KẾT HỢP KHÁNG NGUYÊN-KHÁNG THỂ PGS.TS Đỗ Hoà Bình MỤC TIÊU • Trình bày đặc tính lực liên kết phản ứng kết hợp kháng nguyên (KN)-kháng thể (KT) • Trình bày nguyên lý loại phản ứng tủa • Trình bày nguyên lý loại phản ứng ngưng kết • Trình bày loại miễn dịch đánh dấu 30/1/2007 ĐẠI CƯƠNG 1.1 Ba đặc tính phản ứng kết hợp KN-KT • Đặc hiệu: KT kết hợp đặc hiệu với KN Ứng dụng nhiều chẩn đoán bệnh nghiên cứu • Thuận nghịch: Kết hợp phân ly, cấu trúc KN KT không thay đổi Sự phân ly phụ thuộc vào số yếu tố pH, nồng độ muối, nhiệt độ • Tạo nhiệt: 2-4Kcal/mol 30/1/2007 1.2 Các lực liên kết KN-KT Là lực hóa lý thông thường, gặp liên kết enzymecơ chất, hocmon với receptor… Các lực Nguồn gốc Lực hút tĩnh điện Tương tác nhóm mang điện trái dấu Cầu nối hydro Hydro liên kết với nguyên tử mang điện âm (N,O) Lực Van der Waal Chuyển động đám mây điện tử xung quanh phân tử làm cho phân tử có cực Lực hút kỵ nước 30/1/2007 Các nhóm kỵ nước gần tương tác giải phóng phân tử H20 1.3 Khái niệm epitop paratop • Epitop vị trí kháng nguyên kết hợp trực tiếp với kháng thể Có nhiều loại epitop khác (xem hình) Paratop vị trí kháng thể kết hợp với kháng nguyên KN nhỏ: epitop; Vị trí KHKN: KN epitop;KHKN: KN trung vừa: 6bình: epitop; Vị trí KHKN: 44 KN lớn: 10 epitop; Vị trí KHKN: KHKN: 30/1/2007 1.4 Ái tính háo tính 1.4.1 Ái tính (affinity) KTvới KN biểu thị tổng hợp tất lực liên kết paratop với epitop KT + KN [KN.KT] [KN]x[KT] KN-KT K K: số kết hợp 30/1/2007 Sự kết hợp phân ly KN đơn hóa trị Sự kết hợp phân ly KN đa hóa trị 1.4.2 “Háo tính”(avidity) KT biểu thị tất lực liên kết KT KN đa hóa trị • Háo tính phụ thuộc vào số epitop KN số hóa trị KT (IgG, IgM ), pH, lực, nhiệt độ số kết hợp • Ái tính có ý nghĩa lý thuyết, háo tính có ý nghĩa thực tế 30/1/2007 Sự kết hợp phân ly KN đơn hóa trị Sự kết hợp phân ly KN đa hóa trị CÁC LOẠI PHẢN ỨNG KẾT HỢP KN-KT • Phản ứng tủa • Phản ứng ngưng kết • Phản ứng miễn dịch đánh dấu 30/1/2007 2.1 Phản ứng tủa Nguyên lý chung Các loại phản ứng tủa: • Môi trường lỏng • Môi trường gel 30/1/2007 Thừa KT Tương đương Thừa KN Lượng KT ngưng kết Các KN hoăăc KT dạng hòa tan kết hợp với KT hoăăc KN đặc hiệu tương ứng tạo thành phức hợp miễn dịch (tủa) nhìn thấy Lượng KN thêm vào 2.1.1 Phản ứng tủa môi trường lỏng để phát KN KT (Định tính) 2.1.1.1 Vòng tủa môi trường lỏng - Cho KT vào ống nghiê m ă - Nhỏ từ từ KN lên lớp KT - Vòng tủa xuất hiêăn lớp KN KT (ống 5) - Các ống chứng: 1,2,3,4: 30/1/2007 Vòng tủa Mancini- KN: HT ngựa bình thường+ KT kháng chuỗi gamma - Gel chứa KT - A6 - A1:HT ngựa: Không pha loãng, ½, ¼ … - C: Các mẫu HT ngựa cần định lượng IgG A B Nồng đôă IgG (mg/ml) - B: IgG ngựa tinh khiết biết nồng đôă (từ trái sang phải: 30,15,7,2 15 mg/ml) C Đường kính vòng tủa (mm) 30/1/2007 Điện di tên lửa Nguyên lý: • KN di chuyển điện trường gặp KT tương ứng gen tạo vòng tủa hình “tên lửa” Chiều dài hình “tên lửa” tỉ lệ thuận với nồng độ KN, kết đọc sau 2-6 thay 48 Mancini Tiến hành • Điều chế gen thạch chứa KT: Đun sôi cách thủy gen thạch tan đều, để gen thạch KT vào nồi ấm cách thủy 56độ C Cho KT vào gen thạch theo tỉ lệ 2-5% • Đổ gen thạch chứa KT lên lam kính cho lớp gen thạch có độ dày 2mm, để nhiệt độ phòng 20-30 phút, sau để 4độ C cho đông • Dùng khuôn có đường kính 2mm đục lỗ gen thach(khoảng cách lỗ 7-8mm tùy nồng độ KN) • Cho vào lỗ Dd cần thử nồng độ KN chuẩn tương ứng biết để vẽ đường chuẩn • Để lam thạch vào máy điện di, KN di chuyểntrong điện trường gặp KT tương ứng gen tạo vòng tủa hình “tên lửa” Đọc kết quả: • Sau 2-6 thay 48 Mancini Chiều dài hình “tên lửa” tỉ lệ thuận với nồng độ KN 30/1/2007 Điện di tên lửa KT trộn gel Nồng đôă KN 30/1/2007 Nơi đặt mẫu Điện di miễn dịch hai chiều KT trộn gel 30/1/2007 2.2 Phản ứng ngưng kết 2.2.1 Nguyên lý chung: KN nằm bề mặt tế bào (hồng cầu, bạch cầu…) hạt nhân tạo mang kháng nguyên kết hợp với KT đặc hiệu tạo thành mạng lưới KN-KT (ngưng kết) quan sát 30/1/2007 2.2.2 Các loại ngưng kết: – Chủ động (KN tế bào hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, tinh trùng…) – Thụ động (KN KT gắn nhân tạo lên hạt … Khi KN gắn lên hạt nhân tạo HC nhóm O, HC cừu hạt latex phản ứng gọi ngưng kết thụ động thuận, KT gắn lên hạt gọi thu động ngược) 30/1/2007 2.2.3 Một số ví dụ • Ngưng kết chủ động (xác định nhóm hồng cầu) Các loại hồng Các loạicầu hồng cầu Các cấu trúc cacbohydrat Các loại HT HT mẫu KTK A&B KTK B KTK A Không KTK A&B 30/1/2007 Trực tiếp Gián tiếp Mẹ Rh-, Con Rh+ • Nghiệm pháp Cooms trực tiếp gián tiếp HC con+KT mẹ Huyết mẹ Thêm HC Rh+ rửa KT không gắn +KT thỏ kháng Ig người +KT thỏ kháng Ig người 30/1/2007 Ngưng kết Phản ứng miễn dịch đánh dấu Nguyên lý chung KN KT gắn với chất “đánh dấu”(enzym, chất màu huỳnh quang, phóng xạ) làm tăng khả nhận biết phức hợp KN-KT lên nhiều lần 30/1/2007 Đặc điểm: • Độ nhạy cao: phát phân tử KN KT nồng độ mật độ thấp • Các chất đánh dấu không làm biến tính KN KT không dễ bong • Thường phải đọc kết thiết bị chuyên dụng 30/1/2007 Các loại kỹ thuật đánh dấu 3.1 Kỹ thuật MD huỳnh quang Nguyên lý: Phát phản ứng MD nhờ đánh dấu chất màu huỳnh quang, sau quan sát phản ứng KN-KT kính HVHQ Nhận định kết (hình vẽ) Ánh sáng kích thích 30/1/2007 Ánh sáng phát Các loại kỹ thuật MDHQ • MDHQ trực tiếp: Xác định kháng nguyên bề mặt tế bào lát cắt tổ chức • MDHQ gián tiếp: Phát kháng thể có huyết mẫu thử • Kỹ thuật bánh kẹp “Sandwich”: phát kháng nguyên huyết mẫu thử 30/1/2007 3.2 Kỹ thuật ELISA lý: Phát phản ứng MD nhờ đánh dấu enzyme, sau quan sát phản ứng KN-KT mắt thường máy Thêm KT kháng A gắn Enzyme Nguyên Mẫu 1: KN A Mẫu 2: KN B Rửa KT Ko gắn Một số kỹ thuật ELISA thường dùng + Gián tiếp: phát KT/ huyết người thử bệnh nhân + Sandwich: phát KN/ huyết người thử bệnh nhân 30/1/2007 Enzyme phân hủy chất, tạo màu Đo độ hấp phụ ánh sáng 3.3 Kỹ thuật MD phóng xạ • Nguyên lý:Tương tự hai kỹ thuật khác chất đồng vị phóng xạ (thimidin H3, Cacbon 14 ) 30/1/2007 30/1/2007