ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -o0o - NGUYỄN THỊ KIM DUNG NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG KHÁNG NGUYÊN TRONG QUY TRÌNH SẢN XUẤT VẮCXIN CÚM LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Hà Nội LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc đến: - TS Đỗ Tuấn Đạt, Công ty TNHH MTV Vắcxin Sinh phẩm số - PGS TS Bùi Thị Việt Hà, Bộ môn Vi sinh vật học – Khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội Là người Thầy tận tình quan tâm dạy bảo kinh nghiệm quý báu tạo điều kiện giúp tơi hồn thành khóa luận Tôi xin chân thành cảm ơn đến thầy cô khoa Sinh học - trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội, giảng dạy dìu dắt tơi suốt q trình học tập vừa qua Nhân dịp xin bày tỏ lịng biết ơn tới gia đình, đồng nghiệp, bạn bè động viên, giúp đỡ chia sẻ để tơi có đủ nghị lực hồn thành nhiệm vụ học tập Tơi xin trân trọng cảm ơn ! Học viên Nguyễn Thị Kim Dung MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chương - TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm chung vi rút cúm .3 1.2 Hình thái cấu trúc hạt vi rút cúm 1.3 Cấu trúc hệ gen vi rút cúm protein mã hóa 1.4 Q trình nhân lên vi rút cúm 12 1.5 Sự phát triển vi rút cúm tế bào 16 1.6 Kỹ thuật di truyền ngược .16 1.7 Dịch tễ học bệnh cúm 19 1.8 Sinh bệnh học 24 Nhiễm trùng gây vi rút cúm viêm đường hô hấp Vi rút phát triển tế bào biểu mô đường hô hấp phá hủy nhung mao, nơi coi hàng rào bảo vệ đầu tiên, quan trọng thể hệ thống hô hấp Kèm theo nhân lên vi rút, interferon phát giai đoạn cấp tình bệnh thời gian ngắn nguyên nhân nguy hiểm nhiễm vi rút cúm 24 Nhiễm trùng gây vi rút cúm A thường để lại dấu hiệu sinh bệnh học đường hô hấp Các chứng viêm quản, khí quản, phế quản cấp xuất triệu chứng viêm long đường hô hấp phù nề Nhiễm trùng gây vi rút cúm A/H5N1 bao gồm triệu chứng máu khó đơng, thăn hư, tan hạch bạch huyết tổn trương phổi 24 Nhiễm trùng đường hô hấp viêm phổi cấp có tỷ lệ tử vong cao Viêm phổi thường tình trạng bội nhiễm vi khuẩn Streptococcus pneumonia, Staphyloccus aureus Hemophilus influenza, Staphyloccus aureus nguyên nhân thường gặp nguy hiểm, gây nên suy hô hấp, thiếu oxy diễn biến nặng sau 2-3 ngày sau nhiễm bệnh 24 1.9 Vắcxin cúm 24 1.10 Một số dạng vắcxin cúm .28 1.11 Các phương pháp kiểm tra chất lượng kháng nguyên vắcxin cúm 30 Chương - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 32 2.1 VẬT LIỆU .32 2.1.1 Tế bào .32 2.1.2 Mẫu thử nghiệm .32 2.1.3 Mơi trường hóa chất 32 2.1.4 Trang thiết bị dụng cụ 34 2.2 PHƯƠNG PHÁP 35 2.2.1 Phương pháp chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm CCID50 (liều vi rút gây hủy hoại 50% tế bào) .35 2.2.2 Phương pháp chuẩn độ hiệu giá kháng nguyên HA kỹ thuật ngưng kết hồng cầu Error: Reference source not found .37 2.2.3 Phương pháp xác định hàm lượng kháng nguyên HA SRID Error: Reference source not found 38 2.2.4 Phương pháp xác định hàm lượng protein tổng số Error: Reference source not found .40 2.2.5 Phương pháp điện di gel SDS-PAGE Error: Reference source not found 43 2.2.6 Phương pháp kính hiển vi điện tử Error: Reference source not found 44 2.2.7 Phân tích xu hướng 44 Chương - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 46 3.1 Nghiên cứu xây dựng áp dụng phương pháp đánh giá chất lượng kháng nguyên vắcxin quy trình sản xuất vắcxin cúm 46 3.1.1 Nghiên cứu xây dựng phương pháp chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm CCID50 .46 3.1.2 Kết kiểm tra chất lượng kháng nguyên quy trình sản xuất vắcxin cúm 56 3.2 Xây dựng tiêu chuẩn đánh giá chất lượng kháng nguyên quy trình sản xuất vắcxin cúm 60 3.2.1 Tiêu chuẩn hiệu giá vi rút cúm quy trình sản xuất vắcxin cúm 60 3.2.2 Tiêu chuẩn hiệu giá kháng nguyên HA kỹ thuật ngưng kết hồng cầu quy trình sản xuất vắcxin cúm 63 3.2.3 Tiêu chuẩn hàm lượng kháng nguyên HA SRID 67 3.2.4 Tiêu chuẩn hàm lượng protein tổng số 71 KẾT LUẬN .74 TÀI LIỆU THAM KHẢO 76 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các phân đoạn ARN vi rút cúm chức Error: Reference source not found .8 Bảng 1.2 Các ca nhiễm cúm A (A/H5N1) xác định nước 2003-2015 Error: Reference source not found 22 Bảng 1.3 Báo cáo tổng kết giám sát cúm mùa năm 2014 Error: Reference source not found 23 Bảng 2.1 Công thức pha môi trường MEM 35 Bảng 2.2 Công thức pha môi trường DMEM 35 Bảng 2.3 Công thức pha môi trường LH3E 36 Bảng 2.4 Pha loãng mẫu thử nghiệm kháng nguyên chuẩn .39 Bảng 3.1 Kết chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm với điều kiện thử nghiệm khác (lần 1) .54 Bảng 3.2 Kết chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm với điều kiện thử nghịêm khác (lần 2) .54 Bảng 3.3 Kết chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm với điều kiện thử nghiệm khác (lần 3) .54 Bảng 3.4 Kết kháng nguyên quy trình sản xuất vắcxin cúm A/H5N1 56 Bảng 3.5 Kết kháng nguyên quy trình sản xuất vắcxin cúm A/H1N1 56 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc hạt vi rút cúm Error: Reference source not found Hình 1.2 Hình ảnh vi rút cúm B Error: Reference source not found Hình 1.3 Hình ảnh vi rút cúm A/H1N1 Error: Reference source not found Hình 1.4 Hình ảnh vi rút cúm A/H1N1 Error: Reference source not found Hình 1.5 Hình ảnh vi rút cúm A/H5N1 Error: Reference source not found Hình 1.6 Vi rút cúm A/H5N1 quy trình vi rút cúm xâm nhập vào tế bào, nhân lên thành vi rút 16 Hình 1.7 Lưu hành cúm A, cập nhật đến 17/9/2015 (thông qua mẫu hơ hấp xác định dương tính với cúm A) Error: Reference source not found .20 Hình 3.1 Tế bào MDCK kín lớp sau ngày ni cấy 46 Hình 3.2 Tế bào MDCK chứng gây nhiễm vi rút cúm nồng độ 10-1 sau ngày, nuôi nhiệt độ 32oC 37oC môi trương MEM 47 Hình 3.3 Tế bào MDCK chứng gây nhiễm vi rút cúm nồng độ 10-1, 106, 10-8 sau ngày, nuôi nhiệt độ 32oC 37oC mơi trường MEM 49 Hình 3.4 Tế bào MDCK chứng gây nhiễm vi rút cúm nồng độ 10-1, 106, 10-8 sau ngày, nuôi nhiệt độ 32oC 37oC môi trương MEM 53 Hình 3.5 So sánh chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm loại môi trường MEM, DMEM, LH3E 32oC sau ngày, ngày ngày ( Giá trị trung bình lần thử nghiệm) .55 Hình 3.7 Hình ảnh vi rút cúm A/H1N1 sau 48 gây nhiễm tế bào MDCK 59 Hình 3.8 Kết kính hiển vi điện tử mẫu sau tinh chế vắcxin cúm .59 Hình 3.9 Đồ thị phân tích xu hướng hiệu giá vi rút cúm loạt BTP vắcxin cúm A/H5N1 .61 Hình 3.10 Đồ thị phân tích xu hướng hiệu giá vi rút cúm 10 loạt BTP vắcxin cúm A/H1N1 .63 Hình 3.11 Hình ảnh phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA) .64 Hình 3.12 Đồ thị phân tích xu hướng hiệu giá kháng nguyên HA kỹ thuật ngưng kết hồng cầu quy trình sản xuất vắcxin cúm loạt BTP vắcxin cúm A/H5N1 .65 Hình 3.13 Đồ thị phân tích xu hướng hiệu giá kháng nguyên HA kỹ thuật ngưng kết hồng cầu quy trình sản xuất vắcxin cúm 10 loạt BTP vắcxin cúm A/H1N1 .67 Hình 3.14 Xác định hàm lượng kháng nguyên HA SRID .68 1.Kháng nguyên chuẩn .68 2.Loạt 0112 Loạt 0512 Loạt 0113 68 Hình 3.15 Đồ thị phân tích xu hướng hàm lượng kháng nguyên HA SRID quy trình sản xuất vắcxin cúm loạt BTP vắcxin cúm A/H5N1 70 Hình 3.16 Đồ thị phân tích xu hướng hàm lượng kháng nguyên HA (SRID) quy trình sản xuất vắcxin cúm 10 loạt BTP vắcxin cúm A/H1N1 71 Hình 3.17 Đồ thị hàm lượng Protein tổng số quy trình sản xuất vắcxin cúm loạt BTP vắcxin cúm A/H5N1 72 Hình 3.18 Đồ thị hàm lượng Protein tổng số quy trình sản xuất vắcxin cúm 10 loạt BTP vắcxin cúm A/H1N1 73 MỞ ĐẦU Bệnh cúm đe dọa toàn cầu Trong ba kỷ qua, khoảng 10 đến 40 năm, giới lại chứng kiến đại dịch cúm Trước có vắcxin, đợt dịch có hàng triệu người chết Năm 1918 chứng kiến đại dịch cúm nghiêm trọng lịch sử giới, chí cịn cho đại dịch kinh hoàng loại bệnh dịch Tác nhân gây dịch vi rút cúm A/H1N1 gây tổn thất chưa thấy Dịch cúm gia cầm A/H5N1 xuất từ tháng 12/2003 Hàn Quốc, sau lan rộng số nước châu Á có Việt Nam Từ đầu tháng 4/2009, Mexico thơng báo trường hợp nhiễm cúm A/H1N1 Vi rút nhanh chóng lan nhiều quốc gia giới có thời điểm Tổ chức Y tế Thế giới (TCYTTG) phải đưa cảnh báo coi đại dịch cúm Gần nhất, vào năm 2013, trường hợp nhiễm cúm A/H7N9 thông báo Trung Quốc tiếp tục dấy lên mối lo ngại cho châu Á nói riêng tồn Thế giới nói chung nguyên cúm nguy hiểm sức khoẻ người Bệnh cúm bệnh nhiễm trùng đường hô hấp tạo nên gánh nặng lớn sức khỏe cộng đồng, TCYTTG 40% quốc gia Thế giới khuyến cáo sử dụng vắcxin phòng vi rút cúm Do vậy, phát triển vắcxin cúm cho người đặt yêu cầu cấp bách Là sở nghiên cứu sản xuất vắcxin cho người Việt Nam, Công ty TNHH MTV Vắcxin sinh phẩm số tiến hành xây dựng quy trình cơng nghệ sản xuất vắcxin cúm A/H5N1, cúm A/H1N1 tiến tới vắcxin cúm A/H7N9 nuôi cấy tế bào Một thông số quan trọng để đánh giá chất lượng vắcxin phịng thí nghiệm đặc tính kháng ngun vi rút cúm có mặt sản phẩm trình sản xuất vắcxin Xây dựng phương pháp để đánh giá, từ đưa 62 Hình 3.10 Đồ thị phân tích xu hướng hiệu giá vi rút cúm 10 loạt BTP vắcxin cúm A/H1N1 Từ đồ thị nhận thấy kết nằm khoảng (± 2SD) chứng tỏ loạt BTP ổn định vể hiệu giá vi rút Từ chúng tơi phân tích liệu xây dựng tiêu chuẩn hiệu giá vi rút cúm quy trình sản xuất vắcxin cúm đạt từ 106,5 CCID50/ml trở lên 3.2.2 Tiêu chuẩn hiệu giá kháng nguyên HA kỹ thuật ngưng kết hồng cầu quy trình sản xuất vắcxin cúm Đối với vi rút cúm, test CCID 50 phải kiểm tra với test HA HAU (đơn vị HA) tương đương với x 10 hạt vi rút/ 50µL Gaush Smith thấy 63 chu kì nhân lên vi rút cúm tế bào MDCK cần – 10 A 10 11 12 B C E F G H Hình 3.11 Hình ảnh phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA) (- Cột: A-chứng âm, B-chứng dương có hiệu giá HA 512, C đến H mẫu thử nghiệm có hiệu giá HA tương ứng 128, 128, 2048, 256, 128, 256 - Hàng: Từ đến 12 độ pha loãng tương đương 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512, 1024, 2048, 4096) Kết hiệu giá HA mà đề tài thu phù hợp với nghiên cứu giới Kistner đồng nghiệp tiến hành nuôi cấy chủng cúm phân 64 typ H1, H2 H3 khác tế bào Vero với nồng độ gây nhiễm 0,01 CCID50/tế bào (tương tự liều gây nhiễm chúng tôi), sau 2-3 ngày hiệu giá HA đạt 256 Error: Reference source not found Kistner đồng nghiệp thử nghiệm nuôi cấy chủng cúm H5N1 hoang dại tế bào Vero, hiệu giá HA sau nuôi cấy đạt 512-1024 trứng gà có phơi cho hiệu giá HA 1024-2048 Error: Reference source not found Tuy nhiên trình ni cấy vi rút cúm tế bào Vero địi hỏi phải bổ sung Trypsin vào mơi trường cịn quy trình ni cấy vi rút cúm PMKC khơng cần thiết Hiệu giá HA nước thu phương pháp nuôi cấy tế bào thấp trứng gà có phơi nhiên thể tích nước thu từ ni cấy tế bào lại lớn nhiều so với thể tích nước niệu đạo thu từ trứng gà Hình 3.12 Đồ thị phân tích xu hướng hiệu giá kháng nguyên HA kỹ thuật ngưng kết hồng cầu quy trình sản xuất vắcxin cúm loạt BTP vắcxin 65 cúm A/H5N1 66 Hình 3.13 Đồ thị phân tích xu hướng hiệu giá kháng nguyên HA kỹ thuật ngưng kết hồng cầu quy trình sản xuất vắcxin cúm 10 loạt BTP vắcxin cúm A/H1N1 Qua đồ thị trên, kết hiệu giá kháng nguyên HA kỹ thuật ngưng kết hồng cầu nằm khoảng (± 2SD), chứng tỏ loạt BTP có kết hiệu giá kháng nguyên HA ổn định Từ phân tích chúng tơi đưa tiêu chuẩn hiệu giá kháng nguyên HA kỹ thuật ngưng kết hồng cầu quy trình sản xuất vắcxin cúm phải đạt từ 128 HAU/50µl trở lên 3.2.3 Tiêu chuẩn hàm lượng kháng nguyên HA SRID Thử nghiệm khuyếch tán miễn dịch dạng tròn đơn (SRID) thử nghiệm để định lượng kháng nguyên hòa tan phản ứng kết tủa miễn dịch môi trường bán lỏng J.M.Wood cải tiến phương pháp Schild 1975 để tăng tính xác khả lặp lại 67 Hình 3.14 Xác định hàm lượng kháng nguyên HA SRID 1.Kháng nguyên chuẩn 2.Loạt 0112 Loạt 0512 Loạt 0113 Thử nghiệm SRID thử nghiệm vô quan trọng kiểm tra 68 vắcxin cúm Theo quy định TCYTTG, vắcxin cúm mùa thông thường thử nghiệm cơng hiệu thử nghiệm SRID với u cầu hàm lượng loại kháng nguyên HA phải đạt 15 µg/liều Thử nghiệm SRID thử nghiệm đặc hiệu tính kháng nguyên đảm bảo xác thử nghiệm ngưng kết hồng cầu để định lượng HA Thử nghiêm SRID không bị ảnh hưởng phân giải vi rút quy trình tinh khiết kháng nguyên bề mặt sản xuất vắcxin Để thực thử nghiệm SRID, nhà sản xuất phải nghiên cứu phát triển kháng ngun kháng huyết chuẩn Chính để tạo nguồn huyết chuẩn đặc hiệu cho thử nghiệm SRID, tiến hành gây miễn dịch khỉ Maccaca mulatta (nguồn khỉ kiểm tra vi rút ngoại lai), thỏ dê kháng nguyên HA tinh khiết qua mũi tiêm, mũi cách tuần Sau tiến hành thử nghiệm HI để xác định hiệu giá kháng thể động vật thí nghiệm Kết cho thấy sử dụng huyết khỉ cho hiệu giá HI cao sử dụng huyết khỉ nồng độ 1,2 µg/ml agarose thử nghiệm SRID có kết định lượng HA cao nhất, hệ số tương quan kháng nguyên chuẩn mẫu thử đạt tiêu chuẩn (≥0,95), đảm bảo độ tuyến tính pha lỗng, độ rõ nét vòng ngưng kết đạt yêu cầu Để xây dựng tiêu chuẩn hàm lượng kháng nguyên HA quy trình sản xuất vắcxin cúm, chúng tơi dựa kết hàm lượng kháng nguyên HA loạt BTP vắcxin cúm A/H5N1 10 loạt BTP vắcxin cúm A/H1N1 69 Hình 3.15 Đồ thị phân tích xu hướng hàm lượng kháng nguyên HA SRID quy trình sản xuất vắcxin cúm loạt BTP vắcxin cúm A/H5N1 70 Hình 3.16 Đồ thị phân tích xu hướng hàm lượng kháng nguyên HA (SRID) quy trình sản xuất vắcxin cúm 10 loạt BTP vắcxin cúm A/H1N1 Qua đồ thị trên, kết nằm khoảng (± 2SD), chứng tỏ loạt BTP có kết hàm lượng kháng nguyên HA SRID ổn định Từ phân tích chúng tơi đưa tiêu chuẩn hàm lượng kháng nguyên HA SRID quy trình sản xuất vắcxin cúm phải đạt từ 100 µg/ml trở lên 3.2.4 Tiêu chuẩn hàm lượng protein tổng số Đối với vắcxin cúm sản xuất từ trứng gà có phơi, tiêu chuẩn Protein tổng số khơng vượt lần hàm lượng HA Error: Reference source not found Riêng vắcxin cúm sản xuất tế bào, chưa có tiêu chuẩn Protein tổng số yêu cầu giới hạn Protein ADN tồn dư tế bào chủ không nghiêm ngặt trứng gà có phơi chứa nhiều Albumin Tuy nhiên hàm lượng Protein tổng số loạt vắcxin cúm sản xuất theo quy trình chúng tơi khơng vượt lần so với hàm lượng kháng nguyên HA 71 Hình 3.17 Đồ thị hàm lượng Protein tổng số quy trình sản xuất vắcxin cúm loạt BTP vắcxin cúm A/H5N1 72 Hình 3.18 Đồ thị hàm lượng Protein tổng số quy trình sản xuất vắcxin cúm 10 loạt BTP vắcxin cúm A/H1N1 Qua đồ thị trên, kết hàm lượng Protein tổng số nằm khoảng (± 2SD), chứng tỏ loạt BTP có kết hàm lượng Protein tổng số ổn định Từ phân tích dựa vào tiêu chuẩn protein tổng số vắc xin sản xuất trứng gà có phơi, chúng tơi đưa tiêu chuẩn hàm lượng Protein tổng số quy trình sản xuất vắcxin cúm đạt từ 200 µg/ml đến 600 µg/ml 3.2.5 Tiêu chuẩn điện di gel SDS-PAGE Sản phẩm sau siêu ly tâm tinh nhiều so với trước siêu ly tâm, khơng cịn lẫn tạp chất, sản phẩm băng protein vi rút cúm 3.2.6 Tiêu chuẩn kính hiển vi điện tử Vi rút cúm sau siêu ly tâm nguyên vẹn với kháng nguyên bề mặt đặc hiệu vi rút 73 KẾT LUẬN Nghiên cứu xây dựng áp dụng phương pháp đánh giá chất lượng kháng nguyên quy trình sản xuất vắcxin cúm: - Tìm điều kiện tối ưu cho phương pháp chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm CCID50 (liều vi rút gây hủy hoại 50% tế bào) là: + Nhiệt độ nuôi cấy vi rút: 32oC + Môi trường nuôi cấy vi rút: môi trường MEM + Thời gian nuôi cấy vi rút: ngày - Đã áp dụng phương pháp đánh giá chất lượng kháng nguyên cúm phương pháp chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm CCID 50 (liều vi rút gây hủy hoại 50% tế bào), phương pháp chuẩn độ kháng nguyên HA kỹ thuật ngưng kết hồng cầu, phương pháp xác định hàm lượng kháng nguyên HA SRID, phương pháp xác định hàm lượng protein tổng số, phương pháp điện di gel SDS-PAGE, phương pháp kính hiển vi điện tử cho loạt vắcxin cúm A/H5N1 10 loạt vắcxin cúm A/H1N1 Xây dựng tiêu chuẩn đánh giá chất lượng kháng nguyên quy trình sản xuất vắcxin cúm nhằm đảm bảo tính ổn định chất lượng sản phẩm - Hiệu giá vi rút quy trình sản xuất vắcxin cúm đạt từ 10 6,5 CCID50/ml trở lên 74 - Hiệu giá kháng nguyên HA phương pháp ngưng kết hồng cầu quy trình sản xuất vắcxin cúm đạt từ 128 HAU/50µl trở lên - Hàm lượng kháng nguyên HA SRID quy trình sản xuất vắcxin cúm đạt từ 100 µg/ml trở lên - Hàm lượng Protein tổng số quy trình sản xuất vắcxin cúm đạt từ 200 µg/ml đến 600 µg/ml - Bán thành phẩm sau siêu ly tâm tinh nhiều so với trước siêu ly tâm, khơng cịn lẫn tạp chất, sản phẩm băng protein vi rút cúm - Vi rút cúm sau siêu ly tâm nguyên vẹn với kháng nguyên bề mặt đặc hiệu vi rút 75 - TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Error: Reference source not foundError: Reference source not found 76