ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM MẪN VĂN HOẰNG Tên đề tài: PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN NHỮNG CHỦNG NẤM MEN CÓ KHẢ NĂNG LÊN MEN RƢỢU CAO TỪ BÁNH MEN THU THẬP TẠI YÊN PHONG - BẮC NINH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa :CNSH & CNTP Khóa học : 2011 - 2015 Thái Nguyên, 2016 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM MẪN VĂN HOẰNG Tên đề tài: PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN NHỮNG CHỦNG NẤM MEN CÓ KHẢ NĂNG LÊN MEN RƢỢU CAO TỪ BÁNH MEN THU THẬP TẠI YÊN PHONG - BẮC NINH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Lớp : 43 - CNSH Khoa : CNSH & CNTP Khóa học : 2011 - 2015 Giảng viên hướng dẫn: TS Trần Văn Chí Thái Nguyên, 2016 i LỜI CẢM ƠN Được tạo điều kiện giúp đỡ, quan tâm thầy cô giáo bạn bè, thời gian vừa hoàn thành khóa luận tốt nghiệp phòng thí nghiệm khoa Công Nghệ Sinh Học & Công Nghệ Thực Phẩm – Trường Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS.Trần Văn Chí giảng viên khoa Công Nghệ Sinh Học & Công Nghệ Thực phẩm trường Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên hướng dẫn giúp đỡ suốt thời gian thực làm khóa luận tốt nghiệp Xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo khoa Công Nghệ Sinh Học & Công Nghệ Thực Phẩm bảo, hướng dẫn tận tình kỹ phòng thí nghiệm Động viên tình thần tạo điều kiện tốt để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Cuối xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè động viên giúp đỡ suốt thời gian hoàn thánh khóa luận Thái Nguyên, ngày tháng năm Ngƣời thực Mẫn Văn Hoằng ii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1 Thành phần lít môi trường Hansen 30 Bảng 3.2 Thành phần lít môi trường Malt – Cao Nấm Men - Peptone 30 Bảng 4.1 Kết đo giá trị OD 50 chủng nấm men phân lập 35 Bảng 4.2 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc 50 chủng nấm men 37 Bảng 4.3 Kết thử khả lên men loại đường 40 Bảng 4.4 Kết thử khả lên men dịch chiết malt tỉ lệ 41 Bảng 4.5 Kết chưng cất dịch tinh bột cơm dịch chiết malt 43 iii DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 2.1 Cấu tạo tế bào nấm men [11] 17 Hình 3.1 Hình ảnh số khuẩn lạc 32 Hình 3.2 Ảnh kết việc quan sát qua kính hiển vi chủng 43.1 33 Hình 4.1 Kết thử khả lên men đường glucose số chủng 40 Hình 4.2 Hình ảnh kết thử khả lên men dịch chiết malt 41 Hình 4.3 Hình ảnh số chủng thử hoạt tính catalase 42 Hình 4.4 Đồ thị kháo sát ảnh hưởng nồng độ đường tới phát triển chủng nấm men 34.1 44 Hình 4.5 Đồ thị khảo sát ảnh hưởng nồng độ peptone đến phát triển chủng nấm men 34.1 44 Hình 4.6 Đồ thị khảo sát ảnh hưởng PH ban đầu đến sinh trưởng phát triển chủng nấm men 34.1 45 iv MỤC LỤC Trang PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu yêu đề tài 1.2.1 Mục tiêu đề tài 1.2.2 yêu cầu đề tài 1.3 Ý nghĩa đề tài 1.3.1 Ý nghĩa khoa học 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược rượu 2.1.1 Phân loại rượu 2.1.2 Quy trình sản xuất Rượu [9] 12 2.2 Nấm Men 16 2.2.1 Hình thái cấu tạo nấm men [2] 16 2.2.2 Dinh dưỡng nấm men [2] 18 2.2.3 Sinh sản nấm men [2] 22 2.2.4 Sinh trưởng nấm men [2] 23 2.2.5 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa nấm men[2] 24 PHẦN ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 3.1 Đối Tượng Phạm Vi Nghiên Cứu 29 3.1.1 Đối Tượng 29 3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 29 3.2 Thời gian địa điểm 29 3.3 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 29 v 3.3.1 Thiết bị 29 3.3.2 Dụng cụ 29 3.3.3 Hóa chất 29 3.4 Nội dung nghiên cứu 30 3.5 Các phương pháp nghiên cứu 30 3.5.1 Phương pháp nghiền pha loãng mẫu [7] 30 3.5.2 Phương pháp phân lập [3] 31 3.5.3 Phương pháp cấy truyền giữ giống [3] 31 3.5.4 Phương pháp quan sát đặc điểm hình thái 31 3.5.5 Phương pháp dịch chiết malt [1] 33 3.5.6 Phương pháp đếm số lương tế bào buồng đếm hồng cầu [7] 33 3.5.7 Phương pháp xác định sinh khối nấm men phương pháp đo OD [7] 33 3.5.8 Phương pháp xác định khả lên men [1] 34 3.5.9 Phương pháp chưng chất xác định nồng độ rượu [8] 34 PHẦN KẾT QUẢ THẢO LUẬN 35 4.1 Kết phân lập 35 4.2 Tuyển chọn số chủng nấm men cá khả lên men rượu mạnh 39 4.2.1 Thử khả lên men loại đường 39 4.2.2 Thử khả lên men dịch chiết Malt 41 4.2.3 Thử hoạt tính Catalase 42 4.2.4 Xác định nồng độ cồn tuyển chọn 42 4.3 Tối ưu hóa điều kiện sinh trưởng phát triển chủng Sacchoromyces cerevisiae 34.1 43 4.3.1 Khả sử dụng nguồn carbon ( đường glucose) 43 4.3.2 Khả sử dụng nguồn nitơ (peptone) 44 4.3.4 Ảnh hưởng PH 44 vi 4.4 Định danh sơ 45 PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46 5.1 Kết luận 46 5.2 Đề nghị 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Nước ta nước nông nghiệp, với nhiều nếp văn hóa truyền thống vùng miền khác Từ miền Bắc tới miền Nam lúa gắn bó lâu đời trở lên quen thuộc Xa hơn, từ thời trung cổ châu Âu việc trồng lúa phổ biến rộng rãi Cho lên sản phẩm từ lúa người tạo có bia, rượu Một loại đồ uống mà ưu chuộng sử dụng rộng rãi Việc làm bia rượu lúc thô sơn đơn giản, nên chất lượng chưa cao Vì lúc người chưa hiểu rõ chất việc sinh rượu điều kiện Hiện sau nhiều kỉ, với tiến phát triển loài người nắm nhiều kiến thức khoa học kỹ thuật Chất lượng rượu nâng lên rõ dệt, người biết tuyển chọn lọc chủng vi sinh vật trình làm rượu Quá trình gọi lên men rượu, bia Chủng vi sinh vật sử dụng lên men chủ yếu nấm men Mỗi vùng miền khác lại có chủng nấm men khác chất lượng rượu khác Ở quy mô sản xuất rượu nhỏ lẻ hộ gia đình vung quê nước ta, việc sử dụng chủng nấm men mang tính dân dã theo kinh nghiệm Cho nên việc lên men rượu chưa tối ưu hóa khả lên men chất lượng rượu chưa ổn định Trước trạng đó, để góp phần nâng cao chất lượng rượu tối ưu hóa khả lên men số chủng nấm men địa phương tiến hành “Phân lập tuyển chọn chủng nấm men có khả lên men rượu cao từ bánh men thu thập Yên Phong- Bắc Ninh” nhằm tìm chủng nấm men tốt tối ưu hóa điều kiện sinh trưởng phát triển Phục vụ cho viêc nghiên cứu ứng dụng vào thực tế 1.2 Mục tiêu yêu đề tài 1.2.1 Mục tiêu đề tài Từ mẫu bánh men thu thập địa phương, ta tiến hành phân lập tuyển chọn chủng có khả lên men rượu tốt tối ưu hóa điêu kiện nuôi cấy 1.2.2 Yêu cầu đề tài Phân lập chủng nấm nen từ mẫu bánh men Tuyển chọn nấm men có khả lên men rượu cao định danh Tối ưu hóa điều kiện nuôi sinh trưởng chủng nấm men 1.3 Ý nghĩa đề tài 1.3.1 Ý nghĩa khoa học Sơ đánh giá mẫu bánh men thu thập có loại vi sinh vật chủ yếu ý nghĩa loại vi sinh vật trình lên men Tìm chủng nấm men có khả lên men tốt mẫu bánh men 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn Sau có kết đề tài ứng dụng vào quy mô sản xuất rượu nhỏ lẻ địa phương tiền đề để ứng dụng trình lên men rượu với quy mô công nghiệp 33 Hình 3.2 Ảnh kết việc quan sát qua kính hiển vi chủng 43.1 3.5.5 Phương pháp dịch chiết malt [1] Nghiền malt, sau cân lấy 100(g) Malt hòa 300ml nước cất Sau đem đun 450 30 phút Thêm 200 ml nước cất, tăng nhiệt độ lên 700 khuấy Thử Lugol đến không thấy xuất màu xanh dừng lại Sau đem lọc, trùng 110 C vòng 30 phút, bảo quản tủ lạnh độ C để dùng dần 3.5.6 Phương pháp đếm số lương tế bào buồng đếm hồng cầu [7] Dàn tế bào nấm men giọt nước cất vô trùng buồng đếm hồng cầu Đặt mép lamen sát với mép giọt canh trường sau nghiêng lamen góc 450, hạ từ từ xuống cho giọt canh trường bị ép buồng đếm hồng cầu phiến kính Quan sát đếm số lượng tế bào kính hiển vi 3.5.7 Phƣơng pháp xác định sinh khối nấm men phƣơng pháp đo OD [7] 34 - Nguyên lý: Tế bào nấm men phát triển làm đục dịch nuôi cấy làm cho dịch nuôi cấy chuyển sang dạng huyền phù Độ đục dịch nuôi cấy tỉ lệ thuận với mật độ tế bào nấm men dịch nuôi cấy Dựa vào khả hấp phụ ánh sang bước song 550 – 620 nm nấm men Khả hấp phụ ánh sang cao mật độ tế bào nấm men cao, giá trị OD đo lớn - Tiến hành: Bật máy so màu chuyển sang bước song 620 nm Hút vào curvet 1- ml mấu đối chứng đưa vào giếng đo đợi máy hiển thị kết ghi lại giá trị OD đo 3.5.8 Phương pháp xác định khả lên men [1] - Cơ sở phương pháp: Trong trình lên men dịch đường nấm men sinh khí CO2 mà khí CO2 đẩy ống durhan lên ống nghiệm Chủng có khả lên men mạnh tạo khí đẩy ống Durhan lên thời gian ngắn - Tiến hành: cho 20ml dịch gồm môi trường sở – % loại đường mà định thử khả lên men vào ống nghiệm có chứa sẵn ống durhan Thanh trùng 1210C 15 phút Để nguội cấy nếm men vào quan sát tính thời gian lên men chủng đẩy ống Durhan lên cao 5cm 3.5.9 Phương pháp chưng chất xác định nồng độ rượu [8] Tiền hành: lấy 100ml dịch sau lên men có nhiệt độ khoảng 200C cho vào bình định mức 100ml, rót dịch lên men vào định mức lên khoảng 300ml Tiến hành chưng cất lượng rượu thô đạt khoảng 100ml dừng lại đậy kín rượu thô lại Dùng cồn kế để trực tiếp đọc giá trị đo phần lên cồn kế Tính nồng độ cồn theo công thức N1 = Trong N1: nồng độ cần tính 35 N2 : Nồng độ cồn chưng cất V1: thể tích dịch đem chưng cất V2 thể tích rượu chưng cất từ V1 PHẦN KẾT QUẢ THẢO LUẬN 4.1 Kết phân lập Từ mẫu bánh men thu thập huyện Yên Phong Tỉnh Bắc Ninh phân lập 50 chủng nấm men Với giá trị OD đo thể sinh trưởng phát triển nấm men môi trường Hansen lỏng Bảng 4.1 Kết đo giá trị OD 50 chủng nấm men phân lập đƣợc STT Giá trị mật độ quang Ký hiệu chủng 0h 6h 12h 18h 24h 30h 36h 21.1 0.438 1.116 1.258 1.450 1.497 1.519 1.538 21.2 0.436 1.392 1.452 1.546 1.518 1.583 1.645 21.3 0.510 1.407 1.447 1.553 1.569 1.622 1.652 22.1 0.527 1.380 1.373 1.456 1.473 1.448 1.444 22.2 0.555 1.305 1.285 1.49 1.523 1.596 1.607 22.3 0.583 1.349 1.485 1.485 1.506 1.540 1.563 25.3 0.572 1.263 1.561 1.600 1.649 1.730 1.680 24.2 0.575 1.535 1.528 1.595 1.669 1.704 1.670 24.1 0.536 1.545 1.539 1.612 1.699 1.775 1.792 10 25.1 0.553 1.656 1.625 1.687 1.740 1.756 1.754 11 23.3 0.560 1.608 1.643 1.665 1.670 1.729 1.738 12 23.1 0.566 1.580 1.624 1.681 1.716 1.726 1.736 13 25.2 0.555 1.300 1.552 1.604 1.654 1.785 1.658 14 26.1 0.512 1.285 1.609 1.678 1.728 1.769 1.751 15 23.2 0.570 1.586 1.653 1.655 1.657 1.767 1.720 16 26.2 0.773 1.237 1.547 1.669 1.666 1.670 1.670 17 26.3 0.693 1.345 1.549 1.738 1.761 1.770 1.773 36 18 26.4 0.760 1.391 1.592 1.743 1.752 1.778 1.783 19 29.1 0.833 1.344 1.575 1.676 1.694 1.689 1.687 20 29.2 0.571 1.205 1.406 1.625 1.655 1.634 1.612 21 29.3 0.542 1.293 1.476 1.672 1.676 1.677 1.677 22 29.4 0.323 1.353 1.558 1.611 1.599 1.570 1.552 23 27.1 0.642 1.411 1.617 1.710 1.735 1.153 1.740 24 27.2 0.942 1.406 1.630 1.672 1.701 1.710 1.709 25 30.1 0.557 1.172 1.331 1.641 1.558 1.639 1.556 26 30.2 0.583 1.287 1.408 1.654 1.668 1.647 1.643 27 30.3 0.600 1.142 1.227 1.636 1.680 1.712 1.742 28 30.4 0.545 1.310 1.417 1.654 1.676 1.658 1.657 29 28.1 0.610 1.343 1.613 1.637 1.722 1.707 1.706 30 28.2 0.432 1.165 1.317 1.619 1.656 1.647 1.658 31 28.3 0.593 1.240 1.386 1.649 1.684 1.676 1.730 32 28.4 0.612 1.291 1.429 1.672 1.702 1.671 1.684 33 27.3 0.602 1.278 1.376 1.648 1.659 1.664 1.624 34 27.4 0.423 1.060 1.472 1.701 1.800 1.731 1.729 35 32.1 0.647 1.305 1.456 1.600 1.698 1.690 1.700 36 32.2 0.587 1.280 1.342 1.410 1.529 1.523 1.644 37 32.3 0.430 1.223 1.435 1.514 1.599 1.555 1.634 38 32.4 0.487 1.255 1.341 1.499 1.657 1.521 1.667 39 34.1 0.673 1.454 1.511 1.500 1.481 1.487 1.477 40 3.3 0.556 1.272 1.481 1.622 1.849 1.869 1.890 41 4.2 0.440 1.320 1.225 1,411 1.566 1.562 1.590 42 4.4 0.457 1.158 1.366 1.442 1.550 1.645 1.688 43 3.7 0.400 0.595 1.00 1.215 1.340 1.358 1.328 44 5.8 0.512 1.440 1.458 1.500 1.605 1.634 1.641 45 5.3 0.531 1.240 1.420 1.527 1.651 1.683 1.689 46 5.2 0.610 1.320 1.420 1.602 1.716 1.765 1.808 47 11.3 0.543 1.517 1.613 1.674 1.682 1.700 1.733 37 48 3.5 0.478 1.418 1.425 1.456 1.472 1.472 1.437 49 4.3 0.357 1.032 1.525 1.587 1.611 1.301 1.305 50 12.3 0.482 1.380 1.614 1.649 1.693 1.718 1.737 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc 50 chủng trình bày bảng 4.2 Bảng 4.2 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc 50 chủng nấm men STT Ký hiệu chủng Đặc điểm khuẩn lạc 21.1 Tròn, lồi, bề mặt bóng màu trắng sữa, tâm 21.2 Tròn, bề mặt bóng, màu trắng ngà, tâm 21.3 Hơi tròn, bẹt, bề mặt bóng, màu trắng sữa, có tâm 22.1 Tròn, lồi, bề mặt bóng màu trắng sữa, tâm 22.2 Hơi tròn, bẹt, bề mặt bóng, màu trắng ngà, có tâm 22.3 Tròn, bẹt, bề mặt bóng, màu trắng sữa, có tâm 25.3 Tròn, lồi, bề mặt bóng màu trắng ngà, tâm 24.2 Hơi tròn, bề mặt bóng, màu trắng ngà, tâm 24.1 Tròn, lồi, bề mặt bóng,màu trắng ngà, có tâm 10 25.1 Hơi tròn, bề mặt bóng, màu trắng ngà, tâm 11 23.3 Tròn, lồi, bề mặt bóng màu trắng ngà, tâm 12 23.1 Hơi tròn, bề mặt nhăn, màu trắng ngà, có tâm 13 25.2 Hơi tròn, bẹt, bề mặt bóng, màu trắng ngà có tâm 14 26.1 Tròn, lồi bề mặt nhăn, màu trắng sữa, tâm 15 23.2 Tròn, lồi, bề mặt bóng, màu trắng sữa, tâm 16 26.2 Tròn, lồi, bề mặt bóng, màu trắng sữa, tâm 17 26.3 Tròn, lồi, bề mặt bóng màu trắng ngà, tâm 18 26.4 Hơi tròn, bẹt, bề mặt bóng, màu trắng ngà, có tâm 19 29.1 Tròn, lồi, bề mặt bóng, màu trắng sữa, tâm 20 29.2 Hơi tròn, bề mặt bóng, màu trắng ngà, tâm 21 29.3 Tròn, lồi, bề mặt bóng, màu trắng sữa, tâm 22 29.4 Tròn, lồi, bề mặt bóng màu trắng ngà, tâm 38 23 27.1 Hơi tròn, bề mặt bóng, màu trắng ngà, tâm 24 27.2 Tròn, lồi, bề mặt bóng, màu trắng sữa, tâm 25 30.1 Tròn, lồi, bề mặt bóng màu trắng ngà, tâm 26 30.2 Tròn, bẹt, bề mặt bóng, màu trắng ngà, có tâm 27 30.3 Hơi tròn, bề mặt bóng, màu trắng ngà, tâm 28 30.4 Tròn, lồi, bề mặt bóng, màu trắng sữa, tâm 29 28.1 Tròn, lồi, bề mặt bóng màu trắng ngà, tâm 30 28.2 Hơi tròn, bẹt, bề mặt bóng, màu trắng ngà có tâm 31 28.3 Hơi tròn, bề mặt bóng, màu trắng ngà, tâm 32 28.4 Tròn, lồi, màu trắng ngà, có tâm 33 27.3 Hơi tròn, bẹt, bề mặt bóng, màu trắng ngà có tâm 34 27.4 Hơi tròn, bề mặt bóng, màu trắng ngà, tâm 35 32.1 Tròn, bẹt, màu trằng sữa, tâm 36 32.2 Hơi tròn, bẹt, màu trắng sữa, tâm 37 32.3 Tròn, lồi, bề mặt nhăn màu trắng sữa, có tâm 38 32.4 Hơi tròn, bề mặt bóng, màu trắng ngà, tâm 39 34.1 Tròn, bề mặt bóng, màu trắng ngà, có tâm 40 3.3 Tròn, lồi, bề mặt bóng màu trắng ngà, tâm 41 4.2 Tròn, lồi, bề mặt bóng màu trắng ngà, tâm 42 4.4 Hơi tròn, bẹt, bề mặt bóng, màu trắng ngà có tâm 43 3.7 Tròn, lồi, bề mặt bóng, màu trắng sữa, tâm 44 5.8 Hơi tròn, bề mặt bóng, màu trắng ngà, tâm 45 5.3 Hơi tròn, bẹt, bề mặt bóng, màu trắng ngà có tâm 46 5.2 Tròn, lồi, bề mặt bóng, màu trắng sữa, tâm 47 11.3 Tròn, lồi, bề mặt bóng màu trắng ngà, tâm 48 3.5 Hơi tròn, bề mặt bóng, màu trắng ngà, tâm 49 4.3 Hơi tròn, bẹt, bề mặt bóng, màu trắng ngà có tâm 50 12.3 Tròn, lồi, bề mặt bóng, màu trắng sữa, tâm 39 Từ bảng 4.1.Qua đánh giá sơ giá trị OD chọn ra chủng 22.1, 26.2, 28.2, 32.3, 32.4, 34.1 có khả tăng sinh mạnh, nên chủng sử dụng cho thí nghiệm 4.2 Tuyển chọn số chủng nấm men có khả lên men rƣợu mạnh Để tuyển chọn số chúng có khả lên men rượu mạnh, từ chủng mà chọn thông qua đánh giá sơ Tôi tiến hành thí nghiệm để chọn chủng có khả lên men rượu mạnh 4.2.1 Thử khả lên men loại đường Dựa vào chất trình lên men chuyển hóa loại đường có dịch đường nấm men thành rượu ethylic, CO sản phẩm bậc Chủng nấm men có khả lên men mạnh tạo khí thời gian ngắn Glucose loại đường mà tất chủng nấm men sử dụng được, thử với D – glucose cho kết dương tính ta thực tiếp với loại đường Tiến hành: cho 20 ml dịch (môi trường sở – 2% loại đường định thử khả lên men) vào ống thủy tinh có sẵn ống Durhan Thanh trùng dịch 1210C 15 phút Để nguội cấy cấy 100ml nấm men (đã tăng sinh môi trường Hansen lỏng ) vào môi trường Tiến hành quan sát theo dõi thời gian chủng sinh khí CO2 đẩy ống Durhan lên cao 5cm Thời gian theo dõi vòng 30 40 Hình 4.1 Kết thử khả lên men đƣờng glucose số chủng Bảng 4.3 Kết thử khả lên men loại đƣờng Chủng Các loại đƣờng Glucose Lactose Saccarose 22.1 Nổi sau 18 Nổi sau 18 Khổng 26.2 Nổi sau 30 Nổi sau 34 Khổng 28.2 Nổi sau16 Nổi sau 25 Nổi sau 19 32.3 Nổi sau30 Không Nổi sau 34 32.4 Nổi sau 27 Không Nổi sau 30 34.1 Nổi sau 12 Nổi sau 20 Nổi sau 21 Từ bảng 4.3 ta tiếp tục chọn chủng 22.1, 28.2, 34.1 ba chủng có khả lên men mạnh thời gian đẩy Durhan chủng lên thời gian ngắn Nên ba chủng sử dụng vào thí nghiệm 41 4.2.2 Thử khả lên men dịch chiết Malt Tiến hành cho 20ml dịch chiết malt vào ống thủy tinh có sẵn ống Durhan.Thanh trùng 1210C 15 phút Sau để nguội cấy nấm men vào (đã dược tăng sinh môi trường Hansen lỏng) Theo dõi thời gian tạo khí CO2 đẩy ống Durhan lên cao 5cm Hình 4.2 Hình ảnh kết thử khả lên men dịch chiết malt Lưu ý dịch chiết malt đặc lên ta pha loãng dịch chiết malt với nước cất theo tỉ lệ 9:1, 8:2, 7:3 để đánh giá Bảng 4.4 Kết thử khả lên men dịch chiết malt tỉ lệ khác Các tỉ lệ pha loãng Tỉ lệ 9:1 Tỉ lệ 8:2 Thời Tỉ lệ 7:3 Thời gian Thời gian Chủng gian(giờ) Chủng (giờ)nổi ống Chủng ống Durhan Durhan (giờ) ống Durhan 22.1 12 22.1 21 22.1 25 28.2 12 28.2 15 28.2 15 34.1 34.1 12 34.1 13 42 Qua bảng 4.4 thấy tỉ lệ pha loãng 9:1 chủng 34.1 có khả lên men dịch chiết malt mạnh nhất, thời gian làm ống Durhan tỉ lệ pha loãng ngắn 4.2.3 Thử hoạt tính Catalase Cơ sở: dựa vào đặc tính nấm men loài sinh kỵ khí tùy tiện Do tiến hành việc thử hoạt tính Catalase đánh giá chủng có phải thuộc vi sinh vật kỵ khí tùy tiện hay không Tiền hành: lấy chút sinh khối chủng lên kính, nhỏ trực tiếp vài giọt H2O2 vào Quan sát thấy có tượng sủi bọt khí Kết luận chủng thuộc loại vi sinh vật kỵ khí tùy tiện Hình 4.3 Hình ảnh số chủng thử hoạt tính catalase 4.2.4 Xác định nồng độ cồn tuyển chọn Thực việc xác định nồng độ cồn nhằm tuyển chọn chủng có khả lên men tạo rượu ethylic mạnh Bằng việc chưng cất dịch tinh bột cơm dịch chiết malt 43 Bảng 4.5 Kết chƣng cất dịch tinh bột cơm dịch chiết malt Loại dịch chƣng cất Dịch tinh bột cơm Dịch malt Chủng Độ rượu(%) Chủng Độ rượu(%) 22.1 10,5 22.1 1.75 28.2 10,15 28.2 34.1 11,55 34.1 Qua bảng 4.5 chủng 34.1 có khả lên men mạnh, sau lên men thu rượu với độ rượu cao chủng 22.1 chủng 28.2 Vậy dựa vào kết từ thử nghiệm, chọn chủng 34.1 có khả lên men rượu mạnh sử dụng vào thí nghiệm tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy 4.3 Tối ƣu hóa điều kiện sinh trƣởng phát triển chủng Sacchoromyces cerevisiae 34.1 4.3.1 Khả sử dụng nguồn carbon ( đường glucose) Kết nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ đường tới sinh trưởng phát triển chủa chủng nấm men 34.1 thể qua hình sau 44 Hình 4.4 Đồ thị kháo sát ảnh hƣởng nồng độ đƣờng tới phát triển chủng nấm men 34.1 * Kết luận: Qua biểu đồ ta kết luận nồng độ đường tối thích cho chủng 34.1 3% 4.3.2 Khả sử dụng nguồn nitơ (peptone) Kết nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng peptone thể qua đồ thị sau Hình 4.5 Đồ thị khảo sát ảnh hƣởng nồng độ peptone đến phát triển chủng nấm men 34.1 * Kết luận : Qua đồ thị khảo sát ta kết luận nồng độ peptone tối thích cho chủng 43.1 10 g/l 4.3.4 Ảnh hưởng PH Kết nghiên cứu ảnh hưởng PH đến sinh trưởng phát triển chủng nâm men 34.1 thể qua hình sau 45 Hình 4.6 Đồ thị khảo sát ảnh hƣởng PH ban đầu đến sinh trƣởng phát triển chủng nấm men 34.1 * Kết Luận: Dải PH tối thích cho chủng nấm men 34.1 PH =6 4.4 Định danh sơ Trên sở phân lập chủng đặc điểm hính thái khuẩn lạc, đặc điểm sinh hóa hình thái tế bào Thông qua thí nghiệm khả lên men, xác định nồng độ cồn chọn chủng 34.1 có khả lên men rượu tốt sơ định danh chủng 43.1 thuộc giống Sacchoromyces cerevisiae 46 PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Quá trình thực đề tài “Phân lập tuyển chọn chủng nấm men có khả lên men rượu cao từ bánh men thu thập Yên Phong – Bắc Ninh” Tôi thu kết quả: Phân lập tuyển chọn sơ chủng từ 50 chủng nấm men phân lập từ mẫu bánh men thuốc Bắc thu thập Yên Phong – Bắc Ninh Từ chủng tuyển chọn sơ tiến hành tuyển chọn qua nhiều thí nghiệm, chọn chủng 34.1 chủng nấm men có khả sinh rượu cao Với độ cồn đạt 11,55%, qua thí nghiệm định danh sơ chủng thuộc chủng Sacchoromyces cerevisiae thời đặt tên chủng Saccharomyces cerevisiae 34.1 Qua trình khảo khát tìm điều kiện tối thích cho chủng thấy nồng độ đường tối thích cho chủng nảy 3% Nồng độ peptone tối thích 10 g/l, PH = dải PH thích hợp 5.2 Đề nghị Vì điều kiện phòng thí nghiệm hạn chế nên việc đánh giá định danh sơ phương pháp truyền thống Đề nghị tương lai có thêm nghiên cứu chủng Sacchoromyces cerevisiae 34.1 để ứng dụng vào quy mô sản xuất rượu công nghiệp 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU IN ẤN PGS.TS Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Tygiáo trình vi sinh vật học, NXB giáo dục, 2007 PGS.TS Lê Đức Phẩm- giáo trình nấm men công nghiệp, NXB khoa học kỹ thuật, 2006 Nguyễn Duy Thắng - phân lập tuyển chọn chủng nấm men có hoạt lực cao từ bánh men thuốc bắc số tỉnh phía Bắc, Thái Nguyên, 2010 a Lê Thị Vu Lan, Phạm Minh Nhựt - thực tập vi sinh đại cương, Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ TPHCM,2008 Lê Đình Lương “ nấm men – đối tượng cổ điển & đại công nghệ sinh học”, tạp chí hoạt động khoa học 12-1990 Nguyễn Đức Giang “ phân lập, đánh giá chủng nấm men có hoạt lực cao sản suất rượu men tỉnh Cao Bằng”, khóa luận tốt nghiệp,2011 Trần Linh Thước – Phương pháp phân tích Vi sinh vật Nước, Thực phẩm Mỹ phẩm, NXB giáo dục, 2002 Bộ môn sinh học đất – Trường Đại Học tổng hợp Maxcova, Thực tập visinh vật học, Tài liệu dịch, NXB Đại học THCN, Hà Nội, 1983 Lê Thị Mai , Nguyễn Thị Hiền, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Thanh Hằng, Lê Thị Lan Chi - Các phương Pháp phâ tích nghành Công nghệ lên men, NXB KHKT, Hà Nội, 2005 Trần Thị Thanh – Công nghệ Vi sinh, NXB giáo dục, 2009 THÔNG TIN TỪ MẠNG INTERNET 10 http://www.thegioiruou.vn/vn/tu-van-ruou/cac-dong-ruou-dac-trung-trenthe-gioi/ 11 http://icfood.vn/home/2014/01/02/chiet-xuat-nam-men-yeast-extractla-gi/s_cerevisiae/ [...]... sát trùng - Riêng các chủng nấm men ở nước ta phải có khả năng lên men trong nhiệt độ cao ≥350C Mặc dù ở mỗi vùng có những loại rượu riêng và phương pháp sản xuất riêng Nhưng đều có đặc điểm chung là được lên men truyền thống từ hệ vi sinh vật có trong bánh men đặc trưng của từng vùng 2.2 Nấm Men 2.2.1 Hình thái và cấu tạo nấm men [2] 2.2.1.1 Hình thái nấm men Tế bào nấm men có hình dạng cầu, ovan... loại nấm men đều đồng hóa được các monosacaride, glucose, fructose…Đối với quá trình lên men rượu, nguồn hydrocarbon có ảnh hưởng tới năng suất và chất lượng rượu 26 Dựa vào mối quan hệ với nhiệt độ ngươi ta chia nấm men ra làm 2 loại: loại lên men ở nhiệt độ thấp (5 – 100C) và loại lên men ở nhiệt độ cao (28 – 320C) Trong công nghiệp sản xuất rượu người ta thường dùng những chủng nấm men lên men ở... động của nấm men Môi trường lên men khi có nồng độ quá thấp sẽ không thu n lợi về kinh tế Nồng độ rượu và khí carbonic cũng kìm hãm đến sự sinh trưởng cũng như khả năng lên men của nấm men Sự sinh sản của nấm men sẽ bị chậm lại khi nồn độ rượu có trong môi trườn là 2% và sẽ bị ngừn lại khi nồng độ rượu là 5% Khí carbonic ức chế sự lên men nhưng việc thoát khí CO2 sẽ làm cho môi trườn lên men luôn bị... rƣợu 2.1.1 Phân loại rượu Rượu là loại đồ uống chứa cồn (anchol) có nhiều loại rượu và hương vị cũng khác nhau tùy vào điều kiện sản xuất và vùng miền khí hậu khác nhau Dựa vào công nghệ sản xuất rượu, rượu được phân thành 3 loại rượu chính : 2.1.1.1 Rượu chưng cất: Loại rượu này dùng những nguyên liệu chứa đường và tinh bột, nhưng sau khi lên men được cất lại Rượu chưng cất là những loại rượu nặng... cồn trong rượu Gin thường từ 34 – 47% 2.1.1.2 Rượu lên men thu n túy Rượu được lên men từ các nguyên liệu có chứa đường và tinh bột và đều có nồng độ thấp Những điển hình của loại rượu này là: Rượu vang, saké, rượu nếp… 11 Rượu Nếp Than Là loại đồ uống có cồn ethanol, được sản xuất hoàn toàn bằng phương pháp thủ công từ một loại gạo nếp đặc biệt Nếp Than (Nếp Cẩm), giống như quy trình sản xuất rượu vang,... sinh vật trong sản xuất rượu được sử dụng chủ yếu là các chủng nấm men Sacchoromyces cerevisiae Các chủng nấm men dùng trong sản xuất phải có những đặc điểm sau: 16 - Có đầy đủ các đặc điểm đặc trưng của nấm men - Tốc độ phát triển mạnh, hoạt lực lên men cao - Lên men được nhiều loại đường khác nhau và có tốc độ lên men cao - Thích nghi được với các điều kiện khí hậu không thu n lợi của môi trường,... nấm men Saccharomyces cerevisiae Nhờ nấm men này, trong điều kiện sống yếm khí, chúng có khả năng chuyển hóa đường thành rượu ethanol và CO2 một cách hợp thức Trong điều kiện yếm khí nấm men có khả năng chuyển hóa tiếp các ethanol đã được tạo thành Có nghĩa là sự lên men sẽ dừng lại ở giai đoạn hình thành và tích lũy rượu ethanol Như vậy biện pháp kỹ thu t tốt nhất là lên men trong thùng kín Tế bào nấm. .. xác định khả năng lên men [1] - Cơ sở của phương pháp: Trong quá trình lên men dịch đường nấm men sẽ sinh ra khí CO2 mà khí CO2 sẽ đẩy ống durhan nổi lên trong ống nghiệm Chủng nào có khả năng lên men mạnh thì sẽ tạo ra khí và đẩy ống Durhan lên trong thời gian ngắn nhất - Tiến hành: cho 20ml dịch gồm môi trường cơ sở và 1 – 2 % loại đường mà định thử khả năng lên men vào ống nghiệm có chứa sẵn ống durhan... sôi nảy nở và bắt đầu lên men yếm khí Phương trình tổng quát của quá trình lên men đường thành rượu: C6H12O6 →2C2H5OH +2CO2 + 27kcal Trong quá trình lên men rượu, dịch lên men thu được sau khi quá trình lên men kết thúc, ngoài sinh khối nấm men còn có các thành phần khác: sản phẩm chính là ethanol, CO2 và các sản phẩm phụ như glixerin, acid succinic, các aldehyde, và một số loại rượu bậc cao như isomalic... cao, chủng có khả năng lên men mạnh và nhanh Khi sản xuất rượu từ nguyên liệu chứa tinh bột trước hết cân phải chuyển hóa tinh bột của nguyên liệu đó thành đường đơn giản Thường thì tinh bột của nguyên liệu sẽ được thủy phân đến mantose và glucose nhờ enzyme amylaza Muốn có được sản phẩm chủ yếu trong môi trường lên men rượu là rượu ethanol thì tác nhân cung cấp hệ enzyme đặc thù đó phải là giống nấm