BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG - - TRẦN NGỌC LƯỢM NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP BẢO QUẢN HỖN HỢP CAROTEN-PROTEIN TẬN THU TỪ QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT CHITIN ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM GVHD: PGS.TS TRANG SĨ TRUNG NHA TRANG – 07/2016 i LỜI CAM ĐOAN Đề tài có tham khảo kết số tác giả nghiên cứu ứng dụng chitosan Tuy nhiên em xin cam đoan công trình riêng em, kết số liệu đồ án hoàn toàn trung thực chưa công bố công trình nghiên cứu khác Sinh viên thực Trần Ngọc Lượm ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đồ án này, trước hết, em xin gửi tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Khoa Công nghệ Thực phẩm kính trọng, niềm tự hào học tập Trường năm qua Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Trang Sĩ Trung tạo điều kiện cho em tham gia đề tài nghị định thư: Nghiên cứu sản phẩm giá trị gia tăng từ phế liệu tôm để ứng dụng nông nghiệp Bộ Khoa học công nghệ cấp Đã hỗ trợ mặt hướng dẫn em suốt trình thực đề tài để đề tài nghiên cứu thực với chất lượng cao Em xin chân thành cảm ơn Thầy Cô Khoa Công nghệ Thực phẩm (đặc biệt ThS Nguyễn Công Minh, ThS Phạm Thị Đan Phượng) tập thể cán phòng thí nghiệm: Công nghệ Thực phẩm, Công nghệ Sinh học, Chế biến Thủy sản - Trung tâm Thí nghiệm Thực hành - Trường Đại học Nha Trang tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ em suốt trình thực đề tài Cuối em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình tất bạn bè giúp đỡ, động viên em suốt trình học tập thực đề tài Khánh Hòa, ngày 15 tháng năm 2016 Tác giả đồ án Trần Ngọc Lượm iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG .vi DANH MỤC CÁC HÌNH vii LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN VỀ ĐỀ TÀI 1.1 Tổng quan caroten-protein 1.1.1 Sự tồn chất caroten-ptrotein 1.1.2 Tính chất caroten-protein 1.1.3 Ứng dụng caroten-protein 1.2 Tìm hiểu astaxanthin 1.2.1 Bản chất astaxanthin 1.2.2 Một số tính chất hóa, lý astaxanthin 1.2.3 Ứng dụng astaxanthin 1.3 Các yếu tố ảnh hưởng biến đổi astaxanthin trình chế biến, bảo quản 10 1.4 Một số nghiên cứu nước liên quan đến đề tài 12 1.4.1 Nghiên cứu nước 12 1.4.2 Nghiên cứu nước 12 1.5 Các phương pháp thu nhận bảo quản hỗn hợp caroten-protein giàu astaxanthin 13 1.5.1 Các phương pháp thu nhận hỗn hợp caroten-protein 13 1.5.1.1 Phương pháp lên men 13 1.5.1.2 Phương pháp xử lí hóa chất, kết hợp với enzyme 15 1.5.2 Phương pháp bảo quản hỗn hợp caroten-protein 17 1.5.2.1 Phương pháp cô đặc 17 iv 1.5.2.2 Phương pháp bao gói 20 1.5.2.3 Phương pháp sử dụng phụ gia bảo quản 22 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Đối tượng nghiên cứu 26 2.2 Phương pháp nghiên cứu 26 2.2.1 Sơ đồ bí trí thí nghiệm 26 2.2.2 Hóa chất phương pháp phân tích 28 2.2.3 Phương pháp xử lí số liệu 28 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ, THẢO LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 29 3.1 Thành phần hóa học hỗn hợp caroten-protein 29 3.2 Ảnh hưởng thời gian, nồng độ acid ascorbic, bao bì bao gói đến chất lượng hỗn hợp caroten-protein 30 3.2.1 Ảnh hưởng thời gian, nồng độ acid ascorbic, bao bì bao gói đến hàm lượng astaxanthin 31 3.3.2 Ảnh hưởng thời gian, nồng độ acid ascorbic, bao bì bao gói đến số tổng nitơ bazơ bay (TVB-N) 36 3.2.3 Ảnh hưởng thời gian, nồng độ acid ascorbic, bao bì bao gói đến hàm lượng lipid 39 3.3 Đề xuất phương pháp bảo quản đánh giá chất lượng hỗn hợp carotenprotein tận thu từ trình sản xuất chitin sau thời gian bảo quản 41 3.3.1 Phương pháp đề xuất 41 3.3.2 Đánh giá chất lượng hỗn hợp caroten-protein sau tuần bảo quản bao bì HDPE 42 3.3.2.1 Mẫu caroten-protein thủy phân acid 42 3.3.2.2 Mẫu caroten-protein thủy phân enzyme 42 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 PHỤ LỤC 51 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt HDPE Nội dung Hight Density Poli Etilen (nhựa HDPE) PP Poly Propylen (nhựa PP) TVB-N Total volatile basic nitrogen vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các ứng dụng hỗn hợp protein carotenoid Bảng 1.2 Quan hệ độ chân không nhiệt độ sôi nước 19 Bảng 3.1 Thành phần hóa học hỗn hợp bột nhão caroten-protein 29 vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu tạo astaxanthin Hình 1.4 Astacene Hình 1.5 Crustaxanthin Hình 1.6 Sự thay đổi astaxanthin tương tác với acid yếu 11 Hình 1.7 Vị trí tồn astaxanthin hỗn hợp caroten-protein 23 Hình 1.8 Công thức cấu tạo acid ascorbic 24 Hình 1.9 Khử gốc tự acid ascorbic 25 Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ phối trộn acid ascorbic kết hợp bao bì bao gói hỗn hợp caroten-protein 27 Hình 3.1 Ảnh hưởng thời gian, nồng độ acid ascorbic, bao bì bao gói đến hàm lượng astaxanthin hỗn hợp caroten-protein 32 Hình 3.2 Ảnh hưởng thời gian, nồng độ acid ascorbic, bao bì bao gói đến số TVB-N hỗn hợp caroten-protein 37 Hình 3.3 Ảnh hưởng thời gian, nồng độ acid ascorbic, bao bì bao gói đến hàm lượng lipid hỗn hợp caroten-protein 39 Hình 3.4 Đề xuất phương pháp bảo quản hỗn hợp caroten-protein 41 LỜI MỞ ĐẦU Astaxanthin chất chống oxi hóa, ngăn ngừa số bệnh ung thư, chống lại tác hại tia tử ngoại đồng thời có hoạt tính tiền vitamin, Astaxanthin tạo nên màu sắc đặc trưng số loài thủy sản tôm, cua [34] Sự diện gốc hydroxyl (OH) gốc xeton (C = O) với hệ thống liên kết đôi liên hợp cấu trúc phân tử giải thích astaxanthin có hoạt tính chống oxy hóa cao [39] ứng dụng nhiều lĩnh vực y học, thực phẩm, nuôi trồng thủy sản, mỹ phẩm [27, 30] Vì vậy, năm gần astaxanthin nghiên cứu nhiều, đặc biệt việc việc thu hồi bột đạm thủy phân giàu astaxanthin từ phế liệu đầu tôm, sản phẩm có giá trị kinh tế cao Ở Việt Nam, với nguồn lợi thủy sản dồi việc khai thác, chế biến, xuất mặt hàng thủy sản nâng cao không ngừng phát triển Theo tổng cục thống kê, ước tính phế liệu tôm khoảng 200.000 tấn/năm, có khoảng 120.000 đầu tôm [7] Đây nguồn nguyên liệu dồi cho sản xuất chitin, hỗn hợp caroten-protein Hỗn hợp có ý nghĩa để bổ sung vào làm thức ăn gia súc, nuôi trồng thủy sản, làm tăng màu sắc cho cá hồi, loài giáp xác, tăng hệ miễn dịch cho vật nuôi Quá trình tách chiết hỗn hợp đầu tôm đòi hỏi phải có phương pháp tối ưu để đạt xuất cao phải quan tâm đến chất lượng hỗn hợp carotenprotein tốt Nhưng với tính chất dễ bị biến đổi trình chế biến, bảo quản bị ảnh hưởng oxi không khí, ánh sáng, nhiệt độ, làm nhạt màu astaxanthin, đặc tính quan trọng vốn có astaxanthin việc nghiên cứu để chọn phương pháp điều kiện bảo quản nhằm mang lại giá trị cao cho sản phẩm chứa astaxanthin vấn đề cần thiết Cũng có nhiều nghiên cứu liên quan đến phương pháp bảo quản hỗn hợp caroten-protein trình bảo quản điều kiện khác sử dụng màng chitosan để bao bọc caroten-protein dạng viên, sử dụng phương pháp bao gói hút chân không để hạn chế trình oxi hóa oxi gây ra, bảo quản điều kiện nhiệt độ thấp, bảo quản bống tối [1, 11, 15, 17, 34] phương pháp bảo quản tồn vài khuyết điểm như: phí cao việc bao gói hút chân không, tạo màng chitosan ứng dụng dạng viên, tốn chi phí việc xây dựng hệ thống lạnh, buồng tối để bảo quản hỗn hợp caroten-protein không thuận lợi cho việc phân phối, vận chuyển Do vậy, việc thực đề tài “Nghiên cứu phương pháp bảo quản hỗn hợp carotenprotein tận thu từ trình sản xuất chitin” cấp thiết Mục tiêu nghiên cứu: Nghiên cứu bổ sung acid ascorbic vào hỗn hợp caroten protein kết hợp với sử dụng loại bao bì bao gói để hạn chế hư hỏng hỗn hợp carotenprotein trình bảo quản Nội dung nghiên cứu: Xác định thành phần hóa học hỗn hợp caroten- protein Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian điều kiện bảo quản (nồng độ acid ascorbic bổ sung vào hỗn hợp caroten- protein kết hợp sử dụng bao bì PP hay bao bì HDPE) đến chất lượng hỗn hợp caroten-protein (hàm lượng astaxanthin, số TVB-N, hàm lượng lipid) Đề xuất phương pháp bảo quản đánh giá chất lượng hỗn hợp carotenprotein tận thu từ trình sản xuất chitin Ý nghĩa khoa học: Bảo quản hỗn hợp caroten-protein tránh hư hỏng astaxanthin-là hoạt chất sinh học quan trọng giảm hư hỏng chất lượng hỗn hợp caroten-protein gồm lipid, số TVB-N Ý nghĩa thực tiễn: Sự thành công đề tài quy mô phòng thí nghiệm tạo nên bước phát triển cho việc sản xuất quy mô công nghiệp hỗn hợp carotenprotein chứa astaxanthin, tận thu tối đa nguồn phế liệu từ sản xuất mặt hàng tôm thẻ chân trắng, hạn chế ô nhiễm môi trường mang lại hiệu kinh tế cao việc tách chiết hầu hết lượng astaxanthin có hỗn hợp caroten- protein 47 26 Guerin, M., Huntley, M.E Olaizola, M (2003), "Haematococcus astaxanthin: applications for human health and nutrition", Trends in Biotechnol, 21, 210-216 27 Hayes, M., Carney, B., Staler, J., Bruck, W (2008), "Mining marine shellfish wates for bioactive molecules: Chitin and Chitosan; Part A: Extrac-tion methods", Biotechnol J, 3, 871-877 28 Higuera-Ciapara, I., Valenzuela, L, F., Goycooela, F, M., Monal, W A (2004), "Microencapsulation of astaxanthin in a chitosan matrix", Caarbohydrate Polymers, 56, 41-45 29 Huss, H H (1995), "Quality and quality change in fresh fish", Roma: Food and Agriculture Organisation (FAO) of the United Nations, 5192 30 Hussein, G., Sankawa, U., Goto, H., Matsumoto, K., Watanabe, H (2006), "Astaxanthin, a carotenoid with potential in human health and nutrition", J Nat Prod, 69, 443-449 31 Isiwarati, M (1980), "Thermal reaction of carotene, part 1", J Anal Appl Pyrolysis, 2, 153-161 32 Jovanovic, S V and Simic M G (2000), "Antioxidants in nutrition", Annals of the New York Academy of Sciences, 899, 326-334 33 Kamal M., Rahman M M., Yasmin L., Islam N M., Nurullah M., Mazid A M (2000), "Studies on the post-mortem changes in shrimp and prawn during ice storage: II Biochemical aspects of quality changes", Bangladesh F Fish Res, 4(1), 91-96 34 Kittikaiwan, P., Powthongsook, S., Pavasant, P., Shotipruk, A (2007), "Encapsulation of Haematococcus pluvialis using chitosan for astaxanthin stability enhancement", Carbohydrate polymes, 70, 378385 48 35 Lignell, A., and Inborr, J (2000), "Agent for increasing the production of/in breedingand production mammals", Patent US6054491 36 Lignell, A., Bottiger, P (2011), "Use of xanthophylls, astaxanthin e g for treatment of autoimmune diseases, chronic viral and intracellular bacterial infections", Patent WO01/24787 A1 37 Lignell, A., Nicolin, C., Larsson Lars-Hak , et al (1998), "Method for increasing the production of/in breeding and production animals in the poultry industry", Patent US5744502 38 Martin, A.M (1996), "Fermentation processes for the production of lactic acid", Metabolism and Application of Lactic Acid Bacteria SpringerVerlag, 123-131 39 Miki, W (1991), "Biological functions and activities of animal carotenoids", Pure Appl Chem, 63, 141-146 40 Nhu, V.C., et al (2001), Cobia Rachycentron canadum aquaculture in Viet Nam: recent development and prospects 41 Pincemail, J., Dafraigne, Meurisse M., Limet, R (1998), "Antioxydants et prÐvention des maladies cardiovasculaires, 1Ìre partie: la vitamine C", MÐdi-Sphere, 89, 27-30 42 Qian, F Y., Xie, J., Yang, P S., (2013), "Study of the quality changes and myofibrillar proteins of white shrimp (Litobenaeus vannamei) under modisied asmosphere packaging with varying CO2 levels", Eur Food Res Technol, 263, 629-635 43 Rahman, S M (2007), Handbook of Food Preservation, Taylor & Francis group 44 Rice-Evans, C.A., Sampson, J., Bramley, P.M., Holloway, D.E (1997), "Why we expect carotenoids to be antioxidants in vivo", Free Radic Res, 26, 381-398 49 45 Roberto, E A And Isabel G L (2009), Atability studies on astaxanthin extracted from fermented shrimp by products, chem.2009, 6095-6100 46 Sachindra, N M., Mahendrakar, N, S (2010), "Stability of carotenoids recovered from shrimp waste and their use as colorant in fish sausage", J Food Sci Technol, 47(1), 77-83 47 Simpson, B K Haard, N F (1985), "The use of proteolytic enzymes to extract carotene–proteins from shrimp wastes", Journal of Applied Biochemistry, 7, 212-222 48 Smith, G., & Hole, M (1991), "Browning of salted sun- dried fish", Journal of the science of food and agriculture, 55, 291-301 49 Torrissen, O J., Hardy, R W, Shearer, K D (1989), "Pigmentation of Salmonids; Carotenoid deposition and metabolism", Crit Rev Aquat Sci., 1, 209-225 50 Vasantha Rupasinghe, H.; Yasmin, A (2010), "inhibition of oxidation of aqueous emulsions of omega-3 fatty acids and fish oil by phloretin and phloridzin", Molecules, 15, 251-257 51 Villalobos-Castillejos, F., Cerezal-Mezquita, P., Hemandez-De Jesus, M L., Barragan-Huerta, B E (2013), "Production and stability of water-dispersible astaxanthin oleoresin from Phaffia rhodozyma", Int J food Sci technol, 48, 1243-1251 52 Waagbo, R., Hamre, K., Bjerkas, E., Berge, R., Wathne, E., Lie, O., Torstensen, B (2003), "Cataract formation in Atlantic salmon, Salmo salar L., smolt relative to dietary pro- and antioxidants and lipid level", Journal of Fish Diseases, 26(4), 213-229 53 Zerdin, K., Michael, L R and J Vermue (2003), "The vitamin C content of orange juice packed in an oxigen scavenger material ", Food chemistry 82, 387-395 50 54 Zhang, P.; Omaye, S.T (2001), "Antioxidant and prooxidant roles for β-carotene, α-tocopherol and ascorbic acid in human lung cells", Toxicol In Vitro, 15, 13-24 51 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Các phương pháp phân tích sử dụng đề tài Phương pháp xác định độ ẩm ban đầu hỗn hợp caroten- protein giàu astaxanthin Cốc sấy sấy khô nhiệt độ 1050C 5-6 (đến khối lượng không đổi), sau để bình hút ẩm để làm nguội Cân xác định khối lượng cốc sấy W1 Cho mẫu cho vào cốc sấy cân khối lượng W2 Sấy 1050C 24 giờ, cân khối lượng W3 (AOAC, 1990) Tất khối lượng xác định tính theo gram Hàm lượng ẩm tính theo công thức sau: % Hàm lượng ẩm = [(W2 – W3)/( W2 – W1)] x 100 Sau xác định hàm lượng ẩm, ta đem nung cốc sấy có chứa mẫu khô nhiệt độ 5500C, khoảng 18 giờ, để bình hút ẩm cân khối lượng W4 Hàm lượng tro xác định theo công thức sau: % Hàm lượng tro = [(W4 – W1)/(W2 – W1)] x 100 Xác định hàm lượng astaxanthin phương pháp quang phổ Sachindra Dụng cụ, hóa chất Dụng cụ & thiết bị: Máy đồng hóa, máy cô quay chân không, máy so màu Các dụng cụ thuỷ tinh cốc, bình định mức 10ml, 250ml, ống đong 50ml, 100ml Hóa chất: hexan, isopropanol, eter dầu mỏ (petrolium ether), NaCl Tiến hành - Cân xác 1g mẫu cho vào cốc thủy tinh - Thêm 5ml dung môi chứa hexan isopropanol với tỷ lệ 3:2 Đồng hóa phút Để yên 30 phút Sau tiến hành lọc qua giấy lọc Whatman No.1 Tách chiết lần - Dịch chiết đựng bình chiết bổ sung thêm 12ml eter dầu mỏ 10ml nước muối sinh lý Lắc nhẹ bình chiết để yên 10 phút nhiệt độ phòng cho tách pha hoàn toàn 52 - Tách bỏ pha dưới, lấy pha dung môi bên Sau đó, rửa pha dung môi 10ml nước muối sinh lý - Tiến hành cô quay chân không 40oC để bay dung môi - Hòa tan mẫu với ete dầu mỏ định mức lên 10ml Sau đó, tiến hành pha loãng mẫu (nếu cần) đo độ hấp thụ dung dịch 468 nm(A468), dùng eter dầu mỏ làm dung dịch so sánh - Hàm lượng carotennoid tổng số (µg astaxanthin/g mẫu) mẫu tính theo công thức Simpson Haard (1985): C (µg/g mẫu) = 𝐴∗𝐷∗𝑉 0,2∗𝐺 Trong đó: C: hàm lượng astaxanthin mẫu (µg/g mẫu) A: Độ hấp thụ dung dịch bước sóng 468 nm V: Thể tích mẫu chiết (ml) D: Hệ số pha loãng G: Trọng lượng mẫu khô (g) 0,2: hệ số hấp thụ dung dịch bước sóng 468 nm µg/ml astaxanthin chuẩn Xác định hàm lượng lipit theo phương pháp Bligh & Dyer Hóa Chất: - Chloroform (CHCl3) - Methanol (MeOH) - Dung dịch KCL 0,88%, thay NaCL 0,9% Tiến Hành: - Cân số lượng gam mẫu lượng nước thêm vào cần thiết, tùy thuộc vào hàm lượng ẩm mẫu (mẫu carotenprotein thủy phân acid: 2g mẫu + 1,3ml nước, mẫu caroten-protein thủy phân enzyme: 2g mẫu + 0,8ml nước) - Sử dụng ống ly tâm thủy tinh dung dích 50ml, cho số gam mẫu lượng nước xác định vào, thêm 3,2ml chloroform 6,4ml methanol (đối với mẫu caroten-protein thủy phân acid), thêm 2,7ml chloroform 5,4ml methanol (đối với mẫu caroten-protein thủy phân enzyme) sau đồng hóa phút 53 Thêm 3,2ml chloroform (đối với mẫu caroten-protein thủy phân acid), - thêm 2,7ml chloroform (đối với mẫu caroten-protein thủy phân enzyme) đồng hóa phút Sau cho thêm 3,2ml NaCl 0,9% (đối với mẫu caroten-protein thủy phân - acid), thêm 2,7ml NaCl 0,9% (đối với mẫu caroten-protein thủy phân enzyme) tiếp tục đồng hóa phút - Đem hỗn hợp ly tâm nhiệt độ từ 0-50C, 2500 vòng 20 phút Sau ly tâm xong, sử dụng pipet 50ml để hút pha chloroform có chứa lipid - nằm phía ống ly tâm, pha lọc qua Na2S2O4 (để hút nước) xuống bình định mức 10ml, thêm chloroform đến vạch Sau xử lý xong, dung dịch mang xác định hàm lượng lipid tổng Xác định hàm lượng lipid tổng: - Lấy xác 2ml dung dịch mẫu xử lý, cho vào ống nghiệm có nắp 4ml sấy chân không đến khối lượng không đổi - Cho vào tủ sấy chân không đến khối lượng không đổi, áp suất khoảng 65-70 psi Tính kết quả: Lipid tổng số (%) tính theo công thức: X L (%) = (𝑚1−𝑚𝑜)∗𝑉𝑑𝑚∗10000 𝑉𝑚∗𝑚∗(100−𝑊) Trong đó: X L : Hàm lượng lipid tổng số tính theo trọng lượng khô mẫu m1 : Trọng lượng cân ống nghiệm có nắp mẫu sau sấy (g) m0 : Trọng lượng cân ống nghiệm có nắp đến khối lượng không đổi (g) m: Trọng lượng cân mẫu (g) V dm :Thể tích định mức sau xử lý (ml) V m : Thể tích mẫu sau xử lý lấy để sấy (ml) W: Độ ẩm mẫu (%) 54 Xác định hàm lượng đạm tổng số phương pháp Kjeldahl Vô hóa mẫu acid sulfuric đậm đặc với có mặt chất xúc tác Sau đó, tiến hành kiềm hóa sản phẩm phản ứng Tiếp theo, chưng cất chuẩn độ lượng amoniac giải phóng ra, từ tính hàm lượng nitơ tổng số mẫu Để tính hàm lượng protein thô, lấy giá trị hàm lượng nitơ tổng số nhân với hệ số 6,25 Dụng cụ, hóa chất Dụng cụ: Bộ chưng cất đạm Kjeldahl tự động, Đức Các dụng cụ thủy tinh chưng cất đạm kèm theo số dụng cụ thủy tinh khác ống đong, bình định mức, cốc Hóa chất: H2SO4 đậm đặc, dung dịch NaOH 40%, hỗn hợp xúc tác K2SO4 CuSO4 (5:1), dung dịch H3BO3 4%, thuốc thử tashiro (2g metyl xanh: 1g metyl đỏ pha 1000ml cồn 96o) Tiến hành Vô hóa mẫu: Cân lượng mẫu từ 0,2 – 1g cho vào ống Kjeldahl Thêm khoảng 0,5-1g xúc tác (hỗn hợp K2SO4:CuSO4 theo tỉ lệ 5:1) Cho vào ống khoảng 12 ml acid sulfuric đậm đặc Đặt ống Kjeldahl vào hệ thống phá mẫu Cài đặt nhiệt độ thời gian cho máy, thời gian vô hóa mẫu khoảng từ – Khi giai đoạn hoàn tất, chất lỏng ống có màu xanh da trời nhạt có màu trắng Nếu thấy ống số cặn rắn thêm nước cất vào lắc Chưng cất amoniac: Đặt ống Kjeldahl vô hóa vào hệ thống chưng cất Thời gian chưng cất mẫu khoảng phút Thêm giọt thị Tashiro vào bình hấp thụ tiến hành chưng cất Chuẩn độ lượng amoniac hấp thụ: tiến hành chuẩn độ dung dịch HCl 0,1N Dấu hiệu ngừng chuẩn độ màu dung dịch chuẩn độ chuyển từ màu xanh dương sang màu mận đỏ Tính kết - Hàm lượng nitơ mẫu thử xác định theo công thức sau: WN (%) = - Trong đó: (V1−Vo)∗𝐶∗14∗100 M∗1000 55 - WN: hàm lượng nitơ tổng số mẫu (%) - V1 : thể tích dung dịch HCl 0,1N dùng để chuẩn độ mẫu thử (ml) - Vo: thể tích dung dịch HCl 0,1N dùng để chuẩn độ mẫu trắng (ml) - M : khối lượng mẫu đem phân tích (g) - C: Nồng độ HCl dùng để chuẩn độ - 14: trọng lượng phân tử nitơ - 1000: hệ số chuyển đổi đơn vị mgN/100g thành gN/100g mẫu - Hàm lượng protein thô mẫu thử xác định theo công thức sau: WProtein (%) = 6,25* WN Trong đó: 6,25: hệ số nitơ-protein thịt, cá WN: hàm lượng nitơ tổng số mẫu (%) WProtein: hàm lượng protein thô mẫu (%) Xác định số TVB-N - Lấy xác 5g mẫu, thêm vào 10ml acid trichloroacetic sau đồng hỗn hợp máy đồng - Tiến hành lọc hỗn hợp qua giấy lọc Whatman số để lấy dịch lọc - Sử dụng chưng cất đạm bán tự động để chưng cất, cho vào ống Kjeldahl 2ml dịch lọc, cho vào 6ml dung dịch NaOH 10% gắn ống vào hệ thống chưng cất để tránh làm thất thoát bazơ bay - Chuẩn bị cốc hứng chứa 10ml acid boric 4%, 0,04 ml hỗn hợp methyl đỏ bromocresol green đặt đầu nito bazơ bay hơi, cho đầu ống ngập dung dịch -Tiến hành chưng cất không nito bazơ bay (thử giấy đo PH đầu ống, PH=7) - Chuẩn độ cốc hứng thu dung dịch chuẩn HCl 0,1N dung dịch vừa chướm màu hồng nhạt ổn định 30 giây lắc - Chỉ số TVB-N (mgN/5g mẫu tươi) tính công thức sau: 𝑚𝑔 TVB-N (mgN/5g) = 14 (𝑚𝑜𝑙)∗𝑎∗𝑏∗15 𝑚𝑙 56 Trong đó: a: số ml acid HCl chuẩn tiêu tốn b: nồng độ acid HCl chuẩn 57 Phụ lục 2: Kết phân tích thí nghiệm ảnh hưởng thời gian điều kiện bảo quản đến chất lượng hôn hợp caroten-protein Bảng phụ lục 2.1 Ảnh hưởng thời gian acid ascorbic, bao bì bao gói đến hàm lượng astaxanthin Mẫu caroten-protein thủy phân acid Hàm lượng astaxanthin (mg/kg) Bao bì (PP) Bao bì đục (HDPE) Nồng độ acid ascorbic (w/w) Nồng độ acid ascorbic (w/w) 0% 0,05% 0,1% 0% 0,05% 0,1% TUẦN 182,79 ± 0,18 182,39 ± 0,51 182,31 ± 0,32 182,79 ± 0,18 182,39 ± 0,51 182,31 ± 0,32 TUẦN 180,40 ± 0,43 181,49 ± 0,61 181,63 ± 0,72 181,28 ± 0,33 181,72 ± 0,41 182,11 ± 0,19 TUẦN 178,79 ± 0,24 180,88 ± 0,23 181,5 ± 0,46 179,32 ± 0,29 181,14 ± 0,14 181,93 ± 0,26 TUẦN 176,30 ± 0,40 180,01 ± 0,38 180,51 ± 0,87 177,02 ± 0,24 180,03 ± 0,3 181,05 ± 0,41 TUẦN 171,01 ± 0,09 176,08 ± 0,48 176,8 ± 1,12 174,22 ± 0,28 178,61 ± 0,4 179,77 ± 0,45 TUẦN 167,47 ± 0,80 173,31± 0,32 174,42 ± 0,83 170,71 ± 0,22 176,17± 0,45 177,52 ± 0,59 Kết tính hàm lượng chất khô Mẫu caroten-protein thủy phân enzyme Hàm lượng astaxanthin (mg/kg) Bao bì (PP) Bao bì đục (HDPE) Nồng độ acid ascorbic (w/w) Nồng độ acid ascorbic (w/w) 0% 0,05% 0,1% 0% 0,05% 0,1% TUẦN 212,84 ± 0,25 211,98 ± 0,77 212,28 ± 0,99 212,84 ± 0,25 211,98 ± 0,77 212,28 ± 0,99 TUẦN 209,38 ± 0,82 210,76 ± 0,48 211,87 ± 0,95 211,07 ± 0,24 211,29 ± 0,12 211,85 ± 0,34 TUẦN 206,37 ± 0,64 209,30 ± 0,49 210,79 ± 0,57 209,70 ± 0,45 210,63 ± 0,17 211,19 ± 0,20 TUẦN 202,25 ± 0,77 207,92 ± 0,64 208,97 ± 0,85 206,51 ± 0,48 209,57 ± 0,63 210,45 ± 0,54 TUẦN 196,15 ± 0,39 198,27 ± 0,42 201,27 ± 0,52 203,79 ± 0,47 208,49 ± 0,65 209,45 ± 0,31 TUẦN 189,89 ± 0,56 194,95 ± 1,05 197,18 ± 0,61 200,41 ± 0,36 204,50 ± 0,37 205,75 ± 0,54 58 Bảng phụ lục 2.2 Ảnh hưởng thời gian, acid ascorbic, bao bì bao gói đến số TVB-N Mẫu caroten-protein thủy phân acid Chỉ số TVB-N (mgN/5g) Bao bì (PP) Bao bì đục (HDPE) Nồng độ acid ascorbic (w/w) Nồng độ acid ascorbic (w/w) 0% 0,05% 0,1% 0% 0,05% 0,1% TUẦN 17,37 ± 0,17 17,34 ± 0,15 17,38 ± 0,16 17,37 ± 0,17 17,34 ± 0,15 17,38 ± 0,16 TUẦN 17,9 ± 0,12 17,8 ± 0,14 17,69 ± 0,02 17,79 ± 0,17 17,68 ± 0,00 17,61 ± 0,08 TUẦN 18,93 ± 0,13 18,20 ± 0,29 17,94 ± 0,22 18,40 ± 0,15 17,91 ± 0,08 17,84 ± 0,07 TUẦN 20,95 ± 0,37 18,96 ± 0,38 18,28 ± 0,30 20,06 ± 0,01 18,65 ± 0,06 18,34 ± 0,08 TUẦN 25,57 ± 0,37 21,01 ± 0,30 20,59 ± 0,30 24,00 ± 0,37 20,43 ± 0,22 20,01 ± 0,37 TUẦN 31,62 ± 0,45 24,58 ± 0,45 24,01 ± 0,52 29,00 ± 0,30 22,74 ± 0,38 21,90 ± 0,22 Mẫu caroten-protein thủy phân enzyme Chỉ số TVB-N (mgN/5g) Bao bì (PP) Bao bì đục (HDPE) Nồng độ acid ascorbic (w/w) Nồng độ acid ascorbic (w/w) 0% 0,05% 0,1% 0% 0,05% 0,1% TUẦN 61,9 ± 0,43 61,89 ± 0,69 61,9 ± 0,40 61,89 ± 0,43 61,89 ± 0,69 61,89 ± 0,40 TUẦN 62,04 ± 0,18 61,96 ± 0,08 61,84 ± 0,07 61,99 ± 0,05 62,03 ± 0,07 61,87 ± 0,19 TUẦN 63,21 ± 0,29 62,50 ± 0,07 62,16 ± 0,21 63,04 ± 0,00 62,39 ± 0,16 62,00 ± 0,22 TUẦN 66,27 ± 0,27 63,22 ± 0,28 62,72 ± 0,3 64,97 ± 0,29 62,80 ± 0,26 62,26 ± 0,32 TUẦN 70,16 ± 0,45 65,48 ± 0,36 65,17 ± 0,36 67,75 ± 0,28 64,01 ± 0,38 63,50 ± 0,37 TUẦN 74,99 ± 0,29 68,42 ± 0,23 68,02 ± 0,36 72,47 ± 0,31 66,28 ± 0,32 65,86 ± 0,44 59 Bảng phụ lục 2.3 Ảnh hưởng thời gian acid ascorbic, bao bì bao gói đến hàm lượng lipid Mẫu caroten-protein thủy phân acid Hàm lượng lipid (%) Bao bì (PP) Bao bì đục (HDPE) Nồng độ acid ascorbic (w/w) Nồng độ acid ascorbic (w/w) 0% 0,05% 0,1% 0% 0,05% 0,1% TUẦN 16,96 ± 0,01 17,08 ± 0,02 17,11 ± 0,14 16,96 ± 0,01 17,08 ± 0,22 17,11 ± 0,14 TUẦN 16,23 ± 0,23 16,63 ± 0,05 16,88 ± 0,05 16,33 ± 0,21 16,71 ± 0,09 16,92 ± 0,20 TUẦN 15,11 ± 0,04 15,81 ± 0,28 16,13 ± 0,25 15,45 ± 0,01 15,93 ± 0,10 16,27 ± 0,23 TUẦN 14,02 ± 0,04 15,10 ± 0,21 15,61 ± 0,21 14,34 ± 0,05 15,31 ± 0,16 15,84 ± 0,30 TUẦN 13,30 ± 0,06 14,51 ± 0,17 14,97 ± 0,28 13,55 ± 0,20 14,91 ± 0,13 15,26 ± 0,21 TUẦN 12,28 ± 0,18 14,02 ± 0,33 14,59 ± 0,18 12,97 ± 0,18 14,43 ± 0,20 14,83 ± 0,21 Kết tính hàm lượng chất khô Mẫu caroten-protein thủy phân enzyme Hàm lượng lipid (%) Bao bì (PP) Bao bì đục (HDPE) Nồng độ acid ascorbic (w/w) Nồng độ acid ascorbic (w/w) 0% 0,05% 0,1% 0% 0,05% 0,1% TUẦN 14,89 ± 0,14 14,92 ± 0,19 14,98 ± 0,14 14,89 ± 0,14 14,92 ± 0,19 14,98 ± 0,14 TUẦN 14,16 ± 0,15 14,41 ± 0,11 14,56 ± 0,14 14,13 ± 0,12 14,44 ± 0,07 14,54 ± 0,21 TUẦN 13,04 ± 0,14 13,62 ± 0,15 14,02 ± 0,23 13,16 ± 0,07 13,83 ± 0,05 14,13 ± 0,31 TUẦN 12,17 ± 0,17 12,94 ± 0,26 13,17 ± 0,03 12,95 ± 0,08 13,70 ± 0,05 13,95 ± 0,13 TUẦN 11,34 ± 0,10 12,02 ± 0,17 12,38 ± 0,24 12,42 ± 0,14 13,17 ± 0,16 13,54 ± 0,14 TUẦN 10,9 ± 0,12 11,58 ± 0,22 11,81 ± 0,15 11,95 ± 0,16 12,73 ± 0,10 13,06 ± 0,15 Kết tính hàm lượng chất khô tuyệt đối 60 Phụ lục 3: Hình ảnh bố trí thí nghiệm biến đổi hỗn hợp caroten-protein trình bảo quản Hình PL 3.1 Hình ảnh hai loại bao bì nồng độ acid ascorbic bố trí thí nghiệm Hình PL 3.2 Sự thay đổi màu sắc mẫu caroten-protein thủy phân acid sau tuần bảo quản bao bì PP 61 Hình PL 3.3 Sự thay đổi màu sắc mẫu caroten-protein thủy phân enzyme sau tuần bảo quản bao bì PP Hình PL 3.4 Sự thay đổi màu sắc mẫu caroten-protein thủy phân acid sau tuần bảo quản bao bì HDPE Hình PL 3.2 Sự thay đổi màu sắc mẫu caroten-protein thủy phân enzyme sau tuần bảo quản bao bì HDPE [...]... tạo thành sản phẩm Việc lựa chọn phương pháp thu hồi hỗn hợp caroten- protein dựa vào mục đích thu nhận và các điều kiện thu nhận thích hợp Để thu nhận được hỗn hợp carotenprotein cung cấp nguyên liệu đầu vào cho quá trình cô đặc và hiệu suất thu hồi hỗn hợp caroten- protein cao tiến hành thu hồi hỗn hợp caroten- protein theo phương pháp ủ xilô bằng acid vô cơ Phương pháp thu được khối lượng hỗn hợp lớn,... thấp Phương pháp ủ xi lô bằng enzyme tuy cho khối lượng hỗn hợp không cao nhưng màu sắc cảm quan cũng như hàm lượng astaxanthin của hỗn hợp sau thu hồi cao hơn phương pháp ủ xi lô bằng acid vô cơ Vì vậy, đề tài nghiên cứu này sử dụng cả hai phương pháp tách chiết caroten- protein để vừa thu được hỗn hợp caroten- protein sau cô đặc lớn và hàm lượng astaxanthin trong hỗn hợp cao Hỗn hợp caroten- protein thu. .. quả cho thấy bảo quản astxanthin ở điều kiện đông khô hàm lượng astxanthin cao hơn 41% khi sấy phun Ở điều kiện nhiệt độ thấp (40C và -200C) cũng cho hàm lượng astxanthin cao hơn khi bảo quản ở nhiệt độ thường sau 20 tuần bảo quản [11] 1.5 Các phương pháp thu nhận và bảo quản hỗn hợp caroten- protein giàu astaxanthin 1.5.1 Các phương pháp thu nhận hỗn hợp caroten- protein Phức hợp caroten- protein tồn... nhận từ đầu tôm thẻ chân trắng được tách chiết theo hai phương pháp xử lí hóa học và xử lí enzyme – Trang Sĩ Trung (2015 ) [10] 1.5.2 Phương pháp bảo quản hỗn hợp caroten- protein Hỗn hợp caroten- protein thu nhận từ vỏ tôm tồn tại dưới dạng dung dịch chứa hàm lượng nước lớn rất dễ bị hư hỏng trong quá trình bảo quản cũng như khó khăn trong quá trình vận chuyển vì vậy để nâng cao giá trị của caroten- protein, ... Các nghiên cứu trong nước chủ yếu tập trung vào việc thu hồi caroten- protein có hàm lượng astaxanthin cao cùng với ứng dụng của hỗn hợp caroten- protein trong thực phẩm, nghiên cứu bảo quản hỗn hợp caroten- protein sau thu hồi Phạm Thị Đan Phượng (2012) đã nghiên cứu thu nhận bột đạm carotenoid từ đầu tôm thẻ chân trắng bằng phương pháp xử lí kết hợp hai enzyme protease Bột đạm được tiến hành sấy chân... và thu n tiện cho quá trình lấy mẫu phân tích cần có phương pháp loại nước để thu nhận và bảo quản hỗn hợp caroten- protein như cô đặc, sấy, bảo quản ở nhiệt độ lạnh, sử dụng phụ gia bảo quản (acid ascorbic, tocopherol, polyphenol, bao gói hút chân không, 1.5.2.1 Phương pháp cô đặc Trong sản xuất và đời sống có rất nhiều trường hợp cần loại nước (ẩm) ra khỏi nguyên liệu Sau khi tách nước, nhiều sản. .. tôm do đó để tận dụng các ưu điểm của hỗn hợp caroten- protein cần phải thực hiện các phương pháp tách chiết để thu nhận hỗn hợp Hiện nay, có một số phương pháp thường được dùng để thu nhận hỗn hợp caroten- protein: 1.5.1.1 Phương pháp lên men Lên men lactic là sự chuyển hóa kỵ khí các chất glucid thành acid lactic nhờ hoạt động sống của vi sinh vật Lên men lactic là một trong những quá trình chuyển... trong (PP) Bảo quản ở nhiệt độ 28-300C Thời gian bảo quản Tuần 1 Tuần 2 Tuần 3 Tuần 4 Tuần 5 Đánh giá hàm hượng astaxanthin, TVB-N, lipid sau mỗi tuần bảo quản Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ phối trộn acid ascorbic kết hợp bao bì bao gói hỗn hợp caroten- protein *: Trang Sĩ Trung (2015): Báo cáo chuyên đề nghiên cứu tách chiết hỗn hợp caroten- protein từ đầu tôm bằng hai phương pháp xử...  Sản phẩm dạng chai, cứng  Mờ, đục, có khả năng hạn chế ánh sáng đi qua và ngăn cản tia UV 1.5.2.3 Phương pháp sử dụng phụ gia bảo quản Astaxanthin trong hỗn hợp caroten- protein sau cô đặc phụ thu c phần lớn vào protein mà nó liên kết, vì ở dạng tự do astaxanthin dễ bị oxi hóa nhất, vì vậy vấn đề bảo quản astaxanthin và protein trong hỗn hợp caroten- protein là vấn đề song hành và cấp thiết Để bảo. .. loại [53] Hình 1.9 Khử các gốc tự do bởi acid ascorbic 26 CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Hỗn hợp caroten- protein thu nhận từ đầu tôm thẻ chân trắng được tách chiết theo hai phương pháp xử lí hóa học và xử lí enzyme – Trang Sĩ Trung (2015) Hỗn hợp caroten- protein được vận chuyển từ công ty Việt Nam Food, địa chỉ: khu công nghiệp Hòa Trung, ấp Hòa Trung, xã Lương