1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI TRẦN THỊ HOA LÝ NGHIÊN CỨU TẠO MỘT SỐ CHẾ PHẨM SINH HỌC TỪ CHITIN TÁCH CHIẾT TỪ VỎ TÔM BẰNG PHƯƠNG PHÁP THỦY PHÂN AXIT Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Văn Thiết HÀ NỘI, 2011 -1- LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc em xin gửi tới thầyPGS TS Nguyễn Văn Thiết giao đề tài trực tiếp hướng dẫn để em hoàn thành khóa luận Đồng kính gửi lời cảm ơn chân thành tới bạn Nguyễn Thị Hạnh, người làm đề tài thầy cô làm việc Phòng Hóa Sinh Thực VậtViện Công Nghệ Sinh Học giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi để em thực khóa luận Em xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành đến thầy, cô khoa, thầy, cô trường THPT Lạng Giang số nơi mà công tác, bạn lớp K13 cao học sinh học thực nghiệm, gia đình người thân bên suốt thời gian qua! Hà nội, ngày 26 tháng năm 2011 Học viên Trần Thị Hoa Lý -2- LỜI CAM DOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực không trùng lặp với đề tài khác Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cảm ơn thông tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà nội, ngày 26 tháng năm 2011 Học viên Trần Thị Hoa Lý -3- MỤC LỤC Trang Mở đầu Chương 1: Tổng quan tài liệu 1.1 Giới thiệu chitin/chitosan 1.2 Các phương pháp tách chiết chitin 1.2.1 Thuỷ phân chitin chitosan acid 1.2.2 Các biến đổi hóa học monosaccharide tác động acid 10 1.2.3 Tạo thành furfurol chất họ hàng 12 1.3 Các tính chất hấp phụ chitin/chitosan 13 1.3.1 Khả hấp phụ kim loại nặng, hợp chất hữu 13 1.3.2 Tính kháng khuẩn chitosan 14 1.4 Các sản phẩm sinh học từ chitin/chitosan 17 1.5 Ứng dụng nông nghiệp, y học 20 23 Chương 2: Nội dung, vật liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Vật liệu 23 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 23 23 2.1.2 Hóa chất 2.1.3 Thiết bị 23 2.2 Các phương pháp nghiên cứu 23 2.2.1 Phương pháp tách chiết chitin từ đầu-vỏ tôm 23 2.2.2 Xác định trọng lượng phân tử trung bình chitin phương 24 pháp đo độ nhớt 2.2.3 Phương pháp chuyển chitin thành chitosan 27 2.2.4 Phương pháp thuỷ phân chitin acid 27 2.2.5 Các phương pháp xác định đường khử [19] 27 2.2.6 Các phương pháp thu hồi làm sản phẩm 29 2.2.7 Phương pháp xác định sản phẩm phụ phản ứng thuỷ phân acid 30 2.2.8 Phương pháp xác định độ độc cấp tính chế phẩm SP2 30 31 Chương 3: Kết thảo luận 3.1 Kết tách chiết chitin từ vỏ tôm 31 3.1.1 Kết tách chiết chitin từ vỏ tôm phương pháp hóa học 31 33 3.1.2 Chuyển hóa chitin thành chitosan 3.1.3 Đánh giá chất lượng mẫu chitin chitosan thu 34 3.2 Kết nghiên cứu thuỷ phân chitin acid khác 38 3.2.1 Kết nghiên cứu sơ khả thuỷ phân chitin acid 39 khác 3.3.1.1 Đánh giá khả thủy phân chitin acid khác thông 40 qua xác định lượng polysaccharide lại sau phản ứng 3.3.1.2 Đánh giá khả thủy phân chitin acid khác thông 41 qua xác định lượng đường khử dịch phản ứng 3.3.1.3 Đánh giá khả thủy phân chitin thông qua xác định lượng sản 43 phẩm phụ phản ứng -4- 3.2.2 Nghiên cứu mối phụ thuộc lượng đường khử tạo thành phản ứng thuỷ phân chitin acid vào nhiệt độ thuỷ phân 3.2.3 Kết nghiên cứu thủy phân chitin acid H2SO4 3.2.4 Kết thuỷ phân chitin acid HCl 3.2.5 Kết thuỷ phân chitin acid H3PO4 3.3 So sánh đánh giá chung kết thuỷ phân chitin acid khác 3.4 Nghiên cứu độ độc cấp tính chế phẩm SP2 Chương 4: Kết luận kiến nghị 4.1 Kết luận 4.2 Kiến nghị Tài liệu tham khảo Phần phụ lục -5- 47 49 53 56 59 62 66 66 67 68 79 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên đầy đủ DD Độ deacetyl hóa ĐC Đối chứng GlcN Glucosamine GlcNAc N-Acetyl-glucosamine HH Mẫu chitosan tách chiết từ chitin phương pháp hóa học HQ Hàn Quốc Mr Phân tử lượng polymer NANO Nanochitin OLG Oligochitosaccharide SP Sản phẩm TN Thí nghiệm -6- MỞ ĐẦU 1.Lí chọn đề tài Chitin biopolymer thứ tự nhiên, đứng sau cellulose lượng Đây loại vật liệu quý, không từ chitin tạo nhiều sản phẩm có giá trị gia tăng cao để ứng dụng nhiều lĩnh vực đời sống xã hội, mà quan trọng nguồn nguyên liệu coi vô tận, tái sinh tự nhiên Polysaccharide thành phần quan trọng khung xương nhiều động vật không xương sống, nấm số loài tảo, có chức sinh học chức cấu trúc (nâng đỡ xác định hình dạng thể) bảo vệ Từ chitin dễ dàng nhận chitosan – polymer sinh học dẫn xuất trực tiếp chitin có mặt tự nhiên thành phần thành tế bào số loại nấm Chitosan dẫn xuất quan trọng chitin, polysaccharide coi polymer dược phẩm Cả chitin chitosan không độc, dễ phân hủy có tính dung nạp sinh học Các polysaccharide có tính chất hấp phụ quí với phổ hấp phụ rộng: từ kim loại đế chất hữu Chitin biosorbent tốt kim loại, hấp phụ tất kim loại, đặc biệt kim loại nặng, ngoại trừ kim loại kiềm kiềm thổ sử dụng làm nước thải chứa phóng xạ kim loại nặng [80] Các thử nghiệm invitro cho thấy chitin liên kết bề mặt phân đoạn có khối lượng phân tử trung bình, oligopeptide, creatin, ure, cholesterin triglyceride, không hấp phụ protein có kích thước phân tử lớn, ion Na hấp phụ K Các thí nghiệm động vật cho thấy phát triển trạng thái bệnh lí khác nhau, sử dụng chitin làm giảm lượng oligopeptide độc chất khác máu có tác động âm tính thể, làm giảm lần tỉ lệ chết động vật so với nhóm động vật không nhận biosorbent Hơn nữa, phân tích kết thí nghiệm lâm sàng cho phép đưa giả định tham gia chitin hấp phụ thành phần huyết tương cholesterin, triglyceride, ure, creatinin, serotonin, histamin chất khác, điều có ý nghĩa lớn -7- điều trị loạt trạng thái bệnh lí liên quan tới rối loạn kinh niên hoạt động quan hệ quan tương ứng Các kết mở triển vọng ứng dụng chitin y học thông qua gọi thẩm tích ruột để chữa bệnh nhiễm trùng kinh niên cấp đường dày-ruột, tổn thương hệ thống gan-mật, rối loạn kinh niên cấp tính đồng hành với phát triển ngộ độc (viêm phổi, biến chứng tính chất nhiễm trung mủ sau phẫu thuật, suy thận mãn cấp…), rối loạn dị ứng trao đổi Ngoài chitin sử dụng để chữa bệnh thú y, chăn nuôi… [82] Trở ngại lớn ứng dụng chitin tính chất khó hòa tan chúng nhiều dung môi, kể dung môi hữu Từ chitin chitosan nhận nhiều dẫn xuất khác phương pháp hóa học để làm tăng tính tan chúng, nhằm phát huy tiềm ứng dụng polysaccharide Một phương thức đơn giản rẻ tiền làm tăng tính phân tán chitin chitosan thể tích, mặt đồng nghĩa với làm tăng tính tan chúng, phương pháp thủy phân acid nhờ sử dụng acid vô làm tác nhân thủy phân Bằng phương pháp thu nhận nhiều loại sản phẩm có tác dụng khác từ chitin để phục vụ cho mục đích ứng dụng khác nhau, bao gồm: (i) chitin chitosan mạch ngắn (so với phân tử ban đầu) nanochitin; (ii) chito-oligosaccharide (cả mạch ngắn mạch dài, hay tan không tan), (iii) chito-monosaccharide (chủ yếu glucosamine) Các sản phẩm thủy phân nhóm ứng dụng y học nêu trên, vai trò biosorbent sử dụng để tạo thực phẩm chức phòng chống béo phì, ngăn ngừa bệnh tim mạch, tiểu đường, chống ngộ độc thực phẩm… Nhóm sản phẩm chitooligosaccharide có triển vọng lớn vai trò elicitor – chất làm tăng cường khả miễn dịch thể có tác dụng chống béo phì Glucosamine thuốc chống viêm khớp tốt Chúng quan tâm tới nhóm sản phẩm đầu, đề tài luận văn thạc sĩ có tên là: “Nghiên cứu tạo số chế phẩm sinh học từ chitin tách chiết từ vỏ tôm phương pháp thủy phân acid” -8- Đề tài tiến hành dựa sở phương pháp hóa học nhằm tạo số chế phẩm có giá trị gia tăng cao từ nguồn phụ phẩm dồi ngành công nghiệp chế biến tôm đông lạnh xuất vỏ tôm, phục vụ cho ứng dụng khác Tôi tin tưởng thành công đề tài ý nghĩa thực tiễn mặt kinh tế- xã hội, mà có ý nghĩa khoa học sâu sắc Mục đích nghiên cứu Tạo số chế phẩm sinh học từ vỏ tôm phương pháp thủy phân acid Nhiệm vụ nghiên cứu Đề tài có nội dung sau đây: 1) Thu nhận chế phẩm chitin từ vỏ tôm; 2) Chuyển hóa chitin thành chitosan xác định kích thước phân tử chitin thông qua đo độ nhớt chế phẩm chitosan nhận được; 3) Nghiên cứu động học trình thủy phân chitin axit vô khác để tìm điều kiện tối ưu cho việc tạo số chế phẩm sinh học từ chitin: nhóm sản phẩm SP1(bao gồm chitin mạch ngắn, nanochitin chitooligosaccharide mạch dài không tan), nhóm sản phẩm SP2 (gồm oligosaccharide mạch ngắn, tan acid) nhóm sản phẩm SP3 (các chitomonosaccharide, chủ yếu glucosamine) 4) Xác định độ độc cấp tính chế phẩm SP2 (OLIGOMER) chuột nhắt trắng Đối tượng phạm vi nghiên cứu * Đối tượng nghiên cứu: - Chitin, chitin mạch ngắn, nanochitin, chitooligosaccaride glucosamine * Phạm vi nghiên cứu: - Nghiên cứu trình thủy phân chitin/chitosan acid khác nhau: HCl, H2SO4, H3PO4, HNO3 nồng độ, nhiệt độ thời gian khác Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp tách chiết chitin -9- 10 - Phương pháp chuyển chitin thành chitosan - Xác định trọng lượng phân tử trung bình chitin phương pháp đo độ nhớt - Phương pháp thuỷ phân chitin acid - Các phương pháp xác định đường khử - Phương pháp phân tách, thu hồi làm sản phẩm - Phương pháp xác định sản phẩm phụ phản ứng thuỷ phân acid - Phương pháp xác định độ độc cấp tính chế phẩm SP2 Dự kiến đóng góp Chỉ phương pháp thủy phân acid tạo số chế phẩm sinh học có giá trị giá tăng cao từ chitin -10- 73 b) Điều kiện tốt cho tạo sản phẩm nhóm SP2 (OLG) thủy phân h H2SO4 N với hiệu suất 78% HCl – N với hiệu suất ~70% SP2 nhóm sản phẩm tạo thành nhiều phương pháp thủy phân acid c) Các sản phẩm nhóm SP3 (chitomonosaccharide, chủ yếu glucosamine) tạo thành phương pháp thủy phân acid: hiệu suất thu hồi cao nhóm sản phẩm đạt 6,9% thủy phân chitin h H3PO4 N đạt 6,25% thủy phân h HCl N Chế phẩm SP2 nhận có độ cao, không gây ngộ độc cấp tính chuột nhắt trắng cho chuột ăn liều bổ sung cao gấp 10, 20 50 lần liều điều trị người thời gian 31 ngày Kiến nghị Do hạn thời gian thực đề tài có hạn, để đề tài hoàn thiện đưa số kiến nghị sau: - Nghiên cứu quy trình thu nhận sản phẩm sinh học tách chiết từ chitin phương pháp khác - Nghiên cứu tiếp quy trình thu nhận sản phẩm sinh học tách chiết từ chitin quy mô lớn - Tiến hành thực nghiệm kiểm chứng khả hấp phụ sinh học sản phẩm thu đối tượng thực vật -73- 74 TÀI LIỆU THAM KHẢO Lưu Văn Chính, Ngô Bích Anh, Trần Vũ Hùng, Vũ Mạnh Hùng, Vũ Hà, Ngô Thị Thuận, Châu Văn Minh, (2003), “Hoạt tính kháng viêm khớp muối glucosamin”, Tạp chí Dược học, (số 4), tr 21-24 Lưu văn Chính, Ngô Bích Anh, Ngô Thị Thuận, (2003), “Hoạt tính kháng viêm khớp glucosamin hydroclorid”, Tạp chí dược học, (số 10), tr 21-23 Lưu Văn Chính, Ngô Thị Thuận, Phạm Lê Dũng, Phạm Hữu Điển, Châu Văn Minh, (2001), “Xác định độ deaxetyl hoá chitosan phương pháp phổ 1H-NMR IR”, Tạp chí hoá học, tập 39, (số 1), tr 45-48 Lưu Văn Chính, (2001), “Tổng hợp nghiên cứu hoạt tính sinh học số dẫn xuất từ chitin”, Luận án tiến sỹ hoá học, Thành phố Hồ Chí Minh, 2001 Lưu Văn Chính, Vũ Mạnh Hùng, Ngô Thị Thuận, Châu Văn Minh “Tổng hợp nghiên cứu tác dụng hạ cholesterol máu N,N,N-trimethylchitosan” http://www.cimsi.org.vn/tapchi/Duochoc/Nam2000/bai9-5-2000.htm Nguyễn Thị Đông, (2003), “Tách chitin từ phế thải thuỷ sản phương pháp lên men vi khuẩn axit lactic tổng hợp số dẫn xuất N-cacboxyl chitosan” Luận án tiến sỹ hoá học, Hà Nội 2003 Nguyễn Hữu Đức, Phạm Thị Ngọc Trâm, (1994), “Bước đầu nghiên cứu sản xuất thử chitosan từ vỏ tôm phương pháp bán thuỷ nhiệt”, Tạp chí Dược học, (số 5), tr 11-13 Nguyễn Hữu Đức, Hồ Thị Tú Anh,(2000), “Bước đầu nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn Helicobacter pylory chitosan”, TC Thời Y Dược học TP HCM 8/2000 Nguyễn Thị Huệ, Lâm Ngọc Thụ, Nguyễn Quốc Hiến, Nguyễn Văn Hoan, (2001), “Nghiên cứu tác dụng chất có hoạt tính sinh học cao từ chitin nảy mầm hạt thóc giống , Tạp chí hoá học, tập 39, (số 3), tr 23 26 10 Nguyễn Thị Huệ, Lâm Ngọc Thụ, Nguyễn Văn Hoan, (2002), “Nghiên cứu tác dụng chất điều hoà sinh trưởng từ chitin giâm cành Tạp chí hoá học, tập 40, (số 1), tr 1-5 -74- 75 11 Nguyễn Thị Huệ, Lâm Ngọc Thụ, Nguyễn Quốc Hiến, Nguyễn Văn Hoan, (2001), Nghiên cứu tác dụng chất có hoạt tính sinh học cao từ chitin nảy mầm hạt thóc giống Tạp chí hoá học, tập 39, (số 3), tr 23—26 12 Đỗ Đình Rãng, Phạm Đình Cường, (1999), “Xác định hàm lượng chitin vỏ số loài thuỷ sản Việt Nam chuyển hoá thành glucosamin Trường Đại Sư phạm, Đại học Quốc gia Hà Nội, thông báo khoa học, (số 4), tr 66-71 13.61 119 Nguyễn Văn Sức, Ngô Quang Huy, Nguyễn Quốc Hiến, Nguyễn Văn Hùng, (2004), “Hấp Thụ uran chitin/chitosan có độ deaxetyl thấp” Tạp chí Hoá học, tập 42, (số 1), tr 1-4 14 Vũ Thị Ngọc Thanh, Đoàn Trọng Phụ, Nguyễn Thị Tỵ “Nghiên cứu tác dụng tăng sinh collagen chitosan điều trị bỏng nhiệt thực nghiệm” http://www.cimsi.org.vn/tapchi/DUOChoc/Nam2000/bai9-9-2000.htm 15 Vũ Thị Ngọc Thanh, Lê Thị Hải Yến, (2001), “Bước đầu nghiên cứu tác dụng chống viêm cấp tác dụng giảm đau chỗ chitosan thực nghiệm”, Tạp chí Dược học, (số 7), tr.19 16 Nguyễn Văn Thiết (chủ nhiệm) “Xây dựng quy trình công nghệ tổng hợp chất có tác dụng chống viêm khớp từ vỏ tôm” Đề tài cấp Bộ - Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam 2004 – 2005 17 Nguyễn Văn Thiết, Đỗ Ngọc Tú (2006), “Nghiên cứu khả thủy phân chitosan chitin acid khác T/c Dược liệu, T 11 (4), tr 169-174 18 Nguyễn Văn Thiết, Đỗ Ngọc Tú, Nguyễn Thanh Hải (2005),“ Một số kết bước đầu nghiên cứu quy trình sản xuất chitin từ vỏ tôm phương pháp công nghệ enzyme, Tuyển tập báo cáo khoa học Hội nghị Môi trường toàn quốc 2005, Hà Nội, 2005, tr.1428-1432 19 Nguyễn Văn Thiết, Đỗ Ngọc Tú (2006), “Phương pháp enzym tách chiết chitin từ vỏ tôm T/c Dược liệu, T 11 (2), tr 77-80 20 Đỗ Ngọc Tú, Ngyuễn Văn Thiết (2006), “Phương pháp lên men với chủng vi khuẩn sinh proteinasse tách chiết chitin từ vỏ tôm T/c Dược liệu, T 11 (3), tr 132-136 -75- 76 21 Nguyễn Văn Thiết, Đỗ Ngọc Tú (2007), “Nghiên cứu tách chiết chitin từ đầuvỏ tôm phương pháp sinh học I – Sử dụng bromelain dịch ép vỏ dứa“, T/c Khoa học cụng nghệ, Tập 45 - số 3, tr 51-58 22 Mai Xuân Tịnh, (2001), “Điều chế chitin/chitosan tử vỏ tôm phế thải’’, Tạp chí hoá học công nghệ hữu cơ, số 4(69), tr.17-19 23 Trần Đình Toại, Nguyễn Văn Thiết, Đỗ Trung Sỹ (2006), “Động học trình hoạt hóa chitinase, enzyme xúc tác phản ứng thủy phân chitin tạo thành glucosamin“, Tuyển tập báo cáo Hội nghị khoa học Viện Hóa học năm 2006, Hà Nội, 2006, tr 261-266 24 Trần Đình Toại, Nguyễn Văn Thiết, Nguyễn Bích Thủy, Đỗ Trung Sỹ (2008) “Động học trình hoạt hóa chitinase phản ứng thủy phân chitin thành glucosamine“ T/c Khoa học Cụng nghệ, tập 46, (số 1), 2008, tr.79-85 25 (137)Lê Thị Hải Yến, Nguyễn Thị Ngọc Tú, (2003), “Khảo sát động học phản ứng deaxetyl hoá chitin thành chitosan nhiệt độ thường“, TC Hoá học, tập 41, (số 3), tr 54-60 26 Lê Thị Hải Yến, Nguyễn Thị Ngọc Tú, Nguyễn Thị Thu Hà (2003), “Nghiên cứu điều chế -chitosan từ mai mực nhiệt độ thường“, TC Dược học, (số 3/2002), tr 13-16 27 Lê Thị Hải Yến.(2003), “Nghiên cứu chitin/chitosan ứng dụng y học“ Luận án tiến sỹ hoá học, Hà Nội 2003 28 Angulakshmi N., T Prem Kumar, Sabu Thomas and A Manuel Stephan (2010) Ionic conductivity and interfacial properties of nanochitin-incorporated polyethylene oxide–LiN(C2F5SO2)2 polymer electrolytes Electrochimica Acta, Vol 55, Issue 4, p 1401-1406 29 Beaney P., Lizardi-Mendoza J., Healy M (2005) Comparison of chitins produced by chemical and bioprocessing methods Journal of Chemical Technology and Biotechnology, Vol 80, No 2, pp 145-150 30 Brimacombe J S., Webber J M (1964) Mucopolysaccharides: Chemical Structure, Distribution and Isolation Vol 6, pp 18 – 42, Elsevier, Amsterdam -76- 77 31 Copecny L., Hodrova B (1998) Chitinolytic enzymes in rumen microbial ecsystem Scientific Symp “Animal Microbiology” Domzale, Slovenia, May 29, 1998, pp 85-93 31 a Couvreur, P Kante, B., Grislain, L., Roland, M and Speiser, P., Toxicity of polyalkylcyanoacrylate nanoparticles II: Doxorubicin-loaded nanoparticles J Pharm Sci., 71: 790-792, 1982 32 Davis, B & Eveleigh, D E (1984) Chitosanases: occurrence, production and immobilization In Chitin, Chitosan and Related Enzymes, pp 161-179 Edited by J P Zikakis New York: Academic Press 33 Eduardo F Franca, Roberto D Lins, Luiz C G Freitas and T P Straatsma (2008) Characterization of Chitin and Chitosan Molecular Structure in Aqueous Solution J Chem Theory Comput., 2008, (12), pp 2141–2149 34 Felse, P A., and Panda, T., "Studies on applications of chitin and its derivatives", Bioprocess Engineering, 1999, 20, pp 505-512 35 Fenton, D.M., Eveleigh, D.E (1981) Purification and mode of action of a chitosanase from Penicillium islandicum Journal of General Microbiology 126:151-165 36 Fukamizo, T., Honda, Y., Goto, S., Boucher, I., Brzezinski, R (1995) Reaction mechanism of chitosanase from Streptomyces sp N174 Biochemical Journal 311:377-383 37 Fukamizo, T., Ohkawa, T., Ikeda, Y., Goto, S (1994) Specificity of chitosanase from Bacillus pumilus Biochimica et Biophysica Acta 1205:183-188 38 Fukamizo, T., Ohkawa, T., Sonoda, K., Toyoda, H., Nishiguchi, T., Ouchi, S., Goto, S (1992) Chitinous components of the cell wall of Fusarium oxysporum Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 56:1632-1636 39 Fukamizo, T., Sasaki Ch., Schelp E., Bortone K., Robertus J.D (2001) Kinetic properties of chitinase-1 from the fungal pathogen Coccidioides immitis Biochemistry, Vol 40, pp 2448-2454 -77- 78 40 Gooday G.W (1990) Physiology of microbial degradation of chitin and chitosan Biodegradation, Vol 1, pp 177-190 41 Hall G M., and De Silva, S., "Lactic acid fermentation of scampi (Penaeus monodon) waste for chitin recovery", in Advances in Chitin and Chitosan, (eds Brine, C J., Sandford, P A., and Zikakis, J P.), Elsevier Applied Science, London, 1992, pp 633-668 42 Hall, G M., Reid, C L., and Zakaria, Z., "Fermentation of prawn waste by lactic acidbacteria", presented at GDYNIA, 6th ICCC, 1994 43 Hall, G M., Zakaria, Z., and Reid, C L., "Recovery of value-added products from shellfish waste by lactic acid fermentation process", Seafood from Producer to Consumer, Integrated Appraoch to Quality, (eds Luten, J B., Borresen, T., and Oehlenschlager, J.), Elsevier Science B V., 1997, pp 97-102 44 Ji C., Kuc J (1996) Antifungal activity of cucumber -1,3-glucanase and chitinase Physiol Mol Plant Pathol., Vol 49, pp 257-265 45 Karanda M J., Robbins P W (1991) Chitinase is required for cell separation during growth of Saccharomyces cerevisiae JBC, Vol 266, pp 19758 – 19767 46 Knorr, D., "Use of chitinous polymers in food", Food Technology, 1984, 38, pp 85-97 47 Knorr, D., "Recovery and utilisation of chitin and chitosans in food processing waste management", Food Technology, 1991, 45, pp 114-122 48 Kochetkov N.K., Bochkov A.Ph., Dmitriev B.A., Usov A.I., Chigiov O.S., Shybaev B.I (1967) Carbonhydrates Chemistry Publishinh House “Chemistry”, Moscow 672 p (Tiếng Nga) 49 Kuk J.-H., Ahn J.-S., Jung W.-J., Jin Y.-L., Cho K.-H., Park K.-H., and Park R.D Selective preparation of chitin monomer and trimer by enzymatic hydrolysis of chitin http://ift.confex.com/ift/2004/techprogram/paper_25019.htm 50 Legarreta, G I., Zakaria, Z., and Hall, G M., "Lactic fermentation of prawn waste: Comparison of commercial and isolated starter cultures", in Advances in Chitin Science, (eds Domard, A., Jeuniaux, C., Muzzarelli, R A A., Roberts, G A F.), Jacques Andre, Lyon, France, 1996, pp 399-406 -78- 79 51 Lehninger A L (1977) Biochemistry Worth Publishers, Inc., New York 52 Lundblad G., Elander M., Lind J., Sletengren K (1994) Bovine serum chitinase Eur J.Biolchem., Vol 100, pp 455-460 53 McKay, G., Blair, H S., and Gardner J R., "Adsorption of dyes of chitin", Journal of Applied Polymer Science, 1982, 27, p 3034 54 Meyers, H., Butte, W., and Schlaak, M., "Chitosan in wastewater treatment", in Advances in Chitin Science, (eds Peter, M G., Domard, A., and Muzzarelli, R A A.), University of Potsdam, Germany, 2000, p 153 55 Mitsutomi, M., Isono, M., Uchiyama, A., Nikaidou, N., Ikegami, T., Watanabe, T (1998) Chitosanase activity of the enzyme previously reported as beta-1,31,4-glucanase from Bacillus circulans WL-12 Bioscience Biotechnology and Biochemistry 62:2107-2114 56 Mitsutomi, M., Kidoh, H., Tomita, H., Watanabe, T (1995) The action of Bacillus circulans WL-12 chitinases on partially N-acetylated chitosan Bioscience Biotechnology and Biochemistry 59:529-531 57 Mitsutomi, M., Ohtakara, A (1992) Difference between microbial chitinase and chitosanase in the mode of action on partially N-acetylated chitosan In: Advances in Chitin and Chitosan (C.J Brine, P.A Sandford, J.P Zikakis, editors) Elsevier, London, pages 304-313 58 Muzzarelli R A A (1977) Chitin, Oxford: Pergamon Press 209 p 59 Muzzarelli, R.A.A., Xia, W., Tomasetti, M., Ilari, P (1995) Depolymerization of chitosan and substituted chitosans with the aid of a wheat germ lipase preparation Enzyme and Microbial Technology 17:541-545 60 Ohno, T., Armand, S., Hata, T., Nikaidou, N., Henrissat, B., Mitsutomi, M., Watanabe, T (1996) A modular family 19 chitinase found in the prokaryotic organism Streptomyces griseus HUT 6037 Journal of Bacteriology 178:50655070 -79- 80 61 Ohtakara, A., Izume, M., Mitsutomi, M (1988) Action of microbial chitosanases on chitosan with different degrees of deacetylation Agricultural and Biological Chemistry, 52:3181-3182 62 Olsen, R., Weppner, D S W., and Winandy, R., "Biomedical applications of chitin and its derivatives", in Chitin Handbook, (ed Muzzarelli, R.A.A and Peter, M.G.), 1997, p 813 63 Oshima, T., "Recovery and use of nutraceutical products from marine resources", Food Technology, 1998, 52, p 51 64 Pinelli S A., Toledo G A R., Esquerra B I R., Luviano S A R., Higuera C I (1998) Methods for extracting chitin from shrim shell waste Arch Latioam Nutr., Vol 48, No 1, pp 58 – 61 65 Rao, M., S., Munoz, J., and Stevens, W F., "Critical factors in chitin production by fermentation of shrimp biowaste", Applied Microbiology Biotechnology, 2000, 54, pp 808-813 66 Rechards G (1978) Biochemistry of Insects (Rockstein M., Ed.), Academic Press 67 Roberts W.K., Selitrennikoff C.P (1988) Plant and bacterial chitinases deffer in antifungal activity J.Gen.Microbiol., Vol.134, pp 169-176 68 Sakai, K., Katsumi, R., Isobe, A., Nanjo, F (1991) Purification and hydrolytic action of a chitosanase from Nocardia orientalis Biochimica et Biophysica Acta 1079:65-72 69 Sashiwa, H., Saimoto, H., Shigemasa, Y., Ogawa, R., Tokura, S (1991) Lysozyme susceptibility of partially deacetylated chitins International Journal of Biological Macromolecules, 12:295-296 70 Simpson, B K., Gagne, N., and Simpson, M V., "Bioprocessing of chitin and chitosan", in Fisheries Processing: Biotechnological applications, (ed Martin, A M.), Chapman & Hall, London, 1994, pp 155-173 71 A Manuel Stephan, T Prem Kumar, M Anbu Kulandainathan and N Angu Lakshmi (2009) Chitin-Incorporated -80- Poly(ethylene oxide)-Based 81 Nanocomposite Electrolytes for Lithium Batteries J Phys Chem B, 2009, 113 (7), pp 1963–1971 72 Stepanenko B N (1977) Chemistry and Biochemistry of Carbonhydrates Polysaccharides Publisher “Vyshaiya shkola”, Moscow, 1978, 256 p (tiếng Nga) 73 Suzuki, S., "Recent advances in Biomedical Application of chitic substances", in Chitin and Chitosan in Life Science, (eds Uragami, T., Kurita, K., and Fukamizo, T.), Kodansha Scientific Ltd., Japan, 2001 74 Terbojevich, M., Cosani, A., Muzzarelli, R.A.A (1996) Molecular parameters of chitosans depolymerized with the aid of papain Carbohydrate Polymers 29:63-68 75 Terwisscha A.C., Klak K.H., Beintema J.J., Dijkstra B.D (1994) Crystal structure of hevamine, a plant defence protein with chitinase and lysozyme activity, and its complex with an inhibitor Structure, Vol 2, pp 1181-1189 76 Velosquez C.L., Medina D., Torres C Millon E (2007) Kinetic of the enzymatic degradation of chitosan using bromelain: a viscosimetric study Advances en Quimica, Vol 2, No 2, pp 25-32 77 Visakh P.M., Anu Tresa Sunny, S Thomas and Aji P Mathew Mechanichal properties and transport behaviour of chitin whiskers (CW) reinforced carboxylated styrene butadiene rubber latex (XSBR) nanocomposites 78 Yalpani, M., Pantaleone, D (1994) An examination of the unusual susceptibilities of aminoglycans to enzymatic hydrolysis Carbohydrate Research 256:159-175 79 (Bolshakov I.N et al.) Бльшaкoв И.Н., Hacибoв C.M., Kyклин E.Ю., Пpиxoдькo (2002) Иcпoльзoвaниe xитoзанa и eгo пpoдyктов при воспалитeльныx зaбoлeвaний жeлy-дoчнo-кишeчнoгo тpaктa c 280–301 B кн “Xитин и xитoзан Пoлyчeниe, cвoйcтвa и пpимeнeниe” Пoд peдaкциeй K.Г Cкpябинa, Г.A Bиxopeвoй, B.П Bapлaмoвa Издaтeльcтвo “Нayкa” 2002 – 368 c -81- 82 80 Bykova V.M., Nemtxev S.V (Быкoвa B.M., Heмцев C.В.) (2002) Cыpeвые иcтoчники и cпocoбы пoлyчeния xитинa и xитoзанa c 7–23 B кн “Xитин и xитoзан Пoлyчeниe, cвoйcтвa и пpимeнeниe” Пoд peдaкциeй K.Г Cкpябинa, Г.A Bиxopeвoй, B.П Bapлaмoвa Издaтeльcтвo “Нayкa” 2002 – 368 c 81 Gorovoi L.F., Kosyakov V.I (Гopoвoй Л.Ф., Kocякoв В.И.) (2002) Copбциoнныe cвoйcтвa xитинa и eгo пpoизвoдныx c 217–246 B кн “Xитин и xитoзан Пoлyчeниe, cвoйcтвa и пpимeнeниe” Пoд peдaкциeй K.Г Cкpябинa, Г.A Bиxopeвoй, B.П Bapлaмoвa Издaтeльcтвo “Нayкa” 2002 – 368 c 82 кн “Xитин и xитoзан Пoлyчeниe, cвoйcтвa и пpимeнeниe” Пoд peдaкциeй K.Г Cкpябинa, Г.A Bиxopeвoй, B.П Bapлaмoвa Издaтeльcтвo “Нayкa” 2002 – 368 c 83 Maslova G.VG (Macловa Г.B.) (2002) Teopия и пpaктикa пoлyчeниe xитинa элeктpoxимичecким мeтoдoм c 24–43 B кн “Xитин и xитoзан Пoлyчeниe, cвoйcтвa и пpимeнeниe” Пoд peдaкциeй K.Г Cкpябинa, Г.A Bиxopeвoй, B.П Bapлaмoвa Издaтeльcтвo “Нayкa” 2002 – 368 c 84 Mapквичева E.A (2002) Xитoзан и eгo пpoизвoдныe в биoинкaпcyлиpoвaнии, c 315–326 B кн “Xитин и xитoзан Пoлyчeниe, cвoйcтвa и пpимeнeниe” Пoд peдaкциeй K.Г Cкpябинa, Г.A Bиxopeвoй, B.П Bapлaмoвa Издaтeльcтвo “Нayкa” 2002 – 368 c 85 http://www.baocantho.com.vn/vietnam/trongnuoc/9862/ Đưa công nghệ sản xuất chitin chitosan vào phục vụ đời sống 86 www.lamdong.gov.vn/KyyeuHNMD/Congnghiep/Chitosan.htm Trần Thị Luyến Tiềm phát triển công nghệ sản xuất chitosan sản phẩm công nghiệp từ vỏ tôm cua phế liệu thuỷ sản 87.http://www.lboro.ac.uk/departments/cg/Projects/2001/clarke/exper.html#solvent -82- 83 88.http://www.lboro.ac.uk/departments/cg/Projects/2002/lee/Frameset%20Introductio n.htm 89 http://user.chollian.net/%7Echitin/prechitosan.gif 90 http://www.greatv istachemicals.com/biochemicals/chitosan.html 91 http://www.greatvistachemicals.com/biochemicals/chitin.html 92 http://www.forade.com/sellers/191737-hengyu-guanghan-new-materials-co-ltd chitin, chitosan nano-, bio-nano-liquid, herbal medicines and nano-materials, nano-technology in the standard sets of equipment, nano-bio-pesticides… 93.http://ieeexplore.ieee.org/Xplore/login.jsp?reload=true&url=http%3A%2F%2Fie eexplore.ieee.org%2Fiel5%2F4479671%2F4484266%2F04484345.pdf%3Farnu mber%3D4484345&authDecision=-203 94 http://www.ualberta.ca/~csps/JPPS3(2)/M.Kumar/particles.htm 95 http://www.informaworld.com/smpp/content~db=all~content=a917033619 96 http://www.ualberta.ca/~csps/JPPS3(2)/M.Kumar/particles.htm 97.http://www.adsaleata.com/Publicity/ePub/lang-eng/article-1212/asid71/Article.aspx 98.http://www3.interscience.wiley.com/journal/121571656/abstract?CRETRY=1&SRETR Y=0 99 http://www3.interscience.wiley.com/journal/121571656/abstract 100 http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6TG04W6Y5N92&_user=10&_coverDate=01%2F25%2F2010&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=se arch&_sort=d&_docanchor=&view=c&_searchStrId=1393248265&_rerunOrigi n=google&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5 =ea597a6b5de4614f45d1ed4bdc381805 101.http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6TXW4KBDWM91&_user=10&_coverDate=07%2F26%2F2006&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=searc h&_sort=d&_docanchor=&view=c&_searchStrId=1393196965&_rerunOrigin=goo -83- 84 gle&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=c712dce 0a72ffd7f521a8d11cdf9074f 102 http://www.patentstorm.us/patents/6638918/description.html 103 http://www.lboro.ac.uk/departments/cg/Projects/2001/clarke/exper.html#solvent 104 http://www.greatvistachemicals.com/biochemicals/chitosan.html 105 http://www.greatvistachemicals.com/biochemicals/chitin.html 106 http://en.wikipedia.org/wiki/Chitin -84- 85 PHẦN PHỤ LỤC Kết xác định lượng sản phẩm phụ tạo thành thủy phân chitin chitosan nồng độ acid sulfuric khác Kết đo lượng sản phẩm phụ dạng furfurol (theo hấp phụ 270 nm) tạo thành phản ứng thuỷ phân chitosan chitin acid sulfuric trình bày hình Lượng sản phẩm phụ tạo thành gần tuyến tính với thời gian tất nồng độ acid từ đến N trường hợp thuỷ phân chitin chitosan 1.6 OD270 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 Chtosan, H2 SO4 1.2 1N 2N 0.8 4N 6N 0.4 8N 0.0 t, h 1N 2N 4N 6N 8N Chitin, H2SO4 OD270 t, h Hình - Đồ thị biểu diến mối phụ thuộc lượng sản phẩm phụ tạo thành phản ứng thuỷ phân chitosan chitin acid sulfuric (ở nồng độ khác nhau) vào thời gian Kết xác định lượng sản phẩm phụ trường hợp thủy phân HCl Kết đo lượng sản phẩm phụ tạo thành phản ứng thuỷ phân chitosan/chitin acid clohydric biểu diễn dạng đồ thị hình 0.7 Chitosan, HCl OD270 0.7 0.6 0.6 0.5 0.5 0.4 Chitin, HCl OD270 1N 1N 0.4 2N 0.3 2N 0.3 4N 0.2 6N 0.2 8N 0.1 0.1 0 t, h -85- t, h 86 Hình Đồ thị biểu diến mối phụ thuộc tạo thành sản phẩm phụ hấp phụ cực đại 270 nm thời gian phản ứng thuỷ phân chitosan chitin nồng độ khác acid clohydric Từ kết nhận thấy lượng sản phẩm phụ dẫn xuất furan dạng furfurol có hấp phụ cực đại 270 nm tạo thành phản ứng thuỷ phân chitosan chitin acid clohydric tăng tuyến tính theo thời gian tất nồng độ acid dịch thuỷ phân Kết xác định lượng sản phẩm phụ thủy phân chitin/chitosan acid phosphoric Kết đo lượng sản phẩm phụ dẫn xuất furan trình bày hình 3 OD280 Chitin, H3PO4 Chitosan, H3 PO4 2.5 2N 4N 6N 8N 1.5 0.5 1.8 1.6 1.4 1.2 0.8 0.6 0.4 0.2 OD280 1N 2N 4N 6N 8N 0 t, h t, h 8 Hình Đồ thị biểu diến mối phụ thuộc tạo thành sản phẩm phụ hấp phụ cực đại 280 nm thời gian phản ứng thuỷ phân chitosan chitin nồng độ khác acid phosphoric Các đồ thị hình 30 cho thấy lượng sản phẩm phụ dạng dẫn xuất furan tạo thành phản ứng thuỷ phân chitin chitosan acid phosphoric tăng tuyến tính với thời gian tiến hành phản ứng tất nồng độ acid dịch thuỷ phân -86- 87 -87-