 50vịng/phút, 100vịng/phút, 150vịng/phút bình khơng lắc) 370C 24 Sau đó, lấy dịch vừa lắc xong pha loãng 10 -7 lần đem cấy trang lên đĩa peptri có mơi trường MRS thạch nuôi 370C 24 – 48 đếm số lượng khuẩn lạc Bảng 4.4 : Ảnh hƣởng tốc độ lắc đên nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus reuteri Thể Thể tích mẫu Số lƣợng Tốc độ lắc tích pha lỗng cấy trung bình Mật độ tế (Vịng/phút) mẫu vào đĩa khuẩn lạc bào vi khuẩn pha peptri L reuteri (109 CFU/ml) đếm đƣợc loãng nồng độ pha lỗng 10-7 Khơng lắc 1ml 0.1ml 75 0.75 x 109 50 1ml 0.1ml 156 1.56 x 109 100 1ml 0.1ml 224 2.24 x 109 150 1ml 0.1ml 192 1.92 x 109 41 Hình 4.6 Biểu đồ ảnh hƣởng tốc độ lắc đến mật độ vi khuẩn L reuteri Qua bảng 4.4 hình 4.6, cho thấy tốc độ lắc 100vịng/phút thích hợp cho vi khuẩn L reuteri sinh trưởng phát triển 4.5 Kết tối ƣu hóa điều kiện ni cấy vi khuẩn Lactobacillus reuteri phƣơng pháp bề mặt tiêu Để tối ưu ảnh hưởng pH, nhiệt độ nuôi cấy, tốc độ lắc đến mật độ vi khuẩn L.reuteri nuôi cấy, sử dụng phương pháp bề mặt tiêu theo thiết kế thí nghiệm Box-behnken với ba biến ba cấp độ Sử dụng phần mềm Design Expert 7.0 để tiến hành tối ưu hóa nhằm xác định giá trị yếu tố pH, nhiệt độ nuôi cấy, tốc độ lắc đến mật độ vi khuẩn L.reuteri nuôi cấy tốt 42 Bảng 4.5 Kết mật độ vi khuẩn L reuteri sản phẩm Công thức pH Nhiệt độ Tốc độ Mật độ vi sinh vật (0C) lắc ( 109 CFU/ml) CT14.1 1 CT14.2 -1 1.8 CT14.3 -1 -1 1.78 CT14.4 -1 -1 1.98 CT14.5 1 2.02 CT14.6 1 1.96 CT14.7 0 2.3 CT14.8 -1 -1 1.75 CT14.9 0 2.35 CT14.10 -1 1.9 CT14.11 -1 -1 1.72 CT14.12 -1 1.93 CT14.13 -1 1.89 CT14.14 0 2.34 CT14.15 -1 2.12 Thiết kế thí nghiệm theo kinh nghiệm lựa chọn mơ hình bậc hai Để đánh giá mơ hình bậc hai phù hợp tiến hành kiểm tra mô hình lựa chọn có phù hợp khơng Kiểm tra mơ hình bậc hai có phù hợp khơng vào evaluation, fit summary ta bảng dưới: 43 Bảng 4.6 Lack of Fit tests ( Kiểm tra tính phù hợp mơ hình) Mơ hình Tổng Bình F- P– bình phƣơng Value Value phƣơng trung bình Bậc 0.48 0.054 76.74 0.0129 Tương tác đôi 0.46 0.076 109.20 0,0091 Bậc hai 0.012 4.04 5,77 0,1512 Phù hợp Bảng 4.7 Tổng hợp phân tích mơ hình ( model summary statistics) Mơ hình R- Adj – R- Predicted Squared Squared R- Press Squared Bậc 0,1912 -0,0294 -0,1527 0.69 Tương tác đôi 0,2326 -0,3429 -0,6508 0.99 Bậc hai 0,9761 0,9522 0,8592 0.20 Phù hợp Qua bảng 4.6 4.7 thấy kết khuyến nghị lựa chọn mơ hình bậc hai Để xây dựng mơ hình, sử dụng phương pháp phân tích hồi quy đa nhân tố Trong Design Expert 7.0, lựa chọn phân tích ANOVA để tìm hệ số mơ hình đánh giá mơ hình Kết việc xây dựng mơ hình: Y= 2.33+ 0.03*A+ 0.046*B + 0.11*C – 0.078*B*C – 0.26*A2 – 0.19*B2 – 0.19*C2 Trong đó: Y: mật độ vi khuẩn lactobacillus reuteri A: pH B: Nhiệt độ C: Tốc độ lắc 44 Bảng 4.8 Kết phân tích ANOVA cho mơ hình mật độ vi sinh vật q trình ni cấy Nguồn Mơ hình A pH B nhệt độ C tốc độ lắc B*C A2 B2 C2 Residual Lack of Fit Tổng bình phƣơng Bậc tự 0.59 7.2 0.017 0.090 0.024 0.24 0.13 0.14 0.014 0.013 1 1 1 Bình phƣơng trung bình 0.084 7.2 0.017 0.090 0.024 0.24 0.13 0.14 16,08 FValue P-value 40,85 3.52 8.36 44.13 11.74 118.48 64.28 67.73