ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Họ tên NCS: PHẠM LÊ BỬU TRÚC Tên đề tài: NGHIÊN CỨU ĐIỀU TRỊ THỰC NGHIỆM BỆNH MẠCH VÀNH BẰNG CẤY GHÉP TẾ BÀO GỐC TRÊN MÔ HÌNH CHUỘT Chuyên ngành: SINH LÝ HỌC NGƯỜI VÀ ĐỘNG VẬT Cán hướng dẫn : PGS TS PHẠM THÀNH HỔ 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh mạch vành loại bệnh tim thường gặp nhất, nguyên nhân động mạch vành xơ vữa làm tim bị thiếu máu cục bộ, gây suy tim đột quỵ dẫn đến tử vong bệnh nhân Theo Tổ chức Y tế Thế giới, năm có khoảng 17 triệu người hành tinh chết bệnh tim mạch, số dự đoán tăng lên 25 triệu vào năm 2020 Tại Việt Nam, theo thống kê Viện Tim mạch Việt Nam, hàng năm có đến hàng triệu người bị bệnh mạch vành khoảng 10% số bệnh nhân tử vong nhồi máu tim Hiện nay, có nhiều phương pháp điều trị bệnh mạch vành điều chỉnh lối sống, dùng thuốc, can thiệp động mạch vành qua da hay mổ bắc cầu nối động mạch vành Các phương pháp điều trị gây xâm lấn buộc bệnh nhân phải sử dụng thuốc suốt đời Với phát triển khoa học nay, đặc biệt việc phát tế bào gốc, phương pháp sử dụng tế bào gốc để điều trị bệnh mạch vành nghĩ đến có số nghiên cứu ứng dụng tế bào điều trị bệnh mạch vành Tuy nhiên, chưa có kết nghiên cứu việc sử dụng tế bào gốc trung mô/nội mô từ máu cuống rốn điều trị bệnh mạch vành công bố Tạp chí Khoa học chuyên ngành, chưa có nghiên cứu việc đánh giá, theo dõi tồn tế bào gốc ghép hay vai trò tế bào gốc cấy ghép Do đó, việc tiến hành đề tài “Nghiên cứu điều trị thực nghiệm bệnh mạch vành cấy ghép tế bào gốc mô hình chuột” phù hợp với xu Thế giới định hướng nước ta việc điều trị bệnh mạch vành MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - Chuẩn hóa kĩ thuật thu nhận tế bào gốc trung mô, tế bào gốc nội mô từ máu cuống rốn người biệt hóa thành công tế bào gốc trung mô máu cuống rốn người thành tế bào giống tế bào tim - Khảo sát đánh giá tác động việc ghép tế bào giống tim biệt hóa từ tế bào gốc trung mô, hay tế bào gốc nội mô từ máu cuống rốn người kết hợp nguồn tế bào lên phục hồi bệnh mạch vành thực nghiệm TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 3.1 Tình hình nghiên cứu nước Các bệnh động mạch nói chung nghiên cứu nhiều mô hình động vật bao gồm bệnh suy tim, thiếu máu cục tim, tắt nghẽn động mạch vành, thiếu máu cục chi… Nhiều đối tượng tế bào thử nghiệm điều trị bệnh tim mạch tế bào gốc phôi, tế bào gốc trung mô, tế bào gốc tạo máu, tế bào gốc nội mô Murohara phân lập tế bào đơn nhân từ máu cuống rốn ngoại vi, chọn lọc tế bào CD34 +, sau cấy ghép tế bào vào mô hình chuột thiếu máu chi Kết cho thấy có đáp ứng hình thành mạch máu biểu tăng dòng chảy máu tăng mật độ mao mạch vùng cách xa vùng động mạch đùi thắt [20, 81, 108] Nghiên cứu tương tự Botta hướng tới việc thu nhận tế bào CD34+/KDR phân lập từ máu cuống rốn, sau tiêm vào tim chuột NOD/SCID sau thắt động mạch vành trước Kết cho thấy có cải thiện động học máu suốt khoảng thời gian tháng có định vị nhân tế bào người nhuộm miễn dịch tim chuột Tuy nhiên chưa xác định liệu tế bào cấy ghép có dung hợp hay biệt hóa thành tế bào tim hay không.[27]Việc ứng dụng tế bào gốc nội mô máu cuống rốn người (CD34+/CD133+) lên mô hình chuột thiếu máu cục chi chưa công bố (theo kết tìm kiếm Cơ sơ Dữ liệu Sinh học NCBI đến tháng 6/2009) Như vậy, công bố sử dụng nguồn tế bào cho điều trị bệnh cho thấy có dấu hiệu tốt mô hình chuột, đặc biệt có xuất hiện, hình thành nhiều mạch máu [101, 102, 103] Ở người, việc thử nghiệm điều trị bệnh động mạch ngoại biên thử nghiệm với nhiều kết khác Đến nay, có nguồn tế bào cho ghép sử dụng người: nguyên bào xương tế bào gốc tủy xương hay tế bào gốc huy động từ máu ngoại vi Bệnh nhân ứng dụng liệu pháp tiêm tế bào trực tiếp vào màng tim Trong thử nghiệm này, Menasche cộng tiêm nguyên bào xương tự thân vào tim nhồi máu không sống, không tạo mạch cho 10 bệnh nhân bị suy tim nhồi máu Vào cuối tháng 11, thử nghiệm cho thấy có cải thiện chức tim có gia tăng sức sống mô xơ tất bệnh nhân Không có trường hợp tử vong sau phẫu thuật, có trường hợp chết muộn xảy đột quỵ sau năm cấy ghép Điều đáng ghi nhận thử nghiệm cải thiện sức đập tim đáng kể bệnh nhân.[78,82] Nghiên cứu Orlic cộng cho kết tương tự cải thiện chức tim sau tháng tiêm tế bào vào 12 bệnh nhân nhồi máu tim Trong 12 bệnh nhân có bệnh nhân không cho thấy cải thiện chức tim [90] Tương tự, Ballard cộng thử nghiệm tiêm tế bào đơn nhân tự thân từ tủy xương vào năm bệnh nhân Một năm sau tiêm, bệnh nhân cho thấy có cải thiện sức bơm vùng tổn thương.[116] Trong thí nghiệm khác, Strauer tiến hành truyền tế bào đơn nhân tủy xương tự thân cho 10 bệnh nhân, Assmus đánh giá việc sử dụng tế bào tiền thân thu từ tủy xương máu ngoại vi 20 bệnh nhân Tất bệnh nhân theo dõi 3-4 tháng sau truyền so sánh với bệnh nhân làm đối chứng Kết cho thấy việc truyền tế bào làm kích thích vùng nhồi máu cải thiện sức tống máu tim sức co cục toàn tim.[22, 29, 106] Sự thành công thử nghiệm ban đầu kích thích Wollert cộng tiến hành thử nghiệm để kiểm tra tính an toàn hiệu liệu pháp tế bào bệnh nhân thiếu máu tim Sáu mươi bệnh nhân truyền tế bào tủy xương tự thân vào mạch vành Sau tháng, tác động phụ báo cáo.[79, 120, 121] Sau đó, Cheng cộng tiến hành thử nghiệm tương tự 69 bệnh nhân cho thấy sau tháng, bệnh nhân nhận tế bào có cải thiện đáng kể sức bơm tim [83] Tuy việc sử dụng nguồn tế bào tự thân nguyên bào xương, tế bào gốc từ tủy xương, máu ngoại vi cho kết tốt liệu pháp gặp nhiều hạn chế lượng tế bào gốc từ nguồn giảm theo tuổi bệnh nhân Do đó, nhiều nhà nghiên cứu cho máu cuống rốn nguồn tế bào gốc hữu hiệu việc điều trị bệnh chúng dồi dào, dễ thu nhận tươi [127] 3.2 Tình hình nghiên cứu nước Theo sở liệu khoa học Trung tâm Thông tin Khoa học Công nghệ Quốc gia (đến tháng 6/2009) chưa có báo hay công trình nghiên cứu công bố vấn đề liên quan đến việc sử dụng tế bào gốc nội mô/trung mô điều trị nghẽn động mạch hay thử nghiệm tác động tăng sinh mạch máu tế bào gốc Một số phương pháp điều trị thiếu máu cục sử dụng người khảo sát laser nội mạch (Nguyễn Trọng Lưu, 2005), sử dụng kĩ thuật lấy huyết khối, giải phẫu (Trần Công Quyền, 2006; Đoàn Quốc Hưng, 2006)… Việc thu nhận biệt hóa tế bào gốc tiến hành số nhóm nghiên cứu Phòng thí nghiệm Tế bào Gốc, Đại học Khoa học Tự nhiên Tp.HCM [10-12] Các thử nghiệm ghép tế bào lâm sàng thực bệnh nhân bạch cầu mạn dòng tủy, bệnh nhân thalasemia (Trần Văn Bé, 1995), bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho (Trần Văn Bé, 2002), bệnh nhân khớp giả thân xương chày (Nguyễn Mạnh Khánh, 2007) NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Nội dung 1: Nghiên cứu tạo đánh giá mô hình chuột bệnh mạch vành [122] Mô hình chuột tắc nghẽn mạch vành tạo cách thắt động mạch vành cung cấp máu nuôi tim (theo phương pháp 1) Chuột sau gây mô hình đánh giá dựa tiêu chí (theo phương pháp 8): (1) Sự thay đổi sinh lí tuần hoàn o Sự tăng huyết áp rối loạn hoạt động chức tim o Đo kích thước vùng nhồi máu vùng hư hại (2) Đánh giá thay đổi mức gen, protein tế bào o Thay đổi biểu gen, xơ hóa chết tế bào tim o Hoạt hóa nhân tố tự tiết cận tiết bao gồm giải phóng nhân tố tăng trưởng cytokine Kết quả: Mô hình chuột tắc nghẽn mạch vành đạt yêu cầu cho nghiên cứu cấy ghép điều trị Nội dung 2: Nghiên cứu thu nhận tăng sinh tế bào gốc nội mô tế bào gốc trung mô từ máu cuống rốn người 2.1 Nghiên cứu phân lập tăng sinh tế bào gốc nội mô từ máu cuống rốn người (theo phương pháp 4) [20, 123] Tế bào gốc nội mô từ máu cuống rốn người tiến hành thu nhận theo phương pháp Xiao Wu cộng (2007) Quần thể tế bào gốc nội mô có khả tái tạo mạch máu thu nhận dựa vào chọn lọc marker CD34+/CD133+ Máu cuống rốn được làm giàu tế bào có nhân phương pháp li tâm gradient Ficoll Tế bào đơn nhân làm giàu nuôi cấy chọn lọc tế bào CD34+/CD133+ cách nuôi cấy môi trường chuyên biệt EGM-2 Sau đó, quần thể tế bào gốc nội mô nuôi cấy tăng sinh thu nhận Quần thể tế bào đánh giá 1ại biểu marker CD34+/CD133+ kĩ thuật flow cytometry Quần thể tế bào với 90% CD34+/CD133+ sử dụng cho cấy ghép Nội dung Kết quả: Quy trình thu nhận nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc nội mô quần thể tế bào gốc nội mô đạt độ tinh từ 90% trở lên 2.2 Nghiên cứu thu nhận tăng sinh tế bào gốc trung mô từ máu cuống rốn người (theo phương pháp 3) Tế bào gốc trung mô từ máu cuống rốn người tiến hành thu nhận theo phương pháp Oscar cộng (2004) Tế bào gốc trung mô chọn lọc dựa marker bề mặt, khả tự làm khả biệt hóa Máu cuống rốn làm giàu tế bào có nhân phương pháp li tâm gradient Ficoll, quần thể tế bào đơn nhân nuôi cấy môi trường IMDM dành cho tế bào bám dính Quần thể tế bào bám dính đánh giá marker bề mặt: CD13, CD14, CD34, CD44, CD45, CD73, CD90, CD105, CD106, CD117, CD166, HLA-DR, khả tự làm khả biệt hóa Quần thể tế bào biểu marker đặc trưng độ tinh 90% trở lên sử dụng cho Nôi dung Kết quả: Quy trình thu nhận nuôi cấy tế bào gốc trung mô Dòng tế bào trung mô từ máu cuống rốn người đạt độ tinh từ 90% trở lên Nội dung 3: Đánh giá hiệu điều trị vai trò tế bào gốc nội mô cấy ghép điều trị bệnh mạch vành mô hình chuột 3.1 Đánh giá hiệu điều trị tế bào gốc nội mô Tế bào gốc nội mô CD34+/CD133+ từ máu cuống rốn có khả hình mạch máu mô hình chuột suy giảm miễn dịch Tế bào gốc vừa có khả biệt hóa thành tế bào máu, vừa có khả hình thành tế bào nội mô mạch máu Để đánh giá hiệu điều trị, tế bào gốc nội mô ghép theo phác đồ (nghiệm thức) khác nhau, tiến hành theo phương pháp biến đổi từ phương pháp Chen cs [18]:  Nghiệm thức 1: Ghép 1.000.000 tế bào/30 μl/con (chuột 25 g) vào vùng tim thiếu máu  Nghiệm thức 2: Ghép 10.000.000 tế bào/30 μl/con (chuột 25 g) vào vùng tim thiếu máu  Nghiệm thức đối chứng 1: tiêm PBS vào vùng tim thiếu máu  Nghiệm thức đối chứng 2: chuột bị bệnh mạch vành Việc ghép tiến hành theo cách ghép tế bào vào vùng tim thiếu máu (phương pháp 7) Hiệu ghép đánh giá theo tiêu chí sinh lí sinh hóa (phương pháp 8) Mỗi nghiệm thức tiến hành 30 chuột mô hình Hiệu điều trị nghiệm thức so sánh để chọn phác đồ tốt phác đồ khảo sát 3.2 Đánh giá vai trò tế bào gốc nội mô Các tế bào trước ghép đánh dấu với PKH26 hay Vybrant Dil để thuận lợi cho việc khảo sát tồn di cư tế bào sau ghép (theo phương pháp 7) 3.2.1 Đánh giá mức độ sinh lí (theo nội dung 1) 3.2.1 Đánh giá mức độ tế bào phân tử Khảo sát tồn tế bào ghép đánh dấu thời điểm là: giờ, 12 giờ, 24 giờ, 48 giờ, 3, 7, 15 30 ngày sau ghép tế bào dựa vào tồn tế bào mang dấu kĩ thuật hóa mô miễn dịch (theo phương pháp 6) Các tế bào mô khảo sát phân lập theo kĩ thuật tách hoạt hóa huỳnh quang (FACS) kĩ thuật vi thao tác dựa vào phát quang dấu lưu (theo phương pháp 9) Những tế bào kiểm tra để đánh giá biểu gen quan trọng VEGF (Vascular endothelial growth factor), HGF (hepatocyte growth factor), Ang-1 (angiopoietin-1), eNOS (endothelial nitric oxide synthase), G-CSF (granulocyte colony-stimulating factor), GMCSF (Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, SDF-1 (stromal cell-derived factor 1), IGF-1 (insulin-like growth factor-1), Statins (droxy-3-methylglutaryl coenzyme-A reductase inhibitors) xác định biệt hóa tế bào cho biểu gen marker CD34/CD133 (theo phương pháp 5)bằng kĩ thuật RT-PCR [96] Nội dung 4: Đánh giá hiệu điều trị vai trò tế bào tim biệt hóa từ tế bào gốc trung mô cấy ghép điều trị bệnh tim thiếu máu cục 4.1 Đánh giá hiệu điều trị Tế bào gốc trung mô máu cuống rốn biệt hóa thành tế bào giống tim hóa chất 5-azacytidine (theo phương pháp 4) [24] Tế bào giống tim ghép theo phác đồ (nghiệm thức) khác :  Nghiệm thức 3: Ghép 1.000.000 tế bào/30 μl/con (chuột 25 g) vào vùng tim thiếu máu  Nghiệm thức 4: Ghép 10.000.000 tế bào/30 μl/con (chuột 25 g) vào vùng tim thiếu máu  Nghiệm thức đối chứng 3: tiêm PBS vào vùng tim thiếu máu  Nghiệm thức đối chứng 4: chuột bị bệnh mạch vành Sau ghép, hiệu điều trị đánh giá theo tiêu chí sinh lý sinh hóa (theo phương pháp 8) Mỗi nghiệm thức tiến hành 30 chuột mô hình Hiệu điều trị nghiệm thức so sánh để chọn phác đồ tốt phác đồ khảo sát 4.2 Đánh giá vai trò tế bào tim biệt hóa từ tế bào gốc trung mô [76] Các tế bào trước ghép đánh dấu với PKH26 hay Vybrant Dil để thuận lợi cho việc khảo sát tồn di cư tế bào sau ghép (theo phương pháp 7) 4.2.1 Đánh giá mức độ sinh lí (theo nội dung 1) 4.2.1 Đánh giá mức độ tế bào phân tử Khảo sát tồn tế bào ghép đánh dấu thời điểm là: giờ, 12 giờ, 24 giờ, 48 giờ, 3, 7, 15 30 ngày sau ghép tế bào dựa vào tồn tế bào mang dấu kĩ thuật hóa mô miễn dịch (theo phương pháp 6) Các tế bào mô khảo sát phân lập theo kĩ thuật tách hoạt hóa huỳnh quang (FACS) kĩ thuật vi thao tác dựa vào phát quang dấu lưu (theo phương pháp 9) Những tế bào kiểm tra để đánh giá biểu gen quan trọng VEGF (Vascular endothelial growth factor), HGF (hepatocyte growth factor), Ang-1 (angiopoietin-1), eNOS (endothelial nitric oxide synthase), G-CSF (granulocyte colony-stimulating factor), GMCSF (Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, SDF-1 (stromal cell-derived factor 1), IGF-1 (insulin-like growth factor-1), Statins (droxy-3-methylglutaryl coenzyme-A reductase inhibitors) xác định biệt hóa tế bào cho biểu gen marker CD44, CD73, CD90, CD105, CD106 HLA-DR (theo phương pháp 5) kĩ thuật RT-PCR.[69,107,118,] Bảng 1: trình tự primer Tên Primer Trình tự xuôi (forward primer) Trình tự ngược ( reverse primer) hVEGF 5′5′CTACCTCCACCATGCCAAG GCAGTAGCTGCGCTGATAG T-3′ A-3′ hHGF 5′-TCCCCATCGCCATCCCC- 5′3′ CACCATGGCCTCGGCTGG3′ heNOS 5'5′GTGATGGCGAAGCGAGTG GACACCACGTCATACTCAT AAG-3′ CC3′ hG-CSF TGCCCGGCCTTGGCACGCC TGGGGCTGCCCAGCAGCTG ACCCATC CCCATA hGM-CSF 5'-CATCTAGA 5'-ATGCGGCCGC AAGGAGGGCCACCATG TG- TGTCGAGC TAGCGAATTC3' 3' hSDF-1 5'5'TTCAGGAGTACCTGGAGAA ACTGAACCTGACCGTACAC A-3' CTAACACTGGT-3' hIGF-1 5’5’CCTCCTCGCATCTCTTCTAC TGCTGGAGCCATACCCTGT CTGC-3’ G-3’ hCD44 5’5’CTCCGGACACCATGGACAA CTCTTCTTATGCTATAACCT GT-3’ G-3’ hCD73 5_-ATTGCA AAG TGG TTC 5_-ACA CTT GGC CAG AAA GTC A-3 TAAAAT AGG G-3 hCD105 (endoglin) 5′3′6 hHLA-DR h GAPDH GCTGGATGAGCCGGGAGCT CCCTGCTG-3′; 5’_GACAAAGCCAACCTGG AAATCA-3’ 5′AGGGCTGCTTTTAACTCTG GT-3′ CACAGGCTGAAGGTCACA ATGGACTG-3′ 5’_GGACGTTGGGCTCTCTC AGTT-3’ 5′CCCCACTTGATTTTGGAGG GA-3 Nội dung 5: Nghiên cứu điều trị phối hợp bệnh mạch vành Bênh mạch vành kéo dài dẫn đến hệ tất yếu suy tim kéo dài Việc đưa phác đồ điều trị bệnh mạch vành kết hợp hồi phục chức tim nhằm làm chậm tiến trình suy tim việc ý nghĩa nghiên cứu điều trị Trên sở đó, nội dung nghiên cứu nhằm phối hợp loại tế bào gốc nội mô tế bào tim biệt hóa từ tế bào gốc trung mô điều trị bệnh mạch vành Tế bào gốc có khả kích thích trình tăng sinh mạch máu mới, tiết chất kích thích mạch tim, tế bào tim vai trò hỗ trợ kích thích lên tế bào tim tăng sinh mạch Việc ghép phối hợp dạng tế bào tiến hành theo phác đồ  Nghiệm thức 5: Ghép liều (chứa loại tế bào với phác đồ tốt đánh giá Nội dung 4)  Nghiệm thức đối chứng 5: tiêm PBS vào vị trí tương ứng với lô thí nghiệm  Nghiệm thức đối chứng 6: chuột bị bệnh mạch vành Sau ghép, hiệu điều trị đánh giá theo tiêu chí sinh lý sinh hóa Mỗi nghiệm thức tiến hành 30 chuột mô hình PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Cách tiếp cận - Dựa vào nhu cầu xã hội - Học hỏi, tham khảo ý kiến chuyên gia đầu ngành - Tham khảo tài liệu nước có liên quan đến đề tài Phương pháp nghiên cứu Phương pháp 1: tạo mô hình chuột bệnh mạch vành (quy trình 1, 14, 15, 16, 17) Phương pháp 2: phân lập, tăng sinh tế bào gốc trung mô từ máu cuống rốn người (quy trình 2, 3, 4, 5, 6, 10 11) Phương pháp 3: phân lập, tăng sinh tế bào tiền thân nội mô từ máu cuống rốn người (quy trình 2, 5, 6, 7, 8) Phương pháp 4: biệt hóa tế bào gốc (quy trình 9,10,11) Phương pháp 5: đánh giá biểu gen mức phiên mã (quy trình 10, 11) Phương pháp 6: hóa mô/hóa mô miễn dịch (quy trình 15) Phương pháp 7: cấy ghép tế bào (quy trình 12, 13) Phương pháp 8: đánh giá tiêu sinh lý sinh hóa (quy trình 10,11,12, 16, 17) Phương pháp 9: thu nhận tế bào lưu dấu sau ghép (quy trình 18,19) Quy trình : Phẫu thuật tạo mô hình chuột tắc nghẽn động mạch vành [92, 128] - Đặt ống thở : chuột gây mê ketamine - Làm lông vùng ngực (từ cổ đến qua ngực) - Chuột đặt nằm ngửa nằm làm ấm toàn thể Sử dụng dây chằng vắt ngang qua miệng chuột vùng hàm hình chữ S nhằm giữ cho phần cổ ngực thẳng Dùng kẹp cong kéo lưỡi chuột qua bên nhẹ nhàng luồng ống thở oxy vào vỏ khí quản, sử dụng ống dẫn PE 90 Ống thông vào vùng vỏ khí quản nối với máy phụ thở nhịp 125-150 nhịp/phút, thể tích 10,3ml - Sát trùng vùng phẫu thuật betadine 70% ethanol (lặp lại lần) - Để tránh lây nhiễm, sử dụng phẫu thuật che phủ phần lại chuột, phơi vùng phẫu thuật đèn soi kính hiển vi soi - Tạo vết mổ từ gần chóp lồng ngực đến xương sườn thứ 2, sử dụng banh vết mổ để giữ vết mổ - Kẹp đầu cong 400 sử dụng để mở vùng giáp tách mô mỡ đến vùng mạch vành - Sử dụng lụa 0,6 kim cong gauge 271/2 để thắt mạch, tạo hai vết thắt hờ hai vị trí gần mạch - Lấy banh vết mổ ra, đồng thời thắt nhíp thở thở lần nhằm bơm căng lồng ngực - Khâu vết mổ vùng với prolene 6,0 - Khâu vùng da mổ với prolene 6,0 - Sau khâu vết thương, giảm đau cho chuột buprenorphine (0,1 mg/kg) vào vùng bụng Nếu quan sát thấy có nước, bổ sung nước mối sinh lý cách tiêm vào vùng bụng - Sự phục hồi trình trạng gây mê giảm dần cách cho chuột nằm sấp nhẹ nhàng rút ống thở thấy có thở bình thường tự nhiên phục hồi - Chuột đặt nằm ngửa trở lại đặt vào buồng nhiệt Quy trình 2: Thu nhận tế bào đơn nhân Ficoll từ máu cuống rốn [48] - Pha loãng máu cuống rốn với PBSA với tỉ lệ 1:1 - Hút ml Ficoll-Hypaque vào ống li tâm 15 ml - Nhẹ nhàng đặt 10 ml hỗn hợp PBSA máu cuống rốn lên lớp Ficoll-Hypaque (1,077 g/ml) - Li tâm 450 g 20-30 phút nhiệt độ phòng - Sau li tâm, xuất lớp tế bào đơn nhân nằm lớp giữa, lớp mặt Ficoll-Hypaque - Sử dụng pipette Pasteur chuyển lớp chứa tế bào đơn nhân vào ống li tâm - Rửa tế bào với PBSA li tâm tốc độ 200 g 10 phút - Đổ bỏ dịch nổi, tái huyền phù cặn tế bào PBSA lặp lại quy trình rửa - Cuối cùng, tái huyền phù tế bào thể tích môi trường Quy trình 3: Nuôi cấy chọn lọc tăng sinh tế bào bám dính [109] - Tế bào đơn nhân nuôi môi trường IMDM, với mM L-glutamine, bổ sung với 20% FBS, 1% Antibiotic-antimycotic 100X mật độ 106 tế bào/cm2 , 370 C, 5% CO tủ ấm - Thay môi trường ngày đến tế bào có hình dạng nguyên bào sợi đạt mật độ khoảng 60-70% - Tiến hành cấy chuyền tế bào, nuôi tế bào bình với mật độ 105 tế bào/bình nuôi Quy trình 4: Biệt hóa tế bào bám dính [95] Biệt hóa thành tế bào xương: - Tế bào nuôi cấy môi trường DMEM có bổ sung Dexamethazone: 50 μM, Acid ascorbic: 50 μM, β- glycerophosphate: 10 mM, 10% FBS % antibiotic - Môi trường biệt hóa thay lần tuần tiến hành nuôi cấy tuần - Sau đó, tế bào biệt hóa cố định methanol 10 phút nhiệt độ phòng nhuộm với Alizarin red phút nhiệt độ phòng Biệt hóa thành tế bào mỡ: - Tế bào cảm ứng môi trường cảm ứng biệt hóa mỡ DMEM bổ sung Dexamethazone: 10 μM, Insulin: 10 μg/ ml, Indomethacine: 200 μM, Isobutylmetylxanthane: 0.5 mM, 10 % FBS - Môi trường biệt hóa thay lần tuần Thời gian tiến hành cảm ứng biệt hóa tuần - Các tế bào cố định methanol 45 phút nhiệt độ phòng tiến hành nhuộm với thuốc nhuộm Oil Red Quy trình 5: Xác định marker bề mặt tế bào gốc trung mô kĩ thuật flow cytometry [93] - Các tế bào gốc trung mô ứng viên sau lần cấy chuyền xác định biểu marker bề mặt CD13, CD14, CD34, CD44, CD45, CD73, CD90, CD117, CD105, CD106, CD166, HLA-DR - Các tế bào sau phát triển phủ kín chừng 70% bề mặt bình nuôi xử lí với trypsin/EDTA 0,25% thu nhận tế bào đơn - Cứ 106 tế bào sử dụng để nhuộm với kháng thể 30 phút, tối, 40 C - Sau đó, tế bào rửa lần FACSflow để loại bỏ kháng thể thừa tái huyền phù tế bào 500 µl FACSflow - Mẫu phân tích máy FacsCalibur (BD Bioscience) Tất liệu phân tích phần mềm CellQuest Pro 30.000 tế bào Quy trình 6: Xác định khả tự làm tế bào gốc trung mô kĩ thuật colony assay - 100 tế bào nuôi đĩa nuôi cấy tế bào 35 mm ngày - Sau đó, đĩa nuôi tiến hành nhuộm với thuốc nhuộm Crytal violet 10 phút với methanol - Các colony đếm - Thử nghiệm lặp lại lần Quy trình 7: Nuôi cấy chọn lọc tăng sinh tế bào tiền thân nội mô [88, 94] - Tế bào đơn nhân nuôi môi trường EBM, bổ sung với 10% FBS, 1% Antibiotic- mycobiotic 100X, mật độ 106 tế bào/cm2, 370 C, 5% CO tủ ấm - Sau ngày, quần thể tế bào không bám lên thu nhận, li tâm 3000 vòng/phút phút để thu cặn tế bào - Cặn tế bào tái huyền phù nuôi cấy tăng sinh môi trường tăng trưởng cEGM-2 (EGM-2 bổ sung với Bulletkit nhân tố tăng trưởng toàn bộ, 10% FBS, 1% penicillin (10.000 U/ml), streptomycin (10000 ug/ml), am photericin (25 ug/ml), với chế độ thay môi trường ½ ngày - Quy trình 8: Xác định marker bề mặt tế bào gốc nội mô kĩ thuật flow cytometry [85, 114, 115] - Các tế bào tiền thân nội mô ứng viên sau lần cấy chuyền xác định biểu marker bề mặt CD34, CD133 Các tế bào sau phát triển phủ kín chừng 70% bề mặt bình nuôi xử lí với trypsin/EDTA 0,25% thu nhận tế bào đơn - Cứ 106 tế bào sử dụng để nhuộm với kháng thể 30 phút, điều kiện tối, 40 C - Sau đó, tế bào rửa lần FACSflow để loại bỏ kháng thể thừa tái huyền phù tế bào 500 µl FACSflow - Mẫu phân tích máy FacsCalibur (BD Bioscience) Tất liệu phân tích phần mềm CellQuest Pro 30.000 tế bào - Tế bào gốc nội mô phải dương tính với marker CD34+/CD133+ Quy trình 9: Biệt hóa thành tế bào giống tim [68] - Tế bào sau lần cấy chuyền tiền cảm ứng biệt hóa mật độ 50.000 tế bào/cm2 môi trường cảm ứng biệt hóa bổ sung 10 μM 5-azacytidine - Các tế bào cảm ứng 24 Sau đó, chúng thay môi trường không bổ sung tác nhân cảm ứng biệt hóa nuôi ngày tiến hành tái cảm ứng tế bào 24 - Sau lần cảm ứng, tế bào nuôi môi trường nuôi, đến ngày 35 thu nhận tế bào để phân tích biểu gen Quy trình 10: Tách RNA tổng số [74, 79] Quy trình tách RNA tổng số thực theo hướng dẫn nhà sản xuất Sigma - Thu toàn huyền phù tế bào cho vào eppendorf 1,5 ml, Ly tâm thu cặn - Hòa lẫn với 0,25 ml nước có xử lý DEPC - Cho 0,75 ml Trizol vào (5-10 x 106 tế bào cho 0,75 ml Trizol) - Ly tâm 12,000 g 10 phút 4o C Thu phần dịch - Lắc trong15s, để nhiệt độ phòng phút - Thêm 0,2 ml chloroform Lắc 15 giây thấy huyền phù màu hồng để nhiệt độ phòng 10 phút Sự phân tách bắt đầu xảy (xảy nhanh để đá)  Kết tủa RNA - Chuyển pha nước vào tube sạch, thêm 0,5 ml isopropanol 0,75 ml Trizol sử dụng Để mẫu nhiệt độ phòng 5-10 phút - Ly tâm 12.000 g phút 4-250 C RNA tủa hình thành cặn bên đáy ống  Rửa RNA - Loại bỏ dịch rửa cặn RNA 1ml 75% ethanol Vortex ly tâm 7.500 g phút 4-250 C Nêu cặn RNA trôi hay chất đống bên rửa ethanol 75% - Mẫu trữ lạnh ethanol 4o C tuần năm -20o C  Hòa tan RNA - Làm khô nhanh cặn RNA 5-10 phút để khô tự nhiên hay chân không Không để khô hoàn toàn khó hoà tan - Hoà tan nước DEPC để nóng 55-60o C 10-15 phút cho vào đá phút  Định lượng RNA - Nhuộm ethidium bromide RNA agarose cho thấy hai vạch ưu RNA ribosome nhỏ 2kb lớn 5kb, RNA phân tử nhỏ 0,1- 0,3kb mảnh RNA phân tử lớn 7-15 kb Quy trình 11: RT-PCR Nghiên cứu sử dụng kit RT-PCR one tube Acess Quick Promega Trong kit này, RNA tổng số sau thu nhận, định lượng sử dụng chạy RT-PCR Kit vừa thực phản ứng chuyển RNA thành cDNA sau khuếch đại theo chu trình PCR bình thường - 10 Hỗn hợp phản ứng RT – PCR - Phản ứng RT-PCR tiến hành theo hướng dẫn kit Acess Quick Promega - Hỗn hợp phản ứng sau: - Phản ứng 50 μl: - Master Mix: 25 μl (chứa dNTP, oligo T primer, hexamer random primer, Taq polymerase, PCR buffer) - Primer xuôi 1,5 μl (100 pmol) - Primer ngược: 1,5 μl (100 pmol) - RNA template: μl - Nước: 20 μl - AMV: μl Chu trình RT-PCR: - 450 C 45 phút ( phản ứng phiên mã ngược) - 940 C phút - 680 C phút - 40 C phút Quy trình 12: Đánh dấu tế bào với PKH26 hay Vybrant Dil [103] - Tế bào tiền cảm ứng với azacytidine/tế bào nội mô đánh dấu kĩ thuật đánh dấu màng tế bào với chất phát huỳnh quang đỏ PKH26 (Kit MINI26 cell linker) hay Vybrant Dil trước tiến hành cấy ghép - Tế bào tiền xử lý dung dịch Diluent C, sau tiến hành nhuộm với PKH26/Vybrant Dil 25o C phút Sau tế bào rửa lại FBS lần môi trường lần - Các tế bào đánh dấu kiểm tra kính hiển vi huỳnh quang xác định mật độ trước tiến hành cấy ghép mô hình chuột suy tim Quy trình 13: Ghép tế bào vào vùng tim thiếu máu [22, 26, 27] - Sử dụng phác đồ cyclosporine A mg/kg/ngày tiêm vào tĩnh mạch đuôi tuần trước ghép phác đồ mg/kg cách ngày lần suốt thời gian khảo sát - Tế bào đánh dấu huyền phù PBS thể tích tiêm 30 µl/lần tiêm với mật độ cần thiết /lần tiêm/con - Phương pháp ghép: ghép tế bào trực tiếp vào vùng bệnh lý Quy trình 14: Sự tăng huyết áp rối loạn hoạt động chức tim [67, 82] - Điện tâm đồ đo vùng ngực trước tiến hành cảm ứng thuốc tháng sau xử lý thuốc - Chuột gây mê với 1,5% isofluorane nhịp tim ổn định 400-500 nhịp/phút - Sử dụng hệ thống vi siêu âm độ phân giải cao (Vevo770, VisualSonics Inc, Toronto, Canada, 40 MHz probe) để quan sát hình ảnh tim Quy trình 15: Đo kích thước vùng nhồi máu vùng hư hại [83, 110, 126] - Chuột tiêm 100 U heparin theo đường bụng 20 phút sau tiêm thêm sodium pentobarbitone (300 mg/kg) theo đường tĩnh mạch Khi chuột hoàn toàn bị mê, phẫu thuật mở ngực - Quá trình phẫu thuật thực biện cách rạch qua màng tới trục bên xương sườn suốt trình này, chuột cung cấp oxy qua ống thở Đặt động mạch chủ Thắt động mạch chủ trước lại Đặt ống thông theo vào động mạch thắt lại cho Sau thu nhận tim 11 Thêm 20 ml đệm heparine theo đường ống thông để rửa loại máu tim Tiếp tục thêm ml 1% triphenyltetrazolium chloride (TTC) dung dịch đệm phosphate (Na2PO4 45,1 mM, NaH2PO4 3,3 mM, pH 7,8) theo đường ống thông Đặt tim ống Falcon 50 ml chứa sẵn ml TTC, ủ 370C Sau 10 phút lấy tim - Mối thắt LAD làm ướt lại nhờ phần ống thông PE-10 Để giới hạn vùng hư hại, ml dung dịch 1% Evan Blue 0,9% muối sử dụng để làm đầy thông qua ống thông khoảng 1-2 phút Trong suốt trình làm ướt, muối rửa khắp mặt tim để cản bề mặt nhuộm Tim sau đặt ngập ml muối đệm trước loại bỏ ống thông Sau làm khô điểm, cân tim đông lạnh -800 C để cắt - Việc giải đông tim tiến hành cách cắt thành miếng 100 Am sau cố định 2,5% gluteraldehyde nhận chìm dung dịch 5% agarose Sau cố định 10% formaldehyde rửa lại với PBS - TTC nhỏ xuống để đánh dấu vùng nhồi máu Quan sát có mặt thuốc nhuộm TTC vùng không nhồi máu đèn UV Quy trình 16: Đánh giá trình apoptosis tế bào tim [29, 36] Quá trình apoptosis tế bào tim đánh giá kit annexin V-FitC apoptosis detection nhà sản xuất Sigma - Tế bào tim thu nhận tách thành tế bào đơn sử dụng trypsin/EDTA 0,25% - Rửa tế bào lần với PBS - Tái huyền phù tế bào 1X dung dịch đệm mật độ x 106 tế bào/ml - Thêm 500 μl huyền phù tế bào vào ống test - thêm μl annexin C-FITC 10 l propidium iodide vào huyền phù tế bào - ủ ống nhiệt độ phòng 10 phút, tránh ánh sáng - Xác định phát huỳnh quang tế bào đánh giá trực tiếp hệ thống flow cytometer Các tế bào trạng thái apoptosis bắt màu với annexin V-FITC Các tế bào sống không nhuộm với annexin V-FITC lẫn propidium iodide Các tế bào necrosis nhuộm màu Quy trình 17: Đánh giá hoạt hóa nhân tố tự tiết cận tiết bao gồm giải phóng nhân tố tăng trưởng cytokine kĩ thuật ELISA [33, 34, 39, 87] - Đĩa 96 giếng phủ kháng nguyên nồng độ 40 μg/mL pha loãng 1/100 dung dịch đệm phủ đĩa với thể tích 100 μL/giếng ủ qua đêm nhiệt độ phòng Đĩa rửa lần dung dịch rửa - Tiếp đó, khóa đĩa dung dịch đệm khóa đĩa với thể tích 150 μL/giếng ủ đĩa nhiệt độ phòng - Tiếp tục rửa đĩa lần dung dịch rửa Huyết chuột nhắt trắng pha loãng từ 1/100, 1/200 1/6400 cho vào giếng, giếng 100 μL - Đĩa ủ nhiệt độ phòng trước rửa lần dung dịch rửa - Sau đó, dung dịch cộng hợp (kháng thể kháng IgG chuột có gắn men peroxidase) pha loãng 1/5000 dung dịch đệm PBS tiếp tục bổ sung vào giếng với thể tích 100 μL/giếng - Ủ đĩa nhiệt độ phòng trước rửa đĩa lần dung dịch rửa Tiếp đó, chất TMB bổ sung vào đĩa với thể tích 100 μL/giếng tối - Sau 10 phút, ngừng phản ứng dung dịch H2 SO 1M với thể tích 50 μL/ giếng trước tiến hành đo màu máy quang phổ trắc quang bước sóng 450 nm Quy trình 18: Tách tế bào lưu dấu kĩ thuật FACS [61, 72] - Vùng mô tim chuột sau ghép mốc thời gian thu nhận, phân tách - 12 thành tế bào đơn trypsin/EDTA Quần thể tế bào đơn nhận diện tồn tế bào lưu dấu kĩ thuật flow cytometry - Quần thể tế bào lưu dấu tồn với lượng 5% quần thể tách khỏi quần thể hệ thống tách tube catcher based cell sorter gắn máy flow cytometter Quy trình 19: Tách tế bào lưu dấu vi thao tác - Sau nhận diện tồn tế bào lưu dấu quần thể tế bào tim, quần thể tế bào tồn 5% thu nhận kĩ thuật vi thao tác - Sử dụng hệ thống vi thao tác cho tế bào lơ lửng Eppendorf với kính hiển vi huỳnh quang thu nhận tế bào quan tâm Dưới bước sóng thích hợp, tế bào lưu dấu phát huỳnh quang Dùng hệ thống hút áp lực Eppendorf để hút tế bào quan tâm Các tế bào phân tích theo kiểu phân tích tế bào đơn KẾT QUẢ DỰ KIẾN ĐẠT ĐƯỢC TT Tên sản phẩm Quy trình phân lập tăng sinh tế bào gốc trung mô từ máu cuống rốn người Yêu cầu khoa học cần đạt Tế bào thu nhận từ quy trình đạt số tiêu sau: - Tế bào thu nhận biểu marker: CD13 CD44 CD73 CD105 CD106 CD166 không biểu hiện: CD34 CD45 CD14 HLA-DR Quần thể tế bào đánh giá biểu kĩ thuật flow cytometry: tế bào cho dương tính với marker có 50% quần thể biểu Tế bào cho âm tính có 5% biểu - Tế bào có khả biệt hóa thành tế bào mỡ, xương - Các tế bào có khả hình thành tập đoàn nuôi cấy mật độ thấp Quy trình phân lập tăng sinh tế bào tiền thân nội mô từ máu cuống rốn người Tế bào sau thu nhận đạt tiêu sau: - Có kiểu hình miễn dịch CD34+/CD133+ 90% quần thể phân tích flow cytometry - Các tế bào có khả hình thành tập đoàn nuôi cấy mật độ thấp Quy trình biệt hóa tế bào gốc trung mô từ máu cuống rốn người thành tế bào Tế bào sau biệt hóa đạt tiêu sau: - Biểu gen liên quan đến kiểu hình tim như: cardiac actin, cardiac myosin, cardiac troponin phát kĩ thuật RT-PCR hay realtime RT-PCR - Số lượng tế bào biểu dương tính với marker liên quan đến tim chiếm 65% quần thể tế bào sau biệt hóa 13 đánh giá kĩ thuật flowcytometry Quy trình cấy ghép tế bào điều trị bệnh mạch vành thực nghiệm Bảng phân tích kết hiệu phác đồ điều trị Báo cáo phân tích vai trò tế bào cấy ghép điều trị bệnh mạch vành thực nghiệm Bài báo đăng tạp chí, hội nghị nước Quy trình rõ ràng, cụ thể bước (có video kèm theo) Chuột điều trị liệu pháp có hiệu hồi phục tiêu: - Số chuột sống sót sau điều trị so với chuột đối chứng sau 30 ngày 60% - Số chuột sống sót sau điều trị so với chuột đối chứng sau 15 ngày 90% - Vùng tim thiếu máu giảm 50% - Huyết áp, nhịp tim ngưỡng bình thường 60% chuột sau 30 ngày điều trị - Xuất mạch máu vùng tim thiếu máu cục  Bảng phân tích kết phải phân tích phác đồ điều trị với nghiệm thức đối chứng  Tất số liệu phải phân tích, xử lí thống kê với độ tin cậy 95%  Bảng phân tích kết phải kèm theo với kết thô nhật kí cho chuột khảo sát  Tất số liệu phải phân tích, xử lí thống kê với độ tin cậy 95%  Bảng phân tích kết phải kèm theo với kết thô  Chấp nhận đăng TÍNH MỚI CỦA ĐỀ TÀI - Mô hình động vật : Có nhiều mô hình động vật bệnh lý động mạch nghiên cứu xây dựng mô hình bệnh suy tim, thiếu máu cục tim, tắc nghẽn động mạch vành, thiếu máu cục chi nhiều phương pháp khác hóa học, vật lý… Trên sở tảng này, nhóm nghiên cứu tiến hành nghiên cứu xây dựng mô hình động vật suy tim bệnh động mạch vành phương pháp phẫu thuật hóa chất Đây phương pháp đạt hiệu cao việc tạo mô hình bệnh lý động vật - Nguồn tế bào gốc: nghiên cứu sử dụng nguồn tế bào gốc từ máu cuống rốn Tế bào gốc từ máu cuống rốn dồi dào, việc thu nhận không gây xâm lấn thể thuận lợi nguồn tế bào gốc Hơn nữa, với xu hướng bảo quản tế bào gốc từ máu cuống rốn ngày phổ biến giới nước ta, việc khai thác ứng dụng, sử dụng nguồn tế bào gốc từ máu cuống rốn hướng phù hợp với xu hướng giới nhu cầu xã hội 14 - - Liệu pháp : nghiên cứu sử dụng nguồn tế bào gốc có máu cuống rốn người : tế bào gốc trung mô nội mô Sử dụng phối hợp chiến lược điều trị nguyên nhân triệu chứng hy vọng có kết tốt liệu pháp Tế bào gốc nội mô với khả hình thành mạch máu đối tượng cần sử dụng cho điều trị tình trạng tắt nghẽn mạch vành (điều trị nguyên nhân gây bệnh thiếu máu tim cục bộ), tế bào gốc trung mô với khả biệt hóa thành tế bào tim đối tượng cần sử dụng cho tình trạng suy tim tế bào tim bị hoại tử (điều trị triệu chứng) Phương pháp nghiên cứu : đề tài sử dụng phương pháp nghiên cứu đại, phối hợp đánh giá tác động gián tiếp thông qua biểu sinh lý, trực tiếp thông qua biểu mô học, tế bào học, biểu gen Nghiên cứu sử dụng kĩ thuật đánh dấu theo dõi tồn tại, di cư, kĩ thuật phân tích tế bào đơn, thu nhận tế bào đơn… nhiều kĩ thuật tiên tiến nghiên cứu tế bào gốc ĐỊA ĐIỂM DỰ KIẾN THỰC HIỆN ĐỀ TÀI Nơi chọn để thực đề tài PTN Nghiên cứu Ứng dụng Tế bào gốc, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp.HCM Điện thoại: 08 38397719 Website: www.ptntebaogoc.com www.vinastemcelllab.com Địa chỉ: 227 Nguyễn Văn Cừ P.4 Quận 05 Tp HCM Lý lựa chọn sở đào tạo trường Đại học Khoa học Tự nhiên trường đại học hàng đầu Việt Nam, có nhiều ưu lĩnh vực Sinh học Thêm vào đó, PTN Tế bào Gốc trường trang bị đầy đủ trang thiết bị nghiên cứu đại đáp ứng yêu cầu thực nghiên cứu đề tài DỰ KIẾN VIỆC LÀM VÀ NGHIÊN CỨU TIẾP THEO Sau tốt nghiệp, người dự tuyển dự kiến tiếp tục công tác PTN Tế bào Gốc, tham gia thực dự án nghiên cứu lĩnh vực chuyên môn, giảng dạy viết giáo trình Khi nghiên cứu hoàn thành, kết nghiên cứu xem xét, đánh giá để tiến đến việc liên kết, hợp tác với bệnh viện thử nghiệm lâm sàng người 10 KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG VÀ PHƯƠNG THỨC CHUYỂN GIAO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 10.1 Khả thị trường Bệnh tim mạch đặc biệt bệnh mạch vành ngày tăng nước phát triển Nhu cầu sử dụng liệu pháp trị liệu người dân ngày nhiều Nếu giới, bệnh lý tim mạch đột quỵ kẻ giết người nguy hiểm nhất, cướp mạng sống 17,5 triệu người/năm Việt Nam, theo số liệu thống kê Viện tim mạch Việt Nam, tỉ lệ mắc bệnh lý tim mạch đột quỵ ngày tăng mức đáng báo động Chẳng hạn khu vực miền Bắc, năm 1960 có 2% người 25 tuổi bị bệnh cao huyết áp năm 2003, tỉ lệ tăng lên lần Đặc biệt riêng khu vực nội thành Hà Nội, tỉ lệ người 25 tuổi bị cao huyết áp lên tới 23,3%, nghĩa số 100 người 25 tuổi sống nội thành Hà Nội có tới 23 người bị cao huyết áp 10.2 Khả ứng dụng kết nghiên cứu vào sản xuất kinh doanh Nghiên cứu nghiên cứu điều trị thực nghiệm Kết nghiên cứu tiền đề khoa học quan trọng cho việc triển khai thử nghiệm người Kết nghiên cứu cung cấp liệu pháp ứng viên cho việc điều trị bệnh mạch vành người 15 10.3 Phương thức chuyển giao Kết nghiên cứu chuyển giao cho sở nghiên cứu, sở điều trị dạng quy trình công nghệ đào tạo kĩ thuật 10.4 Phạm vi địa (dự kiến) ứng dụng kết Đề tài Kết nghiên cứu tiền sở nghiên cứu tiến hành nghiên cứu sâu hơn, sở ứng dụng thử nghiệm người Các sở như: Các Trường Đại học, Viện nghiên cứu, Bệnh viện sở y tế ứng dụng kết nghiên cứu 11 TÁC ĐỘNG VÀ LỢI ÍCH MANG LẠI CỦA KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 11.1 Đối với lĩnh vực KH&CN có liên quan Công nghệ sinh học Người Động vật lĩnh vực non trẻ Việt Nam, nghiên cứu tạo điều kiện để hòa nhập với xu hướng nghiên cứu nước bạn Nghiên cứu không đòi hỏi chuyên môn mà mặt kĩ thuật công nghệ Tại Việt Nam, hướng nghiên cứu đầy tiềm Trên giới, nghiên cứu mang tính tiếp cận sáng tạo Kết nghiên cứu hy vọng mang nhiều tính nước 11.2 Đối với tổ chức chủ trì sở ứng dụng kết nghiên cứu Đối với tổ chức chủ trì: việc tiếp cận nghiên cứu dạng góp phần đào tạo mặt kĩ thuật chuyên môn cho cán Đối với sở ứng dụng: có thêm phương pháp điều trị tiếp cận với công nghệ tế bào ứng dụng y học phục hồi 11.3 Đối với kinh tế - xã hội môi trường Nghiên cứu hứa hẹn phương pháp điều trị hiệu cho người bệnh Người bệnh giảm nguy bị tai biến dẫn đến số chức vận động trở thành gánh nặng cho gia đình xã hội Ngoài ra, cách thức trị liệu đơn giản phương pháp gây xâm lấn cho người bệnh, đồng thời bệnh nhân tốn nhiều chi phí cho đại phẫu thuật để chữa bệnh Như vậy, nghiên cứu góp phần mang lại nhiều lợi ích cho bệnh nhân, gia đình xã hội 12 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Đoàn Chính Chung, Phạm Văn Phúc, Phan Kim Ngọc Cảm ứng biệt hóa tế bào gốc trung mô máu cuống rốn người thành tế bào tim 5-azacytidine Hội nghị Miễn dịch học, Hà Nội, 2010 Lê Thế Trung Tế bào gốc-những triển vọng công nghệ tái tạo mô TC Thông tin y dược - 2005 - no - tr 2-4 -ISSN 0868-3891 Lê Văn Đông, Phạm Mạnh Hùng Công nghệ tế bào gốc tạo clôn TC Thông tin y dược - 2006 - no - tr 4-11 -ISSN 0868-3891 Mai Mạnh Tuấn, Chu Quốc Trường, Trần Thanh Loan, Bùi Thị Nga, Nguyễn Thông, Phan Toàn Thắng Kết bước đầu sử dụng tế bào gốc trung mô dây rốn điều trị vết thương TC Nghiên cứu y dược học cổ truyền Việt Nam - 2007 - no 18 - tr 2733 Nguỵ Hữu Tâm Cuộc cách mạng nghiên cứu tế bào gốc TC Thông tin & Phát triển - 2008 - no - tr 21-22 -ISSN 1859-2678 Nguyễn Mạnh Khánh, Nguyễn Thị Thu Hà, Nguyễn Tiến Bình, Lý Tuấn Khải, Trương Thị Minh Nguyệt, Nguyễn Thanh Bình, Ngô Văn Toàn Ghép tế bào gốc tuỷ xương tự thân điều trị khớp giả thân xương chày TC Nghiên cứu y học - 2007 - no 104 - tr 48 -ISSN 0868-202X Nguyễn Mạnh Khánh, Nguyễn Tiến Bình, Nguyễn THị Thu Hà Tế bào gốc khả 16 ứng dụng điều trị TC Y học Việt Nam - 2007 - no - tr 1-6 -ISSN 06863174 Nguyễn Thị Thu Hà Tế bào gốc khả sử dụng tế bào gốc điều trị TC Y học Việt Nam 2004 no 14 tr 3-20 -ISSN 0686-3174 Nguyễn Trung Chính Một số kinh nghiệm ban đầu điều trị huy động tế bào gốc tạo máu ngoại vi bệnh viện trung ương quân đội 108 Nội khoa - 2008 - no - tr 2028 -ISSN 1859-1884 10 Phạm Văn Phúc, Đặng Hoàng Lâm, Trương Hải Nhung, Phan Kim Ngọc (2008) Thu nhận tế bào gốc đa tiềm từ máu cuống rốn người Tạp chí Y dược học Quân sự, 33(2): 119-125 11 Phạm Văn Phúc, Nguyễn Đăng Khoa, Trần Bảo Kiếm, Phan Kim Ngọc (2008) Nghiên cứu biệt hóa tế bào gốc trung mô từ máu cuống rốn người thành tế bào giống thần kinh, tim tiết insulin dịch chiết Tạp chí Công nghệ Sinh học, 6(4): 415-421 12 Phạm Văn Phúc, Nguyễn Thanh Tâm, Vương Thị Hồng Nhung, Dương Thị Bạch Tuyết, Phan Kim Ngọc (2009) Khảo sát tác động tốc độ làm lạnh nồng độ huyết lên tỉ lệ sống tính gốc tế bào gốc trung mô sau đông lạnh Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ: 12(9): 12-23 13 Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc, Trần Lê Bảo Hà (2007) Thu nhận biệt hóa tế bào gốc trung mô từ máu cuống rốn người Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ, 10 (12): 5-10 14 Trần Thị Mỹ Dung, Đỗ Trung Phấn, Nguyễn Quang Tùng, Phạm Quang Vinh, Nguyễn Anh Trí Kết nghiên cứu quy trình giảm khối lượng hồng cầu máu cuống rốn sử dụng cho bảo quản dài ngày tế bào gốc tạo máo TC Nghiên cứu y học - 2007 - no 104 tr 1-3 -ISSN 0868-202X 15 Trần Thị Mỹ Dung, Nguyễn Quang Tùng, Đỗ Trung Phấn Nghiên cứu xây dựng quy trình thu gom tế bào gốc tạo máu từ máu cuống rốn đạt hiệu cao TC Nghiên cứu y học - 2007 - no - tr 69-72 -ISSN 0868-202X Tài liệu tiếng Anh 16 A Zampetaki, J P Kirton, and Q Xu Vascular repair by endothelial progenitor cells Cardiovasc Res 2008; 78(3): 413 - 421 17 Essential role of endothelial nitric oxide synthase for mobilization of stem and progenitor cells Nature Med 2003; 9: 1370–1376 18 Alexander KP, Chen AY, Roe MT, et al Excess dosing of antiplatelet and antithrombin agents in the treatment of non-ST-segment elevation acute coronary syndromes JAMA 2005; 294:3108–3116 19 Anversa P, Leri A, Kajstura J Cardiac regeneration J Am Coll Cardiol 2006; 47:1769– 1776 20 Asahara T, Murohara T, Sullivan A et al Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis Science 1997; 275: 964–967 21 Asahara T Cell therapy and gene therapy using endothelial progenitor cells for vascular regeneration Handb Exp Pharmacol 2007; 181-194 22 Assmus B, Honold J, Schachinger V, et al Transcoronary transplantation of progenitor cells after myocardial infarction N Engl J Med 2006; 355:1222–1230 23 Badorff C, Brandes RP, Popp R et al Transdifferentiation of blood-derived human adult endothelial progenitor cells into functionally active cardiomyocytes Circulation 107: 1024–1032 17 24 Bartosz Balana1, Cecilia Nicoletti, Ihor Zahanich1, Eva M Graf , Torsten Christ, Sabine Boxberger,Ursula Ravens “5-Azacytidine induces changes in electrophysiological properties of human mesenchymal stem cells” Cell Research 2006;16: 949-960 25 Beltrami AP, Barlucchi L, Torella D et al Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration Cell 2003; 114: 763–776 26 Beyrlea, Klaus-Michael Debatinb, Johannes Waltenbergera , Christian Beltingerb Endothelial progenitor cell culture and differentiation in vitro: a methodological comparison using human umbilical cord blood Cardiovascular Research 2003; 58: 478–486 27 Botta R, Gao E, Stassi G, Bonci D, Pelosi E, Zwas D, et al Heart infarct in NOD–SCID mice: therapeutic vasculogenesis by transplantation of human CD34+ cells and low dose CD34+KDR+ cells FASEB J 2004;18(12): 1392–4 28 Bradley EH, Herrin J, Wang Y, et al Strategies for reducing the door-to-balloon time in acute myocardial infarction N Engl J Med 2006; 355:2308–2320 29 Britten MB, Abolmaali ND, Assmus B et al Infarct remodeling after intracoronary progenitor cell treatment in patients with acute myocardial infarction (TOPCARE-AMI) Mechanistic insights from serial contrast-enhanced magnetic resonance imaging Circulation 2003 30 Catalin Toma, Mark F Pittenger, Kevin S Cahill, BS Barry J Byrne, Paul D Kessler “Human Mesenchymal Stem Cells Differentiate to a Cardiomyocyte Phenotype in the Adult Murine Heart” Circulation 2002; 105: 93-98 31 Chen, Heather A Himburg and Nelson J Chao John P Chute, Garrett G Muramoto, Alice B Salter, Sarah K Meadows, Dennis W Rickman, Benny Transplantation of vascular endothelial cells mediates the hematopoietic recovery and survival of lethally irradiated mice Blood journal 2007; 109: 2365-2372 32 Cheng Fanjun, Zou Ping, Yang Handong, Yu Zhengtong, Zhong Zhaodong “Induced Differentiation of Human Cord Blood Mesenchymal Stem/Pro- genitor Cells into Cardiomyocyte-like Cells In Vitro” Journal of Huazhong University of Science and Technology 2003; 23:154-157 33 Christoph Kalka, Haruchika Masuda, Tomono Takahashi, Wiltrud M Kalka-Moll, Marcy Silver, Marianne Kearney,Tong Li, Jeffrey M Isner, and Takayuki Asahara Transplantation of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization PNAS 2000; 97(7): 3422–3427 34 David A Ingram, Laura E Mead, Hiromi Tanaka, Virginia Meade, Amy Fenoglio, Kelly Mortell, KarenPollok, Michael J Ferkowicz, David Gilley and Mervin C Yoder (2004) “Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood” Blood 2004; 104: 2752-2760 35 David B Weinreb, Juan Gilberto S Aguinaldo,Jonathan E Feig, Edward A Fisher2 and Zahi A Fayad Review Article: Non-invasive MRI of mouse models of atherosclerosis NMR Biomed 2007; 20: 256–264 36 Davies MJ, Thomas AC Plaque fissuring: the cause of acute myocardial infarction, sudden ischemic death, and crescendo angina Br Heart J 1985; 53:363–373 37 Dörthe Schmidt MD, Christian Breymann MD, Alberto Weber MD, Christina I Guenter MD, Stefan Neuenschwander PhD, Gregor Zund MD, Marko Turina MD and Simon P Hoerstrup MD Umbilical Cord Blood Derived Endothelial Progenitor Cells for Tissue Engineering of Vascular Grafts The Annals of Thoracic Surgery 2004; 78(6) 2094-2098 18 38 Duan HX, Cheng LM, Wang J, Hu LS, Lu GX Angiogenic potential difference between two types of endothelial progenitor cells from human umbilical cord blood Cell Biol Int 2006; 30: 1018-1027 39 Edelberg JM, Tang L, Hattori K, Lyden D, Rafii S Young adult bone marrow-derived endothelial precursor cells restore aging-impaired cardiac angiogenic function Circ Res 2002; 90: E89–E93 40 Erices A, Conget P, Minguell JJ Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood Br J Haematol 2000; 109:235-242 41 Erik B Friedrich, Katrin Walenta, John Scharlau, Georg Nickenig and Nikos Werner CD34–/CD133+/VEGFR-2+ Endothelial Progenitor Cell Subpopulation With Potent Vasoregenerative Capacities Circ Res 2006; 98;E20-E25 42 Fan Chun-Ling, LI Yan, Gao Ping-Jin, LIU Jian-Jun, Zhang Xue-Jun2 , ZHU Ding-Liang3 Differentiation of endothelial progenitor cells from human umbilical cord blood CD 34 + cells in vitro Fan CL et al / Acta Pharmacol Sin 2003; 24 (3): 212-218 43 Federico Vozzi, Jan-Michael Heinrich, Augustinus Bader, Arti D Ahluwalia Tissue Connected Culture of Murine Hepatocytes and Human Umbilical Vein Endothelial Cells in a Multicompartmental Bioreactor Engineering Part A 2009; 15(6): 1291-1299 44 Fuchs S, Satler LF, Kornowski R et al Catheter-based autologous bone marrow myocardial injection in no-option patients with advanced coronary artery disease: a feasibility study J Am Coll Cardiol 2003; 41: 1721–1724 45 Gavira et al., A comparison between percutaneous and surgical transplantation of autologous skeletal myoblasts in a swine model of chronic myocardial infarction, Cardiovascular Research 2006; 71:744–753 46 Gretel monreal, Mark A Gerhardt, Atsushi Kambara, a Reza Abrishamchian, John A Bauer, and Andrew H Goldstein Methods Selective Microembolization of the Circumflex Coronary Artery in an Ovine Model: Dilated, Ischemic Cardiomyopathy and Left Ventricular Dysfunction, Journal of Cardiac Failure 2004; Vol 10 No 47 Hirschi KK, Goodell MA Hematopoietic, vascular and cardiac fates of bone marrowderived stem cells Gene Ther 2002; 9: 648–652 48 Hu CH, Wu GF, Wang XQ, Yang YH, Du ZM, He XH, et al Transplanted human umbilical cord blood mononuclear cells improve left ventricular function through angiogenesis in myocardial infarction Chin Med J 2006; 119: 1499-1506 49 Hua-Xin Duan, La-Mei Cheng, Jian-Wang, Liang-Shan Hu and Guang-Xiu Lu Angiogenic potential difference between two types of endothelial progenitor cells from human umbilical cord blood Cell Biology International 2006;30(12):1018-1027 50 Hristov M, Erl W, Weber PC Endothelial progenitor cells: mobilization, differentiation, and homing Arterioscler Thromb Vasc Biol 2003; 23:1185-9 51 Iwaguro H, Yamaguchi J, Kalka C, et al Endothelial progenitor cellvascular endothelial growth factor gene transfer for vascular regeneration.Circulation 2002;105:732–738 Jackson KA, Majka SM, Wang H et al Regeneration of ischemic cardiac muscle and vascular endothelium by adult stem cells J Clin Invest 2001; 107: 1395–1402 52 Janssens S, Dubois C, Bogaert J, et al Autologous bone marrow-derived stem-cell transfer in patients with ST-segment elevation myocardial infarction: double-blind, randomized controlled trial Lancet 2006;367:113–121 53 Jeffrey M Isner and Takayuki Asahara Tepper, Edwin Gravereaux, Ann Pieczek, Hideki Iwaguro, Shin-Ichiro Hayashi, Christoph Kalka, Haruchika Masuda, Tomono Takahashi, 19 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 Rebecca Gordon, Oren Endothelial Progenitor Cells in Human Subjects Vascular Endothelial Growth Factor 165 Gene Transfer Augments Circulating Circ Res 2000; 86:1198-1202 Jiang Y, Jahagirdar BN, Reinhardt RL et al Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow Nature 2002; 418: 41–49 Jolicoeur EM, Granger CB, Fakunding JL, et al Bringing cardiovascular cell-based therapy to clinical application: perspectives based on a National Heart, Lung, and Blood Institute Cell Therapy Working Group meeting Am Heart J 2007;153:732–742 Johan Denollet et al Personality, Emotional Distress and Coronary Heart Disease European Journal of Personality 1997; 11:343±357 Jorn Tongers and Douglas W Losordo Frontiers in Nephrology: The Evolving Therapeutic Applications of Endothelial Progenitor Cells J Am Soc Nephrol 2007; 18: 2843–285 Juliane Eggermann, StefanieKliche, GergelyJarmy, KarinHoffmann, UlrikeMayr-Beyrle, Klaus-Michael Debatin, JohannesWaltenberger, ChristianBeltinger, Endothelial progenitor cell culture and differentiation in vitro: a methodological comparison using human umbilical cordblood, Cardiovascular Research 2003; 58:478–486 K Chu, K.-H Jung, S.-T Lee, H.-K Park, D.-I Sinn, J.-M Kim, D.-H Kim, J.-H Kim, S.-J Kim, E.-C Song, et al Circulating Endothelial Progenitor Cells as a New Marker of Endothelial Dysfunction or Repair in Acute Stroke * Supplemental Methods Stroke 2008; 39(5): 1441 - 1447 Kalka C, Masuda H, Takahashi T et al Transplantation of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97: 3422–3427 Kamihata H, Matsubara H, Nishiue T et al Implantation of bone marrow mononuclear cells into ischemic myocardium enhances collateral perfusion and regional function via side supply of angioblasts, angiogenic ligands, and cytokines Circulation 2001; 104: 1046–1052 Kawamoto A, Gwon HC, Iwaguro H et al Therapeutic potential of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for myocardial ischemia Circulation 2001; 103: 634–637 Kawamoto A, Gwon HC, Iwaguro H, Yamaguchi JI, Uchida S, Masuda H, et al Therapeutic potential of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for myocardial ischemia Circulation 2001; 103: 634-637 Keeley EC, Boura JA, Grines CL Primary angioplasty versus intravenous thrombolytic therapy for acute myocardial infarction: a quantitative review of 23 randomised trials Lancet 2003; 361:13–20 Kehat I, Kenyagin-Karsenti D, Snir M et al Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes J Clin Invest 2001;108: 407–414 Kenichi yamahara, Potential use of endothelial progenitor cells for regeneration of the vasculature, Therapeutic Advances in Cardiovascular Disease 2009; 3:17-27 Kocher AA, Schuster MD, Szabolcs MJ et al Neovascularization of ischemic myocardium by human bone-marrow-derived angioblasts prevents cardiomyocyte apoptosis, reduces remodeling and improves cardiac function Nature Med 2001; 7: 430– 436 20 68 Kristine G Gaustad, Andrew C Boquest, Brent E Anderson, A Martin Gerdes,and Philippe Collas “Differentiation of human adipose tissue stem cellsusing extracts of rat cardiomyocytes” Biochemical and Biophysical Research Communications 2004; 314:420–427 69 Kupatt C, Horstkotte J, Vlastos GA, Pfosser A, Lebherz C, Semisch M, et al Embryonic endothelial progenitor cells expressing a broad range of proangiogenic and remodeling factors enhance vascularization and tissue recovery in acute and chronic ischemia Faseb J 2005; 19: 1576-1578 70 Liu C, Sun Z, Du X, Chen X, Feng J, Jia B Implantation of endothelial progenitor cells into laser-induced channels in rat ischemia hindlimb augments neovascularization Ann Vasc Surg 2005; 19: 241-247 71 Lin H, Iammattoni MD, Modblum JR, Bolling SF Experimental heterotopic heart transplantation without ischemia or reperfusion Heart Transplant 1990;9:720 –723 72 Lunde K, Solheim S, Aakhus S, et al Intracoronary injection of mononuclear bone marrow cells in acute myocardial infarction N Engl J Med 2006;355:1199–1209 73 Ma N, Stamm C, Kaminski A, Li W, Kleine HD, Muller-Hilke B, et al Human cord blood cells induce angiogenesis following myocardial infarction in NOD/scid-mice Cardiovasc Res 2005; 66: 45-54 74 Manoukian SV, Feit F, Mehran R, et al Impact of major bleeding on 30-day mortality and clinical outcomes in patients with acute coronary syndromes: an analysis from the ACUITYTrial J Am Coll Cardiol 2007; 49:1362–1368 75 Medvinsky A, Smith A Stem cells: fusion brings down barriers Nature 2003; 422: 823– 825 76 Mehdi Kadivar , Shohreh Khatami , Yousef Mortazavi , Mohammad Ali, Shokrgozar, Mohammad, Taghikhani, Masoud Soleimani “In vitro cardiomyogenic potential of human umbilical vein-derived mesenchymal stem cells ” Biochemical and Biophysical Research Communications 2005; 340: 639–647 77 Melo LG, Gnecchi M, Pachori AS, Kong D, Wang K, Liu X, et al Endothelium-targeted gene and cell-based therapies for cardiovascular disease Arterioscler Thromb Vasc Biol 2004; 24: 1761-1774 78 Menasche P Skeletal muscle satellite cell transplantation Cardiovasc Res 2003 58:351– 357 79 Meyer GP, Wollert KC, Lotz J, et al Intracoronary bone marrow cell transfer after myocardial infarction: eighteen months’ follow-up data from the randomized, controlled BOOST (Bone marrow transfer to enhance ST-elevation infarct regeneration) trial Circulation 2006;113:1287–1294 80 Michael j.b Kutryk and duncan j Stewart, angiogenesis of the heart Microscopy Research And Technique 2003; 60:138–158 81 Murohara T Therapeutic vasculogenesis using human cord blood-derived endothelial progenitors Trends Cardiovasc Med 2001; 11: 303-307 82 Murry C.E., Field L.J., Menasche P Cell-based cardiac repair: reflections at the 10-year point Circulation 2005 112:3174–3183 83 N.-M Heida, J.-P Muller, I.-F Cheng, M Leifheit-Nestler, V Faustin, J Riggert, G Hasenfuss, S Konstantinides, and K Schafer Effects of obesity and weight loss on the functional properties of early outgrowth endothelial progenitor cells J Am Coll Cardiol 2010; 55(4): 357 - 367 21 84 Nabel EG Gene therapy for cardiovascular disease Circulation 1995; 91:541–548 85 Nakagawa, Masabumi Shibuya, Hiroyuki Yoshikawa and Osamu Ohneda Masumi Nagano, Toshiharu Yamashita, Hiromi Hamada, Kinuko Ohneda, Ken-ichi Kimura, Tomoki Identification of functional endothelial progenitor cells suitable for the treatment of ischemic tissue using human umbilical cord blood blood Journal 2007; 110: 151-160 86 Nallamothu BK, Bates ER Percutaneous coronary intervention versus fibrinolytic therapy in acute myocardial infarction: is timing (almost) everything? Am J Cardiol 2003; 92:824–826 87 Neumann FJ, Kastrati A, Pogatsa-Murray G, et al Evaluation of prolonged antithrombotic pretreatment (‘‘cooling-off’’ strategy) before intervention in patients with unstable coronary syndromes: a randomized controlled trial JAMA 2003; 290: 1593– 1599 88 Nieda M, Nicol A, Denning-Kendall P, Sweetenham J, Bradley B, Hows J Endothelial cell precursors are normal components of human umbilical cord blood Br J Haematol 1997; 98: 775-777 89 Oh H, Bradfute SB, Gallardo TD et al Cardiac progenitor cells from adult myocardium: homing, differentiation, and fusion after infarction Proc Natl Acad Sci USA 2003; 100 90 Orlic D, Kajstura J, Chimenti S et al Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium Nature 2001; 410: 701–705 91 Perin EC, Dohmann HF, Borojevic R et al Transendocardial, autologous bone marrow cell transplantation for severe, chronic ischemic heart failure Circulation 2003; 107: 2294–2302 92 Pitchai Balakumar, Amrit Pal Singh, Manjeet Singh, Rodent models of heart failure, Journal of Pharmacological and Toxicological Methods (2007) 56: 1–10 93 Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC et al Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells Science 1999; 284: 143–147 94 Pollok, Michael J Ferkowicz, David Gilley and Mervin C Yoder David A Ingram, Laura E Mead, Hiromi Tanaka, Virginia Meade, Amy Fenoglio, Kelly Mortell, Karen Human peripheral and umbilical cord blood Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using blood journal 2004;104: 2752-2760 95 Polychronis Antonitsis, Elisavet Ioannidou-Papagiannaki, Aikaterini Kaidoglou , Christos Papakonstantinoua “In vitro cardiomyogenic differentiation of adult human bone marrow mesenchymal stem cells The role of 5-azacytidine” Interactive CardioVascular and Thoracic Surgery 2007; 6: 593–597 96 Quaini F, Urbanek K, Beltrami AP, et al Chimerism of the transplanted heart N Engl J Med 2002; 346:5–15 97 Quirici N, Soligo D, Caneva L, Servida F, Bossolasco P, Deliliers York, USA, for initial support in establishing the culture of GL Differentiation and expansion of endothelial cells from human non-adherent cells The generous gift of the antibody bone marrow CD133(1) cells Br J Haematol 2001;115:186–194 98 Rosenzweig A Cardiac cell therapy – mixed results from mixed cells N Engl J Med 2006; 355:1274–1277 99 Schachinger V, Erbs S, Elsasser A, et al Intracoronary bone marrow-derived progenitor cells in acute myocardial infarction N Engl J Med 2006; 355:1210–1221 100 Schachinger V, Erbs S, Elsasser A, et al., for the REPAIR-AMI Investigators Improved clinical outcome after intracoronary administration of bone-marrow-derived progenitor 22 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 cells in acute myocardial infarction: final 1-year results of the REPAIR-AMI trial Eur Heart J 2006; 27:2775–2783 Shi Q, Rafii S, Wu MH et al Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial cells Blood 1998; 92: 362–367 Siminiak T., Kalawski R., Fiszer D., Jerzykowska O., Rzezniczak J., Rozwadowska N., et al Autologous skeletal myoblast transplantation for the treatment of postinfarction myocardial injury: phase I clinical study with 12 months of follow-up Am Heart J 2004; 148:531–537 Simon G Fisher, Michael S Marber An in vivo model of ischaemia–reperfusion injury and ischaemic preconditioning in the mouse heart, Journal of Pharmacological and Toxicological Methods 2002; 48: 161-169 Smits P.C., van Geuns R.J., Poldermans D., Bountioukos M., Onderwater E.E., Lee C.H., et al Catheter-based intramyocardial injection of autologous skeletal myoblasts as a primary treatment of ischemic heart failure: clinical experience with six-month followup J Am Coll Cardiol 2003; 42:2063–2069 Stamm C, Westphal B, Kleine HD et al Autologous bone-marrow stem-cell transplantation for myocardial regeneration Lancet 2003; 361: 45–46 Strauer BE, Brehm M, Zeus T et al Repair of infarcted myocardium by autologous intracoronary mononuclear bone marrow cell transplantation in humans Circulation 2002; 106: 1913–1918 T J Povsic and P J Goldschmidt-Clermont Review: Endothelial progenitor cells: markers of vascular reparative capacity Therapeutic Advances in Cardiovascular Disease 2008; 2(3): 199 - 213 Tateishi-Yuyama E, Matsubara H, Murohara T et al Therapeutic angiogenesis for patients with limb ischaemia by autologous transplanation of bone marrow cells: a pilot study and a randomized controlled trial Lancet 2002; 360: 427–435 Tingzhong Wang, Zhengyun Xu, Wenhui Jiang, Aiqun Ma.“Cell-to-cell contact induces mesenchymal stem cell to differentiate into cardiomyocyte and smooth muscle cell ” International Journal of Cardiology 2006;109: 74 – 81 Thum T, Bauersachs J, Poole-Wilson PA, Volk HD, Anker SD The dying stem cell hypothesis: immune modulation as a novel mechanism for progenitor cell therapy in cardiac muscle J Am Coll Cardiol 2005; 46:1799–1802 Toma C, Pittenger MF, Cahill KS, Byrne BJ, Kessler PD Human mesenchymal stem cells differentiate to a cardiomyocyte phenotype in the adult murine heart Circulation 2002; 105: 93–98 Tse HF, Kwong YL, Chan JK, Lo G, Ho CL, Lau CP Angiogenesis in ischaemic myocardium by intramyocardial autologous bone marrow mononuclear cell implantation Lancet 2003; 361: 47–49 Urao N, Okigaki M, Yamada H, Aadachi Y, Matsuno K, Matsui A, et al Erythropoietinmobilized endothelial progenitors enhance reendothelialization via Aktendothelial nitric oxide synthase activation and prevent neointimal hyperplasia Circ Res 2006; 98: 1405-1413 Urbich C, Heeschen C, Aicher A, Dernbach E, Zeiher AM, Dimmeler S Relevance of monocytic features for neovascularization capacity of circulating endothelial progenitor cells Circulation 2003; 108: 2511–1516 23 115 Ursula M Gehling, Su¨leyman Ergu¨n, Udo Schumacher, Christoph Wagener, Klaus Pantel, Marcus Otte, Gunter Schuch, Philippe Schafhausen, Thorsten Mende, Nerbil Kilic, Katrin Kluge, Birgit Scha¨ fer, Dieter K Hossfeld, and Walter Fiedler In vitro differentiation of endothelial cells from AC133-positive progenitor cells Blood 2005; Volume 95, Number 10 116 V L.T Ballard and J M Edelberg Stem Cells and the Regeneration of the Aging Cardiovascular System Circ Res 2007; 100(8): 1116 – 1127 117 V Planat-Bénard, C Menard, M André, M Puceat, A Perez J.-M Garcia-Verdugo, L Pénicaud, L Casteilla “Spontaneous Cardiomyocyte Differentiation From Adipose Tissue Stroma Cells ” Circulation Research (2003) 94: 223-229 118 Vasa M, Fichtlscherer S, Adler K, et al Increase in circulating endothelial progenitor cells by statin therapy in patients with stable coronary artery disease Circulation 2001;103:2885–2890 119 White HD Non-ST elevation acute coronary syndromes unstable angina and non-ST elevation myocardial infarction In: Textbook of Cardiovascular Medicine, 2nd ed Edited by Topol EJ Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; 2006.pp 352–384 120 Wollert KC, Meyer GP, Lotz J et al Randomized controlled clinical trial of intracoronary autologous bone marrow cell transfer post myocardial infarction Circulation 2003; 108: 2723 121 Wollert KC, Meyer GP, Lotz J, et al Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST randomised controlled clinical trial Lancet 2004; 364:141–148 122 Wuqiang zhu, weinian shou, r Mark payne, randall caldwell, and loren j Field A mouse model for juvenile doxorubicin-induced cardiac dysfunction, pediatric research (2008),vol 64, no 123 Xiao Wu, Lensch, Wylie-Sears et al , Hemogenic Endothelial Progenitors from Cord Blood, Stem Cells 2007;25:2770 –2776 124 Yamamoto K, Takahashi T, Asahara T, Ohura N, Sokabe T, Kamiya A, et al Proliferation, differentiation, and tube formation by endothelial progenitor cells in response to shear stress J Appl Physiol 2003; 95: 2081-2088 125 Yang C, Zhang ZH, Li ZJ, Yang RC, Qian GQ, Han ZC Enhancement of neovascularization with cord blood CD133+ cell-derived endothelial progenitor cell transplantation Thromb Haemost 2004; 91: 1202-1212 126 Yoshioka T, Ageyama N, Shibata H, Yasu T, Misawa Y, Takeuchi K, et al Repair of infarcted myocardium mediated by transplanted bone marrow-derived CD34+ stem cells in a nonhuman primate model Stem Cells 2005; 23: 355-364 127 Zhao Y, Glesne D, Huberman E A human peripheral blood monocyte-derived subset acts as pluripotent stem cells Proc Natl Acad Sci USA 2003; 100: 2426–2431 128 Zijiang Yang 1, Moritz Wyler von Ballmoos 1, Nicolas Diehm, Iris Baumgartner, Christoph Kalka, Stefano Di Santo Call for a reference model of chronic hind limb ischemia to investigatetherapeutic angiogenesis.Vascular Pharmacology 2009; 51:268– 274 24