ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM  HOÀNG VĂN CHUYỀN Tên đề tài: PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG BACILLUS HURINGIENSIS CÓ KHẢ NĂNG DIỆT SÂU HẠI RAU TẠI THÁI NGUYÊN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2011 – 2015 Thái Nguyên, 2015 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM  HOÀNG VĂN CHUYỀN Tên đề tài: PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG BACILLUS HURINGIENSIS CÓ KHẢ NĂNG DIỆT SÂU HẠI RAU TẠI THÁI NGUYÊN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2011 – 2015 Giảng viên hƣớng dẫn: GS Nguyễn Quang Tuyên Th.S Lƣơng Thị Thu Hƣờng Khoa CNSH - CNTP, Trường ĐH Nông Lâm Thái Nguyên Thái Nguyên, 2015 i LỜI CẢM ƠN Lời xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm, tất quý thầy cô môn Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm giảng dạy, hướng dẫn để có kiến thức ngày hôm Và xin đặc biệt cảm ơn GS.TS Nguyễn Quang Tuyên Tuy thời gian làm đề tài có hạn nhờ thầy tận tình hướng dẫn truyền đạt kinh nghiệm quý báu, để hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp Tôi xin gửi lời cảm ơn tới ThS Lương Thị Thu Hường tạo điều kiện giúp đỡ hướng dẫn thời gian thực tập hoàn thành khóa luận Tuy nhiên, thời gian thực tập có hạn, trình độ kinh nghiệm chưa nhiều nên không tránh khỏi thiếu sót hạn chế Kính mong nhận đóng góp thầy cô bạn để khóa luận hoàn thiện Xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày … tháng … năm 2015 Sinh viên Hoàng Văn Chuyền ii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Phân loại gene cry Bt Bảng 3.1: Các thiết bị sử dụng nghiên cứu 21 Bảng 3.2: Các dụng cụ sử dụng nghiên cứu 21 Bảng 4.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc số đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn phân lập .28 Bảng 4.2: Kết thử khả di động chủng sau 24h 34 Bảng 4.3: Kết thử phản ứng catalaza 35 Bảng 4.4: Kết thử phản ứng Voges – Proskauer (V – P) 36 Bảng 4.5: Số lượng bào tử/ml dung dịch lên men sau 24h .37 Bảng 4.6: Hoạt lực diệt sâu chủng vi khuẩn nghiên cứu .38 iii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Cơ chế diệt sâu vi khuẩn Bacillus thuringiensis 10 Hình 2.2: Vòng đời sâu tơ 14 Hình 2.3: Rau bắp cải bị sâu hại .14 Hình 4.1: Hình thái KL (a) hình thái TB (b) chủng C2 32 Hình 4.2: Hình thái KL (a) hình thái TB (b) chủng C6 32 Hình 4.3: Hình thái KL (a) hình thái TB (b) chủng C9 32 Hình 4.4 Hình thái KL (a) hình thái TB (b) chủng C12 .32 Hình 4.5: Hình thái KL (a) hình thái TB (b) chủng C13 .33 Hình 4.6: Hình thái KL (a) hình thái TB (b) chủng C16 .33 Hình 4.7: Khả di động chủng 34 Hình 4.8: Phản ứng catalaza chủng (a) Chủng C2, (b) Chủng C6, (c) Chủng C9, (d) Chủng C12, (e) Chủng C13, (f) Chủng C16 35 Hình 4.9: Khả lên men glucose chủng 36 Hình 4.10: Hoạt lực diệt sâu chủng C6 C16 .39 Hình 4.11: Biểu đồ thể tốc độ diệt sâu chủng theo thời gian 39 iv DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Bt : Bacillus thuringiensis KL : Khuẩn lạc TB : Tế bào v MỤC LỤC Phần I MỞ ĐẦU .1 1.1.Đặt vấn đề .1 1.2 Mục đích nghiên cứu 1.3 Mục tiêu nghiên cứu 1.4 Ý nghĩa đề tài 1.4.1 Ý nghĩa khoa học .2 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn .2 Phần TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Đại cương Bacillus thuringiensis .3 1.1.1 Đặc điểm sinh lý Bt 1.1.2 Đặc điểm sinh hoá Bt 1.1.3 Đặc điểm phân loại Bt 1.1.4 Phân loại gene độc tố Bt .5 1.1.5 Các loại độc tố Bt .7 1.1.6 Cơ chế tác động protein tinh thể lên côn trùng 1.1.7 Các yếu tố ảnh hưởng tới trình hình thành bào tử tinh thể độc 10 1.2 Côn trùng thử nghiệm 12 1.3 Tinh hình nghiên cứu ứng dụng B thuringiensis 15 1.3.1 Tình hình nghiên cứu ứng dụng B thuringiensis giới 15 1.3.2 Tình hình nghiên cứu ứng dụng B thuringiensis Việt Nam 17 Phần VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 3.1 Đối tượng, vật liệu phạm vi nghiên cứu 20 3.1.1 Đối tượng 20 3.1.2 Vật liệu hóa chất dụng cụ nghiên cứu 20 3.1.3 Phạm vi nghiên cứu 22 3.2 Địa diểm thời gian nghiên cứu 22 3.2.1 Địa điểm 22 vi 3.2.2 Thời gian 22 3.3 Nội dung nghiên cứu 22 3.4 Các phương pháp tiến hành thí nghiệm .22 3.4.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn Bt 22 3.4.2 Phương pháp xác định đặc tính sinh lý sinh hóa chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis phân lập 24 3.4.3 Phương pháp xử lý số liệu 27 Phần KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 28 4.1 Kết phân lập Bacillus thuringiensis từ mẫu 28 4.2 Kết xác định đặc tính sinh hóa vi khuẩn Bacillus thuringiensis phân lập 33 4.2.1 Kết thử nghiệm khả di động 33 4.2.2 Kết thử phản ứng catalaza 35 4.2.3 Kết thử phản ứng Voges – Proskauer (V – P): 36 4.3 Xác định hoạt tính diệt sâu chủng vi khuẩn có tinh thể độc 37 4.4.1 Kết xác định số lượng bào tử 24h nuôi cấy 37 4.4.2 Kết đánh giá hoạt lực diệt sâu 38 Phần KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 5.1 Kết luận 41 5.2 Kiến nghị 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 Phần I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Hiện vùng trồng rau chuyên canh nước ta áp dụng nhiều kỹ thuật tiến mới, làm cho suất rau không ngừng nâng lên Tuy nhiên thâm canh sâu bệnh hại rau xuất ngày lại nhiều lên Để đảm bảo suất người nông dân sử dụng nhiều biện pháp như: lạm dụng loại thuốc trừ sâu hóa học, phân bón hoá học thiếu chọn lọc không phương pháp, điều khiến môi trường xung quanh bị ô nhiễm rau xanh có lượng độc tố vượt ngưỡng cho phép Các nghiên cứu khoa học sử dụng thuốc vi sinh vật giữ quần thể sâu hại phát triển mức thấp phát triển thành dịch, bảo vệ loại côn trùng vi sinh vật có ích khác, góp phần nâng cao suất chất lượng rau, bảo vệ môi trường sống sức khoẻ cộng đồng Các chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học nghiên cứu từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) ứng dụng ngày phổ biến Việc tìm chủng Bt thực có giá trị, ý nghĩa tiềm ứng dụng to lớn sở để bảo tồn nguồn gen quý tạo chế phẩm sinh học phục vụ nông nghiệp Xuất phát từ sở lý luận khoa học thực tiễn nói trên, tiến hành đề tài "Phân lập, tuyển chọn số chủng Bacillus thuringiensis có khả diệt sâu hại rau Thái Nguyên" 1.2 Mục đích nghiên cứu Phân lập, tuyển chọn số chủng Bacillus thuringiensis có khả tiêu diệt sâu tơ (Plutellidae xylostella) Thái Nguyên 1.3 Mục tiêu nghiên cứu Tuyển chọn - chủng Bacillus thuringiensis có hoạt lực diệt sâu cao từ chủng vi khuẩn sinh tinh thể độc phân lập 1.4 Ý nghĩa đề tài 1.4.1 Ý nghĩa khoa học - Đánh giá mức độ đa dạng vi khuẩn Bacillus thuringiensis phân lập từ mẫu đất khác địa bàn tỉnh Thái Nguyên - Phân loại chủng Bacillus thuringiensis có hoạt lực diệt sâu tơ (Plutella xylostella) cao 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn - Dựa thu trình nghiên cứu góp phần xác định số đặc điểm hình thái tế bào khuẩn lạc vi khuẩn Bacillus thuringiensis - Giúp sinh vên tiếp cận với công tác khoa học, qua nâng cao trình độ chuyên môn đồng thời tạo cho thân sinh viên tác phong làm việc nghiêm túc nghiên cứu khoa học 29 C5 KL nhỏ, có màu kem, Hình que, xếp đơn lẻ, bề mặt nhăn bào tử lệch tâm + - + + + - + - + + + - + - + + Hình que, hai đầu C6 Tương tự C2, viền tròn, bề mặt nhẵn tù, xếp riêng lẻ hay thành chuỗi, tinh thể có hình không xác định KL hình ovan, màu C7 trắng sữa, có vòng đồng tâm Hình que, xếp thành chuỗi, bào tử lệch tâm KL có hình tròn, màu C8 trắng sữa, viền có gờ Hình que, ngắn, nhỏ, lên, KL lõm bào tử tâm xuống Hình que, xếp thành Tương tự C2, chuỗi đơn lẻ, bào C9 màu trắng sữa, viền tử tâm, tinh thể trơn có dạng không xác định KL có màu trắng kem, Hình que, đầu tù, xếp 10 C10 viền mờ, có núm tâm, đơn lẻ, bào tử lan rộng KL tròn, viền nhăn, 11 C11 màu trắng sữa, bề mặt nhẵn 12 C12 Tương tự C2, bề mặt nhẵn tâm Hình que, xếp riêng lẻ, bào tử lệch tâm Hình que, xếp thành chuỗi, bào tử hình ovan lệch tâm, tinh thể 30 có dạng cầu lưỡng tháp Hình que, hai đầu KL có màu trắng sữa, tù, bào tử hình ovan, 13 C13 viên tròn nhăn, có núm tâm, tinh thể có giũa + + - - + - + + + - - - + - + - dạng lập phương, cầu 14 C14 Kl có màu vàng nhạt, Hình bầu dục, không phẳng, bóng nhớt KL có màu trắng kem, 15 C15 xung quang mép trong, mép gợn sóng có bào tử Hình que, xếp thành chuỗi, bào tử lệch tâm KL có màu trắng sữa, Hình que, bào tử hình 16 C16 viền cưa mở, có ovan, xếp thành chuỗi, núm giữa, bề mặt hay đơn lẻ, tinh thể có nhăn KL màu trắng trong, có 17 C17 dạng sợi li ti, có nhiều thùy nhỏ, bóng nhẵn KL có hình tròn, dạng 18 C18 ướt, có vàng nhạt, mép nhăn nhớt 19 C19 20 C20 dạng lập phương Hình que, xếp đơn lẻ, bào tử tâm Hình cầu, bắt màu đậm, bào tử KL có màu trắng kem, Hình viền tròn, bề mặt nhẵn que, bào tử tâm KL có màu trắng kem, Hình que, xếp thành bề mặt nhăn, viền nhăn chuỗi, bào tử lệch tâm Ghi chú: + (kết dương tính); - (kết âm tính) Từ kết Bảng 4.1 cho thấy tổng số 20 chủng vi khuẩn phân lập có: 31  18/20 chủng nghi ngờ thuộc chi Bacillus (vì tế bào có dạng que, hình thành bào tử) Hai chủng lại không thuộc chi Bacillus chủng C14 C18 (vì hình thái có dạng hình bầu dục không sinh bào tử)  6/18 chủng quan sát thấy có diện tinh thể độc C2, C6, C9, C12, C13, C16 - Từ kết cho thấy: Trong trình tiến hành thí nghiệm xuất dạng vi khuẩn lạ C14 C18, chúng sống điều kiện phân lập (nhiệt độ cao 70oC 20 phút) - Đối với chủng vi khuẩn sinh tinh thể độc có đặc điểm chung là: khuẩn lạc có hình tròn, có màu trắng, có mép nhăn không; tinh thể độc có nhiều dạng: hình lập phương, hình lưỡng tháp, hình không xác định hình cầu Những chủng vi khuẩn có đặc điểm giống với vi khuẩn Bacillus thuringiensis công bố, là: Khuẩn lạc có hình tròn, màu trắng, bề mặt nhăn không, có viền nhăn không có; tế bào có dạng hình que, đầu tù, bào tử tâm; tinh thể có hình lập phương, hình lưỡng tháp hình cầu - Qua kết thấy chủng vi khuẩn sinh tinh thể phân lập có độ đa dạng cao dạng tinh thể, bao gồm: dạng lập phương, dạng cầu, dạng lưỡng thác dạng không xác định Sự khác cấu trúc hình dạng tinh thể độc thành phần protein cấu tạo nên Sự phong phú hình dạng tinh thể dẫn tới đa dạng gene độc tố, sở tạo nên phổ diệt côn trùng rộng cho chủng Bacillus thuringiensis nghiên cứu Hình thái khuẩn lạc hình thái tế bào chủng sinh tinh thể độc thể hình ảnh sau: 32 (a) (b) Hình 4.1: Hình thái KL (a) hình thái TB (b) chủng C2 (a) (b) Hình 4.2: Hình thái KL (a) hình thái TB (b) chủng C6 (a) (b) Hình 4.3: Hình thái KL (a) hình thái TB (b) chủng C9 (a) (b) Hình 4.4 Hình thái KL (a) hình thái TB (b) chủng C12 33 (a) (b) Hình 4.5: Hình thái KL (a) hình thái TB (b) chủng C13 (a) (b) Hình 4.6: Hình thái KL (a) hình thái TB (b) chủng C16 4.2 Kết xác định đặc tính sinh hóa vi khuẩn Bacillus thuringiensis phân lập đƣợc Từ kết phân lập thu Bảng 4.1 tiến hành lấy chủng vi khuẩn sinh tinh thể độc để khảo sát đặc tính sinh lý sinh hoá chúng, bao gồm: xác định khả di động, khả sinh enzyme catalase khả sinh số sản phẩm trung tính acetone trình lên men glucose 4.2.1 Kết thử nghiệm khả di động Cấy chủng (C2, C6, C9, C12, C13, C16) vào môi trường thạch mềm, sau 24h đọc kết Kết trình bày bảng sau: 34 Bảng 4.2: Kết thử khả di động chủng sau 24h STT Kí hiệu chủng Kết C2 + C6 + C9 + C12 + C13 + C16 + Ghi chú: (+) dương tính (vi khuẩn mọc lan khỏi đường cấy làm đục môi trường xung quanh) Từ Bảng 4.2 ta thấy chủng đem thử nghiệm có khả di chuyển môi trường thạch mềm nhờ roi vi mao - Hình ảnh kết giám định khả di động: Hình 4.7: (a) Chủng C2 Hình 4.7: (b) Chủng C6 Hình 4.7: (c) Chủng C9 Hình 4.7: (d) Chủng C12 Hình 4.7: (e) Chủng C13 Hình 4.7: (f) Chủng C16 Hình 4.7: Khả di động chủng 35 4.2.2 Kết thử phản ứng catalaza Để tiến hành phản ứng catalaza, ta dùng que cấy vòng vô trùng lấy sinh khối chủng vi khuẩn tiêu Dùng thuốc thử H 2O2 30% nhỏ lên sinh khối vi khuẩn Kết thể bảng 4.3: Bảng 4.3: Kết thử phản ứng catalaza STT - Kí hiệu chủng C2 C6 C9 C12 C13 C16 Kết + + + + + + Ghi chú: (+) dương tính: sủi bọt khí (có sinh enzyme catalaza) Từ Bảng 4.3 ta thấy chủng vi khuẩn đem tiến hành phản ứng catalaza có tượng sủi bọt khí (do khí O2 thoát ra) Như vậy, chủng có khả sinh enzyme catalaza, phân hủy H2O2 thành O2 H2O Hình ảnh kết giám định phản ứng oxidase Hình 4.8: Phản ứng catalaza chủng (a) Chủng C2, (b) Chủng C6, (c) Chủng C9, (d) Chủng C12, (e) Chủng C13, (f) Chủng C16 Từ kết hình ảnh ta thấy chủng C9, C12, C13 sinh nhiều enzyme catalaza gây tượng sủi bọt khí mạnh chủng C2, C6 C16 36 4.2.3 Kết thử phản ứng Voges – Proskauer (V – P): Để tiến hành phản ứng, ta cấy sinh khối chủng vào môi trường MR-VP, sau 72 nuôi cấy 37oC ta tiến hành nhỏ thuốc thử Kết phản ứng trình bày Bảng 4.4: Bảng 4.4: Kết thử phản ứng Voges – Proskauer (V – P) STT Kí hiệu chủng Kết C2 + C6 + C9 + C12 + C13 + C16 + Ghi chú: (+) dương tính (đổi màu môi trường sang màu thuốc thử) Từ kết Bảng 4.4 ta thấy, chủng vi khuẩn tạo màu sẫm thuốc thử Do vậy, chủng vi khuẩn đem thử nghiệm có khả tạo thành số sản phẩm trung tính acetoin trình lên men glucose Hình ảnh kết giám định khả lên men glucose Hình 4.9.(a) Chủng C2 Hình 4.9 (b) Chủng C6 Hình 4.9(c) Chủng C9 Hình 4.9(d)Chủng C12 Hình 4.9(e)Chủng C13 Hình 4.9(f)Chủng C16 Hình 4.9: Khả lên men glucose chủng 37 4.3 Xác định hoạt tính diệt sâu chủng vi khuẩn có tinh thể độc Để thử hoạt tính diệt sâu chủng vi khuẩn phân lập được, tiến hành nuôi cấy chủng vi khuẩn (C2, C6, C9, C12, C13, C16) môi trường MPA lỏng 30oC, lắc 150 vòng/phút 48h Sau đó, tiến hành xác định bào tử, tinh thể thử hoạt tính sâu tơ (Plutella xylostella) 4.4.1 Kết xác định số lượng bào tử 24h nuôi cấy Để xác định số lượng bào tử, tiến hành xử lý mẫu 70 oC 15 phút pha loãng mẫu Lấy 100µl cấy vào đĩa môi trường MPA vô trùng, để vào tủ ấm 28oC 24h đếm số lượng khuẩn lạc mọc đĩa Kết thể Bảng 4.5 Bảng 4.5: Số lƣợng bào tử/ml dung dịch lên men sau 24h STT Kí hiệu chủng Số lƣợng bào tử (x109)/ml dung dịch lên men C2 1,67 C6 2,33 C9 1,67 C12 2,00 C13 1,33 C16 2,00 Kết Bảng 4.5 cho thấy: Trong chủng vi khuẩn sinh tinh thể độc chọn lọc được, chủng C6 có tốc độc sinh trưởng nhanh nên cho số lượng bào tử tinh thể cao so với chủng lại (2.33x109 bào tử/1ml dung dịch) Tiếp theo chủng C12 C16 (đều có 2.00x109 bào tử/1ml dung dịch) Do tế bào chủng vi khuẩn bị phá vỡ giải phóng bào tử tinh thể độc Bằng cách đếm số lượng bào tử, ta ước tính số lượng tinh thể độc có dung dịch lên men, theo dõi tốc độ sinh trưởng chủng vi khuẩn nghiên cứu 38 4.4.2 Kết đánh giá hoạt lực diệt sâu Để tiến hành thử nghiệm hoạt lực diệt sâu, chủng (C2, C6, C9, C12, C13, C16) pha loãng đạt đến nồng độ 109 bào tử/ml Thí nghiệm thử hoạt lực sâu bố trí đĩa petri, chủng tiến hành đĩa khác đĩa đối chứng, đĩa 10 sâu (tương đối đồng kích thước lứa tuổi) Kết xác định hoạt lực diệt sâu thời điểm sau 24h, 48h 72h (tính theo công thức Abbott) trình bày Bảng 4.6 Hình 4.11 Bảng 4.6: Hoạt lực diệt sâu chủng vi khuẩn nghiên cứu STT Kí hiệu chủng Tỉ lệ sâu chết (%) 24h 48h 72h C2 16,66 44,44 70,83 C6 33,33 62,96 91,67 C9 16, 67 48,15 75,00 C12 26,66 51,85 83,33 C13 13,33 37,04 58,33 C16 23,33 48,33 87,50 Kết cho thấy, chủng nghiên cứu có hoạt lực diệt sâu với tỉ lệ sâu chết cao Theo thời gian hoạt lực diệt sâu tăng mạnh chủng có hoạt lực diệt sấu khác thời điểm Trong đó: - Chủng C13 có hoạt lực diệt sâu thấp chủng: 24h (13,3%); 48h (37,04%); 72h (58,33%) - Chủng C2: 24h (12,66%); 48h (44,44%); 72h (70,83%) - Chủng C9: 24h (16,67%); 48h (48,15%); ở72h (75%) - Các chủng C12 C16 có hoạt lực diệt sâu cao chủng C2 C9 thấp C6:  C12: 24h (26,66%); 48h (51,85%); 72h (83,33%) 39  C16: 24h (23,33%); 48h (48,33%); 72h (87,5%) - Chủng C6 có hoạt lực diệt sâu mạnh chủng: 24h (33,33%); 48h (62,96%); 72h (91,67%) - Một số hình ảnh thí nghiệm thử khả diệt sâu: Hình 4.10: Hoạt lực diệt sâu chủng C6 C16 - Từ số liệu Bảng 4.6 ta có biểu đồ thể tốc độ diệt sâu theo thời gian chủng: Tỉ lệ (%) 100 Biểu đồ thể tốc độ diệt sâu chủng theo thời gian C2 C6 C9 C12 C13 C16 80 60 40 20 0h 24h 48h Thời gian (h) 72h Hình 4.11: Biểu đồ thể tốc độ diệt sâu chủng theo thời gian 40 Từ Hình 4.11 cho ta nhận thấy tốc độ diệt sâu khác chủng có số lượng bào tử/ml dung dịch khác Cụ thể:  Chủng C6 có số lượng bào tử lớn đạt 2,33.10 bào tử/ml dung dịch lên men có tốc độ diệt sâu nhanh mạnh Trong khoảng thời gian 0h-24h, 24h-48h, 48h- 72h tốc độ diệt sâu diễn ổn dịnh theo chiều hướng tăng dần Tại thời điểm 72h tỷ lệ sâu chết đạt mức 91,67% lơn so với chủng lại  Ngược lại, tốc độ diệt sâu chủng C13 thấp theo thời gian thử nghiệm tốc độ diệt sâu có chiều hướng tăng sau khoảng thời gian thử nghiệm Sau 72h, tỷ lệ sâu chết đạt 58,33% thấp chủng C6 33,34%  Tương tự chủng lại, chúng có khả tăng diệt sâu mức định khoảng thời gian, tỷ lệ sâu chết khác thời điểm theo dõi  Từ Hình 4.11 nhận thấy tốc độ diệt sâu hại chủng nghiên cứu phụ thuộc vào số lượng bào tử/ml dung dịch Khi số lượng bào tử nhiều khả diệt sâu thể mạnh số lượng bào tử thấp khả diệt sâu Sự khác khả diệt sâu chủng tảng sở để người lựa cho chủng có đặc tính tốt ứng dụng vào sản xuất chế phẩm sinh học  Dựa kết nghiên cứu đặc tính sinh lý, sinh hóa kết thử hoạt lực diệt sâu chọn chủng C16 C6 để thực nghiên cứu 41 Phần KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Qua trình tiến hành phân lập vi khuẩn Bacillus thuringiensis từ 40 mẫu đất thu thập địa điểm Thái Nguyên, bước đầu có số kết luận sau: - Từ 40 mẫu phân lập 18 chủng vi sinh vật nghi thuộc chi Bacillus Trong có 6/18 chủng có khả sinh tinh thể độc Đó chủng C2, C6, C9, C12, C13, C16 - Đã khảo sát đặc điểm: thử khả di động, khả sinh catalase khả tạo sản phẩm trung tính acetoin - Đã khảo sát khả diệt sâu chủng vi sinh vật kiểm định, chủng C6 C16 có khả diệt sâu mạnh 5.2 Kiến nghị - Tiếp tục tiến hành thử hoạt tính diệt sâu chủng (C2, C6, C9, C12, C13, C16) với loài sâu hai trồng khác nhằm xác định phổ diệt sâu chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis - Tiến hành xác định trình từ DNA chủng Bacillus thuringiensis nhằm tìm đoạn gene mã hóa protein tinh thể độc chưa công bố 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Ngô Đình Bính, Nguyễn Quỳnh Châu, Nguyễn Ánh Nguyệt (2002), Thu nhận huyết miễn dịch cho phân loại Bacillus thuringiensis, Kỷ yếu Viện Công nghệ Sinh học 200-2001, trang 296-303 Ngô Đình Bính, Nguyễn Quỳnh Châu, Nguyễn Văn Thưởng, Nguyễn Ánh Nguyệt, Trịnh Thế Cường, Jasser Mohamad Jamil, Ngô Đình Anh Trí, Nguyễn Hoài Trâm (2000), “Những vấn đề nghiên cứu sinh học” Báo cáo khoa học hội nghị sinh học quốc gia, trang 484-488 Ngô Đình Bính, Nguyễn Quỳnh Châu, Nguyễn Văn Thưởng, Trịnh Thị Ngọt, Nguyễn Ánh Nguyệt (2000), “ Sự phân bố Bacillus thuringiensis mẫu đất Việt Nam”, Tài nguyên sinh vật đất phát triển bền vững hệ sinh thái đất, trang 1-7 Ngô Đình Bính (2005), Giáo trình thuốc trừ sâu sinh học Ngô Đình Bính, Lê Thị Minh Thành, Trịnh Thị Thu Hà, Phạm Kiều Thúy, Phạm Minh Hương, Nguyễn Thị Luy, Lê Thị Hồng Nhung, Đặng Văn Tiến (2010), “35 năm nghiên cứu phát triển thuốc trừ sâu sinh học Bacillus thuringiensis Việt Nam”, Hội nghị khoa học kỷ niệm 35 năm Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, trang 288 – 300 Ngô Đình Bính, Nguyễn Quỳnh Châu, Nguyễn Ánh Nguyệt, Nguyễn Xuân Cảnh, Vi Thị Đoan Chính, Nguyễn Hoài Trâm, Nguyễn Văn Tuất (2003), “Tách dòng biểu gene mã hóa protein Cry1C diệt sâu khoang từ Bacillus thuringiensis subsp aizawai”, Những vấn đề nghiên cứu Khoa học Sự sống, Báo cáo khoa học hội nghị toàn quốc lần thứ hai, trang 830 – 832 Nguyễn Xuân Cảnh, Nguyễn Ánh Nguyệt, Nguyễn Thanh Hạnh, Nguyễn Quỳnh Châu, Ngô Đình Bính (2004), “ Nghiên cứu đa dạng sinh học vi khuẩn Bacillus thuringiensis Việt Nam”, Báo cáo khoa học, nghiên cứu Khoa học sống định hướng Nông lâm nghệp miền núi, Thái Nguyên 2004, NXB KHKT, trang 59 – 62 43 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2000), Vi sinh vật học, Nxb Giáo dục Đặng Trọng Lương, Vũ Đức Quang, Nguyễn Hữu Đống, Trần Duy Quý (1999), Thiết kế lại cấu trúc gene Bt để chuyển vào hai mầm, Báo cáo Hội nghị sinh học toàn quốc, trang 1371-1376 10.Hoàng Thị Lợi (2003), Giáo trình côn trùng học nông nghiệp đại cương tập 2, Nhà xuất Nông Nghiệp Hà Nội, trang 122 – 167 11.Lê Thị Minh Thành, Nguyễn Thị Thanh Hạnh, Nguyễn Xuân Cảnh, Nguyễn Ánh Nguyệt, Nguyễn Đình Tuấn, Phạm Kiều Thúy, Ngô Đình Bính (2005), “Nghiên cứu phân bố đa dạng gene vi khuẩn Bacillus thuringiensis phân lập số tỉnh thuộc vùng Bắc Bộ”, Tạp chí Di truyền ứng dụng, (số 4), trang 29 – 34 Tiếng Anh 12.Klier A (1985), “Biopesticide opportunities and challegene for anegement insect Parteun International Symposia”, page 16 13 http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/toxins2.html 5/5/2015 14.Metahelix Life Sciences Private Limited, Bio- Safety Evaluation of Cry1C Protein Expressed in Bt cotton carrying Cry1C genes, Review Committee on Genetic Modifications Department of Biotechnology MST, GOI New Delhi 110003 event MLS9124 15.Nester E.W, Thomashow L S, Metz M and Gordon M (2002), 100 years of Bacillus thuringiensis: A Critical Scientific Assessment, American Academy of Microbiology,Washington, USA 16.Theiry and E Franchon (1997), “Identification, isolation, culture and preservation entomopathogenic bateria”, Biotechniques Manual of Technology in insect Pathology, Edited by Lawrence A Lacey, Academic Press, pp 55 – 57 17.Schnepf E, Crickmore N., Van Rie N., Lereclus D., Baum F., Feitelson J., Zeigler D.R., and Dean D.H.,(1998) “Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal protein” Microbiol Mol Biol Rev 62: page 775-806 [...]... khi sâu tấn công ở giai đoạn mới trồng, sâu non nở đục tạo thành rãnh, ở tuổi sâu lớn ăn toàn bộ biểu bì phiến lá sẽ bị thủng lỗ chỗ Sâu tơ gây hại quanh năm và gây hại nhiều nhất là vào vụ Đông xuân Hình 2.3: Rau bắp cải bị sâu hại 15 Các nghiên cứu chỉ ra rằng sâu tơ là loại sâu hại nghiêm trọng có khả năng kháng thuốc cao Trong cơ thể sâu tơ có loại men có thể phân giải thuốc thành chất không độc,... tượng - Các chủng Bacillus thuringiensis được phân lập từ các mẫu đất khác nhau tại các huyện ở tỉnh Thái Nguyên - Sâu tơ (Pluella xylostella) gây hại bắp cải tại Thái Nguyên 3.1.2 Vật liệu hóa chất và dụng cụ nghiên cứu - Các loại mẫu đất thu được từ vùng khác nhau trên địa bàn tỉnh Thái Nguyên - Môi trường dùng để phân lập, nuôi cấy và thử nghiệm các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Bacillus thuringiensis. .. từ các mẫu đất thu thập tại 4 địa điểm thuộc tỉnh Thái Nguyên - Nghiên cứu đặc điểm sinh lý và sinh hoá của chủng Bacillus thuringiensis phân lập được - Tuyển chọn được 1 – 2 chủng Bacillus thuringiensis có khả năng diệt sâu hại rau cao 3.4 Các phƣơng pháp tiến hành thí nghiệm 3.4.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn Bt Phương pháp lấy mẫu thí nghiệm: Lấy mẫu theo tiêu chuẩn TCVN 75386:2010 về: “Chất lượng... thập tại 4 địa điểm của tỉnh Thái Nguyên, gồm: Thành phố Thái Nguyên, Huyện Phú Lương, Huyện Đại Từ, Huyện Đồng Hỷ - Địa điểm phân tích mẫu: Phòng nghiên cứu vi sinh vật, Viện Khoa học sự sống, Đại học Thái Nguyên 3.2.2 Thời gian Từ tháng 12/2014 đến tháng 5/2015 3.3 Nội dung nghiên cứu - Phân lập các chủng Bacillus thuringiensis khác nhau từ các mẫu đất thu thập tại 4 địa điểm thuộc tỉnh Thái Nguyên. .. nhà khoa học đã chuyển việc nghiên cứu B thuringiensis sang hướng mới như tìm kiếm các chủng B thuringiensis có phổ diệt sâu rộng, hoạt tính diệt sâu cao để phục hồi lại việc sản xuất thuốc trừ sâu B thuringiensis và ứng dụng công nghệ chuyển gene B thuringiensis phục vụ sản xuất Các nghiên cứu của Ngô Đình Bính và cs cho thấy các chủng B thuringiensis phân lập tại Việt Nam rất đa dạng về thành phần... gọi là sâu bay, sâu đu, sâu nhẩy dù Sâu tơ phá hoại hầu hết các loại lá: xu hào, cải bắp, đậu tương Chúng được đánh giá là một loại sâu hại nghiêm trọng và có tính kháng thuốc trong nhiều nghiên cứu Sâu tơ phân bố rộng rãi, tính đến năm 1982 có tới 128 nước và vùng lãnh thổ đã công bố thấy xuất hiện loài sâu này Sâu tơ sinh sản cao, vòng đời ngắn, tính kháng thuốc nhanh Thiệt hại hàng năm do sâu tơ... và cs, 2002) [15], (Theiry và cs, 1997) [16] Khuẩn lạc của Bt có màu trắng sữa, hình tròn, bề mặt xù xì, viền khuẩn lạc nhăn, đường kính có thể đạt tới 8 - 10µm Một số chủng Bt xuất hiện khuẩn lạc dạng trơn nhẵn Mỗi tế bào Bt khi trưởng thành có khả năng sinh bào tử và tinh thể độc bản chất là protein, có khả năng diệt côn trùng Bào tử Bt có dạng hình trụ hoặc hình trứng, kích thước 1,6 - 2µm Bào tử... ngày Tỉ lệ sâu chết được tính theo công thức Abbott: A = (C – T)/C 100 A: % sâu chết C: số sâu sống ở mẫu đối chứng T: số sâu sống ở mẫu thí nghiệm 27 3.4.3 Phƣơng pháp xử lý số liệu Các số liệu thí nghiệm thu được xử lý theo phương pháp toán học học thông thường và sử dụng các hàm toán học trong phần mềm Microsoft Excel 2010 28 Phần 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 4.1 Kết quả phân lập Bacillus thuringiensis. .. của lá Sâu non có 4 tuổi, sâu mới nở đục lá tạo thành rãnh, tuổi lớn ở mặt dưới của lá 14 Hình 2.2: Vòng đời sâu tơ Đặc điểm gây hại Sâu tơ thường gây hại cho các loại cây trồng thuộc họ cải Sâu non ăn lá, khi mật độ cao nó sẽ ăn thủng lá làm cho lá xơ xác, lá bị tổn thương mất khả năng quang hợp và giữ nước, cây phát triển kém và chết Sâu tơ phá hoại toàn bộ lá của cây, đặc biệt quan trọng khi sâu tấn... Bacillus thuringiensis có 4 loại độc tố: 3 ngoại độc tố và một nội độc tố: Ngoại độc tố α(α - exotoxin), ngoại độc tố β(β - exotoxin), ngoại độc tố γ(γ exotoxin), nội độc tố δ(δ - endotoxin) Trong đó nội độc tố δ có tác dụng diệt côn trùng mạnh nhất (Ngô Đình Bính và cs, 2010) [6] Ngoại độc tố α Có khối lượng phân tử thấp, không bền nhiệt, có khả năng tan trong nước, tích tụ trong pha logarit của một