ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Thảo NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC GENE MÃ HÓA ENZYME THAM GIA THỦY PHÂN CELLULOSE TỪ KHU HỆ VI SINH VẬT TRONG RUỘT MỐI BẰNG KỸ THUẬT METAGENOMICS Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62420121 TÓM TẮT DỰ THẢO LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2014 Công trình đƣợc hoàn thành tại: Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: GS TS Trƣơng Nam Hải TS Đỗ Thị Huyền Phản biện: Dự thảo luận án đƣợc bảo vệ trƣớc Hội đồng cấp Đại học Quốc gia chấm luận án tiến sĩ họp Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên vào hồi ngày tháng năm Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thƣ viện Quốc gia Hà Nội - Trung tâm thông tin – Thƣ viện, Đại học quốc gia Hà Nội MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Cellulase nhóm enzyme đƣợc sử dụng phổ biến ngành công nghiệp nhƣ chế biến thực phẩm, chế biến thức ăn, sản xuất giấy, sản xuất rƣợu, sản xuất bia, công nghệ dệt… Đặc biệt, cellulase đƣợc quan tâm nghiên cứu ứng dụng sản xuất nhiên liệu sinh học nhƣ cồn sinh học từ nguồn phế phẩm lignocellulose dồi thay cho nguồn nhiên liệu hóa thạch đà cạn kiệt Trong vòng 25 năm qua, sản lƣợng cồn sinh học tăng trƣởng đạt mức nhảy vọt kể từ năm 2000 Cồn sinh học đƣợc dùng nhƣ nguồn nhiên liệu độc lập cho loại xe có động chuyên biệt làm phụ gia nhiên liệu cho loại xe có động truyền thống với tỉ lệ lên đến 30% Ở nƣớc ta, ƣớc tính hàng năm, nguồn nguyên liệu lignocellulose từ phế phẩm nông nghiệp nhƣ rơm, rạ, mía bã mía bỏ phí lên đến 50 triệu Các biện pháp xử lý nguồn phế phẩm chủ yếu đốt gây ảnh hƣởng tiêu cực đến môi trƣờng sống sức khoẻ ngƣời Việc tận dụng đƣợc nguồn nguyên vật liệu lignocellulose phế phẩm vào sản xuất cồn sinh học đem đến nhiều lợi ích to lớn cho môi trƣờng nhƣ cho kinh tế nƣớc ta Việc sử dụng cellulase thay hoá chất truyền thống nhƣ acid, kiềm nhiệt độ cao vào trình sản xuất ngành công nghiệp giải đƣợc nhiều vấn đề nhƣ hạn chế ô nhiễm môi trƣờng bảo vệ đƣợc sức khoẻ ngƣời lao động nhƣ tăng hiệu sản xuất Tuy nhiên, vấn đề đặt cần thiết phải có đƣợc nguồn cellulase hoạt động điều kiện pH nhiệt độ thích hợp cho trình sản xuất Hơn nữa, việc sản xuất cồn sinh học gặp số khó khăn việc giảm chi phí sản xuất đặc biệt nguồn cellulase để phân cắt cellulose thành glucose hiệu Do đó, vấn đề quan trọng tìm đƣợc nguồn cellulase phù hợp với điều kiện sản xuất ngành công nghiệp liên quan, phát triển phức hợp cellulase hiệu ổn định để khắc phục khó khăn trình sản xuất Metagenomics kỹ thuật cho phép thu nhận trực tiếp DNA đa hệ gene toàn vi sinh vật môi trƣờng sống định Chính lợi thu nhận phân tích đƣợc tất hệ gene vi sinh vật phong phú đa dạng, đặc biết 99% vi sinh vật không nuôi cấy đƣợc mà Metagenomics trở thành công cụ giúp nhà nghiên cứu khai thác nguồn gene hiệu Thực tế chứng minh, sau 20 năm phát triển, đặc biệt khoảng năm gần đây, kỹ thuật giải mã gene hệ đƣợc áp dụng, Metagenomics đƣợc sử dụng hiệu để tìm hiểu đa dạng vi sinh vật nhƣ khai thác gene từ nhiều môi trƣờng sống khác nhƣ nƣớc, đất, đƣờng tiêu hóa, phế thải, … Mối đóng vai trò quan trọng hệ sinh thái khả phân hủy sinh khối lignocellulose góp phần vào chu trình carbon Khả phân hủy hiệu lignocellulose mối kết hoạt động tổng hợp enzyme cellulase hemicellulase đƣợc tiết từ thân mối từ vi sinh vật sống cộng sinh ruột mối Trong đó, hệ vi sinh vật cộng sinh ruột mối đóng vai trò quan trọng việc tiêu hóa hiệu nguồn thức ăn lignocellulose mối Vì vậy, ruột mối nguồn gene cellulase phong phú cần đƣợc khai thác nhằm tìm enzyme liên quan đến phân hủy cellulose Ở Việt Nam tìm thấy 100 loài mối khác Tuy nhiên, hệ vi sinh vật loài mối Việt Nam chƣa đƣợc nghiên cứu toàn hệ enzyme thủy phân lignocellulose có nguồn gốc từ vi sinh vật cộng sinh ruột mối chƣa đƣợc điều tra khảo sát Với đặc điểm đặc trƣng quần xã vi sinh vật sống cộng sinh ruột mối vai trò chúng giúp vật chủ phân hủy thức ăn, quần xã vi sinh vật mối bậc thấp đƣợc xem nguồn khai thác gene cellulase lý tƣởng sử dụng trình thủy phân cellusose Do đó, để nghiên cứu hệ vi sinh vật ruột mối khai thác gene mã hóa cellulase từ hệ vi sinh vật tƣơng ứng sống cộng sinh ruột hiệu quả, tiến hành đề tài “Nghiên cứu sàng lọc gene mã hoá enzyme tham gia thủy phân cellulose từ khu hệ vi sinh vật ruột mối kỹ thuật Metagenomics” Mục tiêu đề tài Đánh giá đƣợc đa dạng vi sinh vật ruột mối đa dạng gene mã hoá cellulase chúng Phân lập, tách dòng biểu đƣợc gene mã hoá cellulase từ DNA đa gene vi sinh vật ruột mối Xác định đƣợc ảnh hƣởng số điều kiện đến hoạt động protein gene tách dòng đƣợc mã hoá Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu Nghiên cứu đƣợc tiến hành đối tƣợng vi sinh vật ruột mối thợ Coptotermes thu thập miền Bắc Việt Nam Nội dung nghiên cứu Xác định đối tƣợng để tách lấy DNA đa hệ gen vi sinh vật định danh đối tƣợng Xây dựng phƣơng pháp để tách chiết tinh DNA đa hệ gene Giải trình tự xử lý trình tự DNA đa hệ gene Dự đoán gene theo hai khía cạnh đa dạng vi sinh vật đa dạng gene từ liệu trình tự DNA đa hệ gene Chọn trình tự gene để thiết mồi, phân lập, tách dòng biểu Xác định đặc điểm sản phẩm biểu gene phân lập đƣợc Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Ý nghĩa khoa học Đã định loại đƣợc loài mối bậc thấp Coptotermes gestroi thu thập sáu địa điểm Hà Nội Hƣng Yên phƣơng pháp phân tử Đã đánh giá đƣợc đa dạng vi sinh vật đa đạng gene cellulase vi khuẩn sống ruột mối C gestroi Ý nghĩa thực tiễn Đã phân lập, tách dòng biểu đƣợc gene mã hoá endoglucanase Đây enzyme đƣợc ứng dụng rộng rãi nhiều ngành công nghiệp Đóng góp đề tài Đây nghiên cứu đa dạng vi sinh vật ruột mối bậc thấp C gestroi nhƣ đa dạng gen cellulase chúng Trình tự gen phân lập, tách dòng biểu đƣợc có độ sai khác so với trình tự gene tƣơng ứng sở liệu Bố cục luận án Luận án gồm 151 trang bao gồm: phần mở đầu trang; chƣơng 1: tổng quan tài liệu 37 trang; chƣơng 2: đối tƣợng phƣơng pháp nghiên cứu 22 trang; chƣơng 3: kết thảo luận 58 trang; kết luận kiến nghị trang Các công trình khoa học tác giả trang Tài liệu tham khảo 19 trang Trong luận án có 19 bảng 62 hình Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ LIGNOCELLULOSE Nêu đại cƣơng đặc điểm cấu trúc chung ba thành phần cấu tạo nên lignocellulose cellulose, hemicellulose lignin 1.2 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CELLULASE Nêu tổng quan chế hoạt động cellulase thủy phân cellulose Cấu trúc cellulase 1.3 CELLULASE CỦA VI KHUẨN Nêu tổng quan họ cellulase, đặc biệt loài vi khuẩn vi khuẩn cổ tạo cellulase Đồng thời đặc điểm nhiệt độ, pH kích thƣớc cellulase vi khuẩn đƣợc đƣa cụ thể Ngoài ra, phần nêu số ứng dụng bật cellulase 1.4 MỐI VÀ HỆ VI SINH VẬT RUỘT MỐI LIÊN QUAN ĐẾN SỰ THỦY PHÂN LIGNOCELLULOSE Sơ lƣợc mối đa dạng mối Việt Nam Nêu tổng quan hệ vi sinh vật ruột mối bậc thấp tiêu hóa lignocellulose mối Khái quát tính hình nghiên cứu gene mã hóa cellulase sinh vật đƣờng ruột mối bậc thấp 1.5 KHÁI QUÁT CHUNG VỀ METAGENOMICS Nếu khái quát: phƣơng pháp tiếp cận tìm gene Metagenomics, nghiên cứu phân lập gene từ thƣ viện DNA đa hệ gene phƣơng pháp khai thác phân lập gene từ liệu trình tự DNA đa hệ gene Nêu rõ phƣơng pháp giải trình tự số hệ thống máy hệ Đặc biệt, đƣa nghiên cứu ứng dụng Metagenomics khai thác gene đánh giá đa dạng vi sinh vật Ngoài tiềm ứng dụng Metagenomics đƣợc đề cập Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIỆT BỊ MÁY MÓC Trong nghiên cứu này, sử dụng đối tượng vi sinh vật ruột mối thuộc chi Coptotermes Viện Sinh thái Bảo vệ công trình cung cấp; chủng vi sinh vật dùng làm thể nhận thí nghiệm tách dòng gene làm thể nhận biểu gene; plasmid sử dụng để tách dòng biểu gene; cặp mồi PCR Các loại hóa chất sử dụng nghiên cứu đƣợc đặt mua từ công ty đạt tiêu chuẩn quốc tế nhƣ Bio-Lab (Mỹ), Fermentas (Mỹ), Sigma (Mỹ), Merck (Đức) 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Các phƣơng pháp vi sinh 2.2.2 Các phƣơng pháp sinh học phân tử 2.2.2.1 Tách chiết DNA tổng số mối 2.2.2.2 Phƣơng pháp thu nhận vi sinh vật ruột mối tách chiết DNA đa hệ gene chúng 2.2.2.3 Tinh DNA đa hệ gene phƣơng pháp máng đơn (troughing) 2.2.2.4 Giải trình tự DNA đa hệ gene hiệu cao máy giải trình tự hệ HiSeq2000 Illumina 2.2.2.5 Phƣơng pháp biến nạp sốc nhiệt DNA plasmid vào vi khuẩn E coli 2.2.2.6 Phƣơng pháp tách chiết DNA plasmid từ tế bào vi khuẩn E coli 2.2.2.7 Phƣơng pháp cắt ghép nối gene 2.2.2.8 Phƣơng pháp tinh DNA từ gel agarose QIAquick Gel Extraction kit 2.2.2.9 Kỹ thuật PCR 2.2.2.10 Thiết kế vector biểu pET22b(+) mang gene egc 2.2.2.11 Điện di DNA gel agarose 2.2.2.12 Phƣơng pháp biểu gene 2.2.2.13 Điện di biến tính protein gel polyacrylamide-SDS 2.2.2.14 Điện di protein gel polyacrylamide không SDS 2.2.3 Các phƣơng pháp hóa sinh protein 2.2.3.1 Phƣơng pháp tinh protein sắc kí lực his-tag 2.2.3.2 Định lƣợng protein phƣơng pháp Bradford 2.2.3.3 Định lƣợng đƣờng khử phƣơng pháp DNS 2.2.3.4 Phƣơng pháp xác định hoạt tính endoglucanase 2.2.3.5 Phƣơng pháp xác định hoạt tính β-glucosidase β-xylosidase 2.2.3.6 Xác định ảnh hƣởng nhiệt độ, pH, ion kim loại số hóa chất lên hoạt tính endoglucanase 2.2.3.7 Xác định độ bền enzyme 2.2.4 Các phƣơng pháp tin sinh học xử lý số liệu phần mềm sinh học 2.2.4.1 Phân tích trình tự DNA đa hệ gene vi sinh vật ruột mối 2.2.4.2 So sánh trình tự ORF liệu DNA đa hệ gene với CSDL NCBI 2.2.4.3 Thiết kế mồi phần mềm FastPCR 2.2.4.4 Kiểm tra vị trí enzyme hạn chế gene quan tâm phần mềm trực tuyến RestrictionMapper 2.2.4.5 Chuyển mã trình tự DNA sang trình tự amino acid chƣơng trình dịch mã ExPASy 2.2.4.6 Xây dựng chủng loài loài mối nghiên cứu với loài mối khác phần mềm Genedoc MEGA5 2.2.4.7 Dự đoán cấu trúc EGC phần mềm Phyre2 2.2.4.8 Xác định độ tinh protein EGC tinh đƣợc phần mềm Quantity One Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 THU THẬP MỐI 3.1.1 Thu thập mối Từ tháng đến tháng năm 2012, sáu tổ mối đƣợc thu thập sáu địa điểm khác Các tổ mối thu đƣợc ghi rõ địa điểm, xếp vào hộp đựng mẫu Năm địa điểm thu đƣợc mối Hà Nội Văn Quán, Hà Đông; Tản Lĩnh, Ba Vì; Bùi Xƣờng Trạch, Đống Đa; Thái Hà, Đống Đa; Võng Thị, Tây Hồ địa điểm tỉnh Văn Lâm, Hƣng Yên Trong tổ thu đƣợc có hai đẳng cấp mối lính mối thợ Mối lính thực chức bảo vệ Còn mối thợ thực chức tìm kiếm dự trữ thức ăn Chính mối thợ có vai trò then chốt tìm kiếm tiêu hoá thức ăn, dó chúng đối tƣợng quan trọng đƣợc lựa chọn để tách lấy vi sinh vật đƣờng ruột Mối sáu tổ ăn gỗ có hình dạng bên giống Dựa vào hình thái, ngẫu nhiên, sáu mẫu mối đƣợc nhà nghiên cứu thuộc Viện Sinh thái Bảo vệ công trình định loại bậc giống Coptotermes 3.1.2 Kết định loài mối nghiên cứu phƣơng pháp phân tử 3.1.2.1 Tách DNA tổng số mối Để xác định loài mối phƣơng pháp phân tử, trƣớc hết, tiến hành tách chiết DNA tổng số mối DNA tổng số mối sáu mẫu thu thập sáu địa điểm tách chiết đƣợc nguyên vẹn có kích thƣớc lớn 10 kb Mẫu DNA đƣợc sử dụng trực tiếp làm khuôn để khuếch đại đoạn gene ARN ribosome16S (rARN 16S) ti thể 3.1.2.2 PCR khuếch đại đoạn DNA gene ARN ribosome 16S ti thể mối bp TH VT BXT VL M VQ TL 1000 500 400 Sản phẩm PCR cặp mồi thứ Sản phẩm PCR cặp mồi thứ hai 100 Hình 3.1 Điện di đồ hỗn hợp sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gene mã hóa rARN 16S ti thể mối hai cặp mồi LR-J-13007, LR-N-13398 FST-F, FST-R từ khuôn DNA tổng số mối Coptotermes gel agarose 1,7% ĐC M: Thang chuẩn 100 bp (Fermentas); ĐC TH, VT, BXT, VL, VQ TL tương ứng sản phẩm PCR từ khuôn DNA hệ gene mối thu thập Thái Hà, Võng Thị, Bùi Xương Trạch, Văn Lâm, Văn Quán Tản Lĩnh Hai cặp mồi gồm cặp thứ LR-J-13007, LR-N-13398 cặp thứ hai FSTF, FST-R đƣợc sử dụng để khuếch đại hai đoạn DNA gene mã hóa RNA ribosome ti thể mối Kết 54oC, cặp mồi thứ khuếch đại hiệu đoạn DNA đậm nét, kích thƣớc lớn 400 bp bé 500 bp từ DNA tổng số sáu mẫu mối Tuy nhiên, 57oC, cặp mồi thứ hai khuếch đại đƣợc băng DNA kích thƣớc lớn 100 bp từ hai mẫu khuôn DNA tổng số thu thập Văn Quán Tản Lĩnh, bốn mẫu DNA lại đoạn DNA đƣợc khuếch đại (Hình 3.1) Tất đoạn DNA khuếch đại đƣợc đƣợc đọc phân tích trình tự nucleotide 3.1.2.3 Phân tích sản phẩm PCR Phân tích trình tự nucleotide đoạn DNA khuếch đại cặp mồi thứ Trình tự nucleotide sáu đoạn DNA khuếch đại cặp mồi thứ đƣợc xếp so sánh với thể tất trình tự tƣơng đồng với vùng 430 bp khác ba mẫu mối thu thập Võng Thị, Văn Lâm Bùi Xƣơng Trạch Tuy nhiên, hai mẫu mối Văn Quán Thái Hà khác với nhóm khác từ 0,5-0,9%; mẫu mối Tản Lĩnh khác với mẫu mối khác từ 0,5-1,5% (Bảng 3.1) Đồng thời, mức độ tƣơng đồng trình tự nucleotide sáu đoạn DNA đƣợc so sánh với trình tự tƣơng ứng NCBI BlastN Kết cho thấy có giống cao (97-99%) sáu trình tự nghiên cứu với trình tự tƣơng ứng C gestroi (Bảng 3.2) Để xác định rõ quan hệ mối Coptotermes nghiên cứu loài thuộc giống này, phát sinh loài đƣợc thiết lập phần mềm MEGA5 (Hình 3.2) dựa vào trình tự vùng 430 bp với 21 trình tự (giống từ 92-99%) gene tƣơng ứng mã hoá rARN 16S loài mối thuộc giống Coptotermes Kết cho thấy tất sáu mẫu mối thu sáu địa điểm nằm hoàn toàn nhánh tiến hóa C gestroi Phân tích trình tự nucelotide đoạn DNA khuếch đại cặp mồi thứ hai Hai trình tự nghiên cứu khác nucleotide Kết so sánh mức giống hai trình tự nghiên cứu với trình tự tƣơng ứng NCBI Blastn cho thấy, mức giống thể cao (99-100%) trình tự Coptotermes gestroi (Bảng 3.3) Đồng thời, trình tự tƣơng ứng ngân hàng gene có mức giống từ 95-100 % so với hai trình tự nghiên cứu xây dựng phát sinh loài phần mềm MEGA5 thể quan hệ hai mẫu mối nghiên cứu loài mối thuộc giống Coptotermes Giống với kết phân tích trình tự đoạn 430 bp, phát sinh loài cho thấy hai mẫu mối nghiên cứu nằm hoàn toàn nhánh tiến hóa C gestroi Nhƣ vậy, kết phân tích chứng minh đầy đủ chắn rằng, mức độ phân tử, sáu mẫu mối nghiên cứu thu thập sáu địa điểm thuộc loài Coptotermes gestroi CTanLinhVN CVongThiVN 64 CHungYenVN CBuiXuongTrachVN 40 CgestEF092285SG CgestDQ004478SG 62 CgestDQ004480SG CgestDQ915942SG C gestroi CThaiHaVN 61 CVanQuanVN 67 CgestDQ004481MY 92 CgestDQ004487AU 39 68 CgestEF156760US CgestAY558905AG 55 70 CgestAY558906TC C carvinatus CcarvAY558909MY C kalshoveni CkalsAY683211MY 43 ClactAY558912AU 44 C lacteus CformAB626146JP 65 CformU17778US CformAB626145JP C formosanus 100 CformAY558911CN 54 CformDQ007344US CformGU075666CN 31 C intermedius CinteAY558904TG C crassus CcrasAY558901BZ 68 CvastAY558898US 97 C vastator 0.005 Hình 3.2 Cây phát sinh loài loài mối nghiên cứu 21 loài khác xây dựng dựa trình tự có mức độ giống cao với đoạn DNA kích thước 430 bp khuếch lại cặp mồi LR-J-13007 LR-N-13398 Bảng 3.1 Tỷ lệ giống khác trình tự nucleotide vùng 430 bp gene rARN ti thể mối Coptotermes thu thập từ địa điểm BXT BXT VQ VL TL TH VT 2 VQ 99,1 Tỷ lệ giống (%) VL TL TH 100 99,5 99,5 99,1 98,5 99,5 99,5 99,5 99,1 2 Số nucleotide khác 10 VT 100 99,1 100 99,5 99,5 Trong số 22 ngành vi khuẩn đƣợc dự đoán có ngành chiếm ƣu gồm Firmicutes, Proteobacteria, Spirochaetes, Bacteroidetes, Synergistetes, Planctomycetes Actinobacteria Số ORF loài thuộc ngành chiếm đến 57,72% (Bảng 3.4) tổng số ORF vi khuẩn dự đoán đƣợc Bảng 3.4 Đa dạng loài ngành vi khuẩn chiếm ưu thể sống ruột mối C gestroi Lớp Bộ Họ Chi Loài Tỷ lệ có mặt (%) Firmicutes 40 126 429 22,48 Proteobacteria 41 84 260 490 17,84 Spirochaetes 1 34 17,4 Bacteroidetes 13 67 159 11,6 Synergistetes 1 11 4,27 Planctomycetes 3 10 1,14 Actinobacteria 37 72 135 0,48 Ngành Ở bậc phân loại bộ, số 97 vi khuẩn dự đoán đƣợc có 12 chiếm ƣu thể hình (Hình 3.5) Trong đó, có Pseudomonades không thuộc ngành Tỷ lệ (%) chiếm ƣu thể, lại thuộc ngành chiếm ƣu 25 20 15 10 22.48 17.84 17.4 11.6 4.27 1.14 0.48 Ngành vi khuẩn Hình 3.4 Bảy ngành vi khuẩn chiếm ưu có mặt ruột mối C.gestroi nghiên cứu Trong đó, Clostridiales, Actinobacteria, Bacillales, Enterobacteriales, Bacillales, Pseudomonades Bacteroidales có loài phổ biến có khả phân huỷ cellulose, nhƣ Ruminococcus albus (62 ORF), Ruminococcus flavefaciens (40 ORF), Acetivibrio cellulolyticus (85 ORF), Pseudomonas fluorescens (1258 ORF) Xét bậc phân loại chi, Treponema chi thuộc Spirochaetales chiếm ƣu (chiếm đến 91,2% bộ, 15% tổng số vi khuẩn xác định đƣợc) Chi chiếm ƣu thứ hai Lactococcus (thuộc Lactobacillales) chiếm 7,8%, tiếp đến Pseudomonas (thuộc Pseudomonades) chiếm 4,6% tổng số vi khuẩn có mặt mẫu ruột mối thu thập đƣợc 13 Số lượng ORF Ngoài có năm chi chiếm ƣu Pseudomonas (5823 ORF), Enterobacter (3412 ORF), Dysgonomonas (2984 ORF), Clostridium (2968 ORF) Bacteroides (2414 ORF) Những trình tự tám chi ƣu chiếm đến 51,36% so với tổng tất chi dự đoán đƣợc Trong đó, Clostridium Bacteroides hai chi có nhiều loài phổ biến có khả phân hủy cellulose Trong liệu nhiều loài thuộc hai có khả phân huỷ cellulose nhƣ C acetobutylicum (32 ORF), C cellulolyticum (40 ORF), C cellulovorans (46 ORF), C papyrosolvens (53 ORF), B.cellulosilyticus (156 ORF) 25000 21825 20000 1306311995 15000 9951 8438 10000 5861 3685 2009 1740 1629 1470 410 5000 Bộ vi khuẩn Hình 3.5 Mười hai vi khuẩn chiếm ưu ruột mối Coptotermes gestroi ORF thích dựa vào CSDL NR 3.4 GENE MÃ HOÁ ENZYME THUỶ PHÂN CELLULOSE CỦA VI SINH VẬT RUỘT MỐI Coptotermes gestroi 3.4.1 Chú thích chức DNA đa hệ gene Toàn trình tự amino acid tƣơng ứng 125.431 ORF liệu DNA đa hệ gene vi sinh vật ruột mối C gestroi đƣợc thích Blastp dựa vào CSDL eggNOG, COG KEGG Các ORF đƣợc thích chức sâu dựa CSDL COG KEGG Dựa vào COG, 7.428 ORF đƣợc thích liên quan đến trình chuyển hóa carbohydrate gồm 210 nhóm COG Trong đó, 518 ORF thuộc nhóm COG1472, COG2723, COG1904, COG3459, COG1486, COG1363, COG2730, COG2273, COG3405 liên quan trực tiếp đến phân hủy cellulose Dựa vào KEGG, kết thích thể ORF liên quan đến đƣờng chuyển hóa carbohydrate chiếm tỷ lệ cao 12,28% (12.763/103.918 ORF) cao nhiều so với kết dự đoán dựa vào CSDL KOG Trong đó, 587 ORF mã hóa enzyme phân hủy lignocellulose gồm 316 ORF cellulase, 259 ORF hemicellulase 12 ORF lại mã hóa pectatelyase pectinesterase 14 3.4.2 Gene mã hóa enzyme phân hủy cellulose Toàn 316 ORF đƣợc thích (dựa vào CSDL KEGG) thuộc 11 họ GH khác liên quan trực tiếp đến thủy phân cellulose thể tám chức 6-phospho-βglucosidase, licheninase, glucan endo-1,3-β-D-glucosidase, endoglucanase, cellulose 1,4β-cellobiosidase, glucan 1,3- β-glucosidase cellobiose phosphorylase (Bảng 3.5) Bảng 3.5 Các ORF mã hóa cellulase vi sinh vật sống ruột C gestroi STT Mã EC Enzyme 3.2.1.86 ORF thiếu ORF thiếu ORRF thiếu ORF hoàn Tổng số thiện đầu 5’ đầu 3’ đầu 6-phospho-βglucosidase 19 20 15 60 3.2.1.21 β-glucosidase 29 40 55 87 211 2.4.1.20 1 4 3.2.1.91 cellulose 1,4-βcellobiosidase 3.2.1.4 endoglucanase 12 31 3.2.1.58 3.2.1.39 3.2.1.73 licheninase 0 2 Tổng số 55 71 80 110 316 cellobiose phosphorylase glucan glucosidase glucan 1,3-β- endo-1,3-β-D- glucosidase 1 3.4.3 Lựa chọn ORF cellulase để biểu Trong số 316 ORF đƣợc thích mã hóa enzyme tham gia thủy phân cellulose có 55 ORF hoàn thiện, 71 ORF thiếu đầu 5’, 80 ORF thiếu đầu 3’ 110 ORF thiếu hai đầu 5’ 3’ (Bảng 3.5) 55 ORF hoàn thiện gồm 19 ORF mã hóa 6-phospho-βglucosidase, 29 ORF mã hóa β-glucosidase, ORF mã hóa endoglucanase ORF mã hóa glucan 1,3-β-glucosidase Đặc biệt, endoglucanase có nhiều ứng dụng công nghiệp Do vậy, nghiên cứu này, ORF hoàn thiện đƣợc thích chức endoglucanase trình tự đặc biệt quan tâm Từ tỷ lệ tƣơng đồng giống trình tự nucleotide trình tự amino acid ORF, bƣớc đầu ORF GL0130684 đƣợc lựa chọn Để chắn dự đoán ORF GL0130684 mã hoá endoglucanase, xây dựng phân loại để xem xét quan hệ trình tự amino acid ORF GL0130684 với trình tự amino acid tƣơng ứng NCBI Kết cho thấy, trình tự amino acid GL0130684 thể hoạt tính 15 endoglucanase rõ ràng (Hình 3.6) thống so sánh với sở liệu COG, pfarm, PRK thông qua Blastp NCBI Hơn nữa, phần mềm Phyre đƣa cấu trúc 3D chức endoglucanase trình tự amino acid ORF GL0130684 Với đặc điểm phân tích cho thấy ORF GL0130684 đƣợc dự đoán chức endoglucanase với tỷ lệ cao, ORF GL0130684 đƣợc lựa chọn để phân lập, tách dòng biểu Chúng kí hiệu ORF GL0130684 gen egc 41 Escherichia-coli-endoglucanase-(WP001592871) 61 Escherichia-coli-endoglucanase-(WP021532881) 100 Escherichia-coli-endoglucanase-(WP021527136) Enterobacteriaceae-endoglucanase-III-(WP001295222) 40 94 Enterobacteriaceae-endoglucanase-III-(WP000783609) Citrobacter-farmeri-endoglucanase-(GAL50460) 100 Citrobacter-koseri-endoglucanase-III-(WP012135658) 65 Salmonella-enterica-endoglucanase-(WP 024145245) 100 Salmonella-entericagi-endoglucanase-(WP024147272) Enterobacteriaceae-bacterium-FGI57-endoglucanaseY-(WP015962575) EGC-GL0130684 Enterobacter-lignolyticus-endoglucanase-III-(WP 013364269) 96 Yokenella-regensburgei-endoglucanase-III-(WP006817672) 66 100 Yokenella-regensburgei-ATCC49455-endoglucanase-(KFD24598) 0.05 Hình 3.6 Phân tích phát sinh loài EGC endogucanase dựa tương đồng trịnh tự amino acid 0,05 số thể khác nhóm nucleotide/100 amino acid; số nhánh số Bootstrap Tên loài gồm: tên loài mã số gene 3.5 TÁCH DÒNG GENE egc 3.5.1 Trình tự ORF GL0130684 Gene egc lựa chọn có chiều dài 1107 bp Phân tích đặc điểm trình tự amino acid chƣơng trình Expasy trực tuyến cho thấy, trình tự amino acid gene egc chứa đoạn tín hiệu tiết dài 22 amino acid (từ amino acid amino acid thứ 22), tƣơng ứng với độ dài trình tự nucleotide 66 bp (từ đầu gene bp thứ 66) 3.5.2 Khuếch đại gene egc Để khuếch đại đƣợc gene egc từ khuôn DNA đa hệ gene vi sinh vật sống ruột mối với xác suất cao nhất, hai mồi xuôi GL0130684f1, GL0130684f2 mồi ngƣợc GL0130684r đƣợc sử dụng Trong đó, mồi xuôi GL0130684f1 khuếch đại gene egc từ đầu gen (cả trình tự mã hoá tín hiệu tiết) mồi xuôi GL0130684f2 khuếch đại gene egc từ vị trí sau trình tự mã hoá tín hiệu tiết (không mang trình tự mã hoá tín hiệu tiết) 16 Trong khuếch đại gene egc, Vent DNA polymerase đƣợc sử dụng Cả ba mồi đƣợc bổ sung vào phản ứng PCR Một đoạn DNA kích thƣớc lớn kb đƣợc khuếch đại (Hình 3.7) tƣơng đƣơng với kích thƣớc gene egc mong muốn Tuy nhiên, đoạn DNA khuếch đại đƣợc với số lƣợng (băng DNA không rõ ràng), đó, để thuận tiện cho việc tách dòng, sản phẩm khuếch đại có đoạn DNA mong muốn đƣợc sử dụng làm khuôn để khuếch đại đoạn DNA lên với số lƣợng lớn Kết nhƣ dƣ đoán, lƣợng DNA mong muốn đƣợc khuếch đại lên với số lƣợng lớn (Hình 3.10) Đoạn DNA đƣợc thu hồi kit tinh chế DNA QIAQuick gel extraction để ghép nối vào vector tách dòng kb M (-) M (-) 10 1,5 1,0 Sản phẩm PCR Hình 3.7 Điện di đồ sản phẩm khuếch đại gene egc gel agarose 0,8% ĐC (-): đối chứng âm; ĐC 1: sản phẩm PCR lần thứ từ khuôn DNA đa hệ gene vi sinh vật ruột mối; ĐC 2: sản phẩm PCR lần thứ hai từ khuôn sản phẩm PCR lần thứ nhất; ĐC M; thang chuẩn DNA kb (Fermentas) 3.5.3 Ghép nối sản phẩm khuếch đại gene egc vào vector tách dòng pJET1.2 blunt Trong nghiên cứu này, vector pJET1.2/blunt đƣợc sử dụng để tách dòng gene egc Tỷ lệ sản phẩm PCR vector pJET1 phản ứng ghép nối gene 3:1 Hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ nhiệt độ thích hợp Sản phẩm phản ứng ghép nối đƣợc biến nạp vào tế bào E coli DH10b phƣơng pháp sốc nhiệt để chọn dòng mang plasmid mong muốn 3.5.4 Biến nạp sản phẩm ghép nối vào tế bào E coli DH10b Plasmid tái tổ hợp pJET-egc đƣợc biến nạp vào tế bào vi khuẩn E coli DH10b phƣơng pháp sốc nhiệt Các dòng tế bào biến nạp đƣợc nuôi cấy môi trƣờng LBA 37oC lắc qua đêm để tế bào sinh trƣởng tổng hợp số lƣợng lớn Những khuẩn lạc mọc đĩa môi trƣờng LBA dòng tế bào E coli DH10b mang plasmid tái tổ hợp pJET-egc Bốn dòng khuẩn lạc sản phẩm biến nạp đƣợc lựa chọn tách chiết DNA plasmid chứa 17 plasmid có kích thƣớc đồng lớn kích thƣớc dòng pJET1.2/blunt mang đoạn DNA ngắn không đáng kế 3.5.5 Cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp enzyme hạn chế M HindIII XbaI XhoI SalI BglII EcoRV EcoRV SalI XhoI XbaI 858 511 352 377 BglII 384, BglII511 HindIII, 340 wegc Eco47 624 R PlacUV5 16511 pJETwegc 4,2 Kb 2782 Bla (ApR) kb 4,5 Sản phẩm cắt 2,5 Sản phẩm cắt Rep(pMB1) A B Hình 3.8 A Vị trí cắt enzyme cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp gene egc vector pJET1.2/blunt B Điện di đồ sản phẩm cắt plasmid tái tổ sáu enzyme hạn chế HindIII, SbalI, XhoI, SalI, BglII EcoRV Các ĐC HindIII, XbaI, XhoI, SalI, BglII EcoRV tương ứng sản phẩm cắt plasmid enzyme HindIII, XbaI, XhoI, SalI, BglII EcoRV Sáu enzyme hạn chế gồm BglII, SalI, EcoRV, XhoI, XbaI HindIII đƣợc sử dụng để cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp BglII, XhoI, XbaI HindIII cắt plasmid tái tổ hợp vector pJET1.2/blunt không cắt gene egc Kết cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp nhƣ tính toán lý thuyết (Hình 3.8) Nhƣ vậy, dòng plasmid lựa chọn cắt kiểm tra pJET-egc mong muốn 3.5.6 Phân tích trình tự gene egc phân lập đƣợc từ DNA đa hệ gene vi sinh vật ruột mối Trình tự nucleotide gene egc phân lập đƣợc từ DNA đa hệ gene vi sinh vật mối khác với trình tự ORF GL013068 nucelotide vi trí 588/1104 Điều ngẫu nhiên nucleotide sai khác lại không làm thay đổi amino acid tƣơng ứng Nghĩa trình tự amino acid đoạn DNA phân lập đƣợc ORF GL013068 giống hệt Gene egc phân lập đƣợc có trình tự mã hoá tín hiệu tiết nên đƣợc đặt tên gene wegc để phân biệt với gene egc tính hiệu tiết Nhƣ vậy, plasmid tái tổ hợp có đƣợc pJET-wegc Điều chứng tỏ, ba mồi sử dụng để khuếch đại gene egc cặp mồi GL0130684f1 GL0130684r khuếch đại đƣợc wegc Trình tự tín hiệu tiết gene wegc đƣợc thay trình tự tín hiệu tiết protein pelB có vector biểu pET22b+ , đó, trình tự tín hiệu tiết cần phải loại bỏ khỏi gene wegc Để loại bỏ trình tự tín hiệu tiết khỏi gene wegc, sử dụng cặp mồi GL0130684f2 18 GL0130684r để khuếch đại đoạn DNA đích trình tự tín hiệu tiết từ khuôn plasmid tái tổ hợp pJET-wegc 3.5.7 Khuếch đại gene egc không chứa tín hiệu tiết từ khuôn pJET-wegc Ở nhiệt độ bắt cặp mồi khuôn 50oC, 30 chu kỳ PCR, cặp mồi đặc hiệu GL0130684f2 GL0130684r khuếch đại hiệu gene egc không mang tín hiệu tiết có kích thƣớc bé wegc từ khuôn pJET-wegc (Hình 3.9) Gene egc đƣợc tinh chế kit QIAQuick gel ghép nối vào vector biểu pET22b(+) Kb M 10 Hình 3.9 Điện di đồ sản phẩm PCR 1,5 1,0 wegc egc khuếch đại gene egc từ khuôn gene wegc gel agarose 0, 8% ĐC 1: gene wegc; ĐC 2: gene egc khuếch đại từ gene wegc; ĐC M: thang chuẩn DNA kb (Fermentas) 3.5.8 Thiết kế vector biểu gene egc 3.5.8.1 Ghép nối gene egc vào vector biểu Trong nghiên cứu này, vector pET22b(+) đƣợc sử dụng để biểu gene egc pET22b(+) vector phù hợp cho biểu protein tái tổ hợp vật chủ E coli Cả gene egc vector pET22b(+) đƣợc xử lý cặp enzyme hạn chế XhoI NcoI Sản phẩm cắt gene egc kích thƣớc 1041 bp pET22b(+) dạng thẳng kích thƣớc 5431 bp có hai đầu dính tƣơng ứng giống Đặc điểm giúp cho trình ghép nối chúng với hiệu cao Sản phẩm ghép nối pET22-egc đƣợc biến nạp vào tế bào E.coli DH10B sốc nhiệt để chọn dòng mong muốn 3.5.8.2 Cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET22-egc Plasmid tái tổ hợp pET22-egc có trình tự cắt XhoI NcoI hai đầu gene egc Khi sử dụng cặp enzyme để cắt kiểm tra pET22-egc tạo hai đoạn DNA, đoạn thứ gene egc kích thƣớc 1041 bp đoạn thứ hai vector pET22b(+) kích thƣớc 5431 bp Kết cắt kiểm tra bốn dòng plasmid tạo hai đoạn DNA có kích kích thƣớc gene egc pET22b(+) (Hình 3.10) Nhƣ vậy, gene egc đƣợc ghép nối vào vector biểu 19 pET22b(+) nhƣ thiết kế Plasmid pET22-egc đƣợc biến nạp vào tế bào biểu E coli BL21(DE3) sốc nhiệt để biểu gene egc kb M Hình 3.10 sản phẩm cắt dòng 10 6,0 10 5,0 pET22b(+ ) 1,0 egc pET22-egc cặp enzyme hạn chế XhoI NcoI gel agarose 0,8% ĐC p1-4: dòng plasmid pET22-egc; ĐC 1-4: sản phẩm cắt dòng plasmid pET22-egc XhoI NxoI; ĐC M: thang chuẩn DNA kb (Fermentas); ĐC pET: vector pET22b(+) 3.6 BIỂU HIỆN GENE egc TRONG VI KHUẨN E coli BL21(DE3) 3.6.1 Chọn dòng biểu gene egc tế bào E coli BL21(DE3) M (-) kda M TS T 116 KT kda 116 45 45 EGC EGC 35 35 14,4 14,4 A B Hình 3.11 Điện di đồ protein tổng số từ sản phẩm biểu gene egc chủng E coli o BL21(DE3), môi trường LBA 37 C sau tiếng cảm ứng 0,5 mM IPTG ba dòng tế bào khác gel polyacrylamide 12,6% có SDS Tế bào sau biểu cô đặc đến OD600 = 10 ĐC (-): đối chứng âm, protein tổng số dòng tế bào biểu mang vector pET22b(+) không mang gene egc; ĐC 1-3: protein tổng số dòng tế bào biểu mang pET22-egc; ĐC TS: protein tổng số biểu tế bào mang pET22-egc; ĐC T: protein dạng không tan biểu tế bào mang pET22-egc; ĐC KT: protein dạng tan biểu tế bào mang pET22-egc; ĐC M: thang chuẩn protein unstained (Thermo scientific) Kết cho thấy gene egc đƣợc tổng hợp thành protein EGC có kích thƣớc bé 40 kda (Hình 3.11) tƣơng đƣơng với kích thƣớc tính toán lý thuyết ba dòng tế bào, đồng thời, dòng đối chứng âm băng protein Nhƣ vậy, gene egc vector pET22b(+) đƣợc biểu thành protein EGC tế bào E coli BL21(DE3) 20 Kết kiểm tra khả tan EGC cho thấy rằng, toàn protein EGC đƣợc biểu dạng không tan dạng không mong muốn (Hình 3.12) Nhƣ vậy, điều kiện biểu gene egc cần phải thay đổi để tế bào tổng hợp đƣợc protein EGC dạng tan 3.6.2 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến biểu gene egc tế bào E coli BL21(DE3) o o 20 C Kda 25 C o 30 C o 37 C (-) M TS T KT TS T KT TS T KT TS T KT 116 45 EGC 35 Hình 3.12 Điện di đồ protein EGC biểu chủng E coli BL21(DE3) sau tiếng cảm o o o o ứng 0,5 mM IPTG 20 C, 25 C, 30 C 37 C gel polyacrylamide 12,6% có SDS Trong nghiên cứu này, để biểu đƣợc protein mong muốn dạng tan, tiến hành nuôi tế bào 37oC đến OD600 đạt 0,6-0,8 cảm ứng IPTG đến nồng độ cuối 0,5 mM bốn tiếng bốn nhiệt độ 20oC, 25oC, 30oC 37oC Ở 20oC 25oC, protein đích đƣợc tạo thành có dạng tan dạng không tan, lƣợng protein dạng tan 20oC nhiều nhiều 25oC (Hình 3.12) Ở nhiệt độ 30oC 37oC, protein tạo thành dạng không tan Nhƣ vậy, 20oC nhiệt độ đƣợc lựa chọn để biểu gene egc thành protein dùng cho thí nghiệm 3.6.3 Ảnh hƣởng nồng độ IPTG đến hiệu cảm ứng Tế bào đƣợc nuôi 37oC OD600 đạt 0,8 đƣợc chia thành 10 phần bổ sung IPTG theo dải nồng độ Tất mẫu đƣợc nuôi cảm ứng 20oC thời gian tiếng Kết cho thấy nồng độ IPTG tăng từ 0,0 đến 2,0 lƣợng tế bào biểu thu đƣợc thấp Sự tăng nồng độ IPTG cảm ứng từ 0,0 đến 0,1 mM làm tăng tạo thành protein EGC tổng số, nhƣng tăng rõ ràng từ nồng độ 0,1 đến mM, chí giảm mạnh nồng độ mM (Hình 3.13A) Tỷ lệ thuận với kết protein EGC tổng số, lƣợng protein EGC dạng tan tăng dần nồng độ IPTG cảm ứng tăng từ 0,02 đến 0,1 mM, nhƣng tăng rõ ràng từ nồng độ 0,1-1mM giảm mạnh nồng độ 0,02 Vậy, để đƣợc lƣợng protein EGC nhiều nhƣ tỷ lệ protein dạng tan cao nồng độ IPTG cảm ứng thích hợp 0,1 mM 21 Kda 0,0 0,02 0,05 M 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 1,0 2,0 Kda 0,0 0,02 0,05 0,1 M 0,2 0,3 0,4 0,5 1,0 2,0 11 45 EGC 35 B A o Hình 3.13 Điện di đồ protein EGC biểu 20 C tế bào E coli BL21(DE3) cảm ứng 10 nồng độ IPTG khác gel polyacrylamide 12,6% có SDS A: protein tổng số B: protein dạng tan Các ĐC từ 0,0 – tương ứng protein biểu tế bào cảm ứng nồng độ IPTG từ 0,0-2 mM; ĐC M: thang chuẩn protein unstain (Thermo scientific) 3.6.4 Điện di protein gel polyacrylamide kiểm tra hoạt tính endoglucanase EGC Kda M M (-) EGC (-) EGC 170 70 55 40 EGC Vùng hoạt tính A Nhuộm comassie B Ép gel kiểm tra hoạt tính o Hình 3.14 Điện di đồ protein EGC biểu 20 C tế bào E coli BL21(DE3) gel polyacrylamide 9% SDS (A) Gel nhuộm thuốc nhuộm comassie (B) Gel ép môi trường chất 0,1% CMC kiểm tra hoạt tính ĐC (-): đối chứng âm; ĐC EGC: protein o tổng số, biểu 20 C tế bào mang pET22-egc; ĐC M: thang chuẩn protein pageruler prestained (Fermentas) Để kiểm tra hoạt tính endoglucanase protein EGC, tiến hành điện di protein EGC gel polyacrylamide không biến tính ép gel mang protein môi trƣờng 0,5% có chất đặc hiệu (CMC) Kết nhƣ thích chức gene egc, băng protein EGC đậm có kích thƣớc bé 40 kdal (Hình 3.14A) phân huỷ CMC vị trí mà băng tiếp xúc với thạch 0,5% CMC ép gel (Hình 3.14B) Điều 22 chứng tỏ, protein EGC đƣợc biểu có hoạt tính endoglucanase Vậy, phƣơng pháp ép gel định tính, khẳng định protein EGC có hoạt tính endoglucanase 3.6.5 Tinh chế protein EGC cột sắc kí lực His-tag kda F8 116 M F1 F2 F3 F4 F F6 F7 45 35 EGC Hình 3.15 Điện di đồ kiểm tra sản phẩm tinh chế enzyme EGC cột sắc kí lực Histag gel polyacrylamide 12,6% có SDS ĐC 1: protein tổng số biểu từ tế bào mang gene egc; ĐC 2: protein qua cột đưa mẫu lên giá thể; ĐC 3: protein bị đẩy khỏi giá thể đệm rửa; ĐC F1-8: phân đoạn thu protein EGC bám giá thể cột sắc kí lực His-tag; ĐC M: thang chuẩn protein unstained (Thermo Scientific) Kết thể Hình 3.16 cho thấy protein thu đƣợc phân đoạn có kích thƣớc kích thƣớc protein EGC Trong đó, protein đƣợc tập trung chủ yếu phân đoạn 6, đặc biệt phân đoạn 3.6.6 Hoạ tính riêng EGC Bằng phƣơng pháp định lƣợng protein Bradford, khối lƣợng protein EGC/ml đƣợc xác định Qua đó, hoạt tính riêng EGC mg protein đƣợc xác định Ở điều kiện 37oC pH hoạt tính EGC 1,055 U/mg 3.6.7 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến hoạt tính endoglucanase EGC Hoạt tính EGC (%) 120 100.00 100 80 72.90 82.78 90.46 69.33 57.31 60 40 20 30 35 40 45 50 55 Nhiệt độ (oC) Hình 3.16 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính endoglucanase EGC 23 Dải nhiệt độ từ 30 đến 55oC đƣợc lựa chọn Hoạt tính endoglucanase tăng dần từ 30 đến 40oC, nhƣng giảm dần nhiệt độ tăng từ 40 đến 45oC giảm mạnh nhiệt độ 55oC (Hình 3.16) Nhƣ vậy, nhiệt độ thích hợp cho hoạt động EGC 40oC 3.6.8 Ảnh hƣởng pH đến hoạt tính EGC Trong nghiên cứu này, chúng tối lựa chọn dải pH gồm 12 giá trị khác từ 2,5 đến 8,0 để tìm điều kiện pH tối ƣu cho EGC hoạt động Kết cho thấy enzyme có hoạt tính cao pH 5,5 đến 6,0 Ở pH từ 2,5 đến 4,5, hoạt tính EGC thấp không ổn định Ở pH từ 6,5 đến 8,0, hoạt tính EGC cao ổn định so Hoạt tính EGC (%) với khoảng pH 2,5 đến 4,5 nhƣng hoạt tính giảm dần theo tăng dần pH (Hình 3.17) 120 100 80 60 40 20 100.0 97.0 80.6 81.1 68.0 34.5 42.0 39.4 70.0 59.8 34.9 35.4 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 pH o Hình 3.17 Ảnh hưởng pH đến hoạt tính EGC 40 C 3.6.9 Ảnh hƣởng số ion kim loại hoá chất lên hoạt tính EGC Chín ion kim loại (K+, Mn2+, Cu2+, Ca2+, Ni2+, Mg2+, Zn2+, Co2+, Fe3+) sáu hoá chất thƣờng sử dụng phòng thí nghiệm (EDTA, SDS, Urea, tween 80, triton X-100 2-mercaptoethanol) nồng độ 10 mM đƣợc lựa chọn để đánh giá ảnh hƣởng chúng đến hoạt tính EGC Tất đƣợc tiến hành điều kiện hoạt động tối ƣu EGC (40oC pH 5,5) Hình 3.18 cho thấy, ion kim loại gồm Mn2+, Ca2+, Mg2+ Fe3+ ức chế hoạt tính EGC, đặc biệt Mn2+ Fe3+ làm hoạt tính giảm xuống 21% 40%, Cu2+ Ni2+ ảnh hƣởng không đáng kể đến hoạt tính EGC, hoạt tính EGC đạt 94 95% Tuy nhiên, ion K+, Zn2+ Co2+ lại làm tăng hoạt tính EGC, đặc biệt, Co2+ làm tăng hoạt tính lên đến 257% 24 Hoat tính EGC (%) 300 257 250 200 150 100 50 21 40 56 64 65 100 100 107 109 109 111 84 94 95 96 Nhân tố Hình 3.18 Ảnh hưởng số ion kim loại hoá chất đến hoạt tính EGC 3.6.10 Động học EGC Thông số động học đƣợc xác định từ đồ thị Lineweaver-Burke Kết cho thấy, phƣơng trình phụ thuộc tốc độ phản ứng với nồng độ chất tuân theo hàm y=ax+b với độ tin cậy cao R2 = 0,99 (Hình 3.19) Dựa phƣơng trình, Km Vmax endoglucanase đƣợc tính tƣơng ứng 16,14 mg/ml 2,28 mol/phút Do đó, hoạt tính endoglucanase EGC đạt đƣợc 11,774 U/mg Sự phụ thuộc tốc độ phản ứng vào nồng độ chất theo Linewever-Burk 4.5 y = 7.072x + 0.438 R² = 0.990 1/V (1/mM glucose/phút) 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 -0.1 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 1/[CMC] (mg/ml) Hình 3.19 Sự phụ thuộc tốc độ phản ứng enzyme vào nồng độ chất CMC theo Linewever-Burk 25 KẾT LUẬN Với kết thu đƣợc trình thực đề tài, rút kết luận sau: Bằng phƣơng pháp phân tử, dựa vào phân tích trình tự đoạn DNA gen mã hoá rRNA 16S ti thể, loài mối nghiên cứu đƣợc định loại Coptotermes gestroi Đã tách chiết tinh đƣợc DNA đa hệ gene vi sinh vật ruột mối C gestroi có kích thƣớc 5.431,60 Mbp Với liệu này, 125.431 ORF đƣợc xác định, 1460 loài, 731 chi, 282 họ, 138 bộ, 65 lớp 46 ngành đƣợc dự đoán Trong đó, vi khuẩn chiếm 1368 loài thuộc 628 chi, 217 họ, 97 bộ, 41 lớp 22 ngành Tổng số 316 ORF mã hoá tám loại enzyme thuỷ phân cellulose đƣợc dự đoán Trong đó, ba loại enzyme có nhiều ORF mã hoá β-glucosidase (211 ORF), 6-phospho-βglucosidase (60 ORF) endoglucanase (31 ORF) Đã phân lập, tách dòng biểu thành công gene egc dài 1107 bp Gene biểu thành protein EGC điều kiện thích hợp 20oC cảm ứng 0,1 mM IPTG Protein EGC có hoạt tính endoglucanase nhƣ dự đoán Enzyme EGC hoạt động tối ƣu 40oC pH 5,5-6 Các thông số động học endoglucanase đƣợc xác định theo phƣơng trình Lineweaver-Burk Km = 16,14 mg/ml Vmax = 2,28 mol/phút Hoạt tính endoglucanase EGC đạt đƣợc 11,774 U/mg Ở nồng độ 10 mM ion kim loại hoá chất, hoạt tính endoglucanase tăng có mặt Co2+, Zn+ K+ , đặc biệt, Co2+ làm hoạt tính endoglucanase tăng lên đến 257%; hoạt tính endoglucanase giảm có mặt Mn2+, Fe2+, Ca2+, Cu2+ , Ni2+, SDS EDTA KIẾN NGHỊ Bộ liệu trình tự DNA đa hệ gen vi sinh vật ruột mối C gestroi thu đƣợc có 316 ORF đƣợc thích mã hoã enzyme phân huỷ cellulose hemicellulose Tuy nhiên, khuôn khô nghiên cứu này, phân lập, tách dòng biểu đƣợc ORF Do đó, cần thiết phải có thêm nghiên cứu biểu ORF mã hoá cellulase phối trộn với với EGC để phân huỷ hiệu cellulose hiệu 26 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Nguyễn Thị Thảo, Lê Quỳnh Giang, Nguyễn Thanh Ngọc, Đỗ Thị Huyền, Trƣờng Nam Hải (2012),“Sử dụng phƣơng pháp máng đơn (Troghing) để tinh DNA metageneome hệ vi sinh vật cộng sinh ruột mối”,Tạp chí Khoa học Đại học Vinh,Số 41(4A):79-84 Nguyễn Thị Thảo, Lê Quỳnh Giang, Nguyễn Thanh Ngọc, Nguyễn Thị Quý, Nguyễn Thị Trung, Đỗ Thị Huyền, Trƣơng Nam Hải (2012),“Nghiên cứu làm tăng hiệu biến nạp xung điện để tạo thƣ viện metageneome hệ vi sinh vật ruột mối”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, Số10(3), tr 441-447 Nguyễn Thị Thảo, Đào Trọng Khoa, Lê Quỳnh Giang, Đỗ Thị Huyền, Nguyễn Thị Trung, Nguyễn Thúy Hiền, Nguyễn Quốc Huy, Trƣơng Nam Hải (2014),“Định danh loài mối Coptotermes thu chùa Linh Quang, Hà Động, Hà Nội dựa trình tự đoạn DNA gene mã hóa ribosome 16S ti thể”,Tạp chí Sinh học, 36(1), tr 58-64 Thi-Thao NGUYEN, Thi-Huyen DO, Thu-Huong DUONG, Quynh-Giang LE, TrongKhoa DAO, Thi-Trung NGUYEN, Thi-Quy NGUYEN, Thi-Thu-Hien NGUYEN, Keitarou KIMURA, Nam-Hai TRUONG (2014),“Identification of Vietnamese Coptotermes species based on 428-bp and 151-bp regions of mtDNA 16S rRNA gene”, B Insectol,67(1), pp 131-136 Thi Huyen Do, Thi Thao Nguyen, Thanh Ngoc Nguyen, Quynh Giang Le, Cuong Nguyen,Keitarou Kimura, and Nam Hai Truong (2014), “Mining biomass-degrading genes through Illumina-based de novo sequencing and metageneomic analysis of freeliving bacteria in the gut of the lower termite Coptotermes gestroi harvested in Vietnam” J Biosci Bioeng, 118(6), pp 665-671 27