Đang tải... (xem toàn văn)
NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CHỦNG CORDYCEPS SPP. FNA5 VÀ KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG TỚI KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP EXOPOLYSACCHARIDE NHẰM TẠO THỰC PHẨM CHỨC NĂNG. Định danh, nghiên cứu các đặc điểm sinh học các chủng nấm thuộc chi Cordyceps spp.. Nghiên cứu tìm ra môi trường nuôi cấy tối ưu cho các chủng nấm dựa trên ba môi trường đã được tìm ra trong các nghiên cứu trước đó.Dựa trên môi trường tối ưu đã được xác định, nghiên cứu tìm ra nồng độ thành phần trong môi trường để sự sinh tổng hợp hoạt chất sinh học exopolysaccharide là tốt nhất.
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CHỦNG CORDYCEPS SPP FNA5 VÀ KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG TỚI KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP EXOPOLYSACCHARIDE NHẰM TẠO THỰC PHẨM CHỨC NĂNG HÀ NỘI, 09/2016 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CHỦNG CORDYCEPS SPP FNA5 VÀ KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG TỚI KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP EXOPOLYSACCHARIDE NHẰM TẠO THỰC PHẨM CHỨC NĂNG Họ tên : Đỗ Thu Hương Ngành học : Công Nghệ Sinh Học GVHD : TS Bùi Văn Ngọc TS Phạm Thanh Huyền TS Nguyễn Hữu Đức HÀ NỘI, 09/2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan toàn kết khóa luận trực tiếp thực Các số liệu kết số liệu hoàn toàn trung thực 3 LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình học tập nghiên cứu đề tài luận văn tốt nghiệp ngành Công nghệ sinh học, em nhận nhiều giúp đỡ quý báu từ phái Thầy cô, bạn bè người thân Với lòng chân thành biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi lời cảm ơn đặc biệt tới TS Bùi Văn Ngọc, Phòng Công nghệ sinh học trọng điểm, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam; TS Phạm Thanh Huyền, Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Và Công nghệ Việt Nam, hai Thầy cô tạo điều kiện, tận tâm hướng dẫn em từ bước chập chững đầu tiên, bước tiếp cận nghiên cứu khoa học Em xin gửi lời cảm ơn tới Thầy cô giáo khoa Công nghệ sinh học , giáo viên phụ trách, kỹ thuật viên phòng thí nghiệm tạo điều kiện sở vật chất hướng dẫn, giúp đỡ góp ý kiến giúp em suốt trình làm đề tài Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới anh Thắng, chị Nguyên, chị Linh, chị Yến, anh Thế, anh Tâm, anh Long, anh Cường, anh Chiến, Liên, Huyền, Hồng Anh bạn khác làm việc phòng thí nghiệm, người dành thời gian quý giá để giúp đỡ em suốt trình thực tập để đạt kết tốt Và cuối em xin cảm ơn gia đình, người thân bạn bè động viên em suốt trình thực khóa luận tốt nghiệp, giúp em vượt qua nhiều khó khăn công việc sống hoàn thành khóa luận tốt nghiệp cách thuận lợi Hà Nội, ngày 29 tháng 09 năm 2016 Sinh viên 4 Đỗ Thu Hương Mục lục DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Bảng phân loại khoa học Bảng 3.1 Một số thiết bị thường sử dụng nghiên cứu Bảng 3.2 Một số môi trường nuôi cấy 5 DANH MỤC HÌNH Hình 2.5 Chế phẩm dạng lỏng Đông trùng hạ thảo Hình 2.2 Mô tả hình thái nấm Cordyceps Hình 2.3 Cấu trúc hóa học Adenosin Cordycepin Hình 2.4 Chế phẩm dạng rắn Đông trùng hạ thảo Hình 2.1 Hình ảnh nấm Đông trùng hạ thảo TÓM TẮT Mục đích - Định danh, nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng nấm thuộc chi Cordyceps spp 6 - Nghiên cứu tìm môi trường nuôi cấy tối ưu cho chủng nấm dựa - ba môi trường tìm nghiên cứu trước Dựa môi trường tối ưu xác định, nghiên cứu tìm nồng độ thành phần môi trường để sinh tổng hợp hoạt chất sinh học exopolysaccharide tốt Phương pháp nghiên cứu - Nghiên cứu sinh trưởng phát triển chủng nấm ba - thành phần môi trường khác nhau, tìm môi trường tối ưu Nghiên cứu tìm nồng độ thích hợp thành phần môi trường đến sinh tổng hợp hoạt chất exopolysaccharide chủng nấm môi trường tối ưu để đạt kết tốt Kết nghiên cứu đề tài 7 PHẦN I MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Ngay từ thời xa xưa, người ta ý nhiều đến tác dụng dược lý dùng làm thuốc để chữa bệnh loài nấm Cordyceps spp (Đông trùng hạ thảo hay Trùng thảo), gồm hai loài Cordyceps sinensis Cordyceps militaris Cordyceps spp danh pháp khoa học chi ngành nấm túi (Ascomycota), bao gồm khoảng 400 loài miêu tả Mọi loài chi Cordyceps spp nấm ký sinh (loài nấm tên khoa học là: Ophiocordyceps sinensis) ấu trùng loài sâu thuộc chi Thiarodes, số dạng động vật chân khớp (Arthropoda) khác, chúng nấm gây bệnh cho côn trùng; số loài kí sinh loại nấm khác Loài nấm Cordyceps spp phân bố chủ yếu vùng núi cao thuộc dãy núi Hymalaya có độ cao 4000m so với mực nước biển, vùng cao nguyên Tây Tạng (Trung Quốc), số vùng thuộc Nepan Butan Loài Nấm Cordyceps spp có hàm lượng hoạt chất hoạt tính sinh học thể cordycepin, adenosine, mannitol, exopolysaccharide, superoxide dismutise nhiều thành phần khác Nhờ hợp chất hóa học giá trị dược liệu loài nấm đánh giá cao, tác dụng nhà khoa học thống kê như: kìm hãm phát triển tế bào ung thư máu, ung thư phổi, ung thư vú, Nhiều nghiên cứu chứng minh nấm có hiệu chữa trị rối loạn chức gan, lão hoá, chứng viêm tấy Ngoài có tác dụng kìm hãm oxy hoá lipid, lipoprotein lipoprotein tỷ trọng thấp Với giá trị có ý nghĩa ngành y dược việc nghiên cứu đặc điểm sinh học nấm nhằm nhân nuôi hệ sợi nuôi cấy khiết vô quan trọng, sở để bảo tồn nguồn gen quý gây trồng thể giá thể nhân tạo Trên giới, loài Cordyceps spp Đã nhà khoa học nghiên cứu thu nhiều thành tựu có giá trị Từ năm 1998, Tung Quốc, nghiên cứu sâu vào hoạt chất sinh học có Cordyceps, tập trung chủ yếu vào hợp chất polysaccharide, adenosine, cordycepin, cordycepic acid Các nước Hàn quốc , Mỹ, Nhật Bản sản xuất nấm Đông trùng hạ thảo quy mô công nghiệp từ năm 1995, kỷ XX bán thị trường với giá cao Trên thị trường Việt Nam có bán nhiều loại nấm Đông trùng hạ thảo, song phần lớn nhập từ Trung Quốc, nguồn gốc chất lượng không rõ ràng, giá lại đắt đỏ Trong đó, điều kiện,quy trình để làm sản phẩm phức tạp, đòi hỏi phải có đầu tư kỹ lưỡng công nghệ Chính tính chất độc đáo dược liệu thúc thực đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng Cordyceps spp FNA5 khảo sát yếu tố ảnh hưởng tới khả sinh tổng hợp exopolysaccharide nhằm tạo thực phẩm chức năng” Với mục đích tìm môi trường nuôi cấy phù hợp với điều kiện Việt Nam thu nấm Cordyceps có đầy đủ giá trị dược liệu để đáp ứng nhu cầu sử dụng làm vật liệu y học hỗ trợ nâng cao sức khỏe người, đồng thời góp phần nhỏ bé công xây dựng công nghiệp dược nước nhà Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu tìm môi trường thích hợp cho sinh tổng hợp Polysaccharide, ứng dụng cho sản xuất dược nước Đối tượng nội dung nghiên cứu Chủng nấm FNA5 thuộc chi Cordyceps nhận từ sưu tập chủng giống phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Đề tài có ý nghĩa khoa học thực tiễn kết thu cho thấy lỏng loài Cordyceps Đồng thời mở hướng phát triển sản xuất nguyên liệu thôphục vụ công nghiệp dược sản xuất từ chủng nấm Cordyceps phù hợp với điều kiện Việt Nam PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU Tổng quan nghiên cứu loài Cordyceps spp giới Việt Nam 1.1 Sơ lược lịch sử nghiên cứu loài Cordyceps spp 1.1.1 Phân loại khoa học Bảng 2.1: Bảng phân loại khoa học Giới (Regnum) Phân giới (Subregnum) Ngành (phylum) Phân ngành (subphylum) Lớp (class) Phân lớp (subclass) Bộ (ordo) Họ (familia) Chi (genus) Loài (species) Fungi Dikarya Ascomycota Perizomycotina Sordariomycetes Hypocreomycetidae Hypocreales Ophiocordycipitaceae Ophiocordyceps O sinensis Phân loại tên gọi Cordyceps spp danh pháp khoa học chi ngành nấm túi (Ascomycota), bao gồm khoảng 400 loài miêu tả Loài Miles Berkeley miêu tả khoa học lần năm 1843 Sphaeria sinensis (Berkeley MJ., 1843) Pier Andrea Saccardo chuyển loài sang chi Cordyceps vào năm 1878 (Saccardo PA., 1878) Loài biết đến Cordyceps sinensis năm 2007, phân tích phát sinh chủng loài phân tử sử dụng để sửa đổi phân loại họ Cordycipitaceae Clavicipitaceae, kết tạo tên gọi cho họ Ophiocordycipitaceae việc chuyển số loài Cordyceps sang chi Ophiocordyceps (Sung GH, Hywel-Jones NL, Sung JM, Luangsa-Ard JJ, Shrestha B, Spatafora JW (2007)) Trong y học cổ truyền Trung Hoa, tên gọi thường viết tắt chong cao (蟲草 "trùng thảo"), tên gọi áp dụng cho loài Cordyceps khác, C militaris Trong tiếng Nhật, gọi tōchūkasō (冬 虫夏草) 1.1.2 Giới thiệu Cordyceps spp 10 nhược điểm lớn Cordyceps (Đông trùng hạ thảo) lên men việc bị hợp chất ngoại bào (extra – cellular) mà Cordyceps (Đông trùng hạ thảo) sản sinh Khi khuẩn ty lọc khỏi canh trường nuôi cấy chất lỏng dư, thừa loại bỏ, tất hợp chất ngoại bào có hoạt tính sinh học sản sinh trình nuôi bị Có nhiều chất chuyên hoá thứ cấp độc vô nhị sản sinh Cordyceps (Đông trùng hạ thảo) mà có số hiệu y học định Trong vương quốc nấm gần thứ có tính quan trọng sinh học xảy bên màng vách tế bào Điều phải vậy, nấm miệng Để cho ăn, khuẩn ty tăng trưởng với nguồn thức ăn rò rỉ khỏi hợp chất vách tế bào để tiêu hoá thức ăn đó, sau ứa hợp chất khác đóng vai trò phân tử chuyến tiếp, đưa dưỡng chất trở lại vách tế bào vào tế bào để sử dụng Và tất rò rỉ hợp chất kháng vi sinh vật để giữ cho quan khác cạnh tranh thức ăn với (có hợp chất đề cập đến kháng sinh) Và hợp chất khác đóng vai trò theo cách riêng điều chỉnh độ pH môi trường xung quanh Có thể khoảng 90% số hợp chất có hoạt tính sinh học đáng quan tâm mà Cordyceps (Đông trùng hạ thảo) sản sinh chất lỏng bị thải sau thu hoạch khuẩn ty Đối với Cordyceps (Đông trùng hạ thảo) thu thập từ thiên nhiên, thể bướm, thu hoạch với thân cây, ướp hoàn toàn với khuẩn ty Cordyceps (Đông trùng hạ thảo) Nhưng quan trọng hơn, đóng vai trò bể chứa tự nhiên cho tất hoạt chất bị rò rỉ mà sản sinh Hợp chất mà bị rò rỉ bên khuẩn ty lại bướm Có thể lý Cordyceps (Đông trùng hạ thảo) thu thập từ thiên nhiên cho có hiệu so với Cordyceps (Đông trùng hạ thảo) nuôi cấy Đó có mặt hoạt chất ngoại bào mà bị trình thu hoạch 2.2 loại nuôi cấy chất lỏng Phương pháp nuôi cấy chất rắn 22 Phương pháp thứ hai việc thực nuôi cấy Cordyceps(đông trùng hạ thảo) gọi phương pháp chất rắn (solid – substrate) hay phương pháp sinh khối Trong loại nuôi cấy này, Cordyceps (Đông trùng hạ thảo) cấy nguồn dinh dưỡng rắn vô trùng đó, thường thường loại hạt ngũ cốc hay hạt lẫn Nó tăng trưởng chậm nhiều so với nuôi chất lỏng, cuối mức tăng trưởng khuẩn ty tiêu thụ hầu hết tất chất sẵn sàng để thu hoạch Ở điểm này, toàn bên thùng nuôi thu hoạch làm khô, khuẩn ty, chất dư thừa toàn phối hợp hợp chất ngoại bào mà sản sinh trình tăng trưởng Theo cách này, giữ lại hợp chất độc vô nhị mà tự nhiên bị nuôi cấy kỹ thuật lên men Tiềm lực chất lượng lớn nhiều nuôi cấy theo phương thức chất rắn so với phương thức lên mên chất lỏng Tuy nhiên không đơn giản nói Cordyceps (Đông trùng hạ thảo) sản xuất phương pháp tốt phương pháp khác Chất lượng cuối Cordyceps (Đông trùng hạ thảo) xác định số nhân tố, số quan trọng chuỗi đặc biệt chọn cho nuôi cấy, cấu tạo chất, thông số môi trường nuôi cấy (như nhiệt độ hàm lương ôxy) khoảng thời gian mà tăng trưởng Khi tất điều kiện xác, có 5% chất dư thừa chất rắn tăng trưởng đa dạng, 95% nguyên liệu Cordyceps (Đông trùng hạ thảo) bao gồm tất hợp chất thêm tế bào Khi nuôi cấy theo cách chất lượng thực cao, thường vượt hiệu so với Cordyceps (Đông trùng hạ thảo) thu thập từ thiên nhiên nhân tố gấp lần Vì thời gian nuôi cấy yêu cầu dài để sản sinh Cordyceps (Đông trùng hạ thảo) phương pháp nhân tạo nên thị trường giá bán đắt Trong số trường hợp chất ngũ cốc dư thừa có Cordyceps (Đông trùng hạ thảo) chất rắn lớn 80% Hiện phân tích chuẩn loại nấm Đông trùng hạ thảo chuyện tầm thường, trở lên ngày nhiều, ngày có nhiều người giáo dục theo cách sử 23 dụng tiềm loại thảo dược Thời gian trôi đi, mong đợi nhìn thấy toàn chất lượng Cordyceps (Đông trùng hạ thảo) nuôi cấy tiếp tục tăng 2.3 Môi trường điều kiện nuôi cấy Về vật liệu (môi trường), để gìn giữ môi trường nuôi cấy gốc, người ta trộn lẫn thạch trắng dinh dưõng thông thường Đáng ý Cordyceps (Đông trùng hạ thảo) luôn nhanh thích nghi với môi trường mới, mà có tốt có cáí xấu Cái tốt môí trường hỗ trợ cho mức tăng trưởng, xấu sinh vật nhanh chóng phát triển qua hệ enzym đặc trưng đặc tính môi trường đặc biệt đó, điều dẫn đến việc môi trường nuôi cấy bị tăng trưởng mạnh mẽ thời gian chuyển sang môi trường khác Điều dẫn đến già yếu môi trường nuôi cấy ban đầu Cách dễ xung quanh vấn đề thách thức liên miên môi trường cách chuyển sang môi trường với hệ liên tiếp Theo cách này, môi trường bắt buộc phải gìn giữ phổ enzym tiêu hoá rộng để giải nguồn thức ăn đa dạng xảy nhiều thiên nhiên Nó cần giúp đỡ việc đưa vào số chất cuối Cordyceps (Đông trùng hạ thảo) nuôi môi trường ổn định Ví dụ, Cordyceps (Đông trùng hạ thảo) nuôi cấy chất gạo vàng, cần thêm thạch trắng mà môi trường dự trữ Một số số môi trường thạch trắng dinh dưỡng tìm thấy hỗ trợ cho mức tăng trưởng tốt nấm là: chất thạch trắng có chiết xuất từ mạch nha chuẩn, chất thạch trắng dextrose từ khoai tây chuẩn, thạch trắng catfood (l0g catfood khô 20gam thạch trắng lít nước) Thạch trắng dogfood (l0g dogfood khô 20g thạch trắng lít nưốc) Thạch trắng ovaltin (l0g ovaltin khô 20gam thạch trắng lít nước) Về chất: chất sử dụng cho việc nuôi cấy bán Cordyceps (Đông trùng hạ thảo) ban đầu từ xác nhộng tằm (ở Trung Quốc, Hàn Quốc Nhật Bản), hay từ hạt ngũ cốc nước châu Âu châu Mỹ Trong hai chất tốt để sản xuất Cordyceps (Đông trùng hạ 24 thảo) chất lượng cao Những chất có nguồn gốc từ côn trùng, thực mà nói không cho phép Mỹ hướng dẫn FDA Những chất sử dụng để nuôi cấy Cordyceps(đông trùng hạ thảo) trở nên ngày chuẩn hoá nhà nuôi cấy Các hạt ngũ cốc trở thành loại chiếm ưu Về nhiệt độ: nhiệt độ tối ưu cho mức tăng trưởng nấm phụ thuộc vào mục đích nhà nuôi cấy, 21°-27°C cho việc nhanh sản sinh, hay 3-5°C cho mức tăng trưởng chậm nhấn mạnh việc sản xuất hợp chất y học quan trọng Cordycepin (3’ deoxyadenosine) hay Hydroxyethyladenosin Về độ ẩm tương đối: 95 – 100% với hàm lượng ẩm chất 4550% cho mức tăng trưỏng chất rắn Về khoảng thời gian: môi trường chất lỏng, việc sản xuất khuẩn ty thoả mãn xảy 84-96 nuôi 2122°C với không khí độ nóng vừa đủ Nếu nhiệt độ môi trưởng tăng giảm xuống đến 4°c, chu kỳ tăng trưởng kéo dài khoảng 70 ngày để đạt số lương cân khuẩn ty, sản sinh đậm đặc Cordycepin lớn nhiều lần Trong môi trường chất rắn, việc thu hoạch khuẩn ty thường thường ngày 18 ngày 25, trừ việc sản xuất hợp chất quan trọng đặc biệt khác mục tiêu, nơi mà trường hợp mức tăng trưởng lên đến 180 ngày, hay chí lâu tùy thuộc vào mục đích hợp chất mong muốn Về đậm đặc tối ưu CO2: điều hoàn toàn phụ thuộc vào kết mong muốn mức tăng trưởng Trong Cordyceps (Đông trùng hạ thảo) trồng điều kiện ưa khí kị khí, chất chuyến hoá thứ cấp khác hoàn toàn tăng trưởng điều kiện khác Mỗi nhà nuôi cấy có hệ thống riêng mình, người khác người Một số nhà nuôi cấy nhận thấy việc cô đặc CO2 thấp mức ban đầu, nhờ có việc sản sinh loại hợp chất adanosin, môi trường có nồng độ CO CO2 cao sản xuất thành phẩm chất lượng cao Rất khó để khái quát hoá cô đặc tối 25 ưu khí hoạt tính chuyển hoá việc nuôi cấy Cordyceps (Đông trùng hạ thảo), điều phụ thuộc nhiều vào mong muốn hợp chất Về ánh sáng: yêu cầu Việc hình thành nấm dạng thể: áp dụng, dạng sản phẩm thường thu hoạch nuôi cấy khuẩn ty (sợi nấm) 3.Nghiên cứu khả sinh tổng hợp polysaccharide từ nấm Cordyceps 2.3 Đặc điểm plysaccharide Có nhiều polysaccharide chủng Cordyceps spp Wang tìm hàm lượng polysaccharide chứa sợi nấm C.sinensis 157,3 mg/g so sánh hàm lượng đường tổng thể trùng thể có chút khác tương ứng 24,2 24,9%, hàm lượng sợi nấm cao chiếm 39,4% Theo phương pháp đo màu sử dụng sulfuric acid (Dubois, 1956) lại thấy hàm lượng polysaccharides C.sinensis C.hawkesii 3,5% 0,7%, thấp so với C.sinensis C.militaris cho chủng thích hợp chi nấm Cordiceps, chúng nuôi cấy tốt môi trường rắn lỏng Huang cộng nghiên cứu thành phần thểvà sợi nấm C.militaris nhận thấy hàm lượng đường tổng 260,64 389,47 mg/g, giảm hàm lượng đường thể lại cao sợi nấm thu nhận từ tự nhiên nuôi nhân tạo So sánh hàm lượng polysaccharide chứa thể nhộng tằm Cordyceps, chất nền, hạch nấm sợi nấm thấy polysaccharide cao thể, sau chất hạch nấm Trong môi trường nhân tạo, lượng polysaccharide sinh khối khô 0,14% 3.2 Đặc tính chống ung thư polysaccharide 26 Đặc tính kháng khối u polysaccharide bị ảnh hưởng kích thước phân tử, mức độ phân nhánh, hình thức khả hòa tan nước Nói chung polysaccharide cành có trọng lượng phân tử lớn hòa tan nước tốt có khả kháng khối u cao Một số nghiên cứu thu khả kháng khối u phức hợp polysaccharide liên kết với protein tách từ phần khác nấm Cordyceps số dạng khối u cho thấy, polysaccharide cho hoạt động kháng khối u cao có nguồn gốc từ thể, heteropolysaccharides có khối lượng phân tử khoảng 10-103 Da, có chứa galactose, glucose, mannose fucose Ngoài ra, số polysaccharide chứa hoạt tính cao tách từ khuẩn ty dạng sợi nấm chủ yếu glucans chứa protein có trọng lượng phân tử khoảng 10-103 Da Hầu hết polysaccharide công bố có hoạt động kháng u biết có cấu trúc β-glucans khác loại hình liên kết guclosidic Do hoạt hoạt động chống khối u đòi hỏi có cấu trúc đặc trưng liên kết β(1->3)trong chuỗi glucansvà thêm vào nhánh β-(1->6) Nếu β-glucan chủ yếu mạch thẳng, mạch nhánh không dài, chúng cho thấy hoạt động chống ung thư 27 PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1.Vật liệu nghiên cứu Chủng nấm FNA5 thuộc chi Cordyceps nhận từ sưu tập chủng giống phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam 3.2 Hóa chất Các loại hóa chất sử dụng thí nghiệm bao gồm: - Glucose Peptone, cao nấm men Muối khoáng: MgSO4.7H2O, K2HPO4, KH2PO4, vi lượng NaOH, HCl, H2SO4 98%, phenol 80%, ethanol 80% Đệm TE, đệm lyzozyme, enzyme proteinase K, ni tơ lỏng, EDTA, Tris-HCl, SDS - Chloroform : isoamylalcolhol (24:1), isopropanol - Agar - Nước cất, nước de-ion 3.3 Dụng cụ thiết bị sử dụng nghiên cứu 3.3.1 Dụng cụ - Bình thủy tinh loại 250 ml, 500ml, bình tam giác - Ống nghiệm, que cấy, đĩa petri, ống đong, giấy quỳ, màng bọc nilon - Pipet 200µl, 1000µl, 5000µl 3.2 Thiết bị 28 Bảng 3.1 Một số thiết bị thường sử dụng nghiên cứu Thiết bị Tủ ấm Tủ cấy vô trùng Nồi hấp trùng Cân phân tích Máy ly tâm Tủ lạnh Máy vontex Máy lắc Tủ hút Lò vi sóng Tủ sấy Nồi đun Nơi sản xuất 3.3.3 Môi trường Bảng 3.2 Một số môi trường nuôi cấy Thành phần Glucose Peptone Cao nấm men K2HPO4 KH2PO4 MgSO4.7H2O Vi lượng MT3 + + Môi trường (g/l) MT4 + + + MT4 TT + + + + + + + + + + 3.4 Phương pháp nghiên cứu 3.4.1 Phương pháp thu nhận hợp chất sinh học Dịch sau lên men Lọc Dịch lọc Sinh khối Sấy, nghiền 29 EtOH 95%, 1:5, 24h Bột sinh khối Nước, 100oC,1h Đo OD Thu sinh khối Nước cất Dịch chiết nước Dịch chiết Et Chủng Cordyceps spp sau lên men 10 ngày điều kiện 25 oC, tốc độ lắc 150 rpm dừng lên men để thu nhận hợp chất sinh học theo sơ đồ hình Dịch sau lên men đun sôi 100oC, vòng giờ, sau lọc qua giấy lọc có đường kính lỗ lọc 25µm, thu dịch lọc sinh khối giấy lọc Phần dịch sau lọc thu sử dụng để xác định polysaccharide ngoại bào theo bước : Bước 1: Bổ sung ethanol 95% vào dịch sau lọc theo tỷ lệ 4:1 Bước 2: Hỗn hợp sau bổ sung cồn lắc giữ nhiệt độ 10 oC 24h Bước 3: Dịch sau giữ lạnh ly tâm 10 000 vòng/phút 10 phút, oC để thu sinh khối Bước 4: Sinh khối thu đem làm khô nhiệt độ phòng để loại bỏ hết phần ethanol sau hòa với nước cất theo tỷ lệ 1:1(w/v) Dịch thu dùng để xác định polysaccharide Đối với phần sinh khối sau lọc rửa lại ba lần với nước cất, sau đem sấy khô đến lượng không đổi xác định khối lượng thu Phần sinh khối sau sấy khô nghiền nhỏ Để xác định polysaccharide sinh khối tiến hành theo bước sau: Bước 1: Phần sinh khối sau nghiền bổ sung nước cât với tỷ lệ 1:5 Bước 2: Hỗn hợp dịch sau bổ sung nước đun 100 oC vòng Bước 3: Dịch sau đun sôi ly tâm loại bỏ phần sinh khối giữ lại phần dịch Phần dịch dùng để xác định hàm lượng polysacchaside với bước lặp lại phần 3.4.2 Phương pháp xác định polysaccharide Hàm lượng polysaccharide xác định theo phương pháp sử dụng sulfuric acid phenol đo màu OD 480 nm Đối với loại đường đơn giản, 30 oligosaccharides, polysaccharide dẫn xuất chúng, bao gồm gốc methyl ether tự tự sau xử lý với phenol sulfuric acid đặc cho màu cam vàng Phản ứng nhạy màu ổn định Bằng việc sử dụng phenol – sulfuric acid cho phản ứng, phương pháp cho phép phát định lượng đường nhỏ Khi sử dụng kết hợp với sắc ký giấy phương pháp trở nên ưu việt cho xác định thành phần polysacharide dẫn xuất mrthyl chúng Các bước tiến hành: - - Sử dụng piptette hút 0,5 ml dịch cần xác định polysaccharide cho vào ống nghiệm có nắp, thí nghiệm lặp lại ba lần ( lượng đường mẫu cần xác định có nồng độ khoảng từ 0,5-50µg) (được thực box hút) Hút tiếp 0,5 ml dung dịch phenol 5% cho vào ống nghiệm Sau bổ sung 2,5 ml sulfuric acid đặc với d = 1.84 g/ml Đóng nắp ống nghiệm, lắc ống để phản ứng xảy phản ứng xảy trình tỏa nhiệt tỏa mạnh mẽ, ống nghiệm làm nguội nhanh nước tới nghiệt độ phòng, để yên vòng 20 phút, sau tiến hành đo OD bước sóng 480 nm Mẫu đối chứng thay dung dịch nước cất Hàm lượng polysaccharide mẫu thí nghiệm tính toán theo công thức dựa bảng chuẩn (Dubois, 1956) Công thức tính hàm lượng polysaccharide: Trong đó: γ - Tổng polysaccharide dịch cần xác định (µg) y - Giá trị OD dung dịch sau trừ mẫu trắng D - Hệ số pha loãng 0.0166 - Giá trị độ hấp phụ (tra bảng) 34.36 - Giá trị tra bảng 3.5 Bố trí thí nghiệm khảo sát sinh tổng hợp polysaccharide 3.5.1 Khảo sát nồng độ glucose tới khả sinh tổng hợp polysaccharide - Môi trường khảo sát: MT3 - Bố trí thí nghiệm: + Chuẩn bị 11 bình loại nhỏ nút + Cân: Pepton 16,5g; KH2PO4 0,55g; K2HPO4 0,55g; MgSO4.7H2O 0,55g 31 Hòa tan hoàn toàn 800 ml nước ấm, thêm nước vừa đủ 880 ml môi trường thiếu glucose + Rót vào 11 bình, bình 80ml môi trường thiếu glucose, đánh số từ 1D đến 11D + Cân Glucose bổ sung vào bình tương ứng: Bình Glucose (g) 1D 0.5 2D 1.0 3D 1.5 4D 2.0 5D 2.5 6D 3.0 7D 3.5 8D 4.0 9D 4.5 10D 5.0 + Sau đường lắc đều, bổ nước máy lên thể tích đến 100 ml/bình ống đong + Thanh trùng môi trường; để nguội + Cấy chủng C5 từ môi trường (MT3) nuôi từ trước cấy vào bình 2ml giống + Đặt bình máy lắc phòng lạnh 3.5.2 Khảo sát nồng độ Peptone tới khả sinh tổng hợp polysaccharide - Môi trường khảo sát: MT3 - Bố trí thí nghiệm: + Chuẩn bị 11 bình loại nhỏ nút + Cân Glucose 44g; KH2PO4 0,55g; K2HPO4 0,55g; MgSO4.7H2O 0,55g Hòa tan hoàn toàn 700 ml nước ấm, thêm nước vừa đủ 770 ml môi trường thiếu pepton + Dùng ống đong rót vào 11 bình, bình 70ml môi trường thiếu Pepton, đánh số từ 1P đến 11P + Cân 12 g Pepton hòa tan 40 ml nước nóng, lên thể tích nước nóng đạt 60 ml, bổ sung pepton vào bình tương ứng: Bình Pepton 1P 0.0 2P 0.5 3P 1.5 4P 2.5 5P 3.5 32 6P 4.5 7P 5.5 8P 6.5 9P 7.5 10P 9.5 11P 9.5 11D 5.5 e (ml) + Lắc đều, dùng ống đong bổ sung thêm nước vào đảm bảo bình đạt thể tích 100ml/ bình + Thành trùng môi trường, để nguội + Cấy chủng C5 từ môi trường (MT3) nuôi từ trước cấy vào bình 2ml giống + Đặt bình máy lắc phòng lạnh 3.5.3 Khảo sát nồng độ KH2PO4 tới khả sinh tổng hợp polysaccharide - Môi trường khảo sát: MT3 - Bố trí thí nghiệm: + Chuẩn bị bình loại nhỏ nút + Cân Glucose 32g; Pepton 12g; K2HPO4 0,4g; MgSO4.7H2O 0,4g Hòa tan hoàn toàn 500 ml nước ấm, thêm nước vừa đủ 640 ml môi trường thiếu KH2PO4 +Rót vào bình, bình 80ml môi trường thiếu KH 2PO4 , đánh số từ 1K đến 8K + Cân 6,4 g KH2PO4 hòa tan 50ml nước ấm, lên thể tích nước ấm để đạt 64ml + Rót dung dịch vào bình tương ứng: Bình KH2PO4 (ml) 1K 1.0 2K 3.0 3K 5.0 4K 7.0 33 5K 9.0 6K 11.0 7K 13.0 8K 15.0 + Dùng cốc đong bổ sung thêm nước vào đảm bảo bình đạt thể tích 100ml/ bình + Thành trùng môi trường, để nguội + Cấy chủng C5 từ môi trường (MT3) nuôi từ trước cấy vào bình 2ml giống +Đặt bình máy lắc phòng lạnh 3.5.4 Khảo sát nồng độ K2HPO4 tới khả sinh tổng hợp polysaccharide - Môi trường khảo sát: MT3 - Bố trí thí nghiệm: + Chuẩn bị bình loại nhỏ nút + Cân Glucose 32g; Pepton 12g; KH2PO4 0,4g; MgSO4.7H2O 0,4g Hòa tan hoàn toàn 500 ml nước ấm, thêm nước vừa đủ 640 ml môi trường thiếu K2HPO4 + Rót vào bình; bình 80ml môi trường thiếu K 2HPO4 , đánh số từ 1K đến 8K + Cân 6,4 g K2HPO4 hòa tan 50ml nước ấm, lên thể tích nước ấm để đạt 64ml Rót dung dịch vào bình tương ứng: Bình K2HPO4 (ml) 1K2 1.0 2K2 3.0 3K2 5.0 4K2 7.0 5K2 9.0 6K2 11.0 7K2 13.0 + Lắc đều, bổ sung thêm nước vào đảm bảo bình đạt thể tích 100ml/ bình + Thanh trùng môi trường, để nguội 34 8K2 15.0 +Cấy chủng C5 từ môi trường (MT3) nuôi từ trước cấy vào bình 2ml giống +Đặt bình máy lắc phòng lạnh 3.5.5 Khảo sát nồng độ MgSO4.7H2O tới khả sinh tổng hợp polysaccharide - Môi trường khảo sát: MT3 - Bố trí thí nghiệm: + Chuẩn bị bình loại nhỏ nút +Cân Glucose 32g; Pepton 12g; KH2PO4 0,4g; K2HPO4 0,4g Hòa tan hoàn toàn 500 ml nước ấm, thêm nước vừa đủ 640 ml môi trường thiếu MgSO4.7H2O +Rót vào bình; bình 80ml môi trường thiếu K 2HPO4 , đánh số từ 1M đến 8M +Cân 6,4 g MgSO4.7H2O hòa tan 50ml nước ấm, lên thể tích nước ấm để đạt 64ml Rót dung dịch vào bình tương ứng: Bình MgSO4.7H2O (ml) 1M 1.0 2M 3.0 3M 5.0 4M 7.0 5M 9.0 6M 11.0 7M 13.0 8M 15.0 + Lắc đều, bổ sung thêm nước vào đảm bảo bình đạt thể tích 100ml/ bình + Thanh trùng môi trường, để nguội + Cấy chủng C5 từ môi trường (MT3) nuôi từ trước cấy vào bình 2ml giống + Đặt bình máy lắc phòng lạnh 35 36 [...]... trí thí nghiệm khảo sát sự sinh tổng hợp polysaccharide 3.5.1 Khảo sát nồng độ glucose tới khả năng sinh tổng hợp polysaccharide - Môi trường khảo sát: MT3 - Bố trí thí nghiệm: + Chuẩn bị 11 bình loại nhỏ và nút bông sạch + Cân: Pepton 16,5g; KH2PO4 0,55g; K2HPO4 0,55g; MgSO4.7H2O 0,55g 31 Hòa tan hoàn toàn trong 800 ml nước ấm, thêm nước vừa đủ 880 ml môi trường thiếu glucose + Rót vào 11 bình, mỗi... ăn và rò rỉ ra khỏi hợp chất bức vách tế bào để tiêu hoá thức ăn đó, sau đó nó ứa ra các hợp chất khác đóng vai trò như là các phân tử chuyến tiếp, cái thì đưa dưỡng chất trở lại bức vách tế bào và đi vào các tế bào để sử dụng Và trong khi tất cả rò rỉ các hợp chất kháng vi sinh vật để giữ cho các cơ quan khác cạnh tranh về thức ăn với nó (có những hợp chất đề cập đến như là kháng sinh) Và các hợp. .. cấy Cordyceps (Đông trùng hạ thảo), vì điều đó phụ thuộc quá nhiều vào sự mong muốn hợp chất chính Về ánh sáng: không có yêu cầu Việc hình thành nấm dạng quả thể: có thể áp dụng, dạng của sản phẩm thường được thu hoạch trong nuôi cấy là khuẩn ty (sợi nấm) 3 .Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp polysaccharide từ nấm Cordyceps 2.3 Đặc điểm của plysaccharide Có rất nhiều polysaccharide trong các chủng Cordyceps. .. nucleotide trong Cordyceps khi nuôi trong môi trường rắn 1.1.6 Các hợp chất có hoạt tính chống oxy-hoá của Cordyceps spp Hoạt tính chống oxy-hóa là hoạt tính sinh học quan trọng xuất hiện trong các chủng thuộc ngành nấm Basidiomycetes Mặc dù đã có nhiều nhà nghiên cứu đã khảo sát đặc tính chống oxy-hóa phổ rộng của các quả thể nấm, nhưng chỉ có số ít được chú ý và tiến hành thu nhận các chất chống oxy... là chất nền và hạch nấm Trong môi trường nhân tạo, lượng polysaccharide trong sinh khối khô là 0,14% 3.2 Đặc tính chống ung thư của polysaccharide 26 Đặc tính kháng khối u của các polysaccharide có thể bị ảnh hưởng bởi kích thước phân tử, mức độ phân nhánh, hình thức và khả năng hòa tan trong nước Nói chung các polysaccharide cành có trọng lượng phân tử lớn và hòa tan trong nước tốt có khả năng kháng... + + + + + + 3.4 Phương pháp nghiên cứu 3.4.1 Phương pháp thu nhận các hợp chất sinh học Dịch sau lên men Lọc Dịch lọc Sinh khối Sấy, nghiền 29 EtOH 95%, 1:5, 24h Bột sinh khối Nước, 100oC,1h Đo OD Thu sinh khối Nước cất Dịch chiết nước Dịch chiết Et Chủng Cordyceps spp sau khi lên men 10 ngày ở điều kiện 25 oC, tốc độ lắc 150 rpm dừng lên men để thu nhận các hợp chất sinh học theo sơ đồ hình Dịch sau... Nấm Cordyceps spp được đánh giá cao về giá trị dinh dưỡng trong sản xuất thực phẩm chức năng và sản xuất thuốc trong phòng và chữa bệnh Chúng chứa rất nhiều loại đường, bao gồm mono-, di- và oligosaccharide, và nhiều polysaccharides phức tạp (gồm có cyclofurans (đường có 5C, mạch vòng, chưa rõ chức năng) , beta-glucans, beta-mannans, và phức hợp polysaccharides có cả đường 5 và 6C cùng tham gia vào các. .. nấm đã tiết ra rất nhiều chất sinh học từ ngoại tế bào có hoạt tính sính học vào xác sâu và sâu như cái kho chứa đựng các chất trên, về mặt acid amin có trong nấm và sâu của Đông trùng hạ thảo Isaria sp., các nghiên cứu cho thấy ở nấm và sâu đều có 17 acid amin và hàm lượng không khác nhau mấy Vởi lý do trên đã giải thích tại sao Đông trùng hạ thảo hoang dại dùng cả con tốt hơn loại nuôi trồng chỉ dùng... vào từng bình tương ứng: Bình KH2PO4 (ml) 1K 1.0 2K 3.0 3K 5.0 4K 7.0 33 5K 9.0 6K 11.0 7K 13.0 8K 15.0 + Dùng cốc đong bổ sung thêm nước vào đảm bảo mỗi bình đạt được thể tích 100ml/ bình + Thành trùng môi trường, để nguội + Cấy chủng C5 từ môi trường (MT3) đã nuôi từ trước cấy vào mỗi bình 2ml giống +Đặt các bình trên máy lắc trong phòng lạnh 3.5.4 Khảo sát nồng độ K2HPO4 tới khả năng sinh tổng hợp. .. nuôi cấy tốt trong môi trường rắn hoặc lỏng Huang và cộng sự đã nghiên cứu các thành phần của quả th và sợi nấm của C.militaris và nhận thấy rằng hàm lượng đường tổng là 260,64 và 389,47 mg/g, nhưng sự giảm hàm lượng đường trong quả thể lại cao hơn trong sợi nấm khi thu nhận từ tự nhiên và nuôi nhân tạo So sánh hàm lượng polysaccharide chứa trong quả thể nhộng tằm Cordyceps, chất nền, hạch nấm và sợi