ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Phạm Thị Huyền Nhung PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN NẤM MỐC SINH ENZYME HỌ GH61 HỖ TRỢ THỦY PHÂN LIGNOCELLULOSE Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS VŨ NGUYÊN THÀNH Hà Nội Lời cảm ơn Trong suốt trình học tập nghiên cứu, em nhận nhiều giúp đỡ, bảo, động viên thầy cô, gia đình bạn bè Lời em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Vũ Nguyên Thành người thầy tận tình hướng dẫn, bảo, tạo điều kiện giúp em thực khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tập thể cán Bộ môn Vi sinh, Viện Công nghiệp Thực phẩm bảo, tạo điều kiện giúp em hoàn thành tốt công việc Qua đây, em xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên tận tình dạy dỗ chúng em suốt năm học qua Cuối cùng, em xin dành lời cảm ơn chân thành đến gia đình, người thân bạn bè người động viên, khích lệ em đường học tập Học viên Phạm Thị Huyền Nhung DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Thành phần lignocellulose .Error: Reference source not found§ Hình 1.2: Cấu trúc cellulose: kiểu nhiều sợi nhỏ hợp thành (Fringed fibrillar) kiểu chuỗi gấp khúc (Folding chain) Error: Reference source not found§ Hình 1.3: O – acetyl4 – O – methyl – D – glucuronoxylan từ Hạt kín Error: Reference source not found§ Hình 1.4: Arabino – – O – methylglucuronoxylan từ Hạt trần Error: Reference source not found§ Hình 1.5: Glucomannan từ Hạt kín (theo Dekker 1985) Error: Reference source not found§ Hình 1.6: O – acetylgalactoglucomannan từ Hạt trần Error: Reference source not found§ Hinh 1.7: loại tiền chất để tổng hợp lignin Error: Reference source not found§ Hình 1.8: Cấu trúc hóa học lignin .Error: Reference source not found§ Hình 1.9: Phân loại enzyme glycosyl hydrolase Error: Reference source not found§ Hình 1.10 Hoạt động enzyme GH61 Error: Reference source not found§ Hình 1.11 Sản phẩm oxy hóa C1 từ glucose Error: Reference source not found§ Hình 1.12: sợi nấm cấu trúc vách tế bào sợi nấm (Samson et al, 1995) Error: Reference source not found§ Hình 1.13: Bào tử động (theo Samson et al, 1995) Error: Reference source not found§ Hình 1.14: Bào tử túi (b) Mucor circinelloides, (a) Cuống bào tử túi .Error: Reference source not found§ Hình 1.15: Các kiểu cuống bào tử đính Aspergillus Error: Reference source not found§ Hình 1.16: Bào tử đính cuống bào tử đính Penicillium chrysogenum .Error: Reference source not found§ Hình 1.17 Cuống bào tử phân nhánh Trichoderma a T viride, b T koningii, c T polysporum, d T citrinoviride Error: Reference source not found§ Hình 1.18: bào tử đính Fusarium eumartii .Error: Reference source not found§ Hình 1.19 Bào tử đốt Error: Reference source not found§ Hình 3.1 Phổ điện di SDS – PAGE Zymogram chủng FEC 514, FEC 515, FEC 516Error: Reference source not found§ Hình 3.2 Phổ điện di SDS – PAGE Zymogram chủng FEC 519, FEC 523, FEC 534Error: Reference source not found§ Hình 3.3 Phổ điện di SDS – PAGE Zymogram chủng FEC 544, FEC 550 Error: Reference source not found§ Hình 3.4 Phổ điện di SDS – PAGE Zymogram chủng FEC 551, FEC 552 Error: Reference source not found§ Hình 3.5 Hình ảnh khuẩn lạc tế bào chủng FEC 514 Error: Reference source not found§ Hình 3.6 Hình ảnh khuẩn lạc tế bào chủng FEC 519 Error: Reference source not found§ Hình 3.7 Hình ảnh khuẩn lạc tế bào chủng FEC 523 Error: Reference source not found§ Hình 3.8 Hình ảnh khuẩn lạc tế bào chủng FEC 534 Error: Reference source not found§ Hình 3.9 Hình ảnh khuẩn lạc tế bào chủng FEC 550 Error: Reference source not found§ Hình 3.10 Hình ảnh khuẩn lạc tế bào chủng FEC 551 Error: Reference source not found§ Hình 3.11 Phổ fingerprinting 19 chủng nấm mốc phân lập Error: Reference source not found§ DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Thành phần lignocellulose rác thải phế phụ liệu nông nghiệp phổ biến Error: Reference source not found§ Bảng 3.1 Các chủng nấm mốc phân lập .Error: Reference source not found§ Bảng 3.2 Hoạt tính xylanse 40 chủng phân nấm mốc phân lập .Error: Reference source not found§ Bảng 3.3 Hoạt tính cellulase 40 chủng nấm mốc phân lập Error: Reference source not found§ Bảng 3.4 Hoạt tính enzyme xylanase cellulase 10 chủng nấm mốc loại chất carbon khác Error: Reference source not found§ Bảng 3.5 Hàm lượng protein (µg/ml) 10 chủng nấm mốc nuôi môi trường carbon khác Error: Reference source not found§ Bảng 3.6 Hàm lượng D – gluconic acid chủng nấm mốc phân lập Error: Reference source not found§ Bảng 3.7 Phân loại chủng nấm mốc dựa vào hình thái khuẩn lạc tế bào Error: Reference source not found§ Bảng 3.8: Kí hiệu chủng finger printing Error: Reference source not found§ Bảng 3.9 Kết phân nhóm 19 chủng nấm mốc kĩ thuật finger printing .Error: Reference source not found§ CÁC CHỮ VIẾT TẮT CMC: Carboxyl Methy Cellulose DNS: Dinitrosalicylic Acid dNTPs: Deoxyribonucleotide triphosphate IU: International Unit (là đơn vị đo lường cho giá trị chất, dựa hoạt động sinh học) GH: Glycoside Hydrolase PDA: Potato Dextro Agar PCR: Polymerase Chain Reaction SDS – PAGE: Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide MỤC LỤC MỞ ĐẦU Ngày với phát triển xã hội, ngành công – nông – lâm nghiệp … phát triển cách mạnh mẽ Bên cạnh phát triển lượng chất thải từ ngành thải môi trường ngày nhiều, làm ô nhiễm môi trường sống không sinh vật mà gây ảnh hưởng nghiêm trọng tới người Ngoài chất thải nhân tạo khó bị phân hủy có số chất thải có nguồn gốc từ sinh vật khó bị phân hủy điều kiện thường hay sinh vật thông thường chintin, lignocellulose, pectin… Trong lingocellulose chủ yếu Sự tồn đọng lignocellulose môi trường gây ô nhiễm môi trường mà làm đứt quãng chu trình tuần hoàn vật chất tự nhiên Do việc phân giải lignocellulose có vai trò quan trọng không môi trường mà sinh vật Nhiều nghiên cứu chứng minh khả triển vọng sử dụng enzyme vào việc biến đổi sinh học chất thải lignocellulose để tạo đường đơn hữu ích từ phế phụ liệu chứa lignocellulose [3] Tuy nhiên, lignocellulose chất khó bị phân giải điều kiện thường, có số sinh vật có khả phân hủy chúng Bên cạnh đó, trình đòi hỏi tham gia nhiều enzyme khác đặc biệt enzyme họ Glycoside Hydrolase Nhằm mục đích tăng suất trình thủy phân lignocellulose thành đường đơn, đường đôi từ phế phụ phẩm nông – lâm nghiệp, để từ đưa vào ứng dụng rộng rãi sản xuất sản phẩm có giá trị đời sống người vật nuôi (nhiên liệu sinh học, thức ăn chăn nuôi…), thực đề tài: Phân lập tuyển chọn chủng nấm mốc sinh enzyme họ GH61 hỗ trợ thủy phân lignocellulose CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU PHỤ LỤC 2: HÌNH THÁI KHUẨN LẠC VÀ TẾ BÀO CỦA MỘT SỐ CHỦNG NẤM MỐC FEC 504 FEC 513 FEC 515 FEC 516 FEC 518 FEC 519 FEC 520 FEC 521 FEC 523 FEC 532 FEC 538 FEC 544 FEC 546 FEC 548 PHỤ LỤC 3: KẾT QUẢ ĐO OD540 (XYLANASE) THEO PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DNS STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 Kí hiệu chủng FEC 514 FEC 514A FEC 514W FEC 515 FEC 515A FEC 515W FEC 516 FCE 516A FEC 516w FEC 519 FEC 519A FEC 519W FEC 523 FEC 523A FEC 523W FEC 534 FEC 534A FEC 534W FEC 544 FEC 544A FEC 544W FEC 550 Độ pha loãng 90 100 70 150 150 100 50 50 80 50 70 40 10 50 50 70 20 20 50 60 OD mẫu thí nghiệm 0.471 0.705 0.658 0.551 0.532 0.636 0.43 0.211 0.673 0.233 0.442 0.64 0.322 0.422 0.535 0.431 0.4 0.566 0.698 0.371 0.387 0.25 OD mẫu đối chứng 0.116 0.078 0.079 0.026 0.061 0.119 0.103 0.095 0.094 0.1 0.068 0.134 0.062 0.104 0.092 0.175 0.111 0.156 0.134 0.092 0.116 0.117 IU/ml 25.05 49.16 31.78 61.74 55.39 40.53 12.82 4.55 36.31 5.21 0.29 27.77 8.15 2.49 17.37 10.04 0.23 22.50 8.84 4.37 10.62 6.26 23 24 25 26 27 28 29 30 FEC 550A FEC 550W FEC 551 FEC 551A FEC 551W FEC 552 FEC 552A FEC 552W PHỤ LỤC 4: 40 80 60 60 80 50 70 0.164 0.987 0.474 0.232 0.206 0.311 0.28 0.571 0.058 0.162 0.134 0.104 0.129 0.129 0.122 0.132 3.32 51.74 15.99 6.02 4.83 7.13 0.12 24.09 KẾT QUẢ ĐO OD660 THEO PHƯƠNG PHÁP LOWRY Đường chuẩn BSA: BSA (µg/ml) OD 660 nm 0 50 0.139 100 0.192 200 0.461 300 0.51 400 0.769 500 0.881 STT Kết đo OD STT Kí hiệu chủng Độ pha loãng OD 660 µg/ml FEC 514 10 0.459 4590 FEC 514A 10 0.393 3930 FEC 514W 10 0.552 5520 FEC 515 10 0.543 5430 FEC 515A 10 0.238 2380 FEC 515W 10 0.537 5370 FEC 516 10 0.424 4240 FCE 516A 10 0.39 3900 FEC 516w 10 0.511 5110 10 FEC 519 10 0.452 4520 11 FEC 519A 10 0.426 4260 12 FEC 519W 10 0.457 4570 13 FEC 523 10 0.3 3000 14 FEC 523A 10 0.248 2480 15 FEC 523W 10 0.313 3130 16 FEC 534 10 0.368 3680 17 FEC 534A 10 0.229 2290 18 FEC 534W 10 0.392 3920 19 FEC 544 10 0.304 3040 20 FEC 544A 10 0.381 3810 21 FEC 544W 10 0.463 4630 22 FEC 550 10 0.411 4110 23 FEC 550A 10 0.253 2530 25 FEC 551 10 0.581 5810 26 FEC 551A 10 0.445 4450 27 FEC 551W 10 0.424 4240 28 FEC 552 10 0.424 4240 29 FEC 552A 10 0.399 3990 30 FEC 552W 10 0.316 3760 [...]... mốc Nói chung, nấm mốc sinh sản dưới 2 hình thức: vô tính và hữu tính Trong sinh sản vô tính, nấm hình thành bào tử mà không qua việc giảm phân, trái lại trong sinh sản hữu tính nấm hình thành 2 loại giao tử đực và cái a Sinh sản vô tính The Alexopoulos và Mims (1979), nấm mốc sinh sản vô tính thể hiện qua 2 dạng: sinh sản dinh dưỡng bằng đoạn sợi nấm phát triển dài ra hoặc phân nhánh và sinh sản bằng... Hình 1.9: Phân loại enzyme glycosyl hydrolase a)Theo cấu trúc hóa học lập thể của phản ứng b)Theo exo/endo 1.2.2 Họ GH 61 Trong số các họ glycoside hydrolase xúc tác thủy phân cellulose và hemicellulose, thì vai trò chức năng của họ 61 (GH61) vẫn còn nhiều điều chưa được làm sáng tỏ cho đến gần đây Đặc tính của GH61 protein được mô tả đầu tiên vào năm 1992 Ban đầu họ glycoside hydrolase 61 được phân loại... dựa vào việc đo lường hoạt động của endo-1,4-β-D-glucanase của một số thành viên trong họ mặc dù hoạt động của enzyme này là rất yếu Khác với các enzyme GH khác, enzyme họ GH61 không có khả năng thủy phân liên kết glycoside hoặc rất yếu [17], vai trò chính của nó là oxy hóa cellulose tạo ra các đầu hở, tạo điều kiện cho các enzyme cellulase bám vào hoạt động [7] Hình 1.10 Hoạt động của enzyme GH61. .. của sợi nấm thường từ 3-5µm, có khi đến 10µm, thậm chí đến 1mm Chiều dài của sợi nấm có thể tới vài chục centimet Các sợi nấm phát triển chiều dài theo kiểu tăng trưởng ở ngọn ( Hình 1.12) Các sợi nấm có thể phân nhánh và các nhánh có thể lại phân nhánh liên tiếp tạo thành hệ sợi nấm (mycelium) khí sinh xù xì như bông Trên môi trường đặc và trên một số cơ chất trong tự nhiên, bào tử nấm, tế bào nấm hoặc... trên tế bào nội mô Enzyme lactase cần thiết cho sự phân giải lactose sữa Enzyme O – GlcNAcase liên quan đến việc loại bỏ các nhóm Nacetylglucoamine từ serine và threonine thừa trong tế bào chất và nhân tế bào Glycoside hydrolase còn tham gia vào quá trình sinh tổng hợp và phân giải glycogen trong cơ thể [18] Glycoside hydrolase được phân thành nhóm EC 3.2.1 là enzyme xúc tác thủy phân của O- hoặc S-glycoside... đoạn sợi nấm có thể phát triển thành một hệ sợi nấm có hình dạng nhất định gọi là khuẩn lạc nấm Hình 1.12: sợi nấm và cấu trúc vách tế bào sợi nấm (Samson et al, 1995) Một bào tử rơi xuống gặp môi trường thuận lợi sẽ nảy mầm tạo khuẩn lạc Sợi nấm hút thức ăn làm nhiệm vụ nuôi dưỡng gọi là khuẩn ty cơ chất Sợi mang cuống bào tử làm nhiệm vụ sinh sản gọi là khuẩn ty khí sinh 1.3.3 Sinh sản của nấm mốc Nói... diệp lục, sống dị dưỡng (hoại sinh, ký sinh, cộng sinh) , vách tế bào được cấu tạo chủ yếu là chitin, có hoặc không có cellulose Màu sắc của nấm mốc được xác định bởi các bào tử do nó sinh ra như màu xanh, vàng, trắng, đen, nâu… Nhiều loài nấm mốc có khả năng ký sinh trên động vật, thực vật, và trên con người Một số chúng là tác nhân gây bệnh, làm hư hại lương thực, thực phẩm và các đồ dùng, thiết bị Tuy... sợi nấm có thể khác nhau tùy loài • Chi Geotrichum và Oospora có sợi nấm kéo thẳng, vuông hay chữ nhật và tế bào vách dầy gọi là bào tử đốt (arthrospores) (Hình 1.19) Hình 1.19 Bào tử đốt (theo Samson và cs 1995) b Sinh sản hữu tính Sinh sản hữu tính xảy ra khi có sự kết hợp giữa hai giao tử đực và cái (gametes) có trải qua giai đoạn giảm phân Quá trình sinh sản hữu tính trải qua 3 giai đoạn: - Giảm phân. .. ascorbate, và CDH enzyme (thường được kiểm soát và biểu hiện cùng với GH61s) để tăng cường hoạt động của GH61s Mặc dù quá trình oxy hóa có thể diễn ra tại các vị trí carbon khác nhau trong cấu trúc vòng glucose (C1, C4 hoặc C6), tuy nhiên oxy hóa C1 (aldonic) cellodextrines là phổ biến nhất Hình 1.11 Sản phẩm oxy hóa C1 từ glucose 1.3 Giới thiệu chung về nấm mốc [1] 1.3.1 Định nghĩa Nấm mốc là vi sinh vật... ester và nhóm hydroxyl tận cùng của rượu β – coumaryl [22] Hình 1.8: Cấu trúc hóa học của lignin 1.2 Họ GH 61 (Glycosid e Hydrolase 61) 1.2.1 Glycoside hydrolase Glycoside hydrolase (còn gọi là glycosidase hoặc glycosyl hydrolase) xúc tác cho phản ứng thủy phân các liên kết glycoside để tạo thành các phân tử đường nhỏ hơn Chúng là enzyme rất phổ biến trong tự nhiên, có vai trò như phân giải sinh khối sinh