VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHẠM THANH HUYỀN SÀNG LỌC VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CỦA MỘT SỐ CHẤT KHÁNG SINH VÀ KHÁNG UNG THƯ TỪ XẠ KHUẨN BIỂN VIỆT NAM Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 62 42 01 07 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội, 2016 Công trình hoàn thành Viện Công nghệ sinh học Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Lê Gia Hy Viện Công nghệ sinh học TS Phí Quyết Tiến Viện Công nghệ sinh học Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án phiên thức Viện Công nghệ sinh học Vào hồi …h … , ngày … tháng … năm 2016 Có thể tìm thấy luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Thư viện Công nghệ sinh học - Trang web Bộ GD&ĐT MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Hiện nay, chất kháng sinh kháng ung thư xem nhóm thuốc thiết yếu y học, có tác dụng tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh ức chế tế bào ung thư Tuy nhiên, việc sử dụng thuốc kháng sinh không theo định dẫn đến xuất ngày nhiều vi khuẩn đa kháng thuốc thiếu hụt kháng sinh làm cho người phải đối mặt với “thời kỳ hậu kháng sinh” Việt Nam nhiều nước giới phải đối mặt với loại bệnh nhiễm khuẩn bệnh tác nhân kháng thuốc sử dụng thuốc kháng sinh cách tùy tiện Bên cạnh đó, môi trường sống người bị ô nhiễm nghiêm trọng nên gia tăng loại bệnh ung thư Vì vậy, việc tìm kiếm loại kháng sinh thuốc kháng tế bào ung thư nhà khoa học giới quan tâm, đặc biệt loại sản xuất từ chủng xạ khuẩn biển Trong mục tiêu chung phát phát triển sản phẩm có hoạt tính sinh học từ vi sinh vật biển nhằm ứng dụng lĩnh vực bảo vệ sức khỏe người, tiến hành đề tài: “Sàng lọc nghiên cứu đặc điểm số chất kháng sinh kháng ung thư từ xạ khuẩn biển Việt Nam” với mục đích nội dung sau đây: Mục đích - Sàng lọc tập hợp chủng xạ khuẩn biển Việt Nam có khả sinh chất kháng sinh kháng ung thư - Nghiên cứu đặc điểm sinh học xạ khuẩn biển lựa chọn, xác định tính chất hóa lý, cấu trúc hóa học khả ứng dụng các hợp chất kháng sinh kháng ung thư tổng hợp xạ khuẩn Nội dung nghiên cứu - Sàng lọc chủng xạ khuẩn từ vùng biển có khả kháng vi sinh vật kiểm định kháng tế bào ung thư - Xác định đặc điểm sinh học, đặc điểm phân loại chủng xạ khuẩn lựa chọn - Nghiên cứu điều kiện lên men thu nhận chất kháng sinh từ chủng tuyển chọn - Nghiên cứu tách chiết, tinh sạch, tính chất hóa lý khả kháng khuẩn kháng tế bào ung thư chất kháng sinh - Bước đầu nghiên cứu cấu trúc chất kháng sinh thu nhận Những đóng góp luận án - Luận án thu nhận tập hợp 70 chủng xạ khuẩn biển có hoạt tính kháng khuẩn kháng tế bào ung thư phục vụ cho sàng lọc chất kháng sinh góp phần bảo tồn nguồn gen vi sinh vật biển Việt Nam - Luận án công trình nghiên cứu có hệ thống chủng xạ khuẩn biển Streptomyces variabilis HP411 phân lập Việt Nam (phân loại, lên men, tách chiết, tinh chất kháng sinh; dự đoán cấu trúc kháng sinh; đánh giá khả kháng khuẩn kháng tế bào ung thư chất kháng sinh thu được) Bố cục luận án Luận án gồm 156 trang: Mở đầu (3 trang); Chương 1: Tổng quan tài liệu (24 trang); Chương 2: Vật liệu phương pháp (17 trang); Chương 3: Kết (41 trang); Chương 4: Bàn luận kết nghiên cứu (15 trang); Kết luận kiến nghị (2 trang); Danh mục công trình công bố (2 trang); Tài liệu tham khảo (16 trang gồm tài liệu tiếng Việt, 138 tài liệu tiếng Anh 02 tài liệu trang mạng); Summary (11 trang); Phụ lục (25 trang) CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung vi sinh vật biển 1.2 Xạ khuẩn biển chất có hoạt tính dược học từ xạ khuẩn biển 1.2.1 Xạ khuẩn biển 1.2.2 Các chất có hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn biển 1.3 Đặc tính chất có hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn biển 1.3.1 Nghiên cứu thu nhận chất kháng sinh từ xạ khuẩn biển 1.3.2 Nghiên cứu tách chiết xác định đặc trưng chất kháng sinh kháng ung thư 1.3.3 Nghiên cứu phân tích cấu trúc chất kháng sinh 1.3.4 Nghiên cứu ứng dụng chất kháng sinh kháng ung thư từ vi sinh vật biển CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu Vật liệu nghiên cứu: Các mẫu nước bùn thu thập từ vùng ven biển Việt Nam; Các chủng vi sinh vật kiểm định nhận từ Bộ sưu tập giống Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học; Các dòng tế bào ung thư cung cấp từ Phòng Sinh học thực nghiệm, Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên, phòng Công nghệ tế bào động vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Khoa Molecular Oncology thuộc Viện Ung thư Chennai, Ấn Độ 2.2 Phương pháp nghiên cứu Xác định thành phần số lượng vi sinh vật mẫu (Egorov, 1976) Xác định hoạt tính kháng sinh: sử dụng phương pháp khuếch tán thạch Barry (Barry Thornsberry, 1985); phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) tăng trưởng thấp kháng sinh với vi sinh vật (Jennifer, 2006) nồng độ ức chế vi khuẩn tối thiểu (MBC) chất kháng sinh (Jennifer, 2006) Xác định hoạt tính gây độc tế bào phương pháp MTT (Van Vlietlinck, 1991) phương pháp SRB (Likhiwitayawuid et al., 1993) với nguyên lý đo tăng sinh sống sót tế bào thử nghiệm in vitro Các dòng tế bào nuôi cấy theo phương pháp Skehan cs (1991) Xác định đặc điểm sinh học xạ khuẩn theo Waskman (1962); Tresner Backus (1963) định tên xạ khuẩn theo Sổ tay phân loại vi sinh vật Bergey (Stanley et al., 1989) Chương trình xạ khuẩn quốc tế (ISP) (Shirling Gottlieb, 1966) Phân loại vi sinh vật phân tích trình tự gen mã hóa 16S rRNA theo Sambrook cộng (1989); So sánh độ tương đồng phần mềm CLUSTL_X (Thompson et al., 1997); xác định khoảng cách di truyền theo Kimura (1980), phương pháp Neighbor-joining (Saitou Nei, 1987), phân tích Bootstrap phát sinh chủng loại tính với 1000 mẫu thử (Felsenstein, 1985) Nghiên cứu điều kiện lên men kháng sinh thích hợp cho chủng xạ khuẩn theo Cornick McGuire (1962); Yu (2008); Gao (2009); Krishnaraj Mathivanan (2009) Tối ưu hóa môi trường theo phương pháp RSM với thiết kế phức hợp tâm (CCD-Central Composit design) (www.DX7.com) Tách chiết chất kháng sinh dung môi ethyl acetate (Liu et al, 1986) Xác định tính chất hóa lý chất có hoạt tính kháng khuẩn từ dịch lên men xạ khuẩn theo phương pháp sắt ký, phân tích cấu trúc phổ IR, LC-MS, ESI-MS, HPLC NMR theo Nguyễn Đình Triệu (2001) CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Sàng lọc xạ khuẩn biển có hoạt tính kháng sinh 3.1.1 Sàng lọc xạ khuẩn biển có hoạt tính kháng sinh Từ 97 chủng xạ khuẩn phân lập có 70 chủng có hoạt kháng khuẩn chiếm 72,16%, ức chế vi khuẩn B subtilis ATCC 6633 cao chiếm 47%, sau vi khuẩn E coli ATCC 11105 chiếm 44,3% nấm men C albicans 10231 chiếm 17,5% số chủng Trong đó, lựa chọn 16 chủng có hoạt tính mạnh kháng từ chủng vi sinh vật kiểm định trở lên dùng cho nghiên cứu với định hướng sàng lọc hoạt chất sinh học ứng dụng y dược 3.1.2 Sàng lọc chủng xạ khuẩn biển có hoạt tính kháng sinh cao Trong chủng có khả đối kháng với chủng vi sinh vật kiểm định, 16 chủng có hoạt tính mạnh kháng từ chủng vi sinh vật kiểm định trở lên lựa chọn nghiên cứu với định hướng sàng lọc hoạt chất sinh học ứng dụng y dược 3.2 Đặc điểm sinh học phân loại chủng xạ khuẩn biển 3.2.1 Đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn Dựa quan sát màu sắc khuẩn ty chất, khuẩn ty khí sinh, sắc tố tan môi trường ISP hình thái cuống sinh bào tử, bề mặt bào tử để phân loại nghiên cứu đặc điểm hình thái tính chất nuôi cấy 16 chủng xạ khuẩn lựa chọn Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa 16 chủng xạ khuẩn khả sử dụng nguồn carbon, khả sử dụng nguồn nitơ, ảnh hưởng nhiệt độ pH, ảnh hưởng nồng độ muối NaCl 16 chủng xạ khuẩn 3.2.2 Phân loại chủng xạ khuẩn biển a Phân loại theo đặc điểm sinh học Đặc điểm sinh học 16 chủng xạ khuẩn lựa chọn so sánh tiêu phân loại theo Khóa định tên loài xạ khuẩn Nomomura (1976), Khoá phân loại Gause (1983) Bergey’s (1989) cho thấy, chủng nghiên cứu phần lớn thuộc chi Streptomyces (15 chủng) chủng thuộc chi Nocardiopsis Kết định tên loài chủng xạ khuẩn biển sau: (1) Chủng HLĐ3.16 có đặc điểm giống loài S autotrophicus, dạng chủng aa-1-1; ISP 5011 nhóm A-2; (2) Chủng NA1132 giống loài S rutgersensis dạng chủng IMRU 3350, ký hiệu ISP 5077, nhóm A- 9; (3) Chủng NA1134 giống loài S finlaryi, ký hiệu ISP 5218, nhóm B-12; (4) Chủng NA113 giống loài S scabies dạng chủng IMRU 3018, ký hiệu ISP 5058, nhóm B-4; (5) Chủng NA115 giống loài S tendae dạng chủng ETH 11313, ký hiệu ISP 5101, nhóm A-10; (6) Chủng NA116 giống loài S galbus, ký hiệu ISP 5089, nhóm B-5; (7) Chủng HP112 gần giống với chủng chuẩn S litmocidini ISP 5164, dạng chủng 1823155, thuộc nhóm A-8; (8) Chủng HP411 gần giống với chủng chuẩn S variabilis ISP 5179 thuộc nhóm A-5; (9) Chủng HPN11 gần giống với chủng chuẩn S griseoincanatus ký hiệu ISP 5274, nhóm B12; (10) Chủng HPX12 giống loài S griseorubens dạng chủng P-638, ISP 5160; (11) Chủng VD111 gần giống với chủng chuẩn S albogriseolus ISP 5003, nhóm A-2; (12) Chủng VD112 gần giống với chi Streptomyces Nocardiopsis, cần xác định trình tự gen chủng để định tên đến chi, loài cụ thể; (13) Chủng VD114 giống với loài S achromogenes, dạng chủng Z-4-1, ký hiệu ISP 5014 nhóm A-1; (14) Chủng VD115 giống với loài S eurythermus, ký hiệu ISP 5028 nhóm A-1; (15) Chủng C141 giống loài S matensis, ký hiệu ISP 5188, nhóm A13 (16) Chủng TB5.3 mang nhiều đặc điểm giống với chủng chuẩn S viridodiastaticus ISP 5249, thuộc nhóm A-5 b Phân loại theo phân tích trình tự gen 16S rDNA Kết phân loại phân tích trình tự gen 16S rDNA cho thấy, số chủng nghiên cứu có chủng có độ tương đồng 98% đến loài thuộc chi Streptomyces chủng thuộc chi Nocardiopsis Như vậy, kết hợp đặc điểm sinh học phân tích trình tự gen cho kết định tên đến loài chủng xạ khuẩn sau: (1) chủng NA113 định tên Streptomyces scabiei NA113, (2) chủng NA115 định tên S tendae NA115, (3) chủng NA116 định tên S coelicoflavus NA116, (4) chủng HP411 định tên S variabilis HP411; (5) chủng HPN11 định tên S griseoincarnatus HPN11, (6) chủng HPX12 định tên S griseorubens HPX12, (7) chủng VD11 định tên S albogriseolus VD111, (8) chủng TB5.3 định tên S viridodiastaticus TB5.3 (9) chủng VD112 đinh tên Nocardiopsis sp VD112 Các chủng sử dụng nghiên cứu tiếp 3.3 Nghiên cứu thu nhận chất kháng sinh từ xạ khuẩn biển 3.3.1 Lựa chọn môi trường lên men thích hợp Các môi trường lên men sinh tổng hợp kháng sinh lựa chọn cho chủng sau: - MT7 (g/l): Glucose 5, tinh bột tan 10 peptone 4, thích hợp cho chủng NA113 - A4H (g/l): Glucose 10 bột đậu tương 15, thích hợp cho chủng NA115 C141 - M1ASW(g/l): Tinh bột tan 10, cao men 4, pepton 4, thích hợp cho chủng HP411, HPN11, HPX12, VD111 TB5.3 Các chủng nhân giống môi trường M1ASW ISP2, tỷ lệ tiếp giống 5% 48 nuôi, lên men bình với 20% môi trường lên men so với thể tích bình máy lắc 220 v/phút 120 3.3.2 Thu nhận chất kháng sinh chủng xạ khuẩn Dịch lên men chủng xạ khuẩn chiết dung môi ethyl acetate có khả chiết chất kháng khuẩn cao với tỷ lệ dung môi ethyl acetate dịch lên men 2:1 3.3.3 Hoạt tính sinh học chất kháng sinh sau tách chiết a Hoạt tính kháng vi sinh vật Kết xác định hoạt tính kháng sinh chất kháng sinh thô (Bảng 3.13) cho thấy, chủng C141, chủng khác có phổ kháng khuẩn rộng, ức chế vi khuẩn kháng kháng sinh nấm Candida albicans Bảng 3.13 Hoạt tính kháng sinh chất thô chủng xạ khuẩn với vi sinh vật kiểm định VSV kiểm định Vòng kháng khuẩn (mm) NA 113 NA 115 HP 411 25 24 40 20 20 21,9 43,4 22,7 17,4 31,2 32,6 Salmonella typhy ATCC 14028 0 0 0 Salmonella typhy IFO 14193 15 19 0 0 0 0 0 0 0 B subtilis ATCC 6633 Enterococcus faecalis ATCC 29212 E aerogenes ATCC 13048 Alcaligenes faecallis 13,6 13,2 23,1 S lutea M5 HPN HPX 11 12 VD C1 111 41 TB 5.3 17,5 18 24,6 12 0 10 14 0 17,6 15 24,3 B cereus ATCC 11778 20,7 21 40 19,5 17,2 13 17,2 S typhimurium ATCC 14028 21,5 40 14,8 20,8 24,5 E coli ATCC 25922 16,4 17 45,3 24 19 17,7 22,7 A baumannii ATCC 19606 23,7 40,2 19,8 20,8 16,8 29,1 K pneumoniae ATCC 13883 22,4 44,7 18,6 20,5 19,3 28,6 S aureus ATCC 29213 11,4 40,1 13,6 14,8 20,8 24,5 S aureus (MRSA) 50,1 21,5 50,1 18,7 20,8 24,2 S epidermidis ATCC 12228 26 22 21 20 18 19 28,5 21 S epidermidis (MRSE) 17,5 49,5 16,3 18,2 23,8 21,6 Aeromonas hydrophila THWQJ 23,6 54,3 21,7 22,1 29,4 30,1 C albicans ATCC 10231 21,9 16 17,4 16,8 16,8 15 44 b Khả gây độc tế bào Nghiên cứu khả gây độc tế bào chất kháng sinh thô (Bảng 3.15) cho thấy, chất chủng HP411, HPN11, HPX12, VD111 TB5.3 không gây độc với dòng tế bào lành tính Hek giá trị 40µg/ml Ở hàm lượng chất thô chủng VD111 TB5.3 có khả gây độc với dòng tế bào ung thư M14 HeLa với khả sống sót tế bào 45,05 22,1%; 39,40 38,56% Bảng 3.15 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào giá trị IC50 từ chất kháng sinh chủng Ký hiệu mẫu µg/ml) Giá trị IC50 dòng tế bào (µ HepG2 MCF7 RD FL Hek293 M14 HeLa NCIH 460 Chứng (+) 0,19 0,15 0,22 0,18 1,3 0,4 1,2 2,1 NA113 4,55 36,45 1,39 2,1 34,71 14,10 >40 - NA 115 4,15 >40 2,68 5,67 - - - - HP411 13,73 >40 4,41 12,6 - - >40 - HPN11 - 34,25 - - - - - - HPX12 6,01 25,08 5,53 8,83 - - - 3,93 VD111 3,72 27,99 17,94 10,97 - 26,04 14,59 - C141 2,74 30,16 21,01 20,50 TB5.3 - - - 29,56 29,93 - - - Chất kháng sinh thô chủng xạ khuẩn HPX12 có khả diệt tế bào 90% nồng độ 40µg/ml, chủng NA113 có khả diệt tế bào lành Hek293 với khả sống sót 45,05% tế bào ung thư M14 17,05% nồng độ 40µg/ml 3.3.4 Một số đặc trưng chất kháng sinh a Hệ số di chuyển Rf sắc ký giấy 10 Kết phân tích chất có phản ứng với chất mầu TLC cho thấy, cấu trúc chất tách từ chủng xạ khuẩn HP411, HPX12, NA113 TB5.3 có mặt nhóm chức khác như: benzophenon, antracen thiol (Bảng 3.24) với giá trị Rf khác hệ dung môi theo http://www.reachdevices.com/TLC_stains.html Bảng 3.24 Dự đoán sơ nhóm chất có mặt chất kháng sinh thô chủng xạ khuẩn Dự đoán nhóm liên kết qua phản ứng màu Chất thô chủng xạ khuẩn NA113 UV: Benzoph enone, Antrace ne + KMnO4 + (alcohol, ether, ester, alkene, alkyne, ketone, alkyl aromatic, carboxylic acid, amine, amide): màu nâu- nhóm chất KMnO4 + (thiols, phosphines): không màu Iodine (chuyển màu nâu) Nynhydrin + R2CH-NH2= Màu + R2C=O Cả nhóm chất Nhóm R-SH Nhóm -NH2, có nhóm glutamin, có -COOH Nhóm –NH, có vòng benzen, COOH HP411 + Cả nhóm chất Nhóm R-SH HPX12 + Nhóm chất Nhóm R-SH Có liên kết threonine + Nhóm chất thiols phosphines Nhóm R-SH Có nhóm lysine (-NH2, -COOH, -NH2) TB5.3 Tổng hợp nghiên cứu cho thấy, chất kháng sinh thô chủng xạ khuẩn có nhiều chất Với ưu điểm HP411 tách chiết hiệu diệt vi sinh vật gây bệnh gây độc dòng tế bào ung thư nên lựa chọn nghiên cứu tiếp 3.4 Nghiên cứu lên men thu nhận chất kháng sinh chủng HP411 3.4.1 Tối ưu hóa môi trường lên men 12 Dựa vào kết nghiên cứu trên, chọn miền khảo sát trình bày bảng 3.25 để tối ưu môi trường lên men chủng HP411 Bảng 3.25 Các yếu tố biến đổi thành phần môi trường lên men Biến ảnh hưởng Nồng độ tinh bột tan Nồng độ cao nấm men Nồng độ pepton Ký hiệu X1 Đơn vị g/l -α 8,32 X2 g/l X3 g/l -1 Mức 10 +1 11 +α 11,68 2,32 5,68 3,32 6,68 Sau nhập số liệu thí nghiệm vào phần mềm tối ưu DX7, thu kết phân tích số liệu, thiết lập phương trình tối ưu với giá trị tính hoạt tính kháng khuẩn Y sau: Y = 33,32 + 0,11*A + 1,52*B – 0,24*C + 0,31*A*B + 0,39*A*C – 2,20*A2 – 1,51*B2 – 0,78*C2 Hình 3.11 Bề mặt đáp ứng có hàm lượng chất kháng khuẩn (khả đối kháng với vi khuẩn kiểm định) tương quan với biến A Sự tương tác tinh bột tan pepton; B Peptone cao nấm men; C cao nấm men tinh bột tan Như vậy, kết thực nghiệm cho thấy giá trị “Model-F-value” 10,15 mô hình hoàn toàn có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 99,94% (p=0,0006), mô hình hoàn toàn tương thích với thực nghiệm (p= 0,5708) Khảo sát tác động cho thấy nồng độ cao nấm men có tác động lớn tới hoạt tính kháng sinh chủng xạ khuẩn HP411 Kết phân tích ANOVA cho thấy giá trị R2 0,9013 gần 1, chứng tỏ giá trị hoạt tính kháng sinh thu từ thực nghiệm gần với giá trị dự đoán mô hình 13 Hoạt tính kháng khuẩn (mm) Phương án tối ưu số 32 39 phương án, hoạt tính kháng sinh đạt theo mô hình tối ưu 33,70 mm, với thành phần môi trường (g/l) là: Tinh bột tan 10,01; cao nấm men 4,61 peptone 4,65 Kết kiểm chứng với hoạt tính đạt 34,6mm 3.4.2 Động thái trình lên men Kết nghiên cứu động thái trình sinh trưởng, phát triển sinh chất kháng sinh chủng HP411 môi trường M1ASW-32 tối ưu (Hình 3.15 3.16) cho thấy, sinh khối đạt cao 84 hoạt tính kháng sinh cao 96 lên men 40 35 30 25 20 15 10 25 20 15 10 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108120132 Thời gian lên men (h) VKK (mm) Sinh khối (mg/ml) pH Hình 3.15 Động thái trình lên men sinh tổng hợp chất kháng sinh chủng HP411 Hình 3.16 Khả ức chế vi sinh vật chất kháng sinh chủng HP411 3.5 Phân tích cấu trúc chất kháng sinh chủng HP411 3.5.1 Phân tích cấu trúc chất kháng sinh Sơ đồ quy trình phân tích chất kháng sinh thô chủng HP411 trình bày hình 3.22 14 Hình 3.22 Quy trình phân lập từ cặn chiết tổng tinh chế hợp chất HPE 2.4 Kết phân tích phân đoạn tách chiết sau: - Phân đoạn HPE1.6 thu chất acid béo - Phân đoạn HPE 1.9 xác định có hoạt tính kháng sinh nên phân đoạn chọn để tiếp tục phân tách cột sắc ký pha thường với hệ dung môi rửa giải Hexan-Aceton có tỷ lệ thể tích 5/1 Trên phân đoạn HPE1.9 tách tinh chế lại cột sắc ký pha thường với hệ dung môi rửa giải Hexan-Diclometan-Aceton có tỷ lệ thể tích 15/15/1 thu phân đoạn chất có ký hiệu HPE2.1- 2.5 Trong thu chất HPE2.4 có khối lượng 16mg Chất HPE2.4 sử dụng để xác định cấu trúc NMR - Phân đoạn HPE1.10 phân lập chất HPE3.4 có khối lượng mg Lượng chất HPE3.4 nên không đủ để xác định cấu trúc 15 - Hợp chất HPE 2.4 có dạng bột màu vàng Trên phổ khối lượng xuất tín hiệu [M + H]+ m/z 225.1 cho phép dự đoán công thức phân tử C13H8N2O2 (Hình 3.16) Hình 3.16 Phổ ESI-MS HPE 2.4 Hình 3.17 Phổ 1H-NMR HPE 2.4 16 Hình 3.18 Phổ 1H-NMR giãn rộng HPE 2.4 Hình 3.26 Phổ 13C-NMR HPE 2.4 Hình 3.27 Phổ DEPT90, DEPT135 13C NMR HPE 2.4 17 Bảng 3.30 Dữ liệu phổ hợp chất HPE2.4 so sánh với chất Tubermycin B *δ δC, ppm δC, ppm δH, ppm 124.9,C 124.93, C 137.4, CH 137.41, CH 9.0; dd; J= 1.0, 8.5Hz 130.3, CH 130.27, CH 8.06; m 135.1, CH 135.09, CH 8.54; dd; J= 1.0, 8.5Hz 143.4, C 143.36, C 4a 139.8, C 139.83, C 128.0, CH 127.96, CH 8.29; dd; J= 1.0, 8.5Hz 133.2, CH 133.21, CH 8.03; m 131.7, CH 131.73, CH 7.99; m 130.1, CH 130.27, CH 8.36; dd; J= 1.0, 8.5Hz 144.1, C 144.07, C 9a 140.1, C 140.04, C 10 165.9, C 165.91, C COOH Ghi chú: *δC độ dịch chuyển hóa học chất Tubermycin B công bố Vị trí Dựa vào kiện trên, so sánh với số liệu công bố trước (Samina et al., 2013), thấy chất HPE 2.4 có cấu trúc gần giống với cấu trúc Tubermycin B (hay 1-Phenazinecarboxylic acid) Hình 3.28 Tương tác HMBC HPE2.4 Hình 3.29 Cấu trúc HPE2.4 3.5.2 Kiểm tra hoạt tính sinh học chất kháng sinh Chất kháng sinh HPE2.4 kiểm tra hoạt tính kháng sinh với chủng vi sinh vật gây bệnh (Bảng 3.31) hoạt tính gây độc với dòng tế bào (Bảng 3.32) 18 Bảng 3.31 Khả diệt khuẩn HPE2.4 với chủng vi khuẩn gây bệnh Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) HPE2.4 (µg/ml) S aureus MRSA ATCC 25923 S epidermidis A hydrophila C albican MRSE ATCC 35984 THWQJ ATCC 10231 71,25 ± 0,12 20,83 ± 0,01 51,61 ± 0,05 2,96 ± 0,08 Bảng 3.32 Khả gây độc với dòng tế bào HPE2.4 Giá trị IC50 dòng tế bào (µ µg/ml) Ký hiệu mẫu Hek MCF7 A549 Hela Đối chứng (+) 0,11± 0,05 1,5± 0,12 1,93±0,03 5,28 ±0,13 HPE2.4 Hep-G2 3,66 ± 0,1 35,2± 0,21 6,15±0,04 6,91±0,12 6,84± 0,15 9,28±0, 07 CHƯƠNG BÀN LUẬN KẾT QUẢ 4.1 Sàng lọc vi sinh vật biển có hoạt tính kháng sinh Kết nghiên cứu cho thấy, số lượng xạ khuẩn có hoạt tính đối kháng với vi sinh vật gây bệnh chiếm khoảng 67,9% Điều cho thấy tiềm ứng dụng chất có hoạt tính kháng sinh xạ khuẩn biển y dược (Berdy, 2005; Das et al., 2006; Lam, 2006) Trong số chủng nghiên cứu lựa chọn 16 chủng xạ khuẩn có hoạt tính đối kháng cao để nghiên cứu sàng lọc hoạt chất ứng dụng y dược 4.2 Đặc điểm sinh học phân loại chủng xạ khuẩn biển Theo tài liệu nghiên cứu xạ khuẩn, việc xác định đặc điểm sinh học cần thiết để phân loại định tên chủng xạ khuẩn (Nguyễn Lân Dũng cs, 1998; Lê Gia Hy, 1994, 2010; Rajeswari et al., 2014) Trong nghiên cứu này, 16 chủng xạ khuẩn phân loại đến loài, 15 chủng thuộc chi Streptomyces chủng thuộc chi Nocadiopsis Điều phù hợp với công bố giới, chất có hoạt tính dược học thu phần lớn chi Streptomyces sản sinh 19 ra, chi coi nguồn cung cấp để phát triển loại thuốc (Shin et al., 2008, 2010) 4.3 Nghiên cứu thu nhận chất kháng sinh từ xạ khuẩn biển Trong nghiên cứu thu nhận chất kháng sinh từ xạ khuẩn biển cho thấy, cần phải nghiên cứu lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp cho lên men sinh chất kháng sinh (Jensen et al., 2005; Rath et al., 2005; Ilic et al., 2007; Han et al., 2009) Dung môi cho chiết tách sử dụng ethyl acetate (Gailliot, 1998; Wanner, 2009; Rofiq Bambang 2010; Ravikumar et al., 2012; Rajeswari et al., 2014) Ưu điểm việc sử dụng ethyl acetate loại bỏ cô nhiệt độ 60oC Các chất kháng sinh thô kiểm tra khả đối kháng với vi sinh vật gây bệnh cho thấy, phần lớn chúng có hoạt phổ kháng khuẩn rộng, ức chế mạnh vi sinh vật gây bệnh như: Salmonella typhimurium ATCC 14028, Escherichia coli ATCC 25922, Sarcina lutea M5, K pneumoniae ATCC 13883, Bacillus cereus ATCC 11778, Enterobacter aerogenes ATCC 13048; Acinetobacter baumannii ATCC 19606; Staphylococcus aureus ATCC 29213; Aeromonas hydrophila THWQJ; Candida albicans ATCC 10231, đặc biệt khả ức chế hai chủng vi khuẩn gây bệnh kháng thuốc MRSA ATCC 25923 MRSE ATCC 35984 Quá trình tìm kiếm phát triển hợp chất có tiềm điều trị bệnh ung thư từ chủng xạ khuẩn biển gia tăng hội để phát triển loại thuốc cho y dược (Li et al., 2006; Kwon et al., 2006; Shin et al., 2008, 2010) Trong nghiên cứu luận án cho thấy, chất chủng TB5.3 khả gây độc với dòng tế bào ung thư Hep-G2, MCF7, RD FL Chất thô chủng HPN11 có khả gây độc với dòng tế bào MCF7 với lượng tế bào sống sót 43,64% Chất thô thu từ chủng HP411 NA115 có hoạt tính gây độc với dòng tế bào Hep-G2, RD FL không gây độc dòng tế bào MCF7 Tuy nhiên, chất thô chủng HP411 lại khả gây độc với dòng tế bào M14 NCIH460 Trên nghiên cứu phân tích phổ IR kết sắc đồ mỏng (TLC) cho thấy có xuất nhiều chất khác Trong chất thô chủng xạ khuẩn cho thấy sản phẩm thứ cấp, 20 nghiên cứu tách chiết tinh chất kháng sinh cần phải trải qua nhiều bước phức tạp: lựa chọn hệ dung môi cho phù hợp Trong nghiên cứu đưa dự đoán 2- chất có mặt chất kháng sinh thô; chất dự đoán số liên kết amin/amino, có vòng benzen, có nhóm S-S, có nhóm OH, COOH nhóm chức có mặt nhiên kinh phí thời gian nên luận án tiến hành tinh xác định chất kháng sinh chủng xạ khuẩn HP411 4.4 Nghiên cứu lên men thu nhận chất kháng sinh chủng HP411 Trong nghiên cứu này, nghiên cứu tối ưu điều kiện lên men thực phương pháp tối ưu đáp ứng bề mặt để lên men sinh chất kháng sinh chủng S.variabilis HP411, sau dựa vào phần mềm xây dựng lên phương trình tối ưu cho sinh chất kháng khuẩn Phân tích phù hợp thí nghiệm tối ưu hóa chủng xạ khuẩn biển HP411 đánh giá mô hình hoàn toàn có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 99,94% yếu tố có ảnh hưởng tới hoạt tính kháng sinh chủng HP411 Kết nghiên cứu động thái lên men chủng xạ khuẩn HP411 cho kết quả, thời gian đạt hoạt tính kháng sinh cao 96 giờ, hoạt tính kháng khuẩn đạt 34,6 mm Đây thời gian thích hợp thu dịch lên men để tách chiết chất kháng sinh chủng 4.5 Phân tích cấu trúc chất kháng sinh chủng HP411 Chất kháng sinh thô HP411 tinh theo quy trình hình 3.27 thu được: Một acid béo, chất tinh HPE2.4 HPE3.4 Chất HPE2.4 dự đoán công thức phân tử C13H8N2O2 Số liệu phổ HPE2.4: H-NMR (500 MHz, CDCl3), δH (ppm):8.99 (1H, dd,J= 1.0, 8.5Hz, H-2), 8.06 (1H, m, H-3), 8.54 (1H,dd, J = 1.0, 8.5 Hz, H-4), 8.29 (1H,dd, J = 1.0,8.5Hz, H-6), 8.03 (1H, m, H-7), 7.99 (1H, m, H-8), 8.36 (1H,dd,J = 1.0,8.5Hz, H-9) 13 C-NMR (500 MHz, CDCl3), δC (ppm): 124.93 (C-1); 137.41 (C-2); 130.27 (C-3); 135.09 (C-4); 143.36 (C-4a); 139.83 (C-5); 127.96 (C-6); 21 133.21 (C-7); 131.73 (C-8); 130.27 (C-9); 144.07 (C-9a); 140.04 (C-10); 165.91 (COOH) ESI-MS (positive): m/z 225.1[M + H]+ Dựa vào số liệu phổ NMR cho thấy chất HPE2.4 thuộc nhóm phenazine, so sánh với số tài liệu công bố trước cho thấy chất HPE2.4 có nhiều đặc điểm gần giống với chất Tubermycin B (1Phenazinecarboxylic acid, viết tắt PCA) (Samina et al., 2013) (Bảng 3.30) Theo số nghiên cứu, năm 1961 Nagatsu cộng tìm chất kháng sinh đặt tên Tubermycin B, chất sinh từ chủng xạ khuẩn S amakuaensis now sp (Nakamura et al., 1961) Tuy nhiên, chất tubermycin B hay PCA dẫn xuất thuộc nhóm phenazine có hoạt tính kháng nấm gây bệnh cho thực vật sử dụng nông nghiệp Chất PCA thử khả gây độc tế bào hoạt tính gây độc với dòng tế bào ung thư (Gurusiddaiah et al, 1986) Các hợp chất có tiềm ứng dụng công nghệ sinh học như: phản ứng oxy hóa khử tế bào, có hoạt tính chống u, hoạt tính kháng khuẩn, gây độc với tế bào ung thư (Gebhardt et al., 2002; Kamal et al., 2012) Các chất phenazine sinh từ nhiều chủng vi sinh vật khác nhau, có xạ khuẩn vi khuẩn Chủng xạ khuẩn biển Nocardia dassonvillei BM-17 có khả sinh N-(2-hydroxyphenyl)-2phenazine (NHP) chất kháng sinh, chất có hoạt tính kháng nấm Candida albicans có khả gây độc với dòng tế bào HepG2, A549, HCT-116 COC1 (Gao et al., 2012) Theo Saleh et al., 2012 Ramos et al., 2010, chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces S anulatus 9663 (Saleh et al., 2012), S cinnamonensis (Haagen et al., 2006), S lomondensis (Johnson Dietz, 1969) S misakiensis (Nakamura, 1961) có khả sinh kháng sinh PCA Hoạt tính sinh học chất HPE2.4 chủng HP411 có nhiều đặc điểm khác biệt so với chất tubermycin công bố, đặc biệt hoạt tính sinh học Hoạt tính kháng vi sinh vật gây bệnh HPE2.4: chất có hiệu diệt vi khuẩn gây bệnh S aureus MRSA ATCC 25923 S epidermidis MRSE ATCC 35984 C albican ATCC 10231 với giá 22 trị IC50 khác 71,25; 20,83 2,96 µg/ml Hiệu diệt khuẩn HPE2.4 MRSE tốt (Bảng 3.31) Khả gây độc HPE2.4 HPE3.4 thực dòng tế bào ung thư, kết chất HPE3.4 chưa rõ ràng nên không công bố, kết thử dòng tế bào HPE2.4 rõ nét (Bảng 3.32) HPE2.4 có khả gây độc mạnh với dòng tế bào ung thư MCF7, A549, Hela Hep-G2 với giá trị IC50 6,15; 6,91; 6,84 9,28 µg/ml gây độc với dòng tế bào Hek giá trị IC50 35,2 µg/ml Chất HPE2.4 có tiềm phát triển thành thuốc kháng ung thư xem công bố chất HPE2.4 thu từ chủng xạ khuẩn biển S variabilis HP411 phân lập Việt Nam có hoạt tính gây độc với dòng ung thư phổi hiệu so với dòng tế bào ung thư vú nồng độ thấp khả gây độc với dòng tế bào lành Chất HPE2.4 có hiệu diệt chủng vi khuẩn gây bệnh kháng kháng sinh cao chủng S epidermidis MRSE ATCC 35984 với giá trị MIC 20,83 µg/ml, chủng S aureus MRSA ATCC 25923 với giá trị 71,25 µg/ml chủng A hydrophila THWQJ với giá trị 51,61 µg/ml, mà có hoạt tính mạnh với chủng nấm men C albicans ATCC 10231 với giá trị 2,96 µg/ml Như vậy, với nghiên cứu công bố giới số kết sơ đạt nghiên cứu nhận định tiềm tìm chất từ xạ khuẩn biển nhằm ứng dụng vào y dược cần thực nghiên cứu sâu KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Từ 97 chủng xạ khuẩn phân lập từ vùng biển Việt Nam sàng lọc 70 chủng xạ khuẩn có khả đối kháng với loại vi sinh vật kiểm định lựa chọn 16 chủng xạ khuẩn có hoạt tính đối kháng cao với chủng vi sinh vật gây bệnh như: S epidermidis ATCC 12228, E coli ATCC 11105 C albicans ATCC 10231 để thực nghiên cứu sàng lọc chất kháng sinh 23 Kết nghiên cứu đặc điểm sinh học phân loại 16 chủng xạ khuẩn định danh đến chi chủng (7 chủng thuộc chi Streptomyces chủng thuộc chi Nocardiopsis) chủng phân loại đến loài là: Streptomyces scabiei NA113, chủng S tendae NA115, chủng S coelicoflavus NA116, chủng S variabilis HP411; chủng S griseoincarnatus HPN11, chủng S griseorubens HPX12, chủng S albogriseolus VD111 chủng S viridodiastaticus TB5.3 Đã nghiên cứu lựa chọn môi trường, điều kiện lên men dung môi tách chiết thích hợp để thu nhận chất kháng sinh thô từ chủng xạ khuẩn: NA113, NA115, HP411, HPN11, HPX12, VD111, C141 TB5.3 Chất kháng sinh thô nhận có hoạt phổ kháng khuẩn rộng (ức chế vi khuẩn kháng thuốc MRSA, MRSE nấm men) gây độc với dòng tế bào ung thư Chất kháng sinh thô nhận từ chủng NA113, NA115, HP411, HPX12, VD111 C141 có khả gây độc tế bào với dòng tế bào ung thư Hep-G2, MCF7, RD FL với giá trị IC50 nhỏ 40 µg/ml, chất từ chủng VD111 TB5.3 gây độc với dòng tế bào M14 HeLa với IC50 26,04; 14,59; 29,56 29,93; chất từ chủng HPX12 gây độc tế bào NCIH460 với IC50 3,93 µg/ml Đặc biệt, chất kháng sinh thô từ chủng HP411, HPN11, HPX12, VD111 TB5.3 không gây độc tế bào thận lành tính Hek293 giá trị 40 µg/ml Nghiên cứu tối ưu hóa môi trường lên men cho chủng S variabilis HP411 theo phương pháp đáp ứng bề mặt, thu môi trường tối ưu M1ASW-32 cải tiến (g/l): Tinh bột tan 10,01; cao nấm men 4,61; peptone 4,65 pH trung tính, hoạt tính kháng sinh cao đạt thời điểm 96 lên men Đã phân tích cấu trúc chất kháng sinh thô thu từ chủng S variabilis HP411 thu chất acid béo, chất tinh HPE3.4 chất tinh HPE2.4 Chất HPE2.4 phân tích NMR cho thấy, công thức cấu tạo chất C13H8N2O2 có cấu trúc vòng benzen thuộc nhóm phenazine Chất HPE2.4 có hoạt tính kháng vi sinh vật gây bệnh MRSA ATCC 25923, MRSE ATCC 35984 C albicans ATCC 10231 với giá trị IC50 24 71,25; 20,83 2,96 µg/ml Chất gây độc với dòng tế bào ung thư MCF7, A549, Hela Hep-G2 với giá trị IC50 6,15; 6,91; 6,84 9,28 µg/ml KIẾN NGHỊ Tiếp tục tách chiết, phân tích xác định cấu trúc chất HPE3.4 chủng HP411 để nghiên cứu thêm hoạt tính kháng vi sinh vật diệt tế bào ung thư chất Tiếp tục nghiên cứu tách chiết tinh hoạt chất chủng xạ khuẩn lại để sàng lọc chất kháng sinh kháng ung thư nghiên cứu chất có hoạt tính chống oxy hóa chủng xạ khuẩn VD111 CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TIẾN SĨ Phạm Thanh Huyền, Lê Gia Hy, Nguyễn Phương Nhuệ (2012) Phân loại chủng xạ khuẩn biển VD112 có hoạt tính kháng khuẩn Báo cáo khoa học nghiên cứu giảng dạy sinh học Việt Nam: 537-542 Nguyễn Phương Nhuệ, Phạm Thanh Huyền, Hồ Văn Hoàn, Lê Gia Hy (2012) Đặc điểm sinh học số chủng xạ khuẩn biển có hoạt tính kháng khuẩn Báo cáo khoa học nghiên cứu giảng dạy sinh học Việt Nam: 637-642 Nguyễn Văn Hiếu, Phạm Thanh Huyền, Lê Gia Hy, Phí Quyết Tiến, Vũ Thị Hạnh Nguyên, Phan Thị Hồng Thảo, Nguyễn Phương Nhuệ (2012) Phân lập định tên chủng HLĐ 3.16 có hoạt tính kháng sinh từ vùng ven bờ biển Việt Nam Tạp chí Khoa học Công nghệ 50 (5): 579- 591 Phạm Thanh Huyền, Lê Gia Hy, Nguyễn Phương Nhuệ (2013) Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy tới hoạt tính kháng khuẩn chủng xạ khuẩn VD115 phân lập từ vùng biển Việt Nam Báo cáo khoa học hội nghị khoa học công nghệ sinh học toàn quốc 2013 (2): 271 - 274 Phạm Thanh Huyền, Hồ Tuyên, Nguyễn Văn Hiếu, Lê Gia Hy, Phí Quyết Tiến, Nguyễn Phương Nhuệ (2013) Một số đặc điểm sinh học khả sinh chất kháng khuẩn vi khuẩn lam phân lập từ vùng ven biển miền Bắc Việt Nam Tạp chí Khoa học Công nghệ 11 (2): 369-377 25 Pham T Huyen, Le G Hy, Phi Q Tien, Ho Tuyen, Bach T M Hoa, Vu T H Nguyen, Dang T.T Duong, Quach N Tung, Nguyen P Nhue (2013) Isolation and characterization of marine actinomycetes HP411 and its potential in antibacterial and anticancer activity The 3rd conference on Natural Science for Master and PhD Students from ASEAN: 296-306 Phạm Thanh Huyền, Bạch Thị Mai Hoa, Phí Quyết Tiến, Nguyễn Phương Nhuệ, Lê Gia Hy (2014) Hoạt tính kháng khuẩn kháng ung thư chủng xạ khuẩn biển Streptomyces variabilis HP411 Tạp chí Khoa học Công nghệ 12 (2): 221-22 Phạm Thanh Huyền, Lê Gia Hy, Phí Quyết Tiến, Quách Ngọc Tùng, Đặng Thị Thùy Dương, Nguyễn Phương Nhuệ (2014) Hoạt tính kháng khuẩn kháng tế bào ung thu chủng xạ khuẩn Streptomycetes scabies NA113 phân lập từ hệ sinh thái ngập mặn ven biển Diễn Châu- Nghệ An Tạp chí Khoa học Công nghệ 50(5A): 623-629 Phạm Thanh Huyền, Nguyễn Phương Nhuệ, Lê Gia Hy, Phí Quyết Tiến (2014) Đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn Streptomycetes scabies NA113 có hoạt tính kháng khuẩn kháng tế bào ung thu Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ 30(6S): 465-470 10 Huyen T Pham, Nhue P Nguyen, Tien Q Phi, Phuong T Dang, Hy G Le (2014) The antibacterial and anticancer activity of marine actinomycete strain HP411 isolated in the northern coast of Vietnam International Journal of Medical, Health, Pharmaceutical and Biomedical Engineering Vol: 8(12): 753- 757 26