Đang tải... (xem toàn văn)
Trong một số nghiên cứu của các nhà khoa học cho thấy một số vi khuẩn tía quang hợp (VKTQH) có hàm lượng lipit rất cao ( chiếm từ 3040 phần trăm khối lượng khô) đã được lựa chọn. Ngoài ra trong tế bào của các chủng vi khuẩn này cũng chứa hàm lượng lớn các chất có chứa các axit béo không no (MUFAs và PUFAs). Đồng thời, để giải quyết nhu cầu về thức ăn tươi sống trong sản xuất thủy sản do sinh khối tảo không đủ đáp ứng chúng tôi quyết định tiến hành “nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng vi khuẩn tía quang hợp có khả năng tổng hợp axit béo không no đơn nối đôi (MUFAs) và đa nối đôi (PUFAs) sử dụng làm thức ăn tươi sống trong nuôi trồng thủy sản”
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CHỦNG VI KHUẨN TÍA QUANG HỢP CÓ KHẢ NĂNG TỔNG HỢP AXIT BÉO KHÔNG NO (MUFAs VÀ PUFAs) SỬ DỤNG LÀM THỨC ĂN TƯƠI SỐNG TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Cán hướng dẫn: TS Hoàng Thị Yến TS Bùi Văn Ngọc TS Nguyễn Hưũ Đức Sinh viên thực hiện: Mai Thị Ngọc Oanh Lớp : K58 - CNSHC Hà Nội– 2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu Các số liệu, kết khóa luận trung thực chưa tìm thấy công trình nghiên cứu khác Tôi xin cam đoan thông tin khóa luận trích rõ nguồn gốc Tác giả MAI THỊ NGỌC OANH LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới TS Hoàng Thị Yến – Cán phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen người trực tiếp hướng dẫn, tận tình bảo tạo điều kiện tốt cho suốt thời gian thực khóa luận Tôi xin trân trọng cảm ơn TS.Bùi Văn Ngọc trưởng phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen tạo điều kiện cho em học hỏi thực tập khóa luận phòng Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Hữu Đức– Trưởng môn Công nghệ sinh học động vật – Khoa Công nghệ sinh học – Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nộ bên cạnh, bảo, hướng dẫn động viên suốt trình hoàn thành khóa luận Tôi xin gửi lời cảm ơn tớichị Trần Thị Thu Quỳnh tận tình bảo, động viên cho lời khuyên quý báu công việc sống Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới cán nghiên cứu, kỹ thuật viên phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ gen tạo điều kiện thuận lợi để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Tiếp theo, xin gửi lời cảm ơn đến Thầy, Cô khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, tận tình bảo cho suốt trình học tập trường Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn vô hạn đến Bố, Mẹ toàn thể người thân gia đình bạn bè hỗ trợ, động viên, khuyến khích suốt thời gian qua Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 18 tháng 08 năm 2016 Mai Thị Ngọc Oanh MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG Ơ PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Hiện nước ta thực sách thúc đẩy xuất hàng hóa Một mặt hàng trọng thủy sản Hàng năm ngành thủy sản đóng góp hàng triệu USD vào tổng kim ngạch xuất Nguồn cung cấp thủy sản nuôi trồng đánh bắt.Tuy nhiên, nguồn thủy sản có từ đánh bắt ngày giảm người khai thác nhiều ảnh hưởng ô nhiễm môi trường làm cạn kiệt nguồn thủy sản Để đảm bảo có đủ nguồn thủy sản cung cấp cho thị trường nước ta đẩy mạnh hướng nuôi trồng thủy sản Nuôi trồng thủy sản phát triển nhu cầu giống ngày gia tăng Trong sản xuất giống yêu cầu kỹ thuật giống vô quan trọng yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến suất chất lượng thủy sản Từ lâu vi tảo vi khuẩn hay số động vật phù du rotifer, artermia,…đã sử dụng làm thức ăn cho nhiều loại thủy động vật Các loại tảo Chlorella, Spirulina, Nanochloropis,…đã lựa chọn làm thức ăn trực tiếp cho loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ (ở tất giai đoạn), cho loại cá, giáp xác, bào ngư Tuy người nghiên cứu xây dựng kỹ thuật sản xuất sinh khối tảo thực tế suất chưa ổn định Để khắc phục tình trạng người ta tiếp tục tìm kiếm, lựa chọn thêm đối tượng để sử dụng làm thức ăn tươi sống bổ sung sản xuất giống thủy sản Rất nhiều nước tiếng xuất nuôi trồng thủy sản Nhật Bản, Trung Quốc, Malaysia sử dụng vi khuẩn tía quang hợp (VKTQH) làm nguồn thức ăn tươi trực tiếp hay gián tiếp để nuôi ấu trùng số thủy động vật thành công Trong năm gần đây, đối tượng tìm kiếm, phân lập, tuyển chọn nghiên cứu để ứng dụng vào số lĩnh vực như: công nghệ môi trường, thu nhận hoạt chất sinh học có giá trị, làm phân bón hóa học, phân bón vi sinh,…Tuy nhiên, việc nghiên cứu ứng dụng đối tượng vào sản xuất thức ăn tươi sống cho thủy sản quan tâm Trong số nghiên cứu nhà khoa học cho thấy số vi khuẩn tía quang hợp (VKTQH) có hàm lượng lipit cao ( chiếm từ 30-40 phần trăm khối lượng khô) lựa chọn Ngoài tế bào chủng vi khuẩn chứa hàm lượng lớn chất có chứa axit béo không no (MUFAs PUFAs) Đồng thời, để giải nhu cầu thức ăn tươi sống sản xuất thủy sản sinh khối tảo không đủ đáp ứng định tiến hành “nghiên cứu đặc điểm sinh học số chủng vi khuẩn tía quang hợp có khả tổng hợp axit béo không no đơn nối đôi (MUFAs) đa nối đôi (PUFAs) sử dụng làm thức ăn tươi sống nuôi trồng thủy sản” 1.2 Mục đích yêu cầu nghiên cứu 1.2.1 Mục đích Thu số chủng VKTQH không lưu huỳnh có khả tổng hợp axit béo không no (MUFAs PUFAs) sử dụng làm thức ăn tươi sống nuôi trồng thủy sản 1.2.2 Yêu cầu Dựa thành phần dinh dưỡng, dựa vào khả sinh trưởng để lựa chọn chủng vi khuẩn quang hợp không lưu huỳnh có khả tổng hợp axit béo không no sử dụng làm thức ăn tươi sống cho thủy hải sản Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng lựa chọn: + Hình dạng, cấu trúc tế bào + Đặc điểm máy quang hợp + Đặc điểm dinh dưỡng Nghiên cứu ảnh hưởng số điều kiện ngoại cảnh đến khả sinh trưởng chủng VKTQH lựa chọn: + PH, nồng độ muối + Nguồn chất: cacbon, Nitơ - Xác định trình tự gen chủng vi khuẩn nghiên cứu PHẦN II TỔNG QUAN 2.1 Tổng quan tình hình sử dụng vi khuẩn tía quang hợp làm thức ăn tươi sống nuôi trồng thủy sản 2.1.1.Cơ sở khoa học việc sử dụng vi tảo vi khuẩn làm nguồn thức ăn tươi sống nuôi trồng thủy sản Gia tăng dân số phát triển kinh tế xã hội làm tăng cao nhu cầu thực phẩm, không kể tới nhu cầu thủy sản Trên giới năm từ năm 2010 đến năm 2014 nuôi trồng thủy sản có mức tăng cao, bình quân 6%/ năm (Trang Fix it right the first time-2014) Theo dự báo Tổ chức Nông Lương Liên Hợp Quốc (FAO) phối hợp với Tổ chức Hợp tác Phát triển Kinh tế (OECD) dự báo tiêu thụ thủy sản toàn cầu dự báo đạt 188 triệu vào năm 2020 Cũng theo dự báo OECD-FAO World Bangk, nhu cầu hải sản tiếp tục tăng nhanh chóng, dự báo tăng từ 111,679 triệu lên 151,771 triệu năm 2030, tăng gần 30% [Ngày 11/09/2016- Sở công thương thành phố Hồ Chí Minh] Việt Nam phần biển Đông biển lớn Thái Bình Dương, có diện tích khoảng 3.448.000 km2, có đường bờ biển dài 3260 km Vùng nội thủy lãnh hải rộng 226 km Vùng biển đặc quyền kinh tế rộng triệu km Biển Việt Nam có tính đa dạng sinh học cao nơi phát sinh, phát tán nhiều loài thủy động vật Ngoài ra, nước ta có hệ thống sông ngòi dày đặc có đường bờ biển dài điều kiện thuận lợi cho việc khai thác nuôi trồng thủy sản Ở Việt Nam, nuôi trồng thủy sản trở thành nghành sản xuất mang lại hiệu kinh tế cao Năm 2008, diện tích nuôi trồng đạt triệu ha, sản lượng nuôi trồng đạt 2,4 triệu tấn, kim ngạch xuất 4,5 tỷ USD [tiền phong online 28/6/2009] Năm 2014 tổng giá trị xuất thủy đạt 7,84 tỷ USD, mức xuất kỷ lục nghành thủy sản Năm 2015 diện tích nuôi trồng 1,28 triệu ha, kim ngạch xuất 6,72 tỷ USD [trang thông tin điện tử tổng cục thủy sản 18/8/2016].Sau sụt giảm mạnh năm 2015 xuất thủy sản nước quý I năm 2016 phục hồi đạt 1,45 tỷ USD tăng gần 6,4% so với kỳ năm 2015 [02/05/2016, trang hội chế biến xuất thủy sản Việt Nam] Theo dự báo quý tới năm 2016 xuất thủy sản tiếp tục tăng trưởng mạnh góp phần lớn tổng kim ngạch xuất nước ta Thủy sản Việt Nam tiêu thụ 160 thị trường thị trường tiêu thụ ngày mở rộng có chỗ đứng thị trường lớn Mỹ, Nhật Bản, EU thị trường lớn nhất, chiếm 50-60% giá trị xuất Việt Nam Xuất thủy sản chiếm phần lớn kim ngạch xuất khẩu, góp phần trực tiếp tăng giá trị GDP, kim ngạch xuất thủy sản đứng thứ số mặt hàng xuất chủ lực sau dệt may, da giầy dầu thô Việt Nam xếp vào tốp 10 quốc gia xuất thủy sản giới Xuất thủy hải sản tăng kéo theo ngành khai thác nuôi trồng thủy sản phát triển Tuy nhiên tình trạng đánh bắt mức đủ loại hình thức ô nhiễm môi trường nguyên nhân từ việc xả chất thải từ nhà máy, xí nghiệp minh chứng tháng 4-2016 thủy động vật tình miền Trung chết hàng loạt cộng với tượng thủy chiều đỏ làm nguồn tài nguyên thiên nhiên bị cạn kiệt Chính lí mà nước ta thúc đẩy từ đánh bắt sang nuôi trồng thủy sản Nuôi trồng thủy sản phát triển nhu cầu giống tăng theo Trong đó, sản xuất thức ăn giống đóng vai trò vô quan trọng đến suất, chất lượng giá trị thủy sản Thức ăn sản xuất phần quan trọng thương mại đại nuôi trồng thủy sản, cung cấp dinh dưỡng cân cần thiết cho loại thủy động vật Từ nghiên cứu sinh thái, người ta thấy tự nhiên nhiều vi sinh vật (vi tảo, vi khuẩn) tham gia vào chuỗi thức ăn nhiều loài thủy vật Thực tế vi tảo thường thức ăn cho loài cá, giáp xác, bào ngư,…đồng thời làm tức ăn gián tiếp cho nhiều thủy động vật kinh tế khác thông qua động vật phù du rotifer, artemia,… Dựa vào tượng tự nhiên mà nguời ta nghiên cứu xây dựng sản xuất sinh khối vi tảo vi khuẩn làm thức ăn tươi sống cho giống nuôi trồng thủy sản 10 Chiều dài thể (mm) Thời gian (ngày) 1,31 1,53 1,3 1,4 1,29 1,43 1,03 1,32 0,92 - Nguồn thức ăn TANT + Spirulina sp TANT + Rsp Plustris (SKK) TANT + Rps Palustris (SKT) Rps Palustris (SKK) Không cho ăn 0,78 0,78 0,78 0,78 0,78 1,73 1,42 1,47 1,39 - Bảng ảnh hưởng thức ăn lên tăng trưởng artemia TANT : thức ăn nuôi tôm; Sp: Spirulina; Rps Palustris: sinh khối vi khuẩn không lưu huỳnh loài Rps.palustris Dựa kết thu ông đưa kết luận sau: + Vi khuẩn tía quang hợp có khả tốt nuôi động vật phù du + Vi khuẩn tía quang hợp không gây độc cho độc cho động vật phù du + Khả mức độ sống sót artermia nuôi VKTQH thức ăn nuôi tôm có bổ sung sinh khối VKTQH so với công thức đối chứng thức ăn nuôi tôm không đáng kể Đây chứng để sử dụng VKTQH làm thức ăn nuôi artermia Năm 2012, Loo cs sử dụng sinh khối bPOME – PB (VKTQH nuôi môi trường nước thải nhà máy dầu cọ) b112- PB (sinh khối VKTQH nuôi môi trường hóa chất) để nuôi rotifer Kết cho thấy rotifer sinh trưởng tốt cho ăn b112 –PB so với bPOME – P Đó dấu hiệu đáng mừng, nhiên sử dụng rotifer để nuôi ấu trùng cá bống tượng cho ăn rotifer (POMEPB) lại cao nhiều so với ăn rotifer (b112- PB) Trong nuôi trực tiếp Năm 1987, Noparatnaraporn cộng thực thí nghiệm sử dụng VKTQH ( loài Rc Gelatinous) để làm thức ăn trực tiếp nuôi cá vàng (Carrassis auratus) Khi bổ sung VKTQH ( với tỉ lệ 50%) vào thức ăn, mức độ sống sót, tốc độ tăng trưởng trọng lượng chúng tăng rõ rệt VKTQH sử dụng làm thức ăn cho ấu trùng thể thủy động vật biển kinh tế như: cá chạch, cá vàng, cua, cá rô phi, động vật hai mảnh vỏ Năm 2002, Azad cộng bổ sung sinh khối VKTQH không lưu huỳnh loài R.sulfidophilum vào thức ăn truyền thống (tảo S.cosatatum) để nuôi tôm sú 16 (Penaeus monodon) Kết sau ngày nuôi: chiều dài tôm sú tăng bổ sung dich nuoi chứa 1% sinh khối khô VKTQH không lưu huỳnh loài R sulfidophilum đạt 6,13 mm bỏ sung dịch nuôi chứa 2% sinh khối khô VKTQH không lưu huỳnh loài R sulfidophilum đạt 6,18 mm, tỷ lệ sống sót 46% cao nhiều so với không bổ sung dich nuôi VKTQH không lưu huỳnh Năm 2013, Loo cộng (2013) sử dụng nước thải nhà máy sản xuất dầu cọ POME nuôi VKTQH loài Rhodovulum sulfidophilum Sau sử dungk sinh khối thu để nuôi rotifer loài Brachionus rotundiformic artemia nauplii Kết sau 60 nuôi cấy thu 2,58g/l sinh khối khô VKTQH Một số nhà khoa học lý giải gia tăng tỷ lệ sống sót tôm, cá, động vật phù du sử dụng loài R rubrum; R capsulatus… làm thức ăn tế bào VKTQH có chứa kháng sinh, kháng khuẩn, kháng virus Ở nước ta 10 năm qua, nhóm VKTQH trọng nghiên cứu về: phân loại, khả loại bỏ sulfur xử lí nước thải giàu chất hữu việc xử lý hợp chất mạch vòng khó phân hủy việc sử dụng VKTQH làm thức ăn tươi sống nuôi trồng thủy sản Trong lĩnh vực nuôi trồng thủy sản, nhóm nghiên cứu TS Hoàng Thị Yến cs (2010) lựa chọn chủng VKTQH nước mặn (2 chủng thuộc loài Rhodovulum sulfidophylum chủng thuộc loài Rhodobacter sphaeroides) dự vào khả sống sót cao artemia (khi nuôi artemia sinh khối chủng VKTQH) dựa khả tích lũy sinh khối chúng Tiếp theo nhóm nghiên cứu xác định thành phần dinh dưỡng chủng có hàm lượng amino acid tổng số cao (40-47%) so với loài tảo Chlprella sp Tuy nhiên hàm lượng lipid đạt 9-14% trọng lượng khô Ngoài nhóm tìm số điều kiện môi trường nuôi cấy thích hợp để sản xuất sinh khối Cuối cùng, xây dựng quy trình sản xuất sinh khối VKTQH sử dụng sinh khối làm thức ăn tươi sống cho luân trùng giống động vật hai mảnh vỏ 2.2 Giới thiệu VKTQH Năm 1907, Molisch phát số vi khuẩn có màu đỏ có khả quang hợp gọi Rhodobacteria Nhóm vi khuẩn chia làm hai họ Thiorhodaceae (nhóm VKTQH có khả tích lũy giọt lưu huỳnh tế bào) họ Athiorhodaceae (nhóm VKTQH khả tích lũy giọt lưu huỳnh tế bào) Nhóm VKTQH sau đổi tên thành hai họ Chromatiaceae ( nhóm VKTQH có khả tích lũy giọt lưu huỳnh tế bào) họ Rhodospirillaceae ( nhóm VKTQH khả tích lũy giọt lưu huỳnh bên tế bào) Tới năm 1937 nhà khoa 17 học Pelsh năm 1968 nhà khoa học Truper phát số VKQHT có khả hình thành giột lưu huỳnh bên tế bào, chúng xếp vào chi Ectothiorhodospita thuộc họ Chromaticaceae… Qua nghiên cứu, chỉnh sửa xếp theo hệ thống phân loại Bergey qua năm 1989, 1994, 2001, 2005 số VKQHT không lưu huỳnh VKQHT hiếu khí chứa Bchl nằm nhóm Alphaproteobacteria nhóm Betaproeobacteria; VKQHT lưu huỳnh lại nằm nhóm Gammaproteobacteria Vi khuẩn quang hợp tía (VKQHT) nhóm vi khuẩn nhân sơ có khả tiến hành quang hợp không thải oxy vi khuẩn lam Khi chiếu nguồn ánh sáng, nhiều loài nhóm có khả sinh trưởng quang tự dưỡng với CO nguồn carbon sinh trưởng quang dị dưỡng với hợp chất hữu làm nguồn carbon Đặc trưng nhóm vi khuẩn nguồn điện tử trình quang hợp nước mà nguyên tố lưu huỳnh (S) hai sulfide, chúng sử dụng chất hữu đơn giản acid hữu cơ, đường, rượu 18 2.3 Sinh học VKTQH 2.3.1.Đặc điểm hình thái Vi khuẩn tía quang hợp tế bào Gram âm, đơn bào có dạng cầu, xoắn, gậy, phẩy Kích thước tế bào 0,3-0,6 μm Đa số loài sinh sản nhân đôi, sinh sản cách nảy chồi Khi gặp điều kiện quang hợp thích hợp, vi khuẩn chuyển sang màu tía, đỏ,vàng, nâu Sự khác màu sắc khả hấp phụ quang phổ khác Khi quang hợp vi khuẩn có hay khả tổng hợp lưu huỳnh Đây đặc điểm quan trọng để làm sở tách biệt hai nhóm vi khuẩn tía quang hợp có khả hợp giọt lưu huỳnh vi khuẩn tía quang hợp khả tổng hợp giọt lưu huỳnh Hình Hình dạng tế bào số đại diện VKTQH không lưu huỳnh (https://www.google.com.vn/search? q=hình+ảnh+một+số+loài+tảo+tiêu+biểu&biw=1366&bih=665&tbm=isch&tbo=u&so urce=univ&sa=X&ved=0ahUKE) 2.3.2 Qúa trình quang hợp VKTQH Vi khuẩn tía quang hợp thu nhận ánh sáng mặt trời để tiến hành quang hợp Đặc biệt, VKTQH sử dụng lưu huỳnh làm chất cho điện tử không thải oxi 19 Phương trình tổng quát trình quang hợp viết sau: CO2 + 2H2O + hv -> (CH2O)n + H2O + 2A Trong trình oxi hóa diễn theo phương trình: 2H2A > 4H+ +2A Phản ứng khử: 4H+ + CO2 > (CH2O)n + H2O Không giống tảo thực vật bậc cao H 2A H2O, vi khuẩn tía quang hợp H2A chất hữu đơn giản, hợp chất khử lưu huỳnh hidro phân tử Trong chất hữu vừa đóng vai trò chất cho điện tử vừa làm nguồn carbon cho sinh trưởng tế bào Nhìn vào sơ đồ diễn tả trình quang hợp vi khuẩn tía quang hợp ta thấy vi khuẩn tía không sử dụng nước nguồn electron không tạo thành CO Điều trái ngược hoàn toàn với trình quang hợp vi khuẩn lam vi sinh vật quang hợp nhân thật thải oxy ( số vi khuẩn lam tiến hành quang hợp không thải oxy) Trong trình quang hợp vi khuẩn tía NADPH không tạo thành trực tiếp 20 Đặc tính Sắc tố quang hợp Hệ quang II Các chất cho electeron quang hợp Kiểu sản sinh O2 Các sản phẩm sơ cấp chuyển hóa lượng Nguồn carbon Sinh vật nhân thật Vi khuẩn lam Vi khuẩn màu lục vi khuẩn tía Cholorophyll a Cholorophyll a Bacteriocholorophyll Có mặt H2O Có mặt H2 O Vắng mặt H2, H2S, S, chất hữu Thải O2 ATP + NADPH Thải O2* ATP + NADPH Không thải O2 ATP CO2 CO2 Carbon hữu cơ, CO2 Bảng Đặc tính hệ thống quang hợp vi sinh vật 2.3.3 Sắc tố quang hợp VKTQH Các sắc tố có vi khuẩn bacteriochlorophyll carotenoid, hai chất có chức hấp thu ánh sáng cho quang hợp - Bacteriochorophyll (Bchl) Bacteriochlorophyll sắc tố quang hợp xảy trình quang hợp vi khuẩn tía quan hợp phát năm 1932 Chúng liên quan đến chlorophyll sắc tố tảo vi khuẩn lam, có khả quang hợp không tạo oxi Hiện bacteriochlorophyll chia thành nhóm a, b, c, d, e, f, g dựa vào cấu trúc phân tử chế tối đa hấp thụ tia hồng ngoại (nm) Sự hấp thụ loại Bchl nằm vùng ánh sáng đỏ ảnh hưởng trực tiếp tới màu sắc dịch huyền phù tế bào vi khuẩn Trong đó, VKTQH có hai loại Bchl a,b khác cực đại hấp thụ hai loại trình bày bảng sau: Dạng Bacteriochlorophy II A B Nhóm vi khuẩn Vi khuẩn tía Cực đại hấp thụ Chiết ete Trong tế bào 770-775 790 830-890 1020-1030 Bảng So sánh cực đại hấp thụ hai dạng Bacteriochlorophylla b VKTQH (trong tế bào nguyên tế bào dịch chiết ete) Bacteriochlorophyll a, b, g xếp vào nhóm bacteriochlorins có chung đặc điểm có hai vòng macrocycle bacteriochlorophyll c, d, e xếp vào nhóm chlorin có đặc điểm chung có vòng macrocycle 21 Hình Hình ảnh cấu trúc loại chlorophyll làm sở phân loại Hình Cấu tạo hóa học vòng porphyry - Màu sắc dịch huyền phù tế bào VKTQH phụ thuộc vào carotenoid Thành phần carotenoid đa dạng VKTQH Carotenoid chia làm nhóm theo cấu trúc phân tử cực đai hấp thụ chúng: + Nhóm Sprilloxanthin thường bao gồm: Lycopene, rhodospin, spirilloxanthin + Nhóm Spirilloxanthin thay bao gồm: Chloroxanthin, sphaeroidene, sphaeroidenone + Nhóm Okenone bao gồm: Okenone + Nhóm bao gồm: Lycopen, lycopenal, lycopenol, rhodopin, rhodopinol 22 Hình Cấu trúc số Carotenoid có VKTQH Quang hợp tế bào VKTQH diễn đơn vị quang hợp Đơn vị phân bố máy quang hợp.Mỗi đơn vị quang hợp bao gồm ba thành phần sắc tố thu nhận lượng ánh sáng (Bchl carotenoid); trung tâm phản ứng quang hóa mạch truyền điện tử quang hóa Hoạt động máy sơ cấp Hấp thụ ánh sáng Giai đoạn đầu trình quang hợp hấp thụ ánh sáng sắc tố anten Nhờ hấp thụ lượng tử ánh sáng điện tử Bchl anten từ quỹ đạo thấp chuyển sang quỹ đạo cao phần tử truyền từ trạng thái sang trạng thái kích thích Quá trình tạo lượng để chuyển tới trung tâm phản ứng quang hóa kích thích hoạt động khác tế bào Quá trình tách điện tích tạo dòng điện tử qua mạch chuyển điện tử quang hợp Hoạt động mạch truyền điện tử Khác với tảo thực vật bậc cao trình quang hợp xảy với hai hệ quang hóa với hai trung tâm phản ứng, vi khuẩn tía quang hợp trình quang hợp xảy hệ quang hóa với trung tâm phản ứng Sự khác biệt mô tả hình 1.4 hình 1.5: Hình 1.4 Mạch truyền điện tử tảo vi khuẩn bậc cao (https://www.google.com.vn/search?q=h%C3%ACnh+ %E1%BA%A3nh+quang+h%E1%BB%A3p+%E1%BB%9F+th%E1%BB%B1c+v%E1%BA %ADt+b%E1%BA %ADc+cao&biw=1600&bih=763&tbm=isch&tbo=u&source=univ&sa=X&sqi=2&ved=0ahUKE wiAiZyjvofPAhUHM48KHYjbDYAQsAQIGA) 23 Hình Mạch truyền điện tử vi khuẩn tía quang hợp (https://www.google.com.vn/search?q=h%C3%ACnh+%E1%BA%A3nh+quang+h %E1%BB%A3p+%E1%BB%9F+vi+khu%E1%BA%A9n&tbm=isch&imgil) Nguyên lý hoạt động mạch truyền điện tử quang hợp VKTQH Năng lượng tạo hấp thụ ánh sáng sắc tố quang hợp anten chuyển đến trung tâm phản ứng P780 Ngược lại với chiều nhiệt động học (từ +0,4V-0,2V), điện tử chuyển đến chất nhận sơ cấp (Bchl-Bpheo) Điện tử vận chuyển qua quinon A, quinon B, hệ cytochrom bc quay P780 Sau trình vận chuyển lượng ATP tạo ra, NADH tạo cách gián tiếp Năng lượng ATP, NADH tạo dùng để cố định CO Qúa trình cố định CO2 Cũng vi tảo thực vật bậc cao khác, VKTQH lưu huỳnh không lưu huỳnh có khả cố định CO2 Chu trình Calvin đường để chúng cố định CO2 (chu trình C3) Chu trình bao gồm hai chuỗi phản ứng, xúc tác enzyme RubisCo (Ribulozo Biphosphate Carboxylase/ Oxygenase)- enzyme xúc tác trình đồng hóa CO2 phosphoribulokinase- enzyme xúc tác cho phosphoryl hóa phụ thuộc ATP ribulozo 5- phosphate (Ru-5-P) để tạo lượng NADH Ngoài VKTQH có khả đồng hóa hợp chất hữu 1C, 2C, 3C, 4C đường 6C Khả sử dụng hợp chất hữu làm nguồn cacbon + Khả sử dụng chất 1C (formate, methanol, CO) Có nhiều ví dụ khả VKTQH sử dụng hợp chất 1C cho sinh trưởng Loài Rhodocyclus geltinosa Rhodopseudomonas acidophila có khả sử dụng nguồn carbon cho sinh trưởng chiếu sáng Tuy nhiên, methanol có điện oxy hóa khử thấp so với vật liệu tế bào nên chúng đòi hỏi CO2 với vai trò làm chất nhận điện tử để sinh trưởng trường hợp Mức độ 24 Enzyme RuBisCO tế bào tăng lên lần so với sinh trưởng môi trường chứa succinate làm nguồn carbon Chu trình Canvil có vai trò vận chuyển lực khử dư thừa từ methanol tới CO2 Như RuBisCO vừa đóng vai trò làm enzyme đồng hóa CO2 lại vừa có vai trò giữ cân oxy hóa khử + Khả sử dụng chất 2C (acetate) Tất đại diện vi khuẩn tía quang hợp có khả sinh trưởng môi trường có chứa acetate Khả đồng hóa acetate khác đại diện Năm 1960, Kornberg Larcelles phát hoạt tính enzyme ICL (isocitrate lyase) – enzyme chìa khóa chu trình glyoxylate dich chiết từ tế bào thuộc loài Rhodopseudomonas palustris Rhodobacte capsulatus chúng sinh trưởng môi truongf chứa acetate hay butyrate điều kiện quang dưỡng hóa dưỡng Blasco cộng năm 1989 xác định hoạt tính ICL Rhodopseudomonas rubrum Rhodobacter capsulate Những chứng tồn enzyme ICL cho thấy đồng hóa acetate VKTQH không lưu hynhf theo chu trình glyoxylate Ở sáng tất VKTQH có khả sinh trưởng môi trường môi trường chứa pyruvate theo kiểu quang dị dưỡng Sự đồng hóa pyruvate hệ thống enzyme hệ thống enzyme tham gia trình khác loài Đa số loài chứa enzyme pyruvate dehydrogenase Một số loài sinh trưởng ánh sáng phân hủy pyruvate thành CO 2, axetaldehyde acetone nhờ enzyme pyruvate decarboxylase Các tế bào R rubrum sử dụng hai enzyme PEPsynthase (phosphate enol pyruvate synthase ) PEP – carboxylase để chuyển hóa pyruvate tạo thành oxaloacetate (OAA) Trong hai loại vi khuẩn nói không chứa hai enzyme chúng sử dụng pyruvate nhờ xúc tác enzyme pyruvate carboxylase (PC) Enzyme PEP- carboxykinase (PEPCK) vai trò phản ứng xúc tác phản ứng tạo phosphoenol pyruvate mà cung cấp acid C4- dicarboxyliccho tổng hợp tế bào Ở tế bào loài R rubrum, R sphaeroides R capsulatus, enzyme pyruvate kinase (PK) tham gia với PEPCK xúc tacsphanr ứng tạo phosphoenol pyruvate từ pyruvate tối, sản phẩm trình propioonate, H2 formate lại chuyển hóa tiếp tục để tạo CO2 + Khả sử dụng butyrate acid béo dạng khử Các VKTQH không lưu huỳnh sinh trưởng nhanh đạt mật độ cao môi trường có chứa hợp chất 4C với hai nhóm carboxyl (như malate, succinate) so với sinh trưởng nguồn chất khác 25 Các vi khuẩn tía không lưu huỳnh sinh trưởng với butyrate (chất trạng thái khử so với vật liệu tế bào) đòi hỏi bổ sung CO làm chất nhận điện tử Do đó, trình đồng hóa butyrate sáng xảy đồng thời với trình cố định CO + Khả sử dụng đường đơn Đa số loại vi khuẩn tía quang hợp có khả sinh trưởng vài nguồn dinh dưỡng đường thông thường, riêng khả sinh trưởng nguồn dinh dưỡng fructose đặc trưng cho loài Các loài R sphaeroides R capsulatus đồng hóa đường nhờ hệ thống vận chuyển phosphotransferase Loài R capsulatus sử dụng đường EntnerDoudoroff (ED) để phân hủy glucose fructose lại chuyển háo đường Embden-Meyerhof (EMF) Loài R sphaeroides đồng hóa glucose qua đường ED, sản phẩm trình 2-keto-3-deoxygluconate (KDG)còn fructose loài đồng hóa theo đường ED sinh trưởng điều kiện hiếu khí- tối theo đường EMF điều kiện quang hợp Như chất C CO bị oxy hóa hoàn toàn thành CO2 CO2 tạo đồng hóa theo chu trình Canvil để tạo thành hợp chất trung gian 3-PGA Glucose qua đường ED fructose qua đường EMP chuyển hóa thành 3-PGA Trong điều kiện có oxy, VKTQH không lưu huỳnh tiến hành trao đổi chất theo kiểu hô hấp hiếu khí Khi đó, pyruvate hiếu khí phân giải hoàn toàn tạo thành H2O CO2 qua chu trình TAC (krebs acid citric) CO tạo thành quay trở lại chu trình Canvil để cố định CO Các hợp chất 3C, 4C bị oxy hóa để tạo thành acetyl Co-A vào chu trình TAC Trong điều kiện oxy, VKTQH tiến hành trao đổi chất theo kiểu lên men Sản phẩm lên men bao gồm loại acid hữu cơ, CO2, H2 2.3.4 Qúa trình hô hấp Vi khuẩn tía quang hợp nhóm vi khuẩn kỵ khí bắt buộc, có khả quang tự dưỡng vô Khi có mặt oxy tổng hợp sắc tố quang hợp bị ức chế hệ thống vận chuyển điện tử quang hợp trì, nhiên làm cho dịch huyền phù vi khuẩn có màu bạc 2.3.5 Trao đổi Nitơ VKTQH Tất loài VKTQH lưu huỳnh không lưu huỳnh sử dụng nguồn Nitơliên kết ammonium, glutamate, alanine…VKTQH sử dụng hệ thống enzyme GS/GOGAT (glutamine synthetase/ glutamet synthase) để đồng hóa Nitơ Lưu 26 ý, trình đồng hóa chịu ảnh hưởng trực tiếp nồng độ Nitơ đưa vào, nấu hàm lượng Nitơ đưa vào lớn hay nhỏ gây ức chế sinh trưởng VKTQH Trong trường hợp nghiêm trọng enzyme sử dụng trình đồng hóa Nitơ chuyển sang dạng adenyl hóa trở nên bất hoạt hoàn toàn Thựu tế điều kiện qua ng tự dưỡng hầu hết vi khuẩn tía quang hợp có khả sử dụng Nitơ phân tử làm nguồn Trong trình trao đổi Nito enzyme nitrogen thực trình cố định Nito qua hai tiểu phần: protein- Mo protein-Fe Phản ứng khử Nito diễn theo phương trình: N2 + 10H2 +8e- + nMg ATP -> 2NH4 + H+ + nMgADP + nPi Lưu ý tất yếu tố hydro, oxy, PH, ánh sáng ảnh hưởng mạnh tới trình cố định nitơ Khi bổ sung nguồn carbonate, alcohol, bicarbonate hay CO hoạt tính nitrogen tăng cường Khi tế bào VKTQH sinh trưởng điều kiện amoni, nitogenase bị bất hoạt nhanh có khả phục hồi nuôi môi trường nguồn nitơ bị cạn kiệt Hiện tượng gọi hiệu ứng “NH switch-off” quan sát nhiều đại diện thuộc nhóm VKTQH không lưu huỳnh Hiệu ứng xảy tùy thuộc tuổi tế bào, điều kiện sinh trưởng cho quang hợp cường độ chiếu sáng, nguồn C đặc biệt nguồn N 27 PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆ Để nghiên cứu đặc điểm sinh học số loài VKTQH có khả tổng hợp acid béo không no sử dụng thức ăn thủy sản , tiến hành sử dụng chủng vi khuẩn phân lập từ mẫu bùn nước thải nhà máy sản xuất chế biến cá nuôi cấy loại vi khuânr môi trường dinh dưỡng khác Ngoài ra, tiến hành nuôi cấy điều kiện vật lí khác sử dụng phương pháp phân tích gene để xác định chủng vi khuẩn cách xác 3.1 Vật liệu hóa chất 3.1.1.Vật liệu - Các chủng vi khuẩn có sẵn phân lập từ mẫu bùn nước thải có dầu mỡ thu từ nhà máy 3.1.2.Hóa chất - Thành phần môi trường AT bao gồm thành phần sau: NH4Cl (0,4g/l), Acetate-Na(0,5/l), NaCl (25g/l), Cao nấm men (2g/l), MgCl2 (1ml/l), CaCl2.H2O (1, tâ ml/l), KH 2PO4 (4ml/l), K2HPO4 (4ml/l), vi lượng(*) (1ml/l), agar (20g/l)- môi trường đặc, nước cất 1lít, dung dich vitamin B12(**) - Nguồn cacbon: acetate, succinate, glucose, frurose, sobitol, glycerol, lactose - Nguồn Nitơ: Arginine, Methyonine, Leucine, Serine, Alanine, Lysine, Valine, Glycerine, CH3COONH4, (NH4)2SO4 - (*) Thành phần dung dịch vi lượng: FeCl 2.4H20 (1,8g/l), CoCl2.6H2O (0,2g/l), NiCl2.6H2O (0,01g/l), CuCl2.H2O (0,01g/l) - (**) Dung dich vitamin B12 khử trùng bổ sung vào môi trường nuôi cấy trước sử dụng - Các hóa chất pha môi trường hóa chất thông thường pha môi trường Trung Quốc Việt Nam sản xuất Các loại hóa chất cần độ tinh khiết cao nhập từ Đức, Mỹ,… 3.1.3.Thiết bị máy móc -Máy quang phổ NOVASPEC II (Anh); máy ly tâm lạnh cỡ lớn (Sorwall, Đức ); kính hiển vi quang học Olympus (Nhật Bản); kính hiển vi điện tử JEOL5410LV (Nhật Bản), máy sắc ký HP-6890 (CHLB Đức) 28 3.2 Phương pháp Phương pháp nuôi VKTQH môi trường bột đậu tương Từ bình thủy tinh hình trụ thể tích 100ml , tiến hành nuôi chủng VKTQH bình thủy tinh tích bình 500ml (chưa 450ml dịch môi trường) môi trường có dịch chiết bột đạu tương 25g NaCl Giống ban đầu cấy vào bình nuôi khoảng 50ml để mật độ khoảng 10 tể bào/ ml Các bình thủy tinh đặt bóng đèn sợi đốt 60Ư với khoảng cách 20cm tới đèn Phương pháp đánh giá sinh trưởng VKTQH Sinh trưởng vi khuẩn tía quang hợp đánh giá theo mức độ lớn khuẩn lạc theo mật độ quang dich huyền phù tế bào bước sóng 660nm Ngoài ra, đánh giá mức độ sinh trưởng qua khối lượng sinh khối khô thu Phương pháp xác định khuẩn lạc, tế bào cấu trúc màng quang hợp Nuôi vi khuẩn đĩa peptri ống thạch nghiêng Sau đó, lấy tế bào nuôi soi qua kính hiển vi quang học để xác định hình thái, soi kính hiển vi điện tử để xác định cấu trúc màng tế bào Phương pháp xác định đặc điểm hệ sắc tố quang hợp Nuôi vi khuẩn tía quang hợp môi trường AT Sau đó, sử dụng phương pháp quang phổ hấp thụ bước sóng 400-900 nm máy đo quang phổ theo phương pháp Li Y cs Phương pháp xác định đặc điểm dinh dưỡng nitơ Dựa phương pháp nuôi cấy vi sinh thực nuôi vi khuẩn môi trường có chứa nguồn nitơ khác (Arginine, Methyonine, Leucine, Serine, Alanine, Lysine, Valine, Glycerine, CH3COONH4, (NH4)2SO4) đối chứng với môi trường không chứa nitơ Dựa đặc điểm hình thái vi khuẩn chọn nguyên liệu tốt bổ sung vào môi trường nuôi cấy Phương pháp xác định đặc điểm dinh dưỡng cacbon Dựa phương pháp nuôi cấy vi sinh thực nuôi môi trường có chứa nguồn cacbon khác (acetate, succinate, glucose, frurose, sobitol, glycerol, lactose) đối chứng với môi trường không chứa cacbon Dựa đặc điểm hình thái vi khuẩn thu tuyển chọn nguyên liệu tốt bổ sung vào môi trường nuôi cấy Phương pháp xác định khả sử dụng muối cho sinh trưởng 29 Dựa phương pháp nuôi cấy vi sinh nuôi môi trường chứa nồng độ muối khác nhau, sau sử dụng phương pháp quang phổ tìm nồng độ muối thích hợp sử dụng nuôi cấy vi khuẩn tía quang hợp Phương pháp giải trình tự gen 16S-rRNA Thực theo bước:tách chiết DNA genome VKTQH không lưu huỳnh ->PCR -> điện di gel agarose -> gắn sản phẩm PCR với vector > biến nạp sản phẩm lai ghép gen vào tế bào E.coli phương pháp sốc nhiệt -> tách DNA plasmid > phản ứng cắt DNA plasmid với enzyme hạn chế -> Phân tích trình tự xây dựng phát sinh chủng loại Phương pháp đông khô mẫu Đông khô phương pháp dựa vào thăng hoa tinh thể nước đá mẫu đem đông khô Phương pháp đông khô có nhiều ưu điểm phương pháp khác chỗ: gần giữ lại đặc tính nguyên liệu ban đầu, tổn thất mức độ chất lượng mức độ thấp nhất, chất có hoạt tính sinh học vitamin, enzyme bảo vệ tối đa VKTQH sau nuôi cấy môi trường bột đậu tương tiến hành ly tâm thu sinh khối máy ly tâm cỡ lớn Sau thu sinh khối mang đông khô để xác định lipid tổng số Phương pháp xử lý thống kê sinh học Các số liệu thu được xử lý phần mềm ANOVA 30