Ảnh hưởng tannin chiết xuất từ thân chè kết hợp với biochar bổ sung vào phần sở đến tiêu hóa cỏ lượng methane thải điều kiện in vitro 10.1 Ngoài nước (phân tích, đánh giá tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực đề tài giới, liệt kê danh mục công trình nghiên cứu, tài liệu có liên quan đến đề tài trích dẫn đánh giá tổng quan) Chăn nuôi đóng góp khoảng 16% tổng khí methan hành tinh, đứng sau nhiên liệu hóa thạch đất ngập nước (Johnson & Johnson, 1995), khoảng 74% khí methan từ chăn nuôi chăn nuôi gia súc nhai lại gây (Tamminga cs., 1992) Chiến lược chủ yếu giảm thải khí methan từ bò sữa cải tiến chất lượng phần tăng hiệu sản xuất sữa (Bell cs., 2008) Cải tiến chất lượng phần giải pháp ngắn hạn, tăng hiệu sản xuất sữa giải pháp chiến lược Methane thải từ bò sữa giảm theo hàm mũ tăng suất sữa/bò sữa/năm (Garnsworthy, 2004) Giảm đầu con, tăng suất sữa/bò/năm cách để giảm khí thải methan từ chăn nuôi bò sữa (O’Mara cs 2008) Cũng theo O’Mara cs., (2008) suất gia súc tăng lên thông qua dinh dưỡng tốt hơn, lượng cần cho trì tính theo tỷ lệ phần trăm tổng nhu cầu lượng giảm đi, CH4 với nhu cầu trì giảm, CH4/kg sữa thịt giảm Tương tự vậy, suất gia súc cải thiện, thời gian đạt khối lượng giết mổ giảm nên tổng CH4 cho đời gia súc giảm (O’Mara cs., 2008) Tuy nhiên, tăng suất gia súc, tuổi đời gia súc giảm, phải nuôi nhiều gia súc thay nên CH có lại tăng lên (O’Mara cs., 2008) Chiến lược giảm CH 4phải dựa toàn chu kỳ sản xuất gia súc (O’Mara cs., 2008) Chiến lược giảm CH4 cỏ tìm cách giảm tạo hydro, ngăn chăn hạn chế trình hình thành CH4, đưa hydro vào sản phẩm trao đổi chất khác tạo bể chứa hydro khác (O’Mara cs, 2008) Chiến lược dinh dưỡng giảm thiểu CH dựa sở nguyên lý (O’Mara cs, 2008) Từ nghiên cứu trước đây, nhà khoa học kết luận có nhiều loại giàu tannin bổ sung phần ăn gia súc nhai lại làm giảm phát thải khí methane hai điều kiện in vitro in vivo Trong điều kiện in vitro, bổ sung 20% Biophytum petersianum (có 4,3% tannin) Sesbania grandiflora (có 1,9% tannin) vào chất làm giảm từ 17 – 25% 9,2 -10,3% lượng methan thải mà không ảnh hưởng đến tỷ lệ tiêu hóa chất khô (Hariadi and Santoso, 2010) Trong điều kiện in vivo, Grainger cs (2009) bổ sung hai mức tannin (8,6 14,6 g/kg DMI) tách chiết từ Acacia mearnsii vào phần bò sữa chăn thả ăn 4,5 kg thức ăn tinh Kết cho thấy việc bổ sung làm giảm thiểu 11,5 28% methane thải ra, làm giảm tỷ lệ tiêu hóa phần Như vậy, tannin có ảnh hưởng tích cực tiêu cực tùy thuộc nguồn tỷ lệ bổ sung vào phần Điều quan trọng phải nghiên cứu đề tìm nguồn tỷ lệ bổ sung thích hợp để làm giảm lượng methan sản sinh lại không ảnh hưởng đến hệ vi sinh vật cỏ tỷ lệ tiêu hóa phần Nghiên cứu Makkar cs (1995) cho thấy gia súc ăn phần có chứa tannin mẻ rìu tổng số protozoa cỏ giảm đáng kể Các loài nhiệt đới chứa nhiều tannin Lotus pedunculatus sử dụng phần làm giảm tới 30% lượng methane thải (Waghorn cs., 2002; Woodward cs., 2004) thay loại thức ăn thô khác phần 10.2 Trong nước (phân tích, đánh giá tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực đề tài Việt Nam, liệt kê danh mục công trình nghiên cứu, tài liệu có liên quan đến đề tài trích dẫn đánh giá tổng quan) Trong năm gần đây, tổng đàn bò nước ta phát triển với tốc độ nhanh Năm 2004 Việt nam có gần 2,9 triệu bò đến năm 2010, tổng đàn bò nước ta 5,7 triệu Mặc dù ngành chăn nuôi bò phát triển với tốc độ nhanh đồng nghĩa với lượng khí CH thải môi trường từ chăn nuôi ngày lớn Nhưng nhiều lý khác như: kinh phí, người, trang thiết bị kỹ thuật nên đến có nghiên cứu thực để tìm giải pháp nhằm giảm thiểu khí methane sản sinh từ trình lên men cỏ Đinh Văn Tuyền cs (2010) sử dụng buồng hô hấp để xác định lượng methane sản sinh từ bò lai ½ HF cạn sữa bò lai ½ Red Angus trưởng thành ăn phần có mức bổ sung hạt khác thấy lượng methane hàng ngày dao động từ 300-320 l/con/ngày thí nghiệm Vũ Chí Cương cs (2011) sử dụng buồng hô hấp để có sai khác thống kê giống gia súc phần khác Trong đo lượng methane thải từ bò lai ½ HF tơ lỡ Nhưng số liệu sử dụng để xác định nhu cầu lượng cho trì mà không xử lý thống kê Việt Nam quốc gia giới bị ảnh hưởng nặng nề biến đổi khí hậu Xác định yếu tố mức độ ảnh hưởng để tìm chiến lược hạn chế vấn đề cấp bách giới nói chung Việt Nam nói riêng Trong chăn nuôi, methane loại khí có ảnh hưởng đứng thứ việc gây hiệu ứng nhà kính (nguyên nhân gây biến đổi khí hậu) phát thải lớn từ gia súc nhại lại Như vậy, cần có nghiên cứu để định lượng lượng methane thải từ động vật nhai lại, xây dựng chiến lược để hạn chế phát thải loại khí nhà kính Từ trước đến nay, lĩnh vực thức ăn chăn nuôi có hai quan điểm trái chiều vai trò tác dụng tannin Một số nhà khoa học cho tannin hợp chất kháng dinh dưỡng tannin kết hợp với protein thức ăn với enzym đường tiêu hoá làm giảm tỷ lệ tiêu hoá protein thức ăn, giảm thu nhận thức ăn, giảm sinh trưởng, giảm sản lượng vật nuôi (Dương Thanh Liêm, 2008) cần phải khắc phục ảnh hưởng có hại tannin cách xử lý kiềm (bổ sung urê) phối hợp thức ăn chứa tannin với sunphat sắt polyethilene glycol - 4000 (PEG-4000) (Vũ Duy Giảng, 2001) Ngược lại, theo Nguyễn Xuân Trạch (2003) lại cho bổ sung tannin vào phần ăn gia súc nhai lại mức thấp (20-40 g/kg vật chất khô thức ăn) làm tăng hiệu sử dụng protein gia súc Để đạt hai mục tiêu giảm thiểu methane trì tỷ lệ tiêu hóa phần, cần phải xác định nguồn tannin tỷ lệ bổ sung thích hợp vào phần ăn gia súc nhai lại Trong cây, phận tiếp xúc nhiều với ánh sáng mặt trời hàm lượng tannin cao Trong đó, Việt Nam nước nằm khu vực nhiệt đới, thời gian chiếu sáng năm lớn Hầu hết loài thực vật chứa hàm lượng tannin định Đặc biệt loài thực vật có vị chát hàm lượng tannin cao Ví dụ tannin chè chiếm 12,68% vật chất khô (Lê Tự Hải, 2010), keo tràm (Acacia auriculiformis) kim phượng (Bonducpina pulcierrina) có hàm lượng tannin 16,63 7,69% vật chất khô (Hồ Thị Liễu, 2004) Như ta sử dụng nguồn tannin sẳn có từ thực vật bổ sung vào phần ăn gia súc nhai lại để giảm thiểu khí methane Tính cấp thiết Trong năm qua, số lượng vật nuôi nói chung số lượng bò nói riêng có khuynh hướng tăng trưởng mạnh mẽ theo năm (Số lượng đàn bò thịt năm 2014 5,16 triệu con; bò sữa 227,6 nghìn con; đàn trâu 2,53 triệu – Tạp chí Chăn nuôi số 1-2015) Việc tăng trưởng mạnh mẽ số lượng bò thịt nguyên nhân chủ yếu dẫn đến tăng lượng chất thải từ chăn nuôi, đặc biệt nguồn khí gây hiệu ứng nhà kính phát từ cỏ Hàng năm sản xuất chăn nuôi, chủ yếu chăn nuôi gia súc nhai lại, tạo khoảng 86 triệu khí methane (CH 4), đóng góp tới 18% tổng lượng khí thải nhà kính (Steinfeld cs., 2006) Lượng methane có xu hướng ngày tăng số lượng gia súc tăng nhanh phạm vi toàn giới Theo Moss cs (2000) methane từ gia súc nhai lại chiếm khoảng 30-40% tổng lượng methane thải từ quan tiêu hóa động vật toàn cầu Việc phát thải khí nhà kính từ chăn nuôi có khuynh hướng gia tăng tăng số lượng quy mô chăn nuôi nhằm đáp ứng nhu cầu thịt, sữa ngày cao người (Leng, 2008) Methane sản sinh cỏ không gây nên hiệu ứng khí thải nhà kính mà methane kéo theo khoảng 10% lượng vật chủ (Moss cs, 2000) Do vậy, việc giảm lượng CH4 sản sinh cỏ không làm giảm thiểu khí thải gây hỉệu ứng nhà kính mà đóng góp làm tăng suất vật nuôi Để giảm thiểu khí methane cỏ có nhiều công trình nghiên cứu phần ăn tác giả như: Lovett cs, (2005) bổ sung thức ăn tinh, Ungerfeld cs (2005), Van Nevel Demeyer (1996) bổ sung mỡ phần Các kết qủa nghiên cứu cho thấy giảm từ 12 đến 37% phát thải khí methane cỏ sử dụng phần ăn nêu Việc sử dụng probiotic prebiotic phần ăn cho gia súc nhai lại (Mwenya cs, 2004; Takahashi cs, 2005) hướng nghiên cứu nhằm giảm giải phóng phân tử hydro tự thông qua thay đổi môi trường cỏ ức chế sản sinh acetate Một số hướng nghiên cứu khác thực như: bổ sung kháng sinh, axit hữu cơ, chiết suất từ thực vật (như tannin) vào phần ăn gia súc nhai lại hạn chế sản sinh khí methane từ cỏ Hiện tỉnh Thái Nguyên có diện tích chè lớn thứ nước (17.660 ha), huyện, thành thị có sản xuất chè Do thiên nhiên ưu đãi thổ nhưỡng đất đai, nguồn nước, thời tiết khí hậu, phù hợp với chè Vì nguyên liệu chè búp tươi Thái Nguyên có phẩm cấp, chất lượng cao Trong trình sản xuất, hàng năm, có lượng lớn thân chè già đốn chặt để tạo búp mầm mới, nguồn nguyên liệu quan trọng để chiết xuất tannin phương pháp thủ công, đơn giản Nguồn Tannin kết hợp với biochar phối trộn vào phần ăn gia súc nguồn thức ăn bổ sung cải thiện khả thu nhận thức ăn tỷ lệ tiêu hóa suất vật nuôi (Khang Wiktorsson, 2006) Tannin ảnh hưởng trực tiếp đến hình thành methane ảnh hưởng gián tiếp thông qua việc giảm số lượng động vật nguyên sinh vi khuẩn phân giải xơ cỏ (Ushida Jouany, 1996) Do đó, việc sử dụng tannin kết hợp với ure biochar phần ăn có khả làm giảm phát thải methane từ cỏ (Tiemann cs, 2008) mà trì tỷ lệ tiêu hóa phần Mục tiêu Xác định ảnh hưởng việc bổ sung tanin chiết xuất từ thân, chè biochar vào phần ăn đến khả giảm thiểu lượng khí methane thải môi trường từ cỏ đồng thời tăng tỷ lệ tiêu hóa VCK chất hữu bò Xác định phần ăn hợp lý bổ sung tannin chiết xuất từ thân, chè biochar chăn nuôi bò nhằm giảm thiểu lượng khí methane thải môi trường từ cỏ đồng thời trì hiệu sử dụng thức ăn cao Mục tiêu cụ thể: Xác định ảnh hưởng mức tannin biochar khác có ure bổ sung làm chất ảnh hưởng đến tổng lượng khí sản sinh,và tỷ lệ tiêu hóa điều kiện in vitro Xác định ảnh hưởng mức tannin biochar khác đến tỷ lệ tiêu hóa chất khô (VCK) chất hữu (CHC) điều kiện in vitro Xác định lượng methane (CH4) thải cỏ điều kiện in vitro mức tannin khác bổ sung vào mẫu thức ăn (khẩu phần ăn) Nội dung PP nghiên cứu 14 CÁCH TIẾP CẬN, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14.1 Cách tiếp cận Để phát triển chiến lược giảm thiểu khí methane sản sinh từ gia súc nhai lại, phải xác định lượng methane thải Hiện nay, có nhiều kỹ thuật khác sử dụng để đo lượng methan thải điều kiện in vitro từ cá thể hay nhóm động vật Mỗi phương pháp có ưu, nhược điểm riêng Trong năm gần đây, phương pháp sử dụng phổ biến để định lượng methane bao gồm: Kỹ thuật hô hấp nhiệt lượng Sử dụng kỹ thuật hô hấp nhiệt lượng để đo methane phương pháp truyền thống nhà dinh dưỡng gia nhai lại Chúng dùng để thu thập hầu hết thông tin liên quan đến phát thải khí methane từ gia súc Kỹ thuật có nhiều thiết kế khác buồng hô hấp, head hood, hay mặt nạ Nhưng chúng có quy luật chung vòng tuần hoàn khí mở (Blaxter, 1962) Hệ thống có lỗ (head hood, mặt nạ) lỗ (buồng hô hấp) cho không khí lưu thông nằm góc, lỗ để dẫn không khí từ bên vào (lỗ head hood mặt nạ không cần thiết khí vào khe hở tiếp giáp cổ mặt gia súc) lỗ để không khí từ buồng Không khí hệ thống lưu thông theo chiều nhờ bơm hút khí gắn với lỗ đưa khí Hệ thống bơm thổi không khí qua thiết bị đo lưu lượng để xác định tổng lượng khí hút khỏi buồng hô hấp lưu vào máy tính nhờ phần mềm ghi chép lưu giữ số liệu chuyên dụng Ngoài máy phân tích nồng độ khí methane lắp đặt để tự động lấy mẫu phân tích nồng độ khí methane theo chu kỳ phút/lần luồng không khí từ hệ thống (đã có methane gia súc thải ra) 20 phút/ lần mẫu không khí vào Khi gia súc nuôi nhốt gắn hệ thống này, methane thải hòa không khí xung quanh đầu vật hút theo hệ thống bơm nói Tổng lượng khí methane mà gia súc thí nghiệm sản sinh xác định từ số liệu ghi chép máy phân tích nồng độ khí methane thiết bị xác định tổng lưu lượng khí khỏi hệ thống Ưu điểm phương pháp đo xác lượng methane thải từ cỏ (Bhatta cs., 2007) Tuy nhiên nhược điểm kỹ thuật hạn chế di chuyển vật, chi phí để xây dựng trì hoạt động hệ thống cao, yêu cầu nhiều nhân lực Kỹ thuật khí đánh dấu Methane thải từ gia súc nhai lại ước thể tính kỹ thuật đánh dấu Người ta thường dùng khí trơ sulfur hexafluoride (SF6) làm chất đánh dấu để xác định lượng methane thải từ động vật nhai lại điều kiện sản xuất Kỹ thuật khí đánh dấu sulfur hexafluoride phát triển phá vỡ hạn chế kỹ thuật khác.Trong kỹ thuật này, ống thấm nhỏ có chứa sulfur hexafluoride (SF6) đưa vào cỏ Tỷ lệ giải phóng SF6 từ ống thấm biết trước lắp đặt ống vào vật Một dây gắn với ống mao dẫn đặt đầu vật kết nối với hộp nhỏ hút chân không để lấy mẫu Khi thu mẫu van lấy mẫu mở lượng mẫu không khí xung quanh miệng mũi vật thu thập với tỷ lệ định Các mạch thu khí đóng lại áp lực mạch khoảng 0,5 atm Tùy theo thời gian thu mẫu mà người ta thay đổi chiều dài đường kính ống ống mao dẫn Sau thu thập mẫu, ống đựng bơm nitơ vào áp suất ống tương đương với áp không khí (khoảng atm) Nồng độ khí methane SF6 sau xác định phương pháp sắc ký khí Lượng khí methane sản sinh tính sau: QCH4 = QSF6 × [CH4] / [SF6] Trong QCH4 lượng khí methane sản sinh (g / ngày); QSF6 tỷ lệ giải phóng (g / ngày) SF6 từ ống thấm, [CH4] [SF6] đo nồng độ ống đựng Johnson cs (1994) so sánh 55 lần đo sử dụng kỹ thuật SF6 với 25 lần đo sử dụng kỹ thuật buồng hô hấp bò cho thấy lượng methane ước tính SF6 tương đương 93% lượng methane thu từ buồng hô hấp Sự khác biệt không đáng kể Trong nghiên cứu Pinares-Patino (2000) so sánh bê sữa Boadi cs (2002) xác định cừu cho kết tương tự Ưu điểm kỹ thuật không hạn chế vận động động vật, không cần thiết phải thu mẫu trực tiếp từ cỏ họng gia súc Nhược điểm (i) SF6 có tác động gây hiệu ứng nhà kính gấp 23.900 lần so với CO2, thời gian tồn khí 3.200 năm (Machmuller and Hegarty, 2005); (ii) SF6 tồn lưu thịt sữa động vật; (iii) Con vật cần phải huấn luyện để đeo dây hộp thu khí Kỹ thuật sinh khí in vitro Kỹ thuật sinh khí in vitro sử dụng để mô trình lên men cỏ phòng thí nghiệm từ lâu (Storm cs., 2012) Trong năm gần đây, khí nhà kính phát thải từ nông nghiệp ngày tăng Do đó, kỹ thuật sinh khí in vitro truyền thống thay đổi để xác định loại khí đặc biệt khí methane Trong kỹ thuật sinh khí in vitro, thức ăn ủ với hỗn hợp dịch cỏ, dung dịch đệm khoáng chất 390C khoảng thời gian định, cụ thể 24, 48, 72 96 với ba lần lặp lai Tổng lượng khí sinh ghi chép thu lại đem phân tích thành phần hỗn hợp khí để xác định số liệu lượng methane sản sinh Đồng thời, kỹ thuật xác định tỷ lệ phân giải in vitro thức ăn Như vậy, ta tính toán khả giảm thiểu methane trình phân giải thức ăn Kết thí nghiệm thể lượng methane phát thải gam vật chất khô, vật chất khô tiêu hóa hay gam NDF tiêu hóa Có nhiều hệ thống sinh khí in vitro sử dụng để xác định lượng methane ví dụ xylanh (Bhatta cs., 2006; Blümmel and Orskov, 1993), mô cỏ (rusitec) (Bhatta cs., 2006), hệ thống gas production tự động hoàn toàn (Pellikaan cs., 2011) Ưu điểm phương pháp đơn giản, chi phí thấp Một lúc ta chạy hàng trăm nghiệm thức Chúng ta tăng số lần lặp lại nghiệm thức để bảm bảo độ tin cậy cao số liệu thu Phương pháp phù hợp với nước phát triển, nơi mà nguồn kinh phí phục vụ cho nghiên cứu chưa nhiều Một nhược điểm lớn phương pháp mô lên men cỏ thức ăn mà trình tiêu hóa thức ăn vật Hơn nữa, hệ vi sinh vật thời gian thích nghi chuẩn Thông thường, thí nghiệm vật nuôi vật ăn thích với loại thức ăn thí nghiệm Bởi dịch cỏ lấy từ vật ăn phần thích nghi với phần 14 ngày Mỗi phương pháp có ưu, nhược điểm riêng Trong nghiên cứu chiến lược giảm thiểu khí methane sản sinh từ gia súc nhai lại, phải xác định lượng methane thải sử dụng kỹ thuật sinh khí in vitro gas production, phương pháp sử dụng phổ biến, đơn giản có chi phí thấp 14.2 Phương pháp nghiên cứu + Hóa chất dụng cụ làm gas production + Tất mẫu thức ăn phân tích tiêu: Vật chất khô (VCK), protein thô, lipid, xơ thô, NDF, ADF, khoáng tổng số (KTS) phân tích phòng Phân tích thức ăn sản phẩm chăn nuôi - Viện Chăn nuôi Sấy khô, nghiền nguyên liệu thức ăn phần thức ăn bổ sung nghiền nhỏ đến kích thước ≤1mm Mẫu thức ăn (khẩu phần ăn sở) xây dựng theo dạng hỗn hợp hoàn chỉnh, có mật độ dinh dưỡng đáp ứng nhu cầu cho bò sinh trưởng theo tiêu chuẩn NRC (1996) (10-11 MJ/kgVCK 12-14% protein thô) phối trộn Viện KHSS-ĐHTN Nguyên liệu dùng để xây dựng phần sở nguồn thức ăn sẵn có (cỏ voi, đậu tương, bột sắn, cám ngô, cám gạo) thường dùng sở chăn nuôi Bảng Thành phần tỷ lệ mẫu thức ăn (khẩu phần sở) Nguyên liệu Tỷ lệ (% VCK) Cỏ voi 89 Bột sắn 1,8 Đậu tương 3,9 Cám ngô 2,5 Cám gạo 2,8 Tổng 100 VCK 25,2 Protein thô 13 ME 10,3 (MJ/kg) Sau xác định vật chất khô mẫu (khẩu phần sở) tannin biochar bổ sung vào phần sở với tỷ lệ khác kết hợp với ure với tỷ lệ cố định 2% Mẫu phối trộn gọi phần Như có phần (1 mẫu đối chứng, mẫu thí nghiệm) Sau phối trộn, tất mẫu chia làm hai phần, phần đem phân tích thành phần hóa học, phần lại đưa vào làm thí nghiệm in vitro gas production Thiết kế thí nghiệm: Thí nghiệm thiết kế hoàn toàn ngẫu nhiên Sơ đồ bố trí thí nghiệm trình bày bảng 3.2 Bảng 2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm invitro Nghiệm thức Kí hiệu Lặp lại Control (0% tannin; 0% biochar;) + 2% ure Tannin (2%) + 2% ure Tannin (4%) + 2% ure Tannin (6%) + 2% ure Biochar (0,5%)+ 2% ure Biochar (1.0%)+ 2% ure Biochar (1,5%)+ 2% ure Tannin (2%) + Biochar (0,5%)+ 2% ure Tannin (2%) + Biochar (1.0%)+ 2% ure Tannin (2%) + Biochar (1,5%)+ 2% ure Tannin (4%) + Biochar (0,5%)+ 2% ure Tannin (4%) + Biochar (1%)+ 2% ure Tannin (4%) + Biochar (1,5%)+ 2% ure Tannin (6%) + Biochar (0,5%)+ 2% ure Tannin (6%) + Biochar (1%)+ 2% ure Tannin (6%) + Biochar (1,5%)+ 2% ure Tổng số xilanh 48 15 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU VÀ TIẾN ĐỘ THỰC HIỆN 15.1 Nội dung nghiên cứu (trình bày dạng đề cương nghiên cứu chi tiết) Nội dung 1: Xác định ảnh hưởng mức tannin chiết xuất từ thân, chè biochar khác với ure bổ sung vào làm chất đến tổng lượng khí sản sinh tỷ lệ tiêu hóa điều kiện in vitro Thí nghiệm in vitro gas production Phương pháp thí nghiệm in vitro gas production tiến hành theo thủ tục Menke Steingass (1988) gồm bước: chuẩn bị mẫu thức ăn ủ, xylanh dịch cỏ, dung dịch đệm pha chế dịch ủ; tiến hành thí nghiệm Chuẩn bị mẫu ủ, xylanh dịch cỏ Theo phương pháp Menke Steingass (1988) với thức ăn có độ hoà tan kém, thức ăn có hàm lượng xơ cao khối lượng mẫu nên cân 200 ± 5mg Sau đặt lượng mẫu thức ăn vừa cân xuống đáy xylanh (các xylanh rửa sạch, sấy khô) không để mẫu dính vào thành xylanh gây sai số kết sinh khí Mỗi mẫu thường tiến hành với xylanh Lắp pittong bôi trơn vasơlin vào xylanh (vasơlin giúp cho pittong trượt dễ dàng bị đẩy áp suất cột khí sinh trình ủ, mặt khác làm pittông trở lên kín khít với xylanh để khí sinh không bị thoát ngoài) Không lắp pittông sát tận đáy xylanh, để khoảng trống để theo dõi xem xylanh có bị hở không sau buộc (kẹp) đầu lại Các xylanh chứa mẫu đưa vào bảo quản tủ ấm 39 0C trước cho dung dịch ủ vào Dịch cỏ lấy từ bò mổ lỗ dò giống lai Sind ăn phần thức ăn (Cỏ voi, bột đậu tương, bột sắn, bột ngô, cám gạo) theo tiêu chuẩn NRC (1996) (10-11 MJ/kgVCKvà 12-14% protein thô phần) nuôi điều kiện, trước cho ăn sáng để đảm bảo thành phần hoạt lực vi sinh vật cỏ tương đối ổn định Dịch cỏ lấy từ bò thời điểm khoảng 1lít trộn với nhau, đựng bình kín (để đảm bảo yếm khí) giữ ấm bể (bồn) nước ấm 39 0C đến pha chế dung dịch ủ Dịch cỏ trước tiến hành đem pha chế thành dung dịch ủ phải lọc (có thể lọc vải gạc) để đảm bảo loại trừ mảnh thức ăn lớn lẫn dịch cỏ làm ảnh hưởng không tốt đến kết sinh khí thí nghiệm Chuẩn bị dung dịch đệm pha chế dịch ủ Dung dịch đệm thường gồm loại sau: dung dịch đệm 1, dung dịch khoáng đa lượng, dung dịch khoáng vi lượng, dung dịch Resazurin (dung dịch thị) Các dung dịch pha chế trước bảo quản đến trước tiến hành thí nghiệm in vitro gas production pha chế thành dung dịch đệm (dung dịch pha chế trước tiến hành thí nghiệm, nên thường gọi dung dịch tươi) Các dung dịch đệm 1, dung dịch khoáng đa lượng, dung dịch khoáng vi lượng, dung dịch đệm pha chế theo bảng Bảng Bảng pha chế dung dịch đệm 1, dung dịch khoáng đa lượng, dung dịch khoáng vi lượng cần thiết dung dịch Resazurin Dung dịch đệm Dung dịch khoáng vi lượng 35 g NaHCO3 13,2g CaCl2 2H2O g (NH4)HCO3 10 g MnCl2 4H2O Hoà với nước cất thành lít dung dịch g CoCl2 6H2O Dung dịch khoáng đa lượng 0,8 g FeCl2 6H2O 5,7 g Na2HPO4 Hoà với nước cất thành 100 ml 6,2 g KH2PO4 Dung dịch Resazurin 0,6 g MgSO4 7H2O 100 mg resazurin Hoà với nước cất thành lít dung dịch Hoà với nước cất thành 100 ml Bảng 4: Bảng pha chế dung dịch đệm Thành phần Lượng dung dịch cần tạo (ml) 500 1000 1200 1400 1500 2000 Nước cất (ml) 237,5 475 570 665 712,5 950 DD đệm (ml) 120 240 288 336 360 480 Đa khoáng (ml) 120 240 288 336 360 480 Vi khoáng (ml) 0,06 0,12 0,144 0,168 0,180 0,240 Resazurin (ml) 0,61 1,22 1,46 1,71 1,83 2,44 Nước cất (ml) 23,8 47,5 57,1 66,6 71,3 95 NaOH 1N (ml) 1,0 2,0 2,4 2,8 3,0 4,0 Na2S.9H2O (g) 0,168 0,336 0,360 0,470 0,504 0,672 Dung dịch khử Dung dịch đệm sau pha xong đổ vào bình tam giác đặt bể nước ấm 38 - 39 0C (trong nghiên cứu đặt dung dịch đệm máy khuấy từ có bể nước làm ấm) vòng 25 - 30 phút sau cho dung dịch khử vào liên tục sục khí CO vào bình tam giác để tạo môi trường yếm khí mẫu dung dịch chuyển sang màu hồng nhạt sau chuyển màu sáng Bình tam giác giữ ấm liên tục sục khí CO2 trộn lẫn dịch cỏ vào Dung dịch ủ bao gồm dung dịch đệm dịch cỏ lọc trộn lẫn theo tỷ lệ dung dịch đệm 2/ dung dịch cỏ 2/1 Sau pha chế xong dung dịch đệm chuẩn bị xong dung dịch cỏ tiến hành đổ dung dịch cỏ vào bình tam giác nói theo tỷ lệ 1/2 tiếp tục sục khí CO2, dung dịch tạo dịch ủ Dung dịch giữ ấm 38 - 39 0C liên tục sục khí CO2 bơm vào xylanh chứa mẫu Tiến hành thí nghiệm Sau pha xong dung dịch ủ, chuẩn bị xong xylanh chứa mẫu tiến hành cho dung dịch ủ vào xylanh Lấy 30ml dung dịch ủ cho vào xylanh giữ xylanh đẩy hết không khí cách nhẹ nhàng đến khí thoát hết, buộc (kẹp) đầu lại nhẹ nhàng đặt xylanh vào tủ ấm có quạt đối lưu đảm bảo nhiệt độ luôn 39 ± 0,50C Các xylanh chứa mẫu ủ với dịch ủ Blank (xylanh mẫu có dung dịch ủ) đặt giá vị trí ngẫu nhiên đặt vào tủ ấm Sau 30 phút kể từ ủ lắc nhẹ xylanh sau lắc lần suốt 10 ủ Ghi chép số "ml" xylanh thời điểm 0; 3; 6; 9; 12; 24; 48; 72 96 sau bắt đầu ủ Nhẹ nhàng cho thoát khí (xả khí) pittong bị đẩy đến vạch 60ml đưa pittong vị trí ban đầu thời điểm Sự giải thoát khí nhằm giải phóng lượng khí sinh xylanh tích lại gây áp lực làm ảnh hưởng không tốt đến hoạt động vi sinh vật cỏ dung dịch ủ Khi tiến hành thí nghiệm in vitro gas production cần thiết phải sử dụng "mẫu trắng" hay gọi Blank thường chứa 30ml dung dịch ủ xylanh để tính lượng khí mà vi sinh vật sinh từ chất hữu sót lại dịch cỏ khí sinh gián tiếp từ môi trường đệm Kết sinh khí từ Blank sử dụng để hiệu chỉnh tính toán kết sinh khí thực mẫu thức ăn thí nghiệm Các tiêu theo dõi phương pháp xác định Động thái lên men: Tổng lượng khí sản sinh thời điểm 0; 3; 6; 12; 24; 48; 72 96 sau bắt đầu ủ ghi chép để xác định động thái lên men loại thức ăn có hàm lượng tannin cao Động thái lên men mẫu thức ăn: Được xác định theo phương trình Orskov Mc Donald (1979) Phương trình có dạng sau: Y = a + b(1 - e-ct) Trong đó: Y: thể tích khí sinh thời điểm t (ml) a: lượng khí sinh từ chất dễ hoà tan thường thời điểm ban đầu ủ mẫu (ml) b: lượng khí sinh từ chất hữu khó hoà tan suốt trình ủ (ml) a+b: tổng lượng khí sinh mẫu thức ăn đem ủ hay tiềm sinh khí thức ăn (ml) c: tốc tộ sinh khí (%/giờ) t: thời gian ủ mẫu thức ăn thí nghiệm (giờ) Các thông số tính toán dựa vào phần mềm chuyên dụng NEWAY Cheng (1996) xử lý kết phân giải chất hữu khả sinh khí thí nghiệm in sacco in vitro gas production Nội dung 2: Xác định ảnh hưởng mức tannin biochar khác với ure bổ sung vào làm chất đến tỷ lệ tiêu hóa chất khô (VCK) chất hữu (CHC) điều kiện in vitro Phân tích thành phần hoá học loại thức ăn bao gồm: hàm lượng chất khô (%VCK), hàm lượng protein thô, hàm lượng xơ thô, hàm lượng mỡ thô, hàm lượng khoáng tổng số (KTS), tỷ lệ phần xơ tan môi trường trung tính (%NDF) tỷ lệ phần xơ tan môi trường axit (%ADF) ) phân tích Viện KHSSĐHTN Tannin tổng số phân tích theo phương pháp AOAC (1975) Viện KHSS, thể (%VCK) Xác định giá trị lượng trao đổi (ME) axit béo mạch ngắn (SCFA) Dựa vào lượng khí sinh thời điểm 24h sau ủ, kết hợp với thành phần hóa học mẫu thí nghiệm để ước tính giá trị lượng trao đổi chúng thông qua phương trình Vũ Chí Cương (2006) ME (MJ/kg VCK) =11,8-0.198*CP+0,117*EE+0,107CF+0,0147*GP 24 Trong đó: GP24 (ml) thể tích khí xylanh chứa mẫu thời điểm 24 sau ủ, CP (%) tỷ lệ protein thô, CF (%) tỷ lệ xơ thô, EE (%) tỷ lệ lipit Hàm lượng axít béo mạch ngắn (SCFA) (mmol/200gVCK): Dựa vào khí sinh thời điểm 24h sau ủ để ước tính hàm lượng axít béo mạch ngắn loại thức ăn giàu tannin thông qua phương trình Getachew cs (1999): SCFA (mmol/200gVCK) = 0,0239*GP24 – 0,0601 Trong đó: GP24(ml) thể tích khí xylanh chứa mẫu thời điểm 24 sau ủ Ước tính tỷ lệ tiêu hóa chất hữu Dựa vào lượng khí sinh thời điểm 24h sau ủ, kết hợp với thành phần hóa học mẫu thí nghiệm để ước tính giá trị lượng trao đổi chúng thông qua phương trình ước tính tỷ lệ tiêu hóa chất hữu (OMD %) loại thức ăn tinh Vũ Chí Cương cs (2006) OMD = 50,4+0,66*GP24+0,127*DM-0,256*CP Trong đó: GP24: thể tích khí sinh thời điểm 24 sau ủ (ml/200 mg DM); CP (%) tỷ lệ protein thô, DM (%) tỷ lệ vật chất khô Nội dung 3: Xác định ảnh hưởng mức tannin chiết xuất từ thân, chè biochar khác với ure bổ sung vào làm chất đến số tiêu dung dịch cỏ lượng khí mêtan sản sinh điều kiện in vitro Xác định lượng khí CH4 Lượng khí CH4 sản sinh xác định theo phương pháp sau: Phương pháp xác định phần trăm thể tích CH4 dung dịch NaOH (10M): Bước 1: Tại thời điểm ủ 96 lấy xylanh tủ ấm 39 C thu khí vào xylanh Bước 2: Chuyển toàn lượng khí thu vào lọ thủy tinh có dung tích 100 ml Bước 3: Hút V1 ml khí từ lọ thủy tinh vào xylanh 100 ml Chuẩn bị xylanh ml có chứa ml dung dịch NaOH (10M) Bước 4: Bơm từ từ dung dịch NaOH vào xy lanh 100 ml vừa hút mẫu bước sau lắc (1 lần/phút) vòng phút, đọc thể tích V2 sau NaOH hấp thụ hoàn toàn CO (Demeyer cs, 1988; Fievez cs, 2005) theo phản ứng sau: 2NaOH +CO2 → Na2CO3 + H2O Bước 5: Tính kết dựa vào công thức: %CO2 = ×100 % CH4 =100 - %CO2 Phương pháp phân tích xử lý số liệu Số liệu xử lý thô bảng tính Excel phần mềm NEWAY Cheng (1996), sau tiến hành xử lý thống kê phần mềm SAS Số liệu phân tích cách sử dụng mô hình tuyến tính đơn (General Linear Models-GLM) phần mềm SAS(1998) (SAS Inst Inc, Cary, NC) Dữ liệu phân tích cách sử dụng phương trình Yij = µ + Ti + εij Trong (ij) quan sát từ công thức, (i) lặp lại, (µ) giá trị trung bình tổng thể, (Ti) giá trị trung bình công thức, (εij) ảnh hưởng yếu tố lại So sánh đa chiều giá trị trung bình công thức Duncan’s New Multiple Range Test (DMRT) (Steel and Torrie, 1980) Nội dung 4: Thử nghiệm (invivo) mức tannin biochar bổ sung có kết sản sinh CH4 thấp từ kết nội dung 1, đàn bò ảnh hưởng đến khả sinh trưởng bò Sơ đồ bố trí thí nghiệm Các mức thí nghiệm Số lần lặp Mức Tannin x +2% ure Mức Biochar y+2% ure Mức Tannin x + mức Biochar y+2% ure Control +2% ure Thí nghiệm tiến hành 12 bò đực Vàng laisind có độ tuổi cân nặng tương đương Xem lại phần Thí nghiệm tiến hành ba tháng, tiêu theo dõi bao gồm: Lượng thức ăn thu nhận: Được tính toán cách cân tổng lượng thức ăn cho ăn vào sáng sớm cân lại lượng thức ăn thừa vào buổi chiều tối Bò cân hàng tuần để tính toán khả sinh trưởng thông qua tiêu sinh trưởng tuyệt đối/ngày; sinh trưởng tương đối (%) Dựa số liệu thu thập tiêu như: FCR, hiệu kinh tế tính toán 15.2 Tiến độ thực Hiệu KTXH - Góp phần nâng cao lực nghiên cứu giảng dạy cho giảng viên, giúp đào tạo đội ngũ giảng viên trẻ - Kết đề tài góp phần làm phong phú thêm sở liệu khả giảm thiểu khí methane số phụ gia bổ sung - Kết đề tài ứng dụng chăn nuôi trâu bò biện pháp nhằm giảm thiểu lượng khí methane thải môi trường từ cỏ đồng thời trì hiệu sử dụng thức ăn - Góp phần giảm thiểu ô nhiễm môi trường giảm thiểu lượng khí methane thải từ cỏ việc sử dụng phụ phẩm có sẵn, rẻ tiền ĐV sử dụng Kết nghiên cứu phổ biến ứng dụng thông qua chương trình chuyển giao khoa học kỹ thuật đơn vị phối hợp Trung tâm nghiên cứu phát triển chăn nuôi miền núi – Viện Chăn nuôi quốc gia