ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM - - PHẠM THẾ ANH Tên đề tài: TÁCH DÕNG VÀ GIẢI TRÌNH TỰ GENE MÃ HOÁ ENZYME NATTOKINASE TỪ BACILLUS SUBTILIS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Đại học quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2011-2015 Thái Nguyên - 2015 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM - - PHẠM THẾ ANH Tên đề tài: TÁCH DÕNG VÀ GIẢI TRÌNH TỰ GENE MÃ HOÁ ENZYME NATTOKINASE TỪ BACILLUS SUBTILIS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Lớp : Công nghệ sinh học 43 Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2011 - 2015 Giảng viên hƣớng dẫn : TS Dƣơng Văn Cƣờng Th.S Ma Thị Trang Thái Nguyên - 2015 i LỜI CẢM ƠN Trong trình học tập nghiên cứu để hoàn thành đƣợc khóa luận tốt nghiệp nhận đƣợc quan tâm, hƣớng dẫn, giúp đỡ tận tình thầy cô, bạn bè gia đình Nhân dịp hoàn thành luận văn: Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Dƣơng Văn Cƣờng – Trƣởng Bộ môn Công nghệ sinh học Khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm – Trƣờng Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Th.S Ma Thị Trang, Cán Bộ môn Sinh học Phân tử Công nghệ Gene – Viện Khoa học Sự Sống – Đại học Thái Nguyên ngƣời tận tình bảo, trực tiếp hƣớng dẫn giúp đỡ suốt thời gian thực để tài nhƣ trình hoàn chỉnh luận văn tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Khoa học Sự sống – Đại học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm Khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm – Trƣờng Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, cán bộ, anh chị làm việc Bộ môn Sinh học Phân tử Công nghệ Gene – Viện Khoa học Sự Sống – Đại học Thái Nguyên giúp đỡ, tạo điều kiện để học tập nghiên cứu Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè động viên, chia sẻ giúp đỡ vƣợt qua khó khăn trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày 18 tháng năm 2015 Sinh viên Phạm Thế Anh ii DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG KHOÁ LUẬN Trang Bảng 1: Đặc điểm Nattokinase (Kim, Gum et al 2008) Bảng 2: Cặp mồi sử dụng nhân gene aprE .13 Bảng 3: Danh mục thiết bị sử dụng đề tài 16 Bảng 4: Thành phần phản ứng PCR 20 Bảng 5: Thành phần phản ứng gắn nối .23 Bảng 6: Thành phần phản ứng cắt với HindIII EcoRI 26 Bảng 7: Thành phần phản ứng cắt với BamHI SacI .26 iii DANH MỤC CÁC HÌNH TRONG KHOÁ LUẬN Trang Hình 1: Sản phẩm natto sau lên men Hình 2: Sơ đồ hoá quy trình lên men dịch thể Nattokinase .8 Hình 3: Cấu trúc vector pTUAF 15 Hình 4: Quy trình tách dòng xác định trình tự gene aprE từ vi khuẩn B subtilis 18 Hình 5: Chu trình nhiệt phản ứng PCR 21 Hình 6: Hình ảnh tách chiết DNA tổng số B subtilis .28 Hình 7: Sản phẩm PCR gene aprE từ B subtilis 28 Hình 8: Sản phẩm PCR trƣớc sau tinh 29 Hình 9: Đĩa chứa khuẩn lạc mang plasmid nghi ngờ mang đoạn xen 30 Hình 10: Kết điện di plasmid dòng khuẩn lạc chọn 31 Hình 11: PCR kiểm tra dòng khuẩn lạc nghi ngờ .32 Hình 12: Sản phẩm cắt enzyme giới hạn 33 Hình 13: Trình tự gene aprE 34 Hình 15: Sắc ký đồ số điểm sai khác 37 Hình 16: Dịch mã trình tự gene aprE 38 Hình 17: So sánh trình tự peptide 39 iv DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT Amp Ampicillin Bp Base pair – cặp base nito BLAST Basic Local Aligenment Search Tool DNA Deoxyribonucleic axit dNTP Deoxynucleotide Triphotphate E coli Escherichia coli B subtilis Bacillus subtilis Et al Cộng IPTG Isopropyl Thiogalactoside Kb Kilo base –kilo base nito LB Lauria Broth SDS Sodium Dodecyl Sulfate PCR Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi trùng hợp TAE Tris- acetate- EDTA EDTA Etilenduamin tetraacetic acid TE Tris- EDTA X -gal 5-bromo-4-chloro-3indoly-β-D-galactoside v MỤC LỤC PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1.Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Yêu cầu đề tài 1.4 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 1.4.1 Ý nghĩa khoa học 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Nguồn gốc thực vật Nattokinase 2.2 Đặc điểm, cấu trúc Nattokinase 2.2.1 Đặc điểm 2.2.2 Cấu trúc phân tử Nattokinase 2.3 Hoạt tính Nattokinase 2.3.1 Hoạt tính 2.3.2 So sánh tác nhân tiêu sợi 2.4 Tác dụng Nattokinase 2.4.1 Khả làm tam cục máu đông 2.4.2 Đề phòng , hỗ trợ bệnh liên quan đến tim mạch 2.4.3 Giảm huyết áp, giúp lƣu thông máu 2.4.4 Các lợi ích khác 2.5 Các phƣơng pháp sản xuất Nattokinase 2.5.1 Phƣơng pháp lên men dịch thể 2.5.2 Phƣơng pháp sản xuất từ vi sinh vật 2.6 Tình hình nghiên cứu sản xuất Nattokinase nƣớc 10 2.6.1 Trên giới 10 2.6.2 Tình hình nƣớc 11 PHẦN 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 3.1 Vật liệu nghiên cứu 12 3.1.1 Vi khuẩn B subtilis 12 vi 3.1.2 Hóa chất 12 3.1.3 Vật liệu 13 3.1.4 Thiết bị sử dụng 16 3.2 Địa điểm thời gian thực tập 17 3.3 Nội dung nghiên cứu 17 3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 18 3.4.1 Quy trình tách dòng, xác định trình tự gene aprE từ vi khuẩn B subtilis 18 3.4.2 Phƣơng pháp nuôi phục hồi vi khuẩn từ chủng gốc 19 3.4.3 Phƣơng pháp thu cặn tế bào vi khuẩn 19 3.4.4 Phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số 19 3.4.5 Phƣơng pháp PCR 20 3.4.6 Điện di sản phẩm gel agarose 21 3.4.7 Tinh sản phẩm PCR thu nhận lại DNA từ gel 22 3.4.8 Phƣơng pháp gắn nối gene khuếch đại vào vetor tách dòng pTUAF 23 3.4.9 Phƣơng pháp biến nạp DNA plasmid tái tổ hợp vào tế bào E.coli DH5α 24 3.4.10 Phƣơng pháp tách chiết DNA plasmid Kit thƣơng mại 24 3.4.11 Phƣơng pháp cắt kiểm tra dòng plasmid với enzyme cắt giới hạn 26 3.4.12 Phƣơng pháp xác định trình tự nucleotide Sanger cộng 26 3.4.13 Phƣơng pháp so sánh trình tự gene aprE tách dòng với trình tự công bố ngân hàng gene giới – Ngân hàng Gen bank 27 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 4.1 Kết tách chiết DNA tổng số từ vi khuẩn B subtilis 28 4.2 Kết nhân gene aprE từ vi khuẩn B subtilis phƣơng pháp PCR 28 4.3 Kết tinh sản phẩm PCR thu nhận lại DNA từ gel agarose 29 4.4 Kết biến nạp sản phẩm gắn nối 30 4.5 Kết chọn lọc dòng 31 4.5.1 Kết sàng lọc dòng điện di so sánh kích thƣớc plasmid 31 4.5.2 Kết chọn lọc dòng PCR 32 4.5.3 Kết chọn lọc dòng plasmid lập đồ giới hạn 32 4.6 Kết giải trình tự gene 34 4.6.1 Kết phân tích thành phần gene aprE sau giải trình tự 34 4.6.2 Kết dịch mã gene aprE 38 vii PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 5.1 Kết luận 40 5.2 Kiến nghị 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 Tài liệu nƣớc 41 Tài liệu nƣớc 41 PHẦN MỞ ĐẦU 1.1.Đặt vấn đề Hiện nay, giới năm, có hàng triệu bệnh nhân tử vong bệnh liên quan đến tim mạch huyết áp Theo thống kê Tổ chức Y tế giới (WHO), hàng năm giới có khoảng 17 triệu ngƣời tử vong bệnh lý tim mạch Tại Việt Nam, theo PGS.TS Phạm Nguyễn Vinh (Phó chủ tịch Hội Tim mạch TP.HCM), nƣớc ta có khoảng 10 triệu ngƣời mắc bệnh tăng huyết áp Nguyên nhân chủ yếu tắc nghẽn mạch máu mà tác nhân việc hình thành cục máu đông hay gọi tăng sợi huyết Điều đặt thách thức lớn cho không ngành Y tế mà áp lực không nhỏ ngành khoa học khác, có công nghệ sinh học Nattokinase loại enzyme có khả phân hủy huyết khối cách hiệu loại enzyme hoạt huyết, gấp lần Plasmin - enzyme nội sinh làm tan máu đông, đồng thời an toàn cho thể hấp thụ qua đƣờng ăn uống (Yanagisawa, Chatake et al 2010) Từ trƣớc đến nay, Nattokinase đƣợc thu nhận chủ yếu đƣờng lên men bán rắn chủng B subtilis chất đậu nành nấu chín hay lên men dịch thể (Sumi, Hamada et al 1987) Thực tế, Nattokinase đƣợc ly trích từ chất hay môi trƣờng lỏng thƣờng có hàm lƣợng không cao hoạt tính ổn định Vì thực nghiệm cho thấy tổng hợp Nattokinase tự nhiên B subtilis phức tạp đạt mức độ giới hạn Hay nói cách khác, cách tiếp cận thƣờng hiệu kèm công nghệ lên men hoàn hảo với thông số đƣợc nghiên cứu tối ƣu hóa.Tuy nhiên quy trình công nghệ đƣợc công bố (Nguyen Sle, Quyen et al 2014) Ở nƣớc phát triển nhƣ Trung Quốc Việt Nam, ngƣời dân bắt đầu quan tâm sử dụng Do vậy, việc tìm hiểu, thu nhận nguồn gen mã hóa Nattokinase từ chủng B subtilis, xây dựng, phát triển hệ thống tái tổ hợp cách tiếp cận mở triển vọng cho công nghệ sản xuất thu nhận Nattokinase hoạt tính cao nhằm làm nguyên liệu cho dƣợc phẩm, thực phẩm chức 31 4.5 Kết chọn lọc dòng 4.5.1 Kết sàng lọc dòng điện di so sánh kích thước plasmid Các khuẩn lạc trắng đƣợc chọn đƣợc nuôi tăng sinh môi trƣờng LB lỏng có kháng sinh ampicilin Ly tâm thu cặn tách chiết DNA plasmid Kết điện di dòng đƣợc kiểm tra đối chứng với kết tách chiết plasmid khuẩn lạc xanh để so sánh kích thƣớc, hình dạng plasmid Kết tách đƣợc hiển thị hình: ĐC Hình 10: Kết điện di plasmid dòng khuẩn lạc chọn ĐC : Khuẩn lạc xanh đối chứng Đƣờng chạy 1,2,3,4,5,6 sản phẩm dòng khuẩn lạc trắng Theo lý thuyết điện di, điều kiện điện di, phân tử DNA có kích thƣớc lớn di chuyển chậm gel, khoảng cách di chuyển phân tử có kích thƣớc lớn ngắn phân tử có kích thƣớc nhỏ Vector tái tổ hợp đƣợc gắn sản phẩm PCR nên kích thƣớc lớn vector gốc không mang đoạn xen Từ kết điện di cho thấy sản phẩm tách chiết từ dòng khuẩn lạc 4,5,6 có băng vạch nằm cao so với vị trí plasmid tách chiết từ khuẩn lạc xanh Do nghi ngờ dòng khuẩn lạc dòng khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp, tức xảy trình gắn nối với đoạn gene aprE cần 32 tách dòng Để kiểm tra giả thuyết trên, tiến hành kiểm tra phản ứng cắt enzyme giới hạn phản ứng PCR plasmid với cặp mồi đặc hiệu 4.5.2 Kết chọn lọc dòng PCR Tiến hành phản ứng PCR khuếch đại gene aprE với cặp mồi đặc hiệu với dòng plasmid dòng khuẩn lạc xanh dòng khuẩn lạc trắng: dòng 4, dòng dòng Plasmid dòng đƣợc pha loãng 100 lần để làm khuôn cho phản ứng PCR Kết kiểm tra đƣợc hiển thị nhƣ sau: Xanh L D6 L D4 D5 825 bp Hình 11: PCR kiểm tra dòng khuẩn lạc nghi ngờ L : Ladder kb Xanh, D6, D4, D5 : Các dòng khuẩn lạc lần lƣợt xanh, 6, 4, Từ kết điện di cho thấy, phản ứng PCR khuếch đại thành công đoạn gene aprE plasmid dòng khuẩn lạc D4 D5 với kích thƣớc kích thƣớc đoạn gene aprE mong muốn 825 bp 4.5.3 Kết chọn lọc dòng plasmid lập đồ giới hạn Để kiểm chứng chắn dòng chọn lọc đƣợc dòng mang plasmid tái tổ hợp, tiếp tục tiến hành thí nghiệm cắt kiểm tra enzyme cắt giới hạn với dòng Để kiểm tra chắn dòng khuẩn lạc trắng chọn lọc có mang plasmid tái tổ hợp chứa đoạn gene aprE mong đợi Các plasmid đƣợc cắt kiểm tra loạt enzyme giới hạn Trƣớc hết, cắt plasmid hai enzyme BamHI SacI hai enzyme nằm đầu gene aprE thiết kế mồi.Theo lý thuyết chèn đoạn đoạn gene aprE cắt kiểm tra BamHI SacI tạo đƣợc băng Một băng băng sản phẩm có kích thƣớc 825 bp gene aprE băng có kích thƣớc plasmid pTUAF xấp xỉ khoảng 2889 bp 33 Mặc dù có đƣợc sản phẩm có kích thƣớc mong muốn nhƣng sản phẩm đoạn xen ngẫu nhiên có kích thƣớc tƣơng tự mà đoạn xen mong muốn Vậy nên để chắn sử dụng đồng thời kết hợp hai enzyme HindIII EcoRI Lí sử dụng enzyme để kiểm tra vector tách dòng pTUAF đoạn xen có chứa vị trí enzyme HindIII nhƣng khoảng cách vị trí enzyme HindIII plasmid đoạn xen nhỏ nên theo dự đoán, chèn đoạn gene aprE cắt kiểm tra xuất băng vạch, băng vạch xấp xỉ kích thƣớc đoạn nằm HindIII EcoRI tức 705 bp băng thứ hai có kích thƣớc xấp xỉ tổng kích thƣớc vector có đoạn xen pTUAF-aprE trừ 705 bp trừ khoảng cách hai vị trí HindIII, tức xấp xỉ 2844 bp.Sản phẩm cắt sau điện di đƣợc đối chiếu với ladder kb so sách kích thƣớc để khẳng định Với việc sử dụng gel agarose 1% để điện di, hoàn toàn phân tách rõ băng vạch 825 bp 705 bp L ĐC 825 bp 705 bp Hình 12: Sản phẩm cắt enzyme giới hạn Đƣờng chạy 5: Cắt BamHI SacI lần lƣợt với dòng dòng Đƣờng chạy 6: Cắt EcoRI HindIII lần lƣợt với dòng dòng L : Ladder kb ĐC : Mẫu đối chứng dòng 4, không sử dụng enzyme cắt giới hạn 34 Từ kết điện di cho thấy phản ứng cắt đồng thời với hai enzyme diễn đặc hiệu, phản ứng cắt tối ƣu triệt để, băng vạch thu đƣợc rõ nét, dễ nhận biết, dễ phân biệt kích thƣớc Kết cho ta thấy dòng khuẩn lạc nghi ngờ dòng dòng cho kết cắt nhƣ dự kiến 4.6 Kết giải trình tự gene Sản phẩm tách chiết trƣớc đem giải trình tự đƣợc đo OD để xác địch mức độ tinh sản phẩm, dựa kết đo OD, chọn dòng để giải trình tự gene với nồng độ đo đƣợc 150 ng/ul 4.6.1 Kết phân tích thành phần gene aprE sau giải trình tự TCGCTGGATCCGCGCAATCTGTTCTTTACGGCATGTCCCAAATTAAAGCGCCGGCTCTTCACTCTCAAGGCTACACAGGCTCTAACGTAAAAGTAGCTGT TCGCTGGATCCGCGCAATCTGTTCTTTACGGCATGTCCCAAATTAAAGCGCCGGCTCTTCACTCTCAAGGCTACACAGGCTCTAACGTAAAAGTAGCTGT f R TATCGACAGCGGAATTGACCCTTCTCATCCTGACTTAAACGTCAGAGGCGGAGCAAGCTTCGTACCTTCTGAAACAAACCCATACCAGGACGGCGGTTCT TATCGACAGCGGAATTGACCCTTCTCATCCTGACTTAAACGTCAGAGGCGGAGCAAGCTTCGTACCTTCTGAAACAAACCCATACCAGGACGGCGGTTCT f R CACGGTACGCACGTAGCCGGTACGATTGCCGCTCTTAATAACTCAATCGGTGTTCTCGGCGTAGCGCCAAGCGCATCATTATATGCGGTAAAAGTTCTTG CACGGTACGCACGTAGCCGGTACGATTGCCGCTCTTAATAACTCAATCGGTGTTCTCGGCGTAGCGCCAAGCGCATCATTATATGCGGTAAAAGTTCTTG f R ATTCAACAGGAAGCGGCCAATACAGCTGGATCATCAACGGCATTGAATGGGCCATTTCCAACAATATGGATGTTATCAACATGAGCCTTGGCGGACCTTC ATTCAACAGGAAGCGGCCAATACAGCTGGATCATCAACGGCATTGAATGGGCCATTTCCAACAATATGGATGTTATCAACATGAGCCTTGGCGGACCTTC f R TGGTTCTACAGCGCTGAAAACAGTTGTTGATAAAGCCGTTTCCAGCGGTATTGTGGTTGCGGCCGCAGCCGGAAACGAAGGCTCGTCCGGAAGCTCAAGC TGGTTCTACAGCGCTGAAAACAGTTGTTGATAAAGCCGTTTCCAGCGGTATTGTGGTTGCGGCCGCAGCCGGAAACGAAGGCTCGTCCGGAAGCTCAAGC f R ACAGTCGGCTATCCTGCGAAATATCCTTCTACCATCGCGGTAGGTGCGGTAAACAGCAGCAACCAAAGAGCTTCATTCTCAAGCGCAGGTTCTGAGCTTG ACAGTCGGCTATCCTGCGAAATATCCTTCTACCATCGCGGTAGGTGCGGTAAACAGCAGCAACCAAAGAGCTTCATTCTCAAGCGCAGGTTCTGAGCTTG f R ATGTGATGGCTCCTGGCGTATCTATCCAAAGCACACTTCCTGGAGGCACTTACGGTGCTTACAACGGAACGTCAATGGCGACTCCTCACGTTGCCGGAGC ATGTGATGGCTCCTGGCGTATCTATCCAAAGCACACTTCCTGGAGGCACTTACGGTGCTTACAACGGAACGTCAATGGCGACTCCTCACGTTGCCGGAGC f R AGCAGCGTTAATTCTTTCTAAGCACCCGACTTGGACAAACGCGCAAGTCCGCGATCGTTTAGAAAGCACTGCAACATACCTTGGAAGCTCTTTCTACTAT AGCAGCGTTAATTCTTTCTAAGCACCCGACTTGGACAAACGCGCAAGTCCGCGATCGTTTAGAAAGCACTGCAACATACCTTGGAAGCTCTTTCTACTAT f R GGAAAAGGGTTAATCAATGTGGAAGCAGCTGCACAATAAGAGCTCAGCGCGTAAAAACAACTTACAAAAAA GGAAAAGGGTTAATCAATGTGGAAGCAGCTGCACAATAAGAGCTCAAGTATTGGAATTCACTGGCCGTCGT Hình 13: Trình tự gene aprE f R 35 Chất lƣợng kết giải trình tự đƣợc trình bày phụ lục Kết nhận lại hai trình tự nucleotide hai mồi f R trƣợt mạch theo chiều đối ngƣợc tạo Bởi muốn biểu sản phẩm cuối đoạn gene đƣa vào vector phải có trình tự chuẩn xác.Với phƣơng pháp Sanger số base giải đƣợc tốt từ 500-600 bp, gene aprE có kích thƣớc 825 bp nên phải tiến hành so sánh trình tự lấy từ hai đầu hai mồi để có kết xác.Tôi tiến hành so sánh hai trình tự để tìm trình tự chung đƣợc kết nhƣ hình 13 Kết giải trình tự gene aprE hình cho thấy mã ba mở đầu ATG mã ba kết thúc TAA đƣợc bảo toàn, vị trí cắt enzyme giới hạn BamHI GGATCC SacI GAGCTC thiết kế mồi vị trí sai khác Nhƣ vậy, thành phần thiết yếu gene theo thiết kế đƣợc giữ nguyên Vì đảm bảo độ xác để tiến hành nghiên cứu gắn nối vào vector biểu theo mục đích thiết kế Sau có đƣợc trình tự, tiến hành so sánh tƣơng đồng gene giải trình tự với trình tự gene aprE công bố ngân hàng gene giới (Gene bank) công cụ blastn đƣợc kết nhƣ sau: 36 Query Sbjct 340 Query 61 Sbjct 400 Query 121 Sbjct 460 Query 181 Sbjct 520 Query 241 Sbjct 580 Query 301 Sbjct 640 Query 361 Sbjct 700 Query 421 Sbjct 760 Query 481 Sbjct 820 Query 541 Sbjct 880 Query 601 Sbjct 940 Query 661 Sbjct 1000 Query 721 Sbjct 1060 Query 781 Sbjct 1120 ATGTCCCAAATTAAAGCGCCGGCTCTTCACTCTCAAGGCTACACAGGCTCTAACGTAAAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATGTCCCAAATTAAAGCGCCGGCTCTTCACTCTCAAGGCTACACAGGCTCTAACGTAAAA 60 399 GTAGCTGTTATCGACAGCGGAATTGACCCTTCTCATCCTGACTTAAACGTCAGAGGCGGA ||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||| GTAGCTGTTATCGACAGCGGAATTGACTCTTCTCATCCTGACTTAAACGTCAGAGGCGGA 120 GCAAGCTTCGTACCTTCTGAAACAAACCCATACCAGGACGGCGGTTCTCACGGTACGCAC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||| GCAAGCTTCGTACCTTCTGAAACAAACCCATACCAGGACGGCAGTTCTCACGGTACGCAC 180 GTAGCCGGTACGATTGCCGCTCTTAATAACTCAATCGGTGTTCTCGGCGTAGCGCCAAGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTAGCCGGTACGATTGCCGCTCTTAATAACTCAATCGGTGTTCTCGGCGTAGCGCCAAGC 240 GCATCATTATATGCGGTAAAAGTTCTTGATTCAACAGGAAGCGGCCAATACAGCTGGATC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCATCATTATATGCGGTAAAAGTTCTTGATTCAACAGGAAGCGGCCAATACAGCTGGATC 300 ATCAACGGCATTGAATGGGCCATTTCCAACAATATGGATGTTATCAACATGAGCCTTGGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATCAACGGCATTGAATGGGCCATTTCCAACAATATGGATGTTATCAACATGAGCCTTGGC 360 GGACCTTCTGGTTCTACAGCGCTGAAAACAGTTGTTGATAAAGCCGTTTCCAGCGGTATT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGACCTTCTGGTTCTACAGCGCTGAAAACAGTTGTTGATAAAGCCGTTTCCAGCGGTATT 420 GTGGTTGCGGCCGCAGCCGGAAACGAAGGCTCGTCCGGAAGCTCAAGCACAGTCGGCTAT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||| GTGGTTGCGGCCGCAGCCGGAAACGAAGGCTCGTCCGGAAGCTCAACCACAGTCGGCTAT 480 CCTGCGAAATATCCTTCTACCATCGCGGTAGGTGCGGTAAACAGCAGCAACCAAAGAGCT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCTGCGAAATATCCTTCTACCATCGCGGTAGGTGCGGTAAACAGCAGCAACCAAAGAGCT 540 TCATTCTCAAGCGCAGGTTCTGAGCTTGATGTGATGGCTCCTGGCGTATCTATCCAAAGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||| TCATTCTCAAGCGCAGGTTCTGAGCTTGATGTGATGGCTCCTGGTGTATCTATCCAAAGC 600 459 519 579 639 699 759 819 879 939 ACACTTCCTGGAGGCACTTACGGTGCTTACAACGGAACGTCAATGGCGACTCCTCACGTT ||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACACTTCCTGGGGGCACTTACGGTGCTTACAACGGAACGTCAATGGCGACTCCTCACGTT 660 GCCGGAGCAGCAGCGTTAATTCTTTCTAAGCACCCGACTTGGACAAACGCGCAAGTCCGC ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCCGGAGCAGCAGCGTTAATTCTTTCTAAGCACCCGACTTGGACAAACGCGCAAGTCCGT 720 GATCGTTTAGAAAGCACTGCAACATACCTTGGAAGCTCTTTCTACTATGGAAAAGGGTTA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GATCGTTTAGAAAGCACTGCAACATACCTTGGAAGCTCTTTCTACTATGGAAAAGGGTTA ATCAATGTGGAAGCAGCTGCACAATAA |||||||| ||||||||||| |||||| ATCAATGTAGAAGCAGCTGCCCAATAA 807 1146 Hình 14: So sánh gene giải trình tự gene công bố Gen bank Query: Trình tự gene aprE sau giải trình tự Sbjct: Trình tự gene aprE mã số AB 734700 từ Gen bank 999 1059 780 1119 37 Kết so sánh cho thấy, hai gene có độ tƣơng đồng 99 % (Indentities = 800/807) Nhƣ điểm sai khác trình tự gene aprE đƣợc giải trình tự gene aprE đƣợc công bố Gen bank.Tôi tiến hành kiểm tra điểm sai khác so với sắc ký đồ giải trình tự: Vị trí 88 Query Vị trí 163 Query Vị trí 467 Query Vị trí 585 Query Vị trí 427 Sbjct Vị trí 502 Sbjct Vị trí 806 Sbjct Vị trí 924 Sbjct a) b) c) d) Vị trí 612 Query Vị trí 789 Query Vị trí 801 Query Vị trí 951 Sbjct Vị trí 1128 Sbjct Vị trí 1140 Sbjct e) f) g) Hình 15: Sắc ký đồ số điểm sai khác So sánh với sắc ký đồ ta thấy cƣờng độ tín hiệu màu tốt nhƣ điểm sai khác điểm sai khác gene aprE giải trình tự gene aprE đƣợc công bố Giải thích sai khác 1% trình tự gene công bố Gen bank khuếch đại từ genenome chủng vi khuẩn có sai khác vài điểm với chủng vi khuẩn mà thao tác Việt Nam Bƣớc tiếp theo, tiến hành dịch mã đoạn gene giải trình tự xem có bị stop codon hay không 38 4.6.2 Kết dịch mã gene aprE Kết dịch mã đoạn gene giải trình tự không xuất stop codon vô nghĩa tận cuối gene, dịch mã đầy đủ toàn đoạn gene, đảm bảo biểu gene thể sinh vật Hình 16: Dịch mã trình tự gene aprE Để khẳng định chắn nữa, tiến hành so sánh trình tự peptide với trình tự peptide đƣợc công bố Kết nhƣ sau: 39 Query MSQIKAPALHSQGYTGSNVKVAVIDSGIDPSHPDLNVRGGASFVPSETNPYQDGGSHGTH 60 Sbjct 114 MSQIKAPALHSQGYTGSNVKVAVIDSGIDSSHPDLNVRGGASFVPSETNPYQDGSSHGTH 173 Query 61 VAGTIAALNNSIGVLGVAPSASLYAVKVLDSTGSGQYSWIINGIEWAISNNMDVINMSLG 120 Sbjct 174 VAGTIAALNNSIGVLGVAPSASLYAVKVLDSTGSGQYSWIINGIEWAISNNMDVINMSLG 233 Query 121 GPSGSTALKTVVDKAVSSGIVVAAAAGNEGSSGSSSTVGYPAKYPSTIAVGAVNSSNQRA 180 Sbjct 234 GPSGSTALKTVVDKAVSSGIVVAAAAGNEGSSGSSSTVGYPAKYPSTIAVGAVNSSNQRA 293 Query 181 SFSSAGSELDVMAPGVSIQSTLPGGTYGAYNGTSMATPHVAGAAALILSKHPTWTNAQVR 240 Sbjct 294 SFSSAGSELDVMAPGVSIQSTLPGGTYGAYNGTSMATPHVAGAAALILSKHPTWTNAQVR 353 Query 241 DRLESTATYLGSSFYYGKGLINVEAAAQ 268 Sbjct 354 DRLESTATYLGSSFYYGKGLINVEAAAQ 381 Hình 17: So sánh trình tự peptide Query: Trình tự peptide gene giải trình tự Sbjct: Trình tự peptide công bố từ Gen bank Kết so sánh cho thấy, hai chuỗi peptide có độ tƣơng đồng 99 % (Indentities = 266/268).Có amino acid sai khác là: - Vị trí 30 ( tƣơng ứng với ba vị trí lần lƣợt trình tự gene 88, 89, 90, vị trí nucleotide 88 theo phân tích hình 15a điểm sai khác) - Vị trí 55 (tƣơng ứng với ba vị trí lần lƣợt trình tự gene 163, 164, 165, vị trí nucleotide 163 theo phân tích hình 15b điểm sai khác) Từ đó, rút kết luận trình tự peptide từ gene aprE giải trình tự sai khác amino acid so với trình tự peptide công bố ngân hàng Gen bank Sai khác nucleotide nhƣng sai khác vị trí amino acid, tính thoái hoá mã ba, tức nhiều mã ba mã hoá cho amino acid Trình tự mạch gene nằm phần phụ lục 40 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận - Đã tách dòng thành công gene aprE có kích thƣớc 825 bp phƣơng pháp PCR từ vi khuẩn B.subtilis phân lập từ Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử Công nghệ gene, Viện Khoa học sống, Đại học Thái Nguyên - Đã tách dòng thành công gene aprE thông qua vector tách dòng pTUAF, biến nạp vào tế bào E coli DH5α khả biến - Đã xác định đƣợc trình tự gene aprE tách dòng so sánh trình tự gene với trình gene aprE phân lập từ chủng Bacillus subtilis aprE M2-4 công bố ngân hàng gene với mã số AB 734700 Với mật độ tƣơng đồng đạt 99% vị trí đƣợc thiết kế đƣợc bảo toàn, kết luận trình tách dòng gene aprE từ hệ gene vi khuẩn B.subtilis thành công 5.2 Kiến nghị - Với dòng gene aprE tạo đƣợc tiến hành nghiên cứu nhằm thiết kế thành công vector biểu hiện, tạo sở thiết kế chủng vi sinh vật có khả sản xuất nattokinase có suất cao, mà trƣớc mắt tạo chủng E coli tái tổ hợp có khả sản xuất nattokinase - Tiến hành nghiên cứu yếu tố ảnh hƣởng tới trình sản xuất nattokinase vi sinh vật điều kiện phòng thí nghiệm sản xuất quy mô lớn - Phân tích chi tiết chế tác động vai trò nattokinase sức khoẻ dạng tiêu thụ sản phẩm có mặt thị trƣờng 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu nƣớc Lê Thị Bích Phƣợng, Võ Thị Hạnh, Trần Thạnh Phong, Lê Tấn Hƣng, Trƣơng Thị Hồng Vân, Lê Thị Hƣơng “Phân lập tuyển chọn số chủng bacillus sinh tổng hợp Nattokinase” Tạp chí sinh học 34(3): 99104,2012 Tài liệu nƣớc Elahi, M M., et al (2015) "Consequence of patient substitution of nattokinase for warfarin after aortic valve replacement with a mechanical prosthesis." Proceedings (Baylor University Medical Center) 28(1): 81-82 Kim, J Y., et al (2008) "Effects of nattokinase on blood pressure: a randomized, controlled trial." Hypertension Research 31(8): 1583-1588 Kim, W., et al (1996) "Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme produced from Bacillus sp strain CK 11-4 screened from Chungkook-Jang." Applied and Environmental Microbiology 62(7): 24822488 Kim, W., et al (1996) "Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme produced from Bacillus sp strain CK 11-4 screened from Chungkook-Jang." Appl Environ Microbiol 62(7): 2482-2488 Mansell, P and J P Reckless (1991) "Garlic." BMJ : British Medical Journal 303(6799): 379-380 Nakamura, T., et al (1992) "Nucleotide sequence of the subtilisin NAT gene, aprN, of Bacillus subtilis (natto)." Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 56(11): 1869-1871 Nguyen Sle, T., et al (2014) "Highly effective renaturation of a streptokinase from Streptococcus pyogenes DT7 as inclusion bodies overexpressed in Escherichia coli." Biomed Res Int 2014: 324705 42 Okamoto, A., et al (1995) "Anti-hypertensive substances in fermented soybean, natto." Plant Foods for Human Nutrition 47(1): 39-47 10 Sumi, H (1999) "Accumulation of Vitamin K (Menaquinone-7) in Plasma after Ingestion of Natto and Natto Bacilli (B subtilis natto)." Food Science and Technology Research 5(1): 48-50 11 Sumi, H., et al (1990) "Enhancement of the fibrinolytic activity in plasma by oral administration of nattokinase." Acta Haematol 84(3): 139-143 12 Sumi, H., et al (1987) "A novel fibrinolytic enzyme (nattokinase) in the vegetable cheese Natto; a typical and popular soybean food in the Japanese diet." Experientia 43(10): 1110-1111 13 Suzuki, Y., et al (2003) "Dietary supplementation with fermented soybeans suppresses intimal thickening." Nutrition 19(3): 261-264 14 Tai, M W and B V Sweet (2006) "Nattokinase for prevention of thrombosis." Am J Health Syst Pharm 63(12): 1121-1123 15 Toki, N., et al (1985) "Transport of urokinase across the intestinal tract of normal human subjects with stimulation of synthesis and/or release of urokinase-type proteins." Journal of Clinical Investigation 75(4): 1212-1222 16 Weng, M., et al (2009) "Enhancement of oxidative stability of the subtilisin nattokinase by site-directed mutagenesis expressed in Escherichia coli." Biochim Biophys Acta 1794(11): 1566-1572 17 Yanagisawa, Y., et al (2010) "Purification, crystallization and preliminary X-ray diffraction experiment of nattokinase from Bacillus subtilis natto." Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun 66(Pt 12): 1670-1673 Phụ lục 1: Chất lƣợng trình tự đƣợc giải phƣơng pháp Sanger Phụ lục : Trình tự mạch đơn gene aprE ATGTCCCAAATTAAAGCGCCGGCTCTTCACTCTCAAGGCTACACAGGCTCTAACGTAAAAG TAGCTGTTATCGACAGCGGAATTGACCCTTCTCATCCTGACTTAAACGTCAGAGGCGGAGC AAGCTTCGTACCTTCTGAAACAAACCCATACCAGGACGGCGGTTCTCACGGTACGCACGTA GCCGGTACGATTGCCGCTCTTAATAACTCAATCGGTGTTCTCGGCGTAGCGCCAAGCGCAT CATTATATGCGGTAAAAGTTCTTGATTCAACAGGAAGCGGCCAATACAGCTGGATCATCAA CGGCATTGAATGGGCCATTTCCAACAATATGGATGTTATCAACATGAGCCTTGGCGGACCT TCTGGTTCTACAGCGCTGAAAACAGTTGTTGATAAAGCCGTTTCCAGCGGTATTGTGGTTG CGGCCGCAGCCGGAAACGAAGGCTCGTCCGGAAGCTCAAGCACAGTCGGCTATCCTGCGAA ATATCCTTCTACCATCGCGGTAGGTGCGGTAAACAGCAGCAACCAAAGAGCTTCATTCTCA AGCGCAGGTTCTGAGCTTGATGTGATGGCTCCTGGCGTATCTATCCAAAGCACACTTCCTG GAGGCACTTACGGTGCTTACAACGGAACGTCAATGGCGACTCCTCACGTTGCCGGAGCAGC AGCGTTAATTCTTTCTAAGCACCCGACTTGGACAAACGCGCAAGTCCGCGATCGTTTAGAA AGCACTGCAACATACCTTGGAAGCTCTTTCTACTATGGAAAAGGGTTAATCAATGTGGAAG CAGCTGCACAATAA [...]... tách dòng pTUAF bằng enzyme T4 - DNA ligase - Biến nạp vector tái tổ hợp vào chủng E coli DH5α khả biến - Tách chiết DNA plasmid - Cắt kiểm tra vector tái tổ hợp bằng enzyme cắt giới hạn Nội dung 3: Xác định trình tự gene aprE đã tách dòng - Giải trình tự gene aprE đã tách dòng trên máy giải trình tự tự động Applied Biosystems - So sánh thành phần thiết yếu của trình tự gene aprE đã giải trình tự với... dịch mã của đoạn gene đã giải trình tự - So sánh trình tự gene aprE đã tách dòng với trình tự đã công bố trên ngân hàng gene NCBI (Gene bank) thông qua chƣơng trình Blast 18 3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 3.4.1 Quy trình tách dòng, xác định trình tự gene aprE từ vi khuẩn B subtilis Cặn tế bào B subtilis PCR Gen aprE Gắn nối Vector tách dòng pTUAF Sản phẩm gắn nối Biến nạp, cấy trải trên đĩa thạch Các dòng. .. Nuôi và tách chiết plasmid Các dòng plasmid Điện di sàng lọc kích thƣớc Lập bản đồ giới hạn pTUAF - aprE Giải trình tự gen So sánh với trình tự đã công bố trên ngân hàng gen Hình 4: Quy trình tách dòng và xác định trình tự gene aprE từ vi khuẩn B subtilis 19 3.4.2 Phương pháp nuôi phục hồi vi khuẩn từ chủng gốc Nuôi phục hồi vi khuẩn từ chủng gốc B subtilis đƣợc cung cấp bởi Bộ môn Công nghệ vi sinh và. .. nghiệp dƣợc phẩm cũng bắt đầu cho ra các sản phẩm Nattokinase với nguyên liệu ngoại nhập chủ yếu từ Nhật Bản, giá thành khá cao Việc tìm kiếm nguồn nguyên liệu Nattokinase có hoạt tính ổn định và giá cả phù hợp là định hƣớng của nhiều công ty Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn trên, tôi thực hiện đề tài: Tách dòng và giải trình tự gene mã hóa enzyme Nattokinase từ B subtilis” nhằm mục đích cung cấp vật liệu... sản xuất Nattokinase tái tổ hợp, trƣớc tiên là tạo chủng E coli tái tổ hợp 1.2 Mục tiêu đề tài - Phân lập gene aprE từ vi khuẩn B subtilis - Xác định trình tự gene aprE đã phân lập và so sánh với trình tự trên ngân hàng gene (Gene bank) 1.3 Yêu cầu của đề tài - Nắm đƣợc các nguyên lý, kĩ thuật và các phƣơng pháp thực hiện trong quá trình phân tích - Thành thạo các thao tác và thực hiện đƣợc quy trình. .. điểm và thời gian thực tập Địa điểm: Bộ môn Sinh học phân tử và công nghệ gene, Viện khoa học sự sống, Đại học Thái Nguyên Thời gian : Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 12/2014 - 6/2015 3.3 Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Phân lập gene aprE bằng PCR - Khuếch đại gene aprE từ hệ gene của vi khuẩn B.subtilis bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu Nội dung 2: Tạo dòng gene aprE - Gắn gene vào vector tách. .. 4,6 Tổng thể tích 10 Bảng 7: Thành phần phản ứng cắt với BamHI và SacI Thành phần phản ứng DNA plasmid Enzyme Thể tích (µl) 4 BamHI 0,2 SacI 0,2 Buffer BamHI 1 Nƣớc khử ion 4,6 Tổng thể tích 10 3.4.12 Phương pháp xác định trình tự nucleotide của Sanger và các cộng sự Trình tự của gene aprE đã tách dòng đƣợc xác định trên máy giải trình tự tự động của hãng Applied Biosystems Phƣơng pháp này dựa trên nguyên... sẽ làm cho quá trình tổng hợp dừng lại do dideoxynucleotide không có nguyên tử oxi ở nhóm 3’ –OH để hình thành liên kết phosphodieste với nucleotide tự do trong hỗn hợp phản ứng Dựa trên tín hiệu màu nhận đƣợc máy sẽ tự động ghi lại và chuyển các tín hiệu màu thành trình tự tƣơng ứng 3.4.13 Phương pháp so sánh trình tự gene aprE đã tách dòng với các trình tự đã công bố trên ngân hàng gene thế giới –... chất tách chiết DNA plasmid Sử dụng bộ kit Thermo Scientific GeneJET Plasmid Miniprep Kit để tách chiết DNA plasmid  Enzyme giới hạn: SacI, HindIII, BamHI, EcoRI của hãng Thermo Scientific 3.1.3 Vật liệu 3.1.3.1 Mồi phản ứng PCR Chúng tôi sử dụng cặp mồi đặc hiệu để nhân gene aprE Trình tự mồi đƣợc thiết kế dựa vào trình tự gene đã đƣợc công bố trên ngân hàng gene NCBI Bảng 2: Cặp mồi sử dụng nhân gene. .. trong hệ gene của vi khuẩn B subtilis nằm ở đầu 3’, trong đó bao gồm cả 3 nucleotide bổ sung với mã kết thúc TTA trên gene aprE –SacI– F Phần này cho phép khuếch đại chính xác trình tự của gene aprE từ hệ gene của vi khuẩn B subtilis 3.1.3.2 Vector tách dòng pTUAF Vector pTUAF là vector tách dòng TA, đã đƣợc thiết kế thành công dựa trên vector thƣơng mại pTZ57R/T có kích thƣớc 2886 bp, thiết kế dựa vào