ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM - - HOÀNG THỊ TRÒN Tên đề tài: ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SINH KHÁNG SINH CỦA XẠ KHUẨN NỘI CỘNG SINH TRÊN CÂY QUẾ THU THẬP TẠI TỈNH YÊN BÁI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2011 - 2015 Thái Nguyên - 2015 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM - - HOÀNG THỊ TRÒN Tên đề tài: ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SINH KHÁNG SINH CỦA XẠ KHUẨN NỘI CỘNG SINH TRÊN CÂY QUẾ THU THẬP TẠI TỈNH YÊN BÁI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2011 - 2015 Giảng viên hƣớng dẫn : TS Phí Quyết Tiến TS Trần Văn Chí Thái Nguyên - 2015 i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian thực đề tài nghiên cứu này, nhận giúp đỡ tận tình thầy cô cán khoa học Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Với lòng biết ơn sâu sắc xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy giáo TS Phí Quyết Tiến - Trưởng phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, người hướng dẫn cách tiếp cận vấn đề suốt trình thực đề tài Đồng thời gửi lời cảm ơn ThS Vũ Hạnh Nguyên, ThS Quách Ngọc Tùng cán Phòng Công nghệ lên men, người tận tình bảo, giúp đỡ, tạo điều kiện cho suốt trình thực tập tốt nghiệp Tôi xin gửi lời cảm ơn thầy giáo TS Trần Văn Chí thầy cô giáo Khoa Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm, thầy cô, cán trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên giúp đỡ trang bị kiến thức hữu ích đồng hành suốt thời gian học tập nghiên cứu Cuối cùng, xin gửi lời tri ân tới gia đình, bạn bè, người giúp đỡ động viên tạo điều kiện cho suốt trình thực tập Thái Nguyên, ngày 25 tháng năm 2014 Sinh viên Hoàng Thị Tròn ii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Các kháng sinh từ xạ khuẩn nội cộng sinh dược liệu 11 Bảng 3.1: Các thiết bị sử dụng nghiên cứu 19 Bảng 3.2: Trình tự cặp mồi sử dụng phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rDNA 24 Bảng 4.1: Số liệu thống kê khả kháng vi sinh vật kiểm định 105 chủng xạ khuẩn nội cộng sinh 26 Bảng 4.2: Khuếch đại gen mã hóa PKS-I, PKS-II, NRPS khả sinh anthracyline 36 chủng xạ khuẩn nội cộng sinh 31 Bảng 4.3: Đặc điểm hình thái chủng YBQ75 môi trường nuôi cấy khác 34 Bảng 4.4: Khả đồng hóa nguồn cacbon, nitơ chủng YBQ75 sau 7-10 ngày nuôi cấy 30ºC 36 Bảng 4.5: Ảnh hưởng nồng độ muối, nhiệt độ, pH đến sinh trưởng chủng YBQ75 37 Bảng 4.6: Phân tích trình tự gen mã hóa gen mã hóa 16S rDNA chủng xạ khuẩn YBQ75 40 iii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Ảnh quét hiển vi điện tử bề mặt dưa chuột sau ngày gây nhiễm với Streptomyces sp MBCu-56 (A) Hệ sợi bề mặt (B) Hệ sợi xạ khuẩn xâm nhập phát triển trên, bề mặt lớp biểu bì Hình 4.1: Hoạt tính kháng P vulgaris (A), S epidermidis ATTC 12228 (B) số chủng xạ khuẩn nội cộng sinh 28 Hình 4.2: Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen pks-I số chủng xạ khuẩn đại diện 29 Hình 4.3: Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen pks-II số chủng xạ khuẩn đại diện 29 Hình 4.4: Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen nrps số chủng xạ khuẩn đại diện 30 Hình 4.5: Sự thay đổi màu sắc theo pH môi trường chủng YB50 YB80 thời điểm trước (A, C) sau (B, D) thử phản ứng màu Hình 4.6: Hình thái khuẩn lạc (A) môi trường ISP2 hình ảnh bề mặt 20.000 lần (C) chủng YBQ75 35 Hình 4.7: Điện di đồ sản phẩm PCR gel agarose 1,0% 38 iv DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT STT Tên đầy đủ Từ viết tắt rDNA ADN ribosome Bp Cặp bazơ (base pair) DNR Daunorubicin DNA Deoxyribonucleic acid DOX Doxorubicin EPI Epirubicin IDA Idarumycin KTCC Khuẩn ty chất KTKS Khuẩn ty khí sinh 10 Kb Kilo bazơ 11 NRPS Nonribosomal peptide synthetase 12 PCR Phản ứng chuỗi polymerase (polymerase chain reaction) 13 PKS-II Polyketide synthase II 14 PKS-I Polyketide synthases I 15 VSV Vi sinh vật v MỤC LỤC PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Ý nghĩa đề tài PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Xạ khuẩn nội cộng sinh thực vật 2.1.1 Xạ khuẩn nội cộng sinh mối tương tác xạ khuẩn với chủ 2.1.2 Đặc điểm sinh học phân loại xạ khuẩn 2.1.3 Tiềm ứng dụng xạ khuẩn nội cộng sinh 2.2 Khả sinh chất kháng sinh xạ khuẩn nội cộng sinh số gen chức liên quan 11 2.2.1 Khả sinh chất kháng sinh xạ khuẩn nội cộng sinh 11 2.2.2 Một số gen chức liên quan đến sinh tổng hợp kháng sinh 12 2.2.3 Kháng sinh thuộc nhóm anthracycline 13 2.3 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội cộng sinh 14 2.3.1 Tình hình nghiên cứu giới 14 2.3.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 16 2.4 Cây quế tiềm khai thác xạ khuẩn nội cộng sinh quế 17 PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 18 3.1 Vật liệu nghiên cứu 18 3.1.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 18 3.1.2 Hóa chất 18 3.1.3 Thiết bị 18 3.1.4 Môi trường nuôi cấy 19 3.2 Địa điểm thời gian tiến hành 19 vi 3.3 Nội dung nghiên cứu 19 3.4 Phương pháp nghiên cứu 20 3.4.1 Tuyển chọn chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng vi sinh vật 20 3.4.2 Xác định khả sinh anthracyline 21 3.4.3 Khuếch đại gen mã hóa PKS-I, PKS-II, NRPS xạ khuẩn 21 3.4.4 Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn 22 3.4.5 Phân loại chủng xạ khuẩn YBQ75 dựa phân tích trình tự gen 16S rDNA 24 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 4.1 Tuyển chọn chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng vi sinh vật 26 4.2 Xác định gen mã hóa PKS-I, PKS-II, NRPS tham gia sinh tổng hợp kháng sinh 28 4.3 Sàng lọc xạ khuẩn sinh kháng sinh thuộc nhóm anthraycycline 33 4.4 Đặc điểm sinh học phân loại chủng xạ khuẩn YBQ75 33 4.4.1 Đặc điểm hình thái bề mặt chuỗi bào tử xạ khuẩn YBQ75 34 4.4.2 Đặc điểm sinh hóa xạ khuẩn YBQ75 35 4.4.3 Khuếch đại phân tích trình tự gen 16S rDNA xạ khuẩn YBQ75 38 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 5.1 Kết luận 41 5.2 Kiến nghị 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 PHỤ LỤC PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Vi khuẩn gây bệnh có khả kháng thuốc vấn đề vô nghiêm trọng mối quan tâm lớn cộng đồng Vì vậy, việc nghiên cứu, lựa chọn tác nhân kháng khuẩn từ tự nhiên ưu tiên hàng đầu nhà khoa học công ty dược phẩm giới Để đáp ứng nhu cầu tại, nhà khoa học không ngừng tìm kiếm nguồn phân lập nhằm thu nhận hợp chất tự nhiên để phát triển, bào chế loại kháng sinh chống lại bệnh vi sinh vật gây Nhiều nghiên cứu chứng minh thực vật nguồn tự nhiên quan trọng điều trị bệnh gây vi sinh vật Một số loài thực vật sử dụng phổ biến quế tinh dầu quế Cây quế (Cinamomum loureirii) chứa dược chất tinh dầu lá, vỏ với 90% cinnamaldehyde có hoạt tính kháng khuẩn cao vi khuẩn Gram (+) vi khuẩn Gram (-) (Staphylococcus, Micrococcus, Bacillus, Enterobacter) Các nghiên cứu chứng minh tinh dầu quế có tính chất chống đau, co mạch, làm tăng tiết, tăng nhu động ruột, chống oxy hóa với hiệu 55,94 66,9% dùng nồng độ 100 200 ppm [2] Ngoài số hoạt chất eugenol, cinnamaldehyde, carvacrol tinh dầu quế có khả kháng vi sinh vật gây bệnh như: methicillin-resistant Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae Ngoài giá trị dược lý thành phần mang lại, quế môi trường sinh trưởng xạ khuẩn nội sinh Xạ khuẩn nội cộng sinh xạ khuẩn từ vùng rễ xâm nhập vào rễ, thân, mà không gây hại hay cạnh tranh dinh dưỡng với chủ [24] Các hợp chất có hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn nội cộng sinh chứng minh đa dạng mặt số lượng hoạt tính sinh học như: chất kháng sinh, kháng ung thư, chống oxy hóa, chất diệt cỏ [19] Polyketide nhóm chất đại diện cho sản phẩm trao đổi chất bậc hai sản xuất vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn thực vật [38] Trong đó, polyketide synthase II (PKS-II) tham gia tổng hợp cấu trúc chuỗi polyketide polyketide synthase I (PKS-I) chịu trách nhiệm tạo khung polyketide hoàn chỉnh Và nonribosomal peptide synthetase (NRPS) sinh tổng hợp sản phẩm trao đổi chất bậc hai không thông qua ribosome tạo dạng peptide nhờ trình tổng hợp protein acid amin Cho đến nay, số lượng nghiên cứu xạ khuẩn nội cộng sinh quế nói riêng dược liệu nói chung hạn chế Đồng thời, nghiên cứu gen mã hóa PKS-I, PKS-II, NRPS nhằm sàng lọc, đánh giá khả sinh tổng hợp sản phẩm thứ cấp từ xạ khuẩn nội cộng sinh Việt Nam bỏ ngỏ Xuất phát từ định hướng trên, thực nghiên cứu đề tài: "Đánh giá khả sinh kháng sinh xạ khuẩn nội cộng sinh quế thu thập tỉnh Yên Bái" 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Đánh giá khả kháng vi sinh vật kiểm định xác định có mặt gen liên quan đến tổng hợp kháng sinh chủng xạ khuẩn nội công sinh phân lập quế tỉnh Yên Bái 1.3 Ý nghĩa đề tài * Ý nghĩa khoa học Đề tài kế thừa kết số nghiên cứu trước nhóm nghiên cứu, kế thừa kết nghiên cứu nước lĩnh vực khai thác nguồn tài nguyên vi sinh vật, nguồn hợp chất kháng sinh, kháng ung thư Đề tài chọn đối tượng thực vật nghiên cứu quế nhiều nghiên cứu trước đây, đặc biệt liên quan đến nghiên cứu tách chiết tinh dầu 37 L-Histidine monohydrate, L-Valin, L-Lysin, amino hydroxy-methyl 1,3 promo 4.4.2.2 Ảnh hưởng nồng độ muối, pH, nhiệt độ đến sinh trưởng chủng xạ khuẩn YBQ75 Sinh trưởng chủng YBQ75 môi trường Bennett điều kiện thí nghiệm thay đổi nồng độ muối, pH nhiệt độ thể bảng 4.5 Bảng 4.5: Ảnh hƣởng nồng độ muối, nhiệt độ, pH đến sinh trƣởng chủng YBQ75 Điều kiện sinh trƣởng Nhiệt độ (oC) Khả sinh trƣởng 15 – 40 Sinh trƣởng tối ƣu 30 Nồng độ muối (%) 0–5 pH ban đầu – 10 Bảng 4.5 cho thấy, chủng YBQ75 sinh trưởng tốt dải nhiệt độ từ 15-40ºC tối thích 30ºC Có thể kết luận chủng thuộc nhóm ưa ấm kết phù hợp với nguồn gốc phân lập mẫu (tỉnh Yên Bái) Trong môi trường có nồng độ muối cao, xảy tượng nước tế bào làm thay đổi khả trao đổi chất tế bào, ức chế khả sinh trưởng hay tổng hợp sản phẩm trao đổi chất xạ khuẩn Chủng YBQ75 sinh trưởng tốt dải nồng độ muối từ – 5% phát tiển tối thích nồng độ 2% Chủng YBQ75 phát triển môi trường có dải pH từ 5-10, phát triển tốt pH Điều phù hợp với nghiên cứu trước cho xạ khuẩn thuộc nhóm vi sinh vật phát triển tốt môi trường trung tính Các giá trị pH cần cho sinh trưởng sinh sản tương ứng với giá trị pH cần cho hoạt động nhiều enzyme, biến đổi dù nhỏ nồng độ ion H+ OH- ảnh hưởng mạnh đến vi sinh vật Do việc 38 xác định pH thích hợp ban đầu việc trì pH cần thiết thời gian sinh trưởng vi sinh vật cần thiết Ảnh hưởng pH lên trình hoạt động vi sinh vật kết tác động qua lại ion H+ enzyme nội bào Đây đặc điểm có ý nghĩa quan trọng việc ứng dụng xạ khuẩn lên men thu nhận hợp chất có hoạt tính kháng sinh, kháng u Đối chiếu đặc điểm phân loại chủng xạ khuẩn YBQ75 dựa vào khóa định tên loài xạ khuẩn Nomomura 1976 Gause 1983 cho thấy YBQ75 thuộc chi Streptomyces 4.4.3 Khuếch đại phân tích trình tự gen 16S rDNA xạ khuẩn YBQ75 4.4.3.1 Khuếch đại gen 16S rDNA Để phân loại chủng YBQ75 đến loài, nghiên cứu giải phân tích trình tự 16S rDNA thực DNA tổng số chủng xạ khuẩn YBQ75 (Phụ lục 2) sử dụng làm vật liệu di truyền cho nghiên cứu khuếch đại gen 16S rDNA, kết thể hình 4.7 Băng M: thang DNA chuẩn (Thermo scientific, Mỹ); Băng 1: Đối chứng âm; Băng 2: Sản phẩm PCR sử dụng khuôn DNA gen chủng YBQ75 Hình 4.7: Điện di đồ sản phẩm PCR gel agarose 1,0% 39 Kết khuếch đại gen 16S rDNA chủng YBQ75 cho thấy, sản phẩm PCR cho băng rõ nét có kích thước khoảng 1,4kb (Hình 4.7) Như vậy, sản phẩm PCR thu thí nghiệm đặc hiệu, đáp ứng yêu cầu cho tinh giải trình tự gen 16S rDNA 4.4.3.2 Phân tích trình tự gen 16S rDNA Trình tự gen 16S rDNA chủng YBQ75 nhận từ nghiên cứu trình bày (phụ lục 4) Kết phân tích trình tự gen 16S rDNA chủng xạ khuẩn trình bày bảng 4.6 Bảng 4.6: Phân tích trình tự gen mã hóa gen mã hóa 16S rDNA chủng xạ khuẩn YBQ75 Trình tự gen 16S rDNA chủng xạ Mã số truy cập khuẩn đƣợc so sánh GenBank Streptomyces cavourensis NRRL 2740 NR 043851.1 Độ tƣơng đồng (%) 100 Streptomyces cavourensis NBRC 13026 NR 112345.1 100 Streptomyces albolongus NBRC 13465 NR 041144.1 99 Streptomyces sp SirexAA-E NR 074561.1 99 Kết phân tích trình tự gen 16S rDNA so sánh với trình tự gen công bố Genbank công cụ BLAST (NCBI) cho thấy: gen 16S rDNA chủng YBQ75 có độ tương đồng cao (100%) so với gen tương ứng rDNA chủng Streptomyces cavourensis (Bảng 4.6) Dựa vào kết nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lý-sinh hóa phân tích trình tự gen 16S rDNA, chủng xạ khuẩn YBQ75 định danh Streptomyces cavourensis YBQ75 Theo công bố trước đây, loài Streptomyces cavourensis phát lần vào năm 1978, nhóm xạ khuẩn phổ biến tự nhiên, thường phân lập từ đất vùng rễ loại thực vật hay môi trường nước Ngoài ra, chủng xạ khuẩn có khả sinh chromomycin, flavensomycin-loại kháng sinh sử dụng rộng rãi điều trị bệnh gây vi khuẩn nấm, ung thư [42] 40 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận - Đã đánh giá khả kháng VSV kiểm định 105 chủng xạ khuẩn nội cộng sinh quế Từ đó, tuyển chọn 36 chủng xạ khuẩn có khả kháng loại VSV số loại VSV kiểm định - Đã xác định có mặt gen pks-I, pks-II, nrps tham gia sinh tổng hợp kháng sinh 36 chủng xạ khuẩn tuyển chọn Trong đó, chủng mang gen pks-I (chiếm 25%), 19 chủng mang gen pks-II (chiếm 52,8%), 13 chủng xuất gen nrps (chiếm 36,1%); 04 chủng xạ khuẩn ký hiệu: YBQ59, YBQ63, YBQ75, YBQ94 mang ba gen mã hóa PKS-I, PKS-II, NRPS - Đã xác định 30 chủng tổng số 36 xạ khuẩn nghiên cứu có khả sinh kháng sinh thuộc nhóm anthracyline - Chủng YBQ75 có khả sinh kháng sinh phổ rộng, hoạt tính cao phân loại thuộc loài Streptomyces cavourensis dựa phân tích đặc điểm sinh học trình tự gen 16S rDNA Do đó, chủng YBQ75 định danh Streptomyces cavourensis YBQ75 5.2 Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu tối ưu thành phần môi trường, điều kiện lên men nhằm thu nhận kháng sinh chủng Streptomyces cavourensis YBQ75 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2007) Vi sinh vật học NXB Giáo dục Nguyễn Minh Khởi, Đào Văn Đôn, Hoàng Văn Lương, Trần Minh Ngọc, “Chiết xuất phân lập số phenollic glycosid từ quế chi Việt Nam (cinnamomum cassia blume)” Quách Ngọc Tùng, Khiếu Thị Nhàn, Chu Kỳ Sơn, Phạm Thanh Huyền, Vũ Thị Hạnh Nguyên, Trương Quốc Phong, Nguyễn Tiến Thành, Vũ Thu Trang, Phí Quyết Tiến (2014), “Đa dạng di truyền xạ khuẩn nội cộng sinh phân lập từ quế tỉnh Hòa Bình”, Tạp chí Khoa học Công nghệ, 52 (5B), 577-582 Quách Ngọc Tùng, Khiếu Thị Nhàn, Chu Kỳ Sơn, Vũ Thị Hạnh Nguyên, Vũ Thu Trang, Phí Quyết Tiến (2014), “Đánh giá sang lọc xạ khuẩn nội cộng sinh quế có khả kháng vi sinh vật gây bệnh”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 12 (2), 365-371 Văn Thị Phương Như, Cao Ngọc Điệp (2013), “Phân lập đặc tính vi khuẩn nội cộng sinh lúa (Oryza sativa L.) trồng đất tỉnh Phú Yên, Việt Nam”, Hội nghị Khoa học Công nghệ sinh học toàn quốc, (2), 450-454 Tài liệu tiếng Anh Abebe B, Feleke M, Berhanu A (2013), “Isolation and screening of antibiotic producing actinomycetes from soils in Gondar town, North West Ethiopia”, Asian Pac J Trop Dis 3(5), 375-381 Ajit K, Passari, Vineet K, Mishra, Ratul S, Vijai K, Gupta and Bhim P, Singh (2015), “Isolation, abundance and phylogenetic affiliation of 42 endophytic actinomycetes associated with medicinal plants and screening for their in vitro antimicrobial biosynthetic potential”, Front Microbiol (273), 1-13 Bacon CW, White JF (2000) Microbial endophytes, New York, Marcel Dekker Bérdy J (2005), “Bioactive microbial metabolites”, J Antibiot, (58),1-26 10 Cane DE (1997), “A special thematic issue on polyketide and nonribosomal polypeptide biosynthesis, Chem Rev, (97), 2463-2706 11 Compant S, Duffy B, Nowak J, Clément C, Barka EA (2005), “Use of plant growth-promoting bacteria for biocontrol of plant diseases: principles, mechanisms of action, and future prospects”, Appl Environ Microbiol, (71), 4951-4959 12 Duong Minh Lam, Nguyen Dinh Viet and Tong Thi Mo (2014), “Screening for anticancer producing endophytic actinomycetes in three mangrove plant species”, Chemical and Biological Sci, 59(9), 114-122 13 Franco C, Michelsen P, Percy N, Conn V, Listiana E, Moll S, Loria R, Coombs J (2007), “Actinobacterial endophytes for improved crop performance”, Australas Plant Pathol, (36), 524-531 14 Gangwar M, Dogra S and Sharma N (2011), “Antagonistic Bioactivity of Endophytic Actinomycetes Isolated from Medicinal Plants”, Journal of Advanced Laboratory Research in Biology, 2(4), 154-157 15 Gewirtz DA (1999), “A critical evaluation of the mechanism of action proposed for the antitumor effects of the anthracycline antibiotics adriamycin and daunorubicin”, Biochem Pharmacol, (57), pp 727-741 16 Giorgio M, Pierantonio M, Emanuela S, Gaetano C, Luca G (2004), “Anthracycline: Molecular Advances and pharmacologic developments in antitumor activity and cardiotixicity”, Pharmacol Rew, (56), 185-229 43 17 Gontang EA, Gaudencio SP, Fenical W, Jense PR (2010), “Sequencebased analysis of secondary-metabolite biosynthesis in marine actinobacteria”, Appl Environ Microbiol, 76(8), 2487-2499 18 Hadacek F, Greger H (2000), “Testing of antifungal natural products: Methodologies, comparability of results and assay choice”, Phytochem Anal, (11), 137-147 19 Higashide E, Asai M, OotsuK TS, Kozay Y, Hasegawa T, Kishi T, Sugino Y, Yoneda M (1977), “Ansamitocins, a group of novel maytansinoid antibiotics with antitumour properties from Nocardia”, Nature (270), 721-722 20 Igarashi Y (2004), “Screening of novel bioactive compounds from plantassociated actinomycetes”, Actinomycetologica (18), 63-66 21 Jeffrey EJ and Guy TC (2010), “Biosynthetic Potential of Phylogenetically Unique Endophytic Actinomycetes from Tropical Plants”, Applied and environmental Microbiology p, 4377-4386 22 Kakadumycins, “Novel antibiotics from Streptomyces sp NRRL 30566, an endophyte of Grevillea pteridifolia”, FEMS Microbiol Lett (234), 183-190 23 Kupchan SM, Komoda Y, Court WA, Thomas GJ, Smith RM, Karim A, Gilmore CJ, Haltiwanger RC, Bryan RF (1972), “Maytansine, a novel antileukaemic ansa macrolide from Maytenus ovatus”, J Am Chem Soc (94), 1355-1356 24 Li J, Zhao GZ, Chen HH, Wang HB, Qin S, Zhu WY,Xu LH, Jiang CL, Li WJ (2008), “Antitumour and antimicrobial activities of endophytic Streptomycetes from pharmaceutical plants in rainforest”, Lett Appl Microbiol (47), 574-580 44 25 Li Y , Kam SL , Wang H , Wong EY , Ooi VE (2006), “Antimicrobial activities of cinnamon oil and cinnamaldehyde from the Chinese medicinal herb Cinnamomum cassia Blume”, Am J Chin Med 34(3), 511-522 26 Loria R, Bukhalid RA, Fry BA, King RR (1997), “Plant pathogenecity in the genus Streptomyces”, Plant Dis (81), 836-846 27 Lu CH, Shen YM (2007), “A novel ansamycin, naphthomycin K from Streptomyces sp J”, Antibiot (60), 649-653 28 Mahera MS, Sulaiman AA, Ismet A, Milton W (2013), “Evaluation of antibiotic producing genes in Streptomyces isolated from a desert environment of Saudi Arabia”, Life Sci J 10(4), 974-980 29 Marahiel MA, Stachelhaus T, and Mootz HD (1997), “Modular pep-tide synthetases involved in nonribosomal peptide synthesis”, Chem Rev (97), 2651-2673 30 Matsukuma S, okuda T, Watanabe J (1994), “Isolation of actinomycetes from pine litter layers”, Actinomycetologica (8) 57-65 31 Meguro A; Ohmura Y, Hasegawa S, Shimizu M, Nishimura T & Kunoh H (2006), “An endophytic actinomycete, Streptomyces sp MBR-52, that accelerates emergence and elongation of plant adventitious roots”, Actinomycetologica (20), 1-9 32 Munumbicins, “Wide-spectrum antibiotics produced by Streptomyces NRRL 30562, endophytic on Kennedia nigriscans”, Microbiology, (148), 2675-2685 33 Nduka O (2007),“Modern Industrial Microbiology and Biotechnology”, Science, Enfield, pp 429-453 34 Nimnoi P, Pongsilp N, Lumyong S (2010), “Endophytic actinomycetes isolated from Aquilaria crassna Pierre ex Lec and screening of plant growth promoters production”, World J Microbiol Biotechnol (26), 193-203 45 35 Priham TG and Tenser HD (1974), ”Streptomyces Waksman and first and second studies”, Int J Syst Bacteriol (18,) 279 36 Pullen C, Schmitz P, Meurer K, Bamberg DD, Lohmann S, Franc SDC, Groth I, Schlegel B, Möllmann U, Gollmick F, Gräfe U, Leistner E (2002), “New and bioactive compounds from Streptomyces strains residing in the wood of Celastraceae”, Planta (216), 162-167 37 Qin S, Xing K, Jiang JH, Xu LH, Li WJ (2011), “Biodiversity, bioactive natural products and biotechnological potential of plant-associated endophytic actinobacteria”, Appl Microbiol Biotechnol (89), 457-473 38 Rojas DJ, Sette LD, Araujo WL, Lopes MSG, Silva LF, Furlan RLA, Padilla G (2012), “The diversity of polyketide synthase genes from sugarcane-derived fungi”, Microb Ecol (63), 565-577 39 Sambrook J, Russell DW (2001), “Molecular cloning A laboratory manual, 3rded”, Cold Spring Harbor laboratory, NY 40 Shimizu M, Yazawa S, Ushijima Y (2009), “A promising strain of endophytic Streptomyces sp for biological control of cucumber anthracnose”, J Gen Plant Pathol (75), 27-36 41 Shirling EB, Gotilieb D (1972), “Cooperative deription of type cultures of Streptomyces” V.Additional descriptions, International journual of systematic Bacteriology (22), 265-394 42 Skarbek JD, Brady LR (1978), “Streptomyces cavourensis sp nov (nom Rev.) and Streptomyces cavourensis subsp Washingtonensis subsp Nov., a Chromomycin-producing subspecies”, International Journal of Systematic Bacteriology 28(1), 45-53 43 Snipes CE, Duebelbeis DO, Olson M, Hahn DR, Dent WH, Gilbert JR, Werk TL, Davis GE, Lee-Lu R, Graupner PR (2007), “The endophytes in the stems and roots of rice”, Microb Ecol (53), 700-707 46 44 Sun Y, Cheng Z, Glick BR (2009), “The presence of a 1aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) deaminase deletion mutation alters the physiology of the endophytic plant growth promoting bacterium”, Burkholderia phytofirmans PsJN FEMS Microbiol Lett (296), 131-136 45 Suwanborirux K, Chang CJ, Spjut RW, Cassady JM (1990), “Ansamitocin P-3, a maytansinoid from Claopodium crispifolium and Anomodon attenuatus or associated actinomycetes”, Experientia (46), 117-120 46 Suzuki T, Shimizu M, Meguro A, Hasegawa S, Nishimura T, Kunoh H (2005), “Visualization of infection of an endophytic actinomycete Streptomyces galbus in leaves of tissue-cultured rhododendron”, Actinomycetologica (19),7-12 47 Thomson CJ, Bialphos SH (1995), “Genetics and Biochemistry of antibiotic production”, 197-222 48 Trease GE, Evans WC (1996), “A textbook of Pharmacognosy 14th ed Bailliere Tindall Ltd, London”, 832 49 Trenser HD and Danga F (1958), “Hydrogen sulfide production by Streptomyces as criteria for species differentiation”, J Bacteriol (76), 239 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Môi trƣờng nuôi cấy - Môi trường YIM 38 (g/L): Cao malt 4; cao men 4; glucose 4; agar 20; H2O 1L; pH 7,2 - Môi trường LBA (Luria-Bertani) (g/L): Cao nấm men 5; Tryptone 10; NaCl 10; agar 15; H2O 1L; pH= 6,5-7,0 - Môi trường MPA (g/L): Cao thịt 3; peptone 10; NaCl 5; agar 18g; H2O 1L; pH - Môi trường Hansen (g/L): Glucose 20; peptone 10; KH2PO4 2; MgSO4 2; cao nấm men 3; agar 18g; H2O 1L; pH 6,5 - Môi trường Bennett (g/L): Cao thịt 1; glucose 10; cao men 1; Casamino acid 2; agar 18-20; H2O 1L; pH 7,3-7,5 - Môi trường Gause-I (g/L): Tinh bột tan 20; K2HPO4 0,5; MgSO4.7H2O 0,5; NaCl 0,5; (NH4) 2SO4 2; KNO3 0,5; FeSO4 0,01; agar 18g; H2O 1L; pH 7-7,4 - Môi trường Gause-II (g/L): Nước chiết thịt 30ml; peptone 5; NaCl 5; glucose 10; agar 18g; H2O 1L; pH 7-7,4 - Môi trường ISP-1 (g/L): Tryptone 5; cao nấm men 3; agar 18g; H2O 1L; pH - Môi trường ISP-2 (g/L): Cao nấm men 3, cao malt 10; dextrose 4; agar 20g; H2O 1L; pH 7-7,2 - Môi trường ISP-3 (g/L): Bột kiều mạch 20; muối A 1ml; agar 20g; H2O 1L; pH 7,2 - Môi trường ISP-4 (g/L): Tinh bột tan 10; K2HPO4 1; MgSO4.7H2O 1; NaCl 1; (NH4)2SO4 2; CaCO3 2; muối A 1ml; agar 18g; H2O 1L; pH - Môi trường ISP-5 (g/L): Asparagin 1; glixerin 10; K2HPO4 1; muối A 1ml; agar 20g; H2O 1L; pH 7-7,4 - Môi trường ISP-6 (g/L): Peptone 10; cao nấm men 1; xitrat sắt 0,5; agar 18g; H2O 1L; pH 7-7,2 - Môi trường ISP-7 (g/L): Glycerol 15; L-tyrosine 0,5; L-asparagine 1; FeSO4.7H2O 0,01; K2HPO4 0,5; MgSO4.7H2O 0,5; NaCl 0,5; muối A 1ml; agar 20g; H2O 1L; pH 7,2-7,4 - Môi trường ISP-9 (g/L): (NH4)2SO4 2,64; KH2 PO4 2,38; K2HPO4 5,65; MgSO4 1; dung dịch muối B 1ml, nguồn cacbon 10; agar 20g; H2O 1L; pH 6,8-7 - Dung dịch muối A (%): FeSO4 0,1; ZnSO4 0,15; MnCl2 0,1; H2O 100ml - Dung dịch muối B (%): CuSO4 0,64; FeSO4 0,11; MgCl2 0,79; H2O 100ml Phụ lục 2: DNA tổng số chủng xạ khuẩn Hình Điện di đồ sản phẩm tách chiết DNA tổng số số chủng xạ khuẩn nội cộng sinh gel agarose 1% Trong đó: 1:YBQ128; 2:YBQ56; 3:YBQ40; 4:YBQ108; 5:YBQ26; 6:YBQ44; 7:YBQ80; 8:YBQ59; 9: YBQ118; 10: YBQ107; 11: YBQ88; 12: YBQ21; 13: YBQ19; 14: YBQ47; 15: YBQ65; 16: YBQ50; 17: YBQ1 Phụ lục 3: Bảng số liệu khả kháng loại vi sinh vật kiểm định 36 chủng xạ khuẩn Đƣờng kính vòng kháng khuẩn (D-d, mm) STT Ký hiệu chủng YBQ01 0 0 0 0 YBQ02 0 0 0 7,2 ±0.16 0 YBQ19 15,9 ±0.1 0 0 0 11,3 ±0.12 YBQ21 0 0 16,5 ±0.35 0 YBQ25 0 0 12,8 ±0.28 14 ±0.17 0 YBQ36 0 0 ±0.17 YBQ40 0 15,7 ±0.12 YBQ44 0 ±0.05 0 YBQ46 9,2 ±0.13 17,3 ±0.12 10 YBQ47 19,1 ±0.32 8,8 ±0.08 11 YBQ50 0 0 12 YBQ56 13 YBQ59 15 ±0.05 10,1 ±0.05 21,3 ±0.12 22,7 ±0.12 14 0 20 ±0.26 19,3 ±0.12 9,1 ±0.07 22 ±0.12 0 0 0 18,7 ±0.06 15,8 ±0.49 10,8 ±0.18 4,7 ±0.15 8,2 ±0.15 16 ±0.35 2,6 ±0.07 18,8 ±0.3 15 ±0.1 18,8 ±0.46 1,2 ±0.04 0 0 21,5 ±0.11 0 0 23 ±0.21 21,3 ±0.14 15,5 ±0.28 16,7 ±0.12 8,5 ±0.21 12 ±0.26 16,6 ±0.42 14,9 ±0.14 YBQ63 0 0 15 YBQ65 16 YBQ75 18,8 ±0.33 16,3 ±0.28 17 YBQ76 0 18 YBQ80 14,5 ±0.06 22,9 ±0.31 16,7 ±0.21 17,7 ±0.15 8,5 ±0.13 23,3 ±0.12 19 YBQ88 0 20 YBQ90 14,2 ±0.07 14,6 ±0.45 0 0 7,3 ±0.21 12,3 ±0.23 19,5 ±0.13 ±0.17 19,3 ±0.15 15 ±0.26 5,3 ±0.03 12,3 ±0.06 17,3 ±0.12 13 ±0.14 23,2 ±0.08 22 ±0.35 5,1 ±0.13 17,6 ±0.16 0 0 0 6,3 ±0.06 16,7 ±0.12 15 ±0.14 19 ±0.42 0 11,7 ±0.08 0 10,3 ±0.06 0 STT Ký hiệu chủng Đƣờng kính vòng kháng khuẩn (D-d, mm) 13,8 ±0.14 12,5 ±0.94 4,9 ±0.40 9,8 ±0.46 14,7 ±0.14 17,5 ±0.05 0 0 0 23 YBQ101 0 0 0 24 YBQ104 1,5 ±0.05 0 0 0 14,5 ±0.26 20 ±0.35 14,7 ±0.32 2,1 ±0.14 12,1 ±0.1 25 YBQ105 26 YBQ106 0 0 0 0 7,2 ±0.13 27 YBQ107 0 12 ±0.53 10 ±0.14 12,3 ±0.25 12,3 ±0.23 0 28 YBQ108 0 0 0 0 7,8 ±0.08 29 YBQ115 30 YBQ116 6,8 ±0.08 31 YBQ118 32 YBQ119 0 0 33 YBQ121 11,4 ±0.05 15,8 ±0.28 15,5 ±0.09 12,3 ±0.06 19,3 ±0.42 34 YBQ122 0 0 0 0 7,5 ±0.09 35 YBQ125 1.21 ±0.13 1.7 ±0.13 1.2 ±0.14 2.07 ±0.42 1.6 ±0.21 1.83 ±0.21 1.64 ±0.34 36 YBQ128 0 1.43 ±0.06 0.33 ±0.18 0 0 0 21 YBQ92 22 YBQ94 11,2 0 ±0.03 11,2 13 ±0.09 ±0.14 5,8 5,7 16 ±0.2 ±0.04 ±0.07 17,5 ±0.09 15 ±0.42 7,8 ±0.28 6,8 ±0.44 0 0 7,8 ±0.03 9,6 ±0.12 7,9 ±0.04 10,5 0 ±0.05 11,6 4,2 ±0.23 ±0.09 18 7,4 ±0.1 ±0.14 ±0.40 9,7 ±0.15 15,7 ±0.06 0 0 0 Ghi chú:1 Escherichia coli ATCC 11105; Proteus vulgaris CNLM; Salmonella enterica ATCC 14028; Enterobacter aerogenes ATCC 13048; Pseudomonas aeruginosa CNLM; Sarcina lutea CNLM; Staphylococcus epidermidis ATCC 12228; Bacillus cereus ATCC 1177; Candida albicans ATCC 10231 Phụ lục 4: Trình tự 16S rDNA chủng YBQ75 51 101 151 201 251 301 351 401 451 501 551 601 651 701 751 CTTCGGTGG TGGATTAGTG GCGAACGGGT GAGTAACACG TGGGCAATCT GCCCTTCACT CTGGGACAAG CCCTGGAAAC GGGGTCTAAT ACCGGATAAT ACTCCTGCCT GCATGGGTGG GGGTTGAAAG CTCCGGCGGT GAAGGATGAG CCCGCGGCCT ATCAGCTTGT TGGTGGGGTA ATGGCCTACC AAGGCGACGA CGGGTAGCCG GCCTGAGAGG GCGACCGGCC ACACTGGGAC TGAGACACGG CCCAGACTCC TACGGGAGGC AGCAGTGGGG AATATTGCAC AATGGGCGAA AGCCTGATGC AGCGACGCCG CGTGAGGGAT GACGGCCTTC GGGTTGTAAA CCTCTTTCAG CAGGGAAGAA GCGCAAGTGA CGGTACCTGC AGAAGAAGCG CCGGCTAACT ACGTGCCAGC AGCCGCGGTA ATACGTAGGG CGCAAGCGTT GTCCGGAATT ATTGGGCGTA AAGAGCTCGT AGGCGGCTTG TCACGTCGGA TGTGAAAGCC CGGGGCTTAA CCCCGGGTCT GCATTCGATA CGGGCTAGCT AGAGTGTGGT AGGGGAGATC GGAATTCCTG GTGTAGCGGT GAAATGCGCA GATATCAGGA GGAACACCGG TGGCGAAGGC GGATCTCTGG GCCATTACTG ACGCTGAGGA GCGAAAGCGT GGGGAGCGAA CAGGATTAGA TACCCTGGTA GTCCACGCCG TAAACGTTGG GAACTAGGTG TTGGCGACAT TCCACGTCGT CGGTGCCGCA GCTAACGCAT TAAGTT [...]... của xạ khuẩn nội cộng sinh và một số gen chức năng liên quan 2.2.1 Khả năng sinh chất kháng sinh của xạ khuẩn nội cộng sinh Nhiều loài xạ khuẩn nội cộng sinh, đặc biệt là những loài được phân lập từ cây dược liệu có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt nhiều loại VSV gây bệnh như vi khuẩn, nấm và virus Vì vậy, xạ khuẩn nội cộng sinh có tiềm năng lớn trong việc phát triển các loại thu c kháng sinh mới (Bảng... Phần lớn các chất kháng sinh được sử dụng trong y học có nguồn gốc từ xạ khuẩn Nhiều loài xạ khuẩn nội cộng sinh, đặc biệt là những loài được phân lập từ cây dược liệu có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt nhiều loại vi sinh vật gây bệnh như vi khuẩn, nấm và virus Như vậy, xạ khuẩn nội cộng sinh có tiềm năng để phát triển các loại thu c kháng sinh mới Cho đến nay, rất nhiều loại thu c kháng sinh mới đã được... có khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh 20 - Đánh giá sự có mặt của ba gen mã hóa các enzyme tham gia vào quá trình tổng hợp kháng sinh gồm PKS-I, PKS-II, NRPS và khả năng sinh anthracyline của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn - Tuyển chọn, nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại của một chủng xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh cao 3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 3.4.1 Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn. .. A B Hình 4.1: Hoạt tính kháng P vulgaris (A), S epidermidis ATTC 12228 (B) của một số chủng xạ khuẩn nội cộng sinh Gần đây, Passari và cộng sự (2015) đã công bố kết quả phân lập, đánh giá khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh của 42 chủng xạ khuẩn nội cộng sinh trên 7 loại cây dược liệu tại Ấn Độ Hai mươi hai chủng (chiếm 52,3%) thể hiện phổ kháng khuẩn với ít nhất hai loại vi khuẩn như S aureus và E...3 hoặc tách chiết các hợp chất tự nhiên có tiềm năng kháng vi sinh vật, kháng tế bào ung thư Từ đó, đưa ra một số cơ sở khoa học về mặt lý thuyết về tác dụng và cơ chế cộng sinh của các chủng xạ khuẩn trên mô tế bào cây quế Đồng thời đánh giá khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh của các chủng xạ khuẩn nhằm tìm ra chất kháng sinh, kháng ung thư mới * Ý nghĩa trong thực tiễn - Kết quả nghiên... nói chung và hoạt tính kháng sinh nói riêng từ xạ khuẩn cộng sinh trên cây dược liệu tự nhiên đang là hướng nghiên cứu triển vọng của các nhà khoa học trên thế giới Khi nghiên cứu về xạ khuẩn nội cộng sinh, câu hỏi được đặt ra là làm sao xạ khuẩn có thể xâm nhập vào cây chủ? Và làm thế nào xạ khuẩn có thể sinh trưởng trong các bộ phận của cây và mô tế bào? Để làm sáng tỏ câu hỏi trên, các nhà khoa học... đề kháng trong cây đỗ quyên con, đồng thời tăng cường sản xuất jasmonate kích thích hệ thống miễn dịch [40] Mối liên hệ giữa xạ khuẩn nội cộng sinh với các cây chủ và các sản phẩm tự nhiên có hoạt tính sinh học tạo ra cơ hội tìm ra các loại thu c đặc hiệu có tiềm năng, ứng dụng trong bảo vệ thực vật, tăng năng suất cây trồng và kiểm soát sinh học 11 2.2 Khả năng sinh chất kháng sinh của xạ khuẩn nội. .. tính sinh học từ cây quế nói riêng và cây dược liệu nói chung Hi vọng trong thời gian tới sẽ có nhiều công trình nghiên cứu về xạ khuẩn liên quan đến cây dược liệu 17 2.4 Cây quế và tiềm năng khai thác xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây quế Cây quế có tên khoa học là Cinnamomum loureirii Nees, thu c lớp hai lá mầm, ngành hạt kín, loại thân gỗ và sống lâu năm Vỏ quế có vị thơm, cay nồng dùng làm thu c,... trong đánh giá khả năng kháng vi sinh vật kiểm định và xác định đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn nội cộng sinh (Phụ lục 1) 3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành - Địa điểm nghiên cứu: Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam - Thời gian nghiên cứu: Từ 12/2014 đến 6/2015 3.3 Nội dung nghiên cứu - Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây quế. .. hormone trên thực vật [31] * Kiểm soát sinh học Trong những năm gần đây, xạ khuẩn nội cộng sinh đã thu hút sự chú ý của các nhà nghiên cứu bởi khả năng kiểm soát sinh học đối với cây mang mầm bệnh do đặc tính cư trú của chúng trong các cây chủ và hoạt tính kháng nấm Xạ khuẩn nội cộng sinh chiếm hữu các cơ quan bên trong để lấy chất dinh dưỡng và sự bảo vệ từ cây chủ Đổi lại, chúng tăng cường sức đề kháng