ĐỖ THỊ THANH BÌNH 2013B TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NÔI MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN iii LỜI CẢM ƠN iv BẢNG KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ vii MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 TÌNH HÌNH SỬ DỤNG GIẤY TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 1.2 GIẤY BÁO IN VÀ PHƢƠNG PHÁP IN 1.3 KHỬ MỰC GIẤY BÁO IN BẰNG PHƢƠNG PHÁP TUYỂN NỔI 1.4 HÓA CHẤT SỬ DỤNG ĐỂ KHỬ MỰC THÔNG THƢỜNG 1.5 ENZYM VÀ CƠ CHẾ HOẠT ĐỘNG CỦA ENZYM 10 1.5.1 Giới thiệu chung enzym 10 1.5.2 Tính chất enzym 10 1.5.3 Cơ chế hoạt động enzym 11 1.6 ỨNG DỤNG ENZYM TRONG QUÁ TRÌNH KHỬ MỰC GIẤY BÁO 12 1.7 SỬ DỤNG ENZYM CELLULASE VÀ XYLANASE TRONG KHỬ MỰC GIẤY BÁO 14 1.7.1 Cellulase 14 1.7.2 Xylanase 20 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 29 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 29 2.1.1 Enzyme 29 2.1.2 Giấy 29 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.2.1 Xác định hoạt độ xylanase 30 2.2.2 Xác định hoạt độ cellulase 31 i ĐỖ THỊ THANH BÌNH 2013B TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NÔI 2.2.3 Thí nghiệm xác định khả khử mực giấy báo cũ với hỗn hợp enzyme 32 2.2.4 Sơ đồ qui trình thí nghiệm khử mực giấy in báo enzyme 33 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 33 3.1 ĐẶC TÍNH CỦA CELLULASE THU NHẬN TỪ CHỦNG NẤM MỐC 34 3.1.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ môi trƣờng phản ứng đến hoạt lực celllulase 34 3.1.2 Ảnh hƣởng pH môi trƣờng phản ứng đến hoạt lực celllulase 35 3.2 ĐẶC TÍNH CỦA XYLALASE THU NHẬN TỪ CHỦNG NẤM MỐC 36 3.2.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ môi trƣờng phản ứng đến hoạt lực xylanase 36 3.2.2 Ảnh hƣởng pH môi trƣờng phản ứng đến hoạt lực xylanase 37 3.3 ẢNH HƢỞNG CỦA CÁC YẾU TỐ CÔNG NGHỆ CỦA QUÁ TRÌNH TẨY MỰC LÊN ĐỘ BỀN HOẠT LỰC CỦA ENZYME 39 3.4 ẢNH HƢỞNG CỦA TỶ LỆ PHỐI TRỘN ENZYME LÊN HIỆU QUẢ CỦA QUÁ TRÌNH TẨY MỰC GIẤY IN BÁO 40 3.5 ẢNH HƢỞNG CỦA LƢỢNG ENZYME SỬ DỤNG VÀ pH PHẢN ỨNG LÊN HIỆU QUẢ CỦA QUÁ TRÌNH KHỬ MỰC GIẤY IN BÁO 42 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 ii ĐỖ THỊ THANH BÌNH 2013B TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NÔI LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chƣa đƣợc công bố công trình khác Học viên Đỗ Thị Thanh Bình iii ĐỖ THỊ THANH BÌNH 2013B TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NÔI LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới TS Đặng Minh Hiếu – Viện Công Nghệ sinh học- Công nghệ Thực phẩm Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội tận tình giúp đỡ hƣớng dẫn thực luận văn tốt nghiệp Trong thời gian học tập nghiên cứu vừa qua, nhận đƣợc giúp đỡ tạo điều kiện thầy cô Bộ môn thầy cô Viện Sau Đại Học - Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ quý báu Các nội dung nghiên cứu luận văn đƣợc thực hoàn thành Trung Tâm Nghiên Cứu Phát Triển Công Nghệ Sinh Học Trƣờng Đại Học Bách Khoa Hà Nội Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ quý báu tập thể cán phòng Đồng thời xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới bạn sinh viên nhiệt tình giúp đỡ Nhân xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban lãnh đạo, Chú, Cô, Anh, Chị em Viện Công Nghiệp Giấy Xenluylô, 56 Vũ Trọng Phụng, Cầu Giấy, Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi cho để hoàn thành thí nghiệm luận văn Cuối xin chân thành cảm ơn gia đình, đồng nghiệp bạn bè quan tâm giúp đỡ động viên suốt thời gian học tập hoàn thành luận văn tốt nghiệp Hà Nội, tháng 10/2015 Học Viên Đỗ Thị Thanh Bình iv ĐỖ THỊ THANH BÌNH 2013B TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NÔI BẢNG KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT OCC : Hỗn hợp giấy caton cũ ONP : Giấy báo cũ OMG : Giấy tạp chí cũ CBD : Cellulose binding domain v ĐỖ THỊ THANH BÌNH 2013B TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NÔI DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng1.1 Sử dụng giấy thu hồi để sản xuất giấy theo khu vực giai đoạn 2005 – 2010 (1000 tấn) [1] Bảng 1.2 Giấy loại thu hồi qua năm Việt Nam (tấn) Bảng 1.3: Enzyme khử mực giấy tái chế 26 Bảng 2.1: Tỷ lệ phối trộn enzyme hỗn hợp mẫu 32 Bảng 3.1:Ảnh hƣởng nhiệt độ môi trƣờng phản ứng lên hoạt độ cellulase 34 Bảng 3.2: Ảnh hƣởng pH môi trƣờng phản ứng lên hoạt lực Cellulase 35 Bảng 3.3: Ảnh hƣởng nhiệt độ phản ứng lên hoạt lực enzyme xylanase 36 Bảng 3.4: Ảnh hƣởng pH môi trƣờng phản ứng lên hoạt lực 38 enzyme xylanase 38 Bảng 3.5: Độ bền hoạt độ cellulase xylanase điều kiện công nghệ qui trình khử mực thông thƣờng 39 Bảng 3.6: Ảnh hƣởng tỷ lệ phối trộn enzyme lên số tính chất 41 bột giấy sau trình khử mực (Xylanase : Cellulase) 41 Bảng 3.7: Ảnh hƣởng pH phản ứng enzyme lƣợng dùng enzyme lên 43 số tính chất bột giấy 43 vi ĐỖ THỊ THANH BÌNH 2013B TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NÔI DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1: Cấu trúc -1,4-endo glucanase từ chủng Streptomyces lividans 15 Hình 1.2: Cơ chế hoạt động hệ enzyme cellulase 16 Hình 1.3: Quá trình phân giải Cellulose Cellulase 16 Hình 1.4: Đặc điểm hình thái chủng nấm mốc Trichoderma 18 Hình 1.5: Cấu trúc 3-D G11 xylanase từ Bacillus subtilis 20 Hình 1.6: Sơ đồ hoạt động hệ enzyme xylanase 22 Hình 1.7: Hình thái khuẩn lạc bào tử nấm msốc A niger 24 Hình 3.1: Ảnh hƣởng nhiệt độ môi trƣờng phản ứng lên hoạt độ cellulase 34 Hình 3.2: Ảnh hƣởng pH môi trƣờng phản ứng lên hoạt lực Cellulase 35 Hình 3.3: Ảnh hƣởng nhiệt độ phản ứng lên hoạt lực enzyme xylanase 37 Hình 3.4: Ảnh hƣởng pH môi trƣờng phản ứng lên hoạt lực 38 enzyme xylanase 38 vii ĐỖ THỊ THANH BÌNH 2013B TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NÔI MỞ ĐẦU Hiện nay, vấn đề kinh tế môi trƣờng mà nhu cầu sử dụng giấy loại ngày tăng, giấy loại trở thành nguồn nguyên liệu xơ sợi thay quan trọng công nghiệp sản xuất giấy Giấy loại thƣờng có ba loại chính: o Hỗn hợp cacton cũ (Old corrugated container - OCC) o Giấy báo cũ (Old newspaper - ONP) o Hỗn hợp giấy loại văn phòng Thông thƣờng, OCC đƣợc xử lý dùng cho sản xuất giấy bao gói, giấy báo cũ đƣợc khử mực, tẩy trắng dùng cho sản xuất giấy in báo… Xuất phát từ thực tế trên, công nghệ khử mực giấy loại có bƣớc cải tiến hoàn thiện nhằm làm tăng hiệu suất chất lƣợng bột giấy thu hồi Các phƣơng pháp khử mực giấy loại hóa chất truyền thống từ trƣớc tới có giá thành cao, sử dụng nhiều hóa chất có hại cho môi trƣờng Việc sử dụng hoá chất có xu hƣớng cải thiện mức loại mực độ trắng bột giấy, nhƣng hóa chất sau thải môi trƣờng gây ô nhiễm trầm trọng Cùng với giá thành cao ảnh hƣởng đến môi trƣờng, hóa chất khử mực tác động vào xơ sợi ảnh hƣởng tới tính chất lý bột Một phƣơng pháp cải tiến trình khử mực giấy loại kết hợp tác nhân sinh học hóa học thu hút đƣợc ý nhà sản xuất thời gian gần Một số nghiên cứu loại enzym nhƣ cellulase, hemicellulase, xylanase, amylase lipazase có hiệu việc khử mực giấy báo giấy loại văn phòng Các enzym đƣợc sử dụng kết hợp với để nâng cao hiệu khử mực giấy loại báo tạp chí, cung cấp nguyên liệu cho sản xuất giấy in báo, giấy vệ sinh hòm hộp Chính từ nhu cầu xuất phát từ việc xây dựng phƣơng pháp khử mực giấy in báo hiệu quả, thân thiện với môi trƣờng sử dụng tác nhân sinh học enzyme, năm 2014 đề xuất đề tài nghiên cứu: ĐỖ THỊ THANH BÌNH 2013B TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NÔI “Đánh giá khả khử mực giấy báo hỗn hợp cellulase xylanase” Đề tài đƣợc chấp thuận Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội bắt đầu đƣợc triển khai từ tháng 4/2014 Nội dung nghiên cứu bao gồm:  Khảo sát đặc tính hoá lý enzyme cellulase thu nhận từ chủng nấm mốc Trichoderma reesei (đƣợc đặt tên Trichoderma reesei T9)  Khảo sát đặc tính hoá lý enzyme xylanase thu nhận từ chủng nấm mốc Aspergillus niger (đƣợc đặt tên Aspergillus niger BH7)  Bƣớc đầu đánh giá khả sử dụng hỗn hợp phối trộn enzyme cellulase xylanase cho trình khử mực giấy báo cũ ĐỖ THỊ THANH BÌNH 2013B TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NÔI CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 TÌNH HÌNH SỬ DỤNG GIẤY TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM Hiện nay, tái chế giấy loại sản phẩm từ giấy đƣợc nhà máy bột giấy giấy quan tâm Do ý thức bảo vệ môi trƣờng đƣợc cải thiện nhƣ quy định chặt chẽ sản xuất, ngành công nghiệp giấy giới nhƣ Việt Nam nỗ lực thu hồi tái chế 40 % tất sản phẩm giấy qua sử dụng Ví dụ nhƣ Nhật Bản, Hoa Kỳ, Trung Quốc sử dụng đến 61%; 62% 65% lƣợng bột tái chế từ giấy loại Các quốc gia khu vực Đông Nam Á nhƣ Indonesia, Malaysia, Philippine… có mức sử dụng giấy loại lên đến 60% Ở Châu Âu, vấn đề đƣợc trọng thực cách nghiêm ngặt Điển hình Đức, gần 100% giấy bao gói đƣợc thu hồi mức độ tái sử dụng có hiệu đạt 70% Ở Phần Lan thu hồi đƣợc 75% giấy loại 53% số đƣợc sử dụng có hiệu Các quốc gia khác nhƣ Pháp, Bỉ, Thuỵ Điển có mức độ thu hồi giấy loại lên đến 75% Sử dụng bột giấy loại hiệu giúp tiết kiệm chi phí hoá chất, vận hành giảm thiểu đƣợc ảnh hƣởng xấu tới môi trƣờng việc khai thác rừng trình nấu bột gây Trên giới, sử dụng giấy thu hồi cho sản xuất tăng 3% giai đoạn 2005 – 2010 giá bột giấy tăng liên tục Châu Á nơi sử dụng giấy thu hồi nhiều nhất, chiếm gần 40% so với toàn giới Lƣợng giấy thu hồi tỉ lệ sử dụng giấy thu hồi cho sản xuất giấy thời gian gần đƣợc thống kê bảng 1.1 [1] Ngoài lƣợng lớn giấy bao bì cacton cũ giấy báo cũ (ONP) giấy tạp chí cũ đƣợc thu hồi đáng kể Năm 2010, tỉ lệ thu gom giấy báo loại ONP giới đạt 67,8% Dự kiến đến năm 2015, số đạt 69%, cung cấp nguồn nguyên liệu đáng kể cho sản xuất giấy ĐỖ THỊ THANH BÌNH 2013B TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NÔI CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 ĐẶC TÍNH CỦA CELLULASE THU NHẬN TỪ CHỦNG NẤM MỐC Trichoderma reesei T9 3.1.1 Ảnh hưởng nhiệt độ môi trường phản ứng đến hoạt lực celllulase Nhƣ trình bày phần trên, enzyme cellulase thu đƣợc từ nhiều nguồn vi sinh vật khác tuỳ thuộc vào nguồn thu vi sinh vật mà enzyme có đặc tính lý hoá khác Trong hoạt độ enzyme phụ thuộc nhiều vào điều kiện nhƣ nhiệt độ, pH, chất nồng dộ chất phản ứng Nhằm tìm điều kiện công nghệ thích hợp cho việc sử dụng enzyme khử mực giấy in báo, enzyme cellulase thu nhận đƣợc từ chủng nấm mốc Trochoderma reesei T9 đƣợc tiến hành xác định đặc tính theo số yếu tố nhƣ nhiệt độ pH môi trƣờng phản ứng Trong thí nghiệm này, biến đổi hoạt độ cellulase theo điều kiện nhiệt độ môi trƣờng khác đƣợc tiến hành xác định Bảng 3.1:Ảnh hƣởng nhiệt độ môi trƣờng phản ứng lên hoạt độ cellulase Nhiệt độ (°C) 30 40 Hoạt độ (U/ml) 75.4 114.5 Hoạt độ tƣơng đối (%) 26.1 39.7 45 50 144.1 202.9 48 70.4 55 60 70 288.4 234.7 85.3 100 81.4 29.6 Hoạt độ tƣơng đối (%) 100 100 90 80 81.4 70 70.4 60 Hoạt độ tƣơng đối (%) 50 48 40 39.7 30 20 29.6 26.1 10 30 40 45 50 55 60 70 Nhiệt độ (°C) Hình 3.1: Ảnh hƣởng nhiệt độ môi trƣờng phản ứng lên hoạt độ cellulase 34 ĐỖ THỊ THANH BÌNH 2013B TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NÔI Kết nghiên cứu phù hợp với số nghiên cứu trƣớc váì tác giả enzyme cellulase thu đƣợc số loài nấm mốc bao gồm loài Trichoderma (Miettien-Oinonen, 2004; Sathyavrathan Krithika, 2013; Grigorevski-Lima, 2013) Các nghiên cứu nhiệt độ tối ƣu cho hoạt lực enzyme cellulase nấm mốc thƣờng từ khoảng 50 – 60oC, cellulase từ chủng Trichoderma thƣờng có nhiệt độ thích hợp vào khoảng 50oC 3.1.2 Ảnh hưởng pH môi trường phản ứng đến hoạt lực celllulase Trong thí nghiệm tiếp theo, biến đổi hoạt lực cellulase theo pH môi trƣờng phản ứng đƣợc tiến hành xác định Bảng 3.2: Ảnh hƣởng pH môi trƣờng phản ứng lên hoạt lực Cellulase pH Hoạt độ (U/ml) 163.5 321.3 311.3 257.7 24.3 17.7 Hoạt độ tƣơng đối (%) 50.9 100 96.9 80.2 7.5 4.3 Hoạt độ tƣơng đối (%) 100 100 90 96.9 80 80.2 70 Hoạt độ tƣơng đối (%) 60 50 50.9 40 30 20 10 7.5 4.3 pH Hình 3.2: Ảnh hƣởng pH môi trƣờng phản ứng lên hoạt lực Cellulase 35 ĐỖ THỊ THANH BÌNH 2013B TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NÔI Kết thể biểu đồ hình 3.2 cho thấy enzyme cellulose thu đƣợc từ chủng nấm mốc Trichoderma reesei T9 cho hoạt lực cao pH giảm chậm pH Tại pH cho thấy giảm mạnh hoạt lực enzyme Kết nghiên cứu nhƣ cho thấy tƣơng đồng với số nghiên cứu trƣớc cellulase thu đƣợc từ số chủng Trichoderma hoạt lực tốt cellulase đƣợc khoảng pH từ 5-6 (Grigorevski-Lima, 2013; Miettien-Oinonen, 2004) 3.2 ĐẶC TÍNH CỦA XYLALASE THU NHẬN TỪ CHỦNG NẤM MỐC Aspergillus niger BH7 3.2.1 Ảnh hưởng nhiệt độ môi trường phản ứng đến hoạt lực xylanase Có nhiều nguồn vi sinh vật cho khả thu nhận enzyme xylanase tuỳ nguồn thu nhận mà enzyme có đặc tính hoá lý khác Với enzyme xylanase thu nhận từ nấm mốc Aspergillus niger, hoạt độ enzyme phụ thuộc nhiều vào điều kiện nhƣ nhiệt độ, pH, chất nồng dộ chất phản ứng Nhằm tìm điều kiện công nghệ thích hợp cho việc sử dụng enzyme khử mực giấy in báo, enzyme xylanase từ chủng nấm mốc Aspergillus niger BH7 đƣợc tiến hành xác định đặc tính theo số yếu tố nhƣ nhiệt độ pH môi trƣờng phản ứng Trong thí nghiệm này, biến đổi hoạt độ xylanase theo điều kiện nhiệt độ môi trƣờng khác đƣợc tiến hành xác định Bảng 3.3: Ảnh hƣởng nhiệt độ phản ứng lên hoạt lực enzyme xylanase Nhiệt độ (°C) Hoạt độ (U/ml) Hoạt độ tƣơng đối (%) 30 40 45 50 55 60 3.201 5.089 5.552 6.96 6.057 5.17 46 73.1 79.8 100 87 74.3 36 ĐỖ THỊ THANH BÌNH 2013B TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NÔI Hoạt độ tƣơng đối (%) 100 100 90 87 80 79.8 70 74.3 73.1 60 50 40 Hoạt độ tƣơng đối (%) 46 30 20 10 30 40 45 50 55 60 Nhiệt độ (°C) Hình 3.3: Ảnh hƣởng nhiệt độ phản ứng lên hoạt lực enzyme xylanase Kết thể biểu đồ hình 3.3 cho thấy xylanase cho hoạt lực cao nhiệt độ 50oC giải nhiệt độ từ 40 – 60oC hoạt lực enzyme tƣơng đối ổn định đạt đƣợc 70% so với mực hoạt lực cao Kết nghiên cứu phù hợp với số nghiên cứu trƣớc xylanase nấm mốc vài tác giả Trong điều kiện lên men chìm, xylanase thu đƣợc từ nấm mốc Aspergillus niger cho hoạt lực tốt khoảng 45 – 50oC (Tallapragada, 2011) Một số nghiên cứu enzyme xylanase từ số loài nấm mốc Aspergillus khác cho thấy hoạt lực ổn định enzyme (trên 70% mức hoạt lực cao nhất) dải nhiệt độ tƣơng đối rộng từ 50 – 70oC (Michellin cộng sự, 2010; Betini cộng sự, 2009) 3.2.2 Ảnh hưởng pH môi trường phản ứng đến hoạt lực xylanase Trong thí nghiệm tiếp theo, ảnh hƣởng pH môi trƣờng phản ứng lên hoạt lực xylanase từ chủng nấm mốc Aspergillus niger BH7 tiếp tục đƣợc tiến hành xác định 37 ĐỖ THỊ THANH BÌNH 2013B TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NÔI Bảng 3.4: Ảnh hƣởng pH môi trƣờng phản ứng lên hoạt lực enzyme xylanase pH Hoạt độ (U/ml) 0.129 0.43 1.012 1.098 0.998 0.83 Hoạt độ tƣơng đối (%) 11.8 39.2 92.1 100 90.1 75.5 Hoạt độ tƣơng đối (%) 100 90 92.1 80 100 90.1 70 75.5 60 Hoạt độ tƣơng đối (%) 50 40 39.2 30 20 10 11.8 pH Hình 3.4: Ảnh hƣởng pH môi trƣờng phản ứng lên hoạt lực enzyme xylanase Kết thể biểu đồ hình 3.4 cho thấy hoạt lực enzyme cao thể pH ổn định dải pH từ 5-7 (đều đạt 90% so với hoạt lực cao thu đƣợc) Các kết thu đƣợc lần cho thấy tƣơng đồng với kết số nghiên cứu trƣớc với enzyme xylanase từ số chủng nấm mốc Aspergillus khác bao gồm Aspergillus niger, Aspergillus ochraceus Aspergillus niveus (Betini cộng sự, 2009; Michellin cộng sự, 2010) 38 ĐỖ THỊ THANH BÌNH 2013B TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NÔI 3.3 ẢNH HƢỞNG CỦA CÁC YẾU TỐ CÔNG NGHỆ CỦA QUÁ TRÌNH TẨY MỰC LÊN ĐỘ BỀN HOẠT LỰC CỦA ENZYME Trong thí nghiệm trƣớc, đặc tính hai loại enzyme cellulase xylanase đƣợc tiến hành khảo sát Các kết cho thấy hai enzyme có khoảng làm việc tốt dải pH axit nhiệt độ khoảng 50-55oC, phù hợp với yếu tố công nghệ trình khử mực Với mục tiêu sử dụng enzyme nhƣ giải pháp thay cho việc sử dụng hoá chất tẩy mực truyền thống không thân thiện với mội trƣờng, enzyme tiếp tục đƣợc tiến hành kiểm tra độ bền hoạt lực điều kiện giống với điều kiện qui trình tẩy mực thông thƣờng Các điều kiện phản ứng tẩy mực đƣợc cố định nhiệt độ 45oC pH Bảng 3.5: Độ bền hoạt độ cellulase xylanase điều kiện công nghệ qui trình khử mực thông thƣờng Hoạt độ tƣơng đối ( %) Enzyme CMCase 100 92.46 95.07 85.57 85.79 87.67 82.60 Xylanase 100 98.43 96.62 94.55 96.57 95.81 97.58 Hoạt độ tƣơng đối (%) 98.43 100 100 96.57 96.62 95 94.55 95.07 92.46 97.58 95.81 CMCase 90 Xylnase 87.67 85.57 85 Linear (CMCase) 85.79 82.6 Linear (Xylnase) 80 75 70 15 30 45 60 75 90 Thời gian (phút) Hình 3.5: Độ bền hoạt độ cellulase xylanase điều kiện công nghệ qui trình khử mực thông thƣờng 39 ĐỖ THỊ THANH BÌNH 2013B TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NÔI Ghi chú: o Các nhãn tam giác vuông thể hoạt độ tƣơng đối xylanase cellulase tƣơng ứng o Các đƣờng đứt liền thể đƣờng thể đƣờng xu hƣớng biến đổi hoạt độ xylanase cellulase, tƣơng ứng Thí nghiệm cho thấy với khoảng thời gian phản ứng lên đến 90 phút điều kiện nhiệt độ pH thông thƣờng qui trình tẩy mực, hoạt độ tƣơng đối hai enzyme không cho thấy thay đổi đáng kể Trong khoảng thời gian 40 phút ban đầu, hoạt độ tƣơng đối không giảm nhiều enzyme giữ đƣợc hoạt độ tƣơng đƣơng 90% hoạt độ ban đầu (hình 3.5) Các kết lần khẳng định phù hợp hai enzyme cellulase xylanase thu đƣợc từ hai chủng nấm mốc T reesei T9 A niger BH17, tƣơng ứng, cho việc ứng dụng trình tẩy mực giấy 3.4 ẢNH HƢỞNG CỦA TỶ LỆ PHỐI TRỘN ENZYME LÊN HIỆU QUẢ CỦA QUÁ TRÌNH TẨY MỰC GIẤY IN BÁO Nhằm xác định lƣợng enzyme loại phù hợp cho trình tẩy mực giấy in báo, thí nghiệm tiến hành xác định hiệu trình tẩy mực giấy báo với mẫu hỗn hợp phối trộn xylanase cellulase theo tỷ lệ khác Tỷ lệ loại dịch enzyme đƣợc mô tả bảng 2.1 thể tích mẫu đƣợc sử dụng thí nghiệm 10 ml Đặc tính nhiệt độ pH enzyme đƣợc khảo sát nghiên cứu trƣớc Enzyme cellulase cho thấy hoạt động ổn định dải nhiệt độ 50 – 60oC dải pH 4-6 enzyme xylanase cho dải nhiệt độ hoạt động tốt rộng từ 40 – 60oC dải pH 5-7 Hiệu trình tẩy mực tiêu bột giấy giấy mà thể việc sử dụng lƣợng hay hoá chất tham gia trình tẩy mực Các thí nghiệm xác định hiệu tẩy mực giấy báo với mẫu hỗn hợp enzyme khác đƣợc tiến hành điều kiện nhiệt độ mức trung bình 45oC pH 6, nhằm giảm thiểu việc sử dụng lƣợng đun nóng hỗn 40 ĐỖ THỊ THANH BÌNH 2013B TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NÔI hợp phản ứng hoá chất điều chỉnh pH phản ứng Phản ứng tẩy mực đƣợc thực hoàn toàn enzyme không bổ sung chất tẩy mực Hiệu trình tẩy mực đƣợc đánh giá thông qua số tiêu nhƣ độ bụi, độ trắng tiêu lý giấy sau tẩy mực Bảng 3.6: Ảnh hƣởng tỷ lệ phối trộn enzyme lên số tính chất bột giấy sau trình khử mực (Xylanase : Cellulase) Mẫu E0 E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 Kiểm 10:0 2:8 3:7 5:5 7:3 8:2 0:10 chứng Độ bụi (ppm) 515 464 449 377 463 460 458 450 Độ trắng (%ISO) 52.6 53.4 53.8 55 53.9 54.4 54.1 54.1 Hiệu suất thu hồi 87.6 84 84.6 83.6 86.3 86.37 86.36 85.3 bột giấy (%) Các kết thể bảng 3.1 cho thấy thí nghiệm với mẫu hỗn hợp E3 (tƣơng ứng với 0,03 U xylanase 0,14 U cellulase /g bột giấy khô tỷ lệ 3:7 tiến hành phản ứng) cho hiệu khử mực cao độ trắng giấy đạt cao 55% độ bụi thấp 377ppm Thí nghiệm với tất mẫu enzyme cho thấy cải thiện độ trắng độ bụi giấy so với thí nghiệm với mẫu kiểm chứng E0, enzyme Hiệu suất thu hồi bột giấy tất thí nghiệm đạt 80%, có giảm không đáng kể hiệu suất thu hồi thí nghiệm với mẫu E3 so với thí nghiệm với mẫu kiểm chứng E0 Điều lý giải việc phối hợp hoạt động hiệu enzyme cellulase xylanase phân giải mạch hemicellulose cellulose 41 ĐỖ THỊ THANH BÌNH 2013B TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NÔI Tiến hành đánh giá số số lý mẫu giấy thí nghiệm với hỗn hợp E3 E0 ( mẫu kiểm chứng – enzyme) 10 6.27 6.4 E3 2.84 E0 2.53 Độ bền kéo (Nm/g) Độ bền xé (mNm2/g) Hình 3.6: Tính chất lý mẫu giấy với hỗn hợp E3 E0 Cho kết 2.84, 6.27 2.53, 6.40 tƣơng ứng với độ bền kéo (Nm/g) độ bền xé (mNm2/g) giấy khử mực có sử dụng không sử dụng enzyme Kết cho thấy khác biệt nhiều tính chất lý mẫu giấy có tăng nhẹ độ bền kéo giảm nhẹ độ bền xé giấy khử mực enzyme so với mẫu giấy kiểm chứng Kết tƣơng tự đƣợc công bố số báo cáo nghiên cứu trƣớc việc sử dụng enzyme khử mực giấy in (Ibarra cộng năm 2012) 3.5 ẢNH HƢỞNG CỦA LƢỢNG ENZYME SỬ DỤNG VÀ pH PHẢN ỨNG LÊN HIỆU QUẢ CỦA QUÁ TRÌNH KHỬ MỰC GIẤY IN BÁO Nhƣ đề cập phần trên, enzyme cellulase xylanase sử dụng nghiên cứu đƣợc thu nhận từ chủng nấm mốc đặc tính phụ thuộc nhiệt độ pH chúng đƣợc khảo sát Các enzyme cho hoạt lực cao dải pH axit Trong thí nghiệm tiếp theo, tiến hành khảo sát 42 ĐỖ THỊ THANH BÌNH 2013B TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NÔI ảnh hƣởng pH phản ứng lƣợng dùng enzyme lên hiệu trình tẩy mực Hỗn hợp enzyme đƣợc phối trộn theo tỷ lệ nhƣ mẫu E3 Bảng 3.7: Ảnh hƣởng pH phản ứng enzyme lƣợng dùng enzyme lên số tính chất bột giấy Mẫu E3 pH Thể tích dịch enzyme Xylanase : Cellulase (thể tích dịch enzyme 10 (thực pH 6) ml) (3:7) (ml) 20 30 Độ bụi (ppm) 358 469 461 452 470 Độ trắng (%ISO) 55.8 53.6 53.7 54.1 53.6 84.42 87.91 88.25 85.23 85.67 Hiệu suất thu hồi bột giấy (%) Các kết thể bảng 3.2 cho thấy điều chỉnh pH trình ủ enzyme xuống hiệu khử mực đạt cao thể độ trắng 55,8% độ bụi 358 ppm so sánh với số tƣơng tự mẫu pH Kết với việc hiệu suất thu hồi bột giấy mẫu với pH giảm đƣợc lý giải hoạt lực mạnh hai loại enzyme cellulase xylanase pH môi trƣờng phản ứng Khảo sát trƣớc cho thấy cellulase cho hoạt lực đạt tới 96,9% mức hoạt lực cao pH đạt 80,2% pH Tƣơng tự, xylanase đạt 92,1% mức hoạt lƣc cao pH môi trƣờng phản ứng Khảo sát lƣợng enzyme sử dụng phản ứng cho thấy việc tăng lƣợng enzyme không làm thay đổi hiệu khử mực xem xét tính chất bột giấy Điều cho thấy lƣợng enzyme đƣa vào nhƣ thí nghiệm ban đầu đủ để dùng cho phản ứng Xét khía cạnh kinh tế, việc sử dụng lƣợng enzyme cho hiệu qủa tổng thể trình khử mực giấy cao giá thành enzyme dù sản xuất nƣớc hay nƣớc thƣờng cao so với hoá chất tẩy mực hoá học 43 ĐỖ THỊ THANH BÌNH 2013B TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NÔI khác Cũng tƣơng tự, việc điều chỉnh pH phản ứng dải pH thấp nhằm đạt hiệu tẩy mực cao phải đƣợc xem xét thêm khía cạnh kinh tế ảnh hƣởng môi trƣờng Bên cạnh trình tuyển sau ủ enzyme yêu cầu pH phải đƣợc điều chỉnh pH Việc điều chỉnh pH trình ủ mức axit sâu đòi hỏi lƣợng NaOH nhiều để đƣa hỗn hợp bột giấy sau ủ mức pH 44 ĐỖ THỊ THANH BÌNH 2013B TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NÔI KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Các kết nghiên cứu đƣợc trình bày phần cho thấy tiềm lớn việc sử dụng enzyme cellulase xylanase từ vi sinh vật trình tẩy mực giấy tái chế Với lƣợng enzyme sử dụng nhỏ (0,03 U xylanase 0,091 U cellulase/g bột giấy khô) cho thấy cải thiện đáng kể độ bụi độ trắng giấy tăng 2,4 % ISO so với mẫu giấy kiểm chứng không sử dụng enzyme tẩy mực Việc sử dụng enzyme tẩy mực giấy loại bỏ việc sử dụng hoá chất tẩy trắng kiềm qui trình tẩy mực thông thƣờng Bên cạnh đó, việc chuyển công đoạn tẩy mực từ kiềm sang điều kiện axit hạn chế khả tạo thành màu vàng giấy thƣờng gây hoá chất kiềm tính Một số tiêu lý giấy sau tẩy mực enzyme cho thấy thay đổi nhiều so với tiêu lý giấy sau tẩy mực không sử dụng enzyme Tuy nhiên, kết thể báo cáo mang tính chất khảo sát Để đƣa qui trình hoàn thiện tẩy mực giấy tái chế sử dụng enzyme, việc khảo sát ảnh hƣởng pH lƣợng dùng cần phải đánh giá sâu Bên cạnh đó, nhiều yếu tố khác cần phái đánh giá nhƣ ảnh hƣởng nhiệt độ, thời gian phản ứng ủ enzyme lên tính chất giấy Tất yếu tố cần phải đƣợc xem xét cách toàn diện dựa khía cạnh xem xét tính kinh tế, ảnh hƣởng lên môi trƣờng qui trình công nghệ Việc xem xét khả thu hồi tái sử dụng enzyme qúa trình khử mực giấy khía cạnh khác cần quan tâm 45 ĐỖ THỊ THANH BÌNH 2013B TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NÔI TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Hiệp hội giấy Bột giấy cung cấp Hóa sinh công nghiệp Lê Ngọc Tú (nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Hà Nội) Thực tập Vi sinh vật học Vũ Thị Minh Đức ( ĐH Quốc gia Hà Nội) Ahmed, S et al (2009) Molecular cloning of fungal xylanases: an overview Applied Microbiology and Biotechnology 84:19–35 Bajpai, P et al (1998) Deinking with enzymes: A review Tappi Journal 81(12) Bakri, Y et al (2008) Xylanase Production by a Newly Isolated Aspergillus niger SS7 in Submerged Culture Polish J Microbiol 7(3): 249-251 Betini, J H A et al (2009) Xylanases from Aspergillus niger, Aspergillus niveus and Aspergillus ochraceus produced under solid-state fermentation and thier application in cellulose pulp bleaching Bioprocess Biosyst Eng 32: 819-824 Bhat, M K (2000) Cellulases and related enzymes in biotechnology Biotechnology Advances 18: 355-383 Carre’, B et al Deinking difficulties related to ink formulation, printing process, and type of paper Centre technique du Papier, Domaine Universitaire B.P 251, 38044 Greoble Cedex 9, France 10 Chávez, R et al (2006) The Xylanolytic Enzyme System from the Genus Penicillium Journal of Biotechnology, 123(4): 413–433 11 David J and Hamilton, J (1992) Biobleaching with Xylanases Brings Biotechnology to Reality Pulp & Paper 66(9): 111-114 12 Dienes, D et al (2004) Treatment of recycled fiber with Trichoderma cellulases Industrial Crops and Products 20(1): 11–21 13 Grigorevski-Lima, A et al (2013) Production and Partial Characterization 46 ĐỖ THỊ THANH BÌNH 2013B TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NÔI of Cellulases and Xylanases from Trichoderma atroviride 676 Using Lignocellulosic Residual Biomass Applied Biochemistry & Biotechnology 169(4): p1373 14 Heitmann, J A et al Enzyme deinking of newsprint waste Pollution Prevention Reference Collection http://infohouse.p2ric.org/ 15 Ibarra, D et al (2012) Enzymatic deinking of secondary fibers: cellulases/hemicellulases versus laccase-mediator system J Ind Microbiol Biotechnol 39, – 16 Kuhad, R C et al (2011) Microbial Cellulases and Their Industrial Applications Enzyme Research Vol 2011, Article ID 280696 17 Maciel, G M et al (2008) Xylanase Production by Aspergillus niger LPB 326 in Solid-State Fermentation Using Statistical Experimental Designs Food Technol Biotechnol 46(2): 183-189 18 Mai, C et al (2004) Biotechnology in the wood industry Applied Microbiology and Biotechnology 63(5): 477–494 19 Mansfield, S D et al (1996) Modification of Douglas-fir mechanical and kraft pulps by enzyme treatment Tappi Journal 79(8): 125–132 20 Michellin, M et al (2010) Production and properties of xylanases from Aspergillus terricola Marchal and Aspergillus ochraceus and thier use in celllulose pulp bleaching Bioprocess Biosyst Eng 33: 813-821 21 Pala H et al (1998) Preliminary studies on enzymatic deinking 7th Intl Conference in Biotechnology in the Pulp and Paper Industry Canada, June 1998 22 Puneet, P et al (2010) Enzymatic Deinking of office waste paper: An overview, IPPTA J 22(2) April – June 2010 23 Sá-Pereira, P et al (2003) A new look at xylanases – An overview of purification strategies Molecular Biotechnology 24:257-281 24 Sathyavrathan, P and Krithika S (2013) Comparison Of Cellulase Production In Trichoderma reesei (NCIM – 1052) And Aspergillus niger 47 ĐỖ THỊ THANH BÌNH 2013B TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NÔI (NRRL – 322); Media Optimization And Enzyme Characterization Of Cellulase From Trichoderma reesei With Lyophilization International Journal of ChemTech Research 5(1): 554-557 25 Schuster, E et al (2002) On the safety of Aspergillus niger – a review, Appl Microbiol Biotechnol 59: 426-435 26 Sukumaran, R K et al (2005) Microbial cellulases—production, applications and challenges Journal of Scientific and Industrial Research 64(11): 832–844 27 Sun, Y and Cheng, J (2002) Hydrolysis of lignocellulosic materials for ethanol production: a review Bioresource Technology 83(1): 1–11 28 Tallapragada, P and Venkatesh, K (2011) Isolation, identification and optimization of xylanase enzyme produced by aspergillus niger under submerged fermentation J Microbiol Biotech Res., 1(4):137-147 29 Tuyên, Đ T et al (2008) Tối ƣu số điều kiện nuôi cấy chủng nấm Aspergillus oryzae DSM1836 Aspergillus niger DSM1957 sinh tổng hợp xylanase Tạp chí Công nghệ sinh học 6(3): 349-355 30 Verma, D et al (2013) Biotechnilogical Applications of Microbial Xylanases Productivity 54(1): 19- 25 48