ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC _o0o _ CHU HỒNG QUẢNG NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM BÀO TỬ NẤM KÍ SINH CÔN TRÙNG TỪ CHỦNG NẤM LECANICILLIUM LECANII L439 VÀ ĐÁNH GIÁ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CHẾ PHẨM LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên – 2013 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC _o0o _ CHU HỒNG QUẢNG NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM BÀO TỬ NẤM KÍ SINH CÔN TRÙNG TỪ CHỦNG NẤM LECANICILLIUM LECANII L439 VÀ ĐÁNH GIÁ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CHẾ PHẨM Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS VŨ VĂN HẠNH Thái Nguyên – 2013 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ MỞ ĐẦU Lí chọn đề tài: Rệp (Aphidoidae) nhóm côn trùng chích hút nhựa phổ biến giới, phân bố rộng rãi vùng ôn đới, cận nhiệt đới nhiệt đới Chúng kí sinh 11000 loài thuộc 243 họ khác nhau, có nhiều trồng quan trọng nhƣ loại ngũ cốc, bông, khoai tây, cà chua, họ cải [48] Chúng vừa hút cạn nguồn dinh dƣỡng vừa làm cản trở trình hô hấp, quang hợp cây, đồng thời truyền virus gây bệnh từ bị bệnh sang khỏe mạnh đồng ruộng [72] Theo thống kê, rệp côn trùng khác làm thiệt hại khoảng 15% sản lƣợng trồng giới [31] Biện pháp phòng trừ rệp chủ yếu dùng thuốc hóa học, thuốc có phổ tác dụng rộng nhiều đối tƣợng hiệu tác dụng nhanh Tuy nhiên, thuốc hóa học có độc tính cao, khó phân hủy điều kiện bình thƣờng, tích tụ lại đất, nƣớc, không khí sản phẩm nông nghiệp, làm ô nhiễm môi trƣờng, ảnh hƣởng xấu đến sức khỏe ngƣời sinh vật có ích Ngoài ra, tính độc cao thuốc trừ sâu hóa học gây tƣợng đột biến kháng thuốc rệp dẫn tới nguy bùng phát dịch rệp hại nhiều loại trồng Việc ứng dụng khống chế sinh học loài thiên địch kí sinh trùng gây bệnh dùng để thay phần cho thuốc hóa học bảo vệ thực vật trồng trọt có ƣu điểm vƣợt trội nhƣ an toàn ngƣời môi trƣờng sinh thái, góp phần trì phát triển bền vững ngành nông nghiệp Nấm kí sinh côn trùng Lecanicillium ssp chi nấm có khả kí sinh tự nhiên số loài rệp côn trùng Từ năm 1960, giới có nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng nấm Lecanicillium ssp để diệt rệp hại trồng, vài sản phẩm đƣợc thƣơng mại hóa nhiên kết đạt đƣợc nhiều hạn chế Vì vậy, việc tăng cƣờng nghiên cứu phát triển chế phẩm diệt rệp từ Lecanicillium ssp cần thiết Việc tối ƣu môi trƣờng lên men, sản xuất, bảo quản chế phẩm bào tử thử nghiệm độc lực bào tử vấn đề cần đƣợc giải nghiên cứu 2 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Vì lí trên, thực đề tài: “Nghiên cứu sản xuất chế phẩm bào tử nấm kí sinh côn trùng từ chủng nấm Lecanicillium lecanii L439 đánh giá đặc điểm sinh học chế phẩm”, đề tài đƣợc thực Phòng chất Chức sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Mục tiêu nghiên cứu: Sản xuất chế phẩm bào tử nấm diệt rệp hại trồng có hiệu cao, an toàn, dễ sử dụng chuyển giao kĩ thuật cho hộ nông dân sản xuất sử dụng Nội dung nghiên cứu: Tối ƣu môi trƣờng lên men Sản xuất bào tử, phối trộn với chất phụ gia tạo chế phẩm bảo quản Thử nghiệm độc lực chế phẩm rệp hại Luận văn Thạc sĩ Chu Hồng Quảng Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ NỘI DUNG Chƣơng TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiệu rệp hại trồng 1.1.1 Cấu tạo, phân loại rệp đặc điểm sinh thái Rệp (Aphidoidae) họ lớn thuộc lớp côn trùng thuộc ngành chân khớp – động vật không xƣơng sống, thể chia thành ba phần (đầu, ngực, bụng), có ba cặp chân phân đốt, mắt kép có cặp râu, thể đƣợc bao bọc xƣơng chitin, chiều dài từ – 10 mm (Hình 1.1) Rệp có lớp biểu bì mềm, có cánh (dạng màng) không cánh Phần lớn thân rệp có màu xanh cây, đen, nâu, hồng không màu Rệp nhóm côn trùng chích hút phổ biến nay, phân bố tập trung vùng ôn đới [72], số sống cận nhiệt đới nhiệt đới với số lƣợng khoảng 3700 loài rệp đƣợc biết giới [48] Hình 1.1 Cấu tạo rệp (University of Birmingham, England) [105] Rệp sinh sản theo hình thức đơn tính hữu tính Vào mùa thu, có thay đổi cƣờng độ chiếu sáng, nhiệt độ, giảm sút nguồn thức ăn chất lƣợng thức ăn, rệp sinh rệp đực rệp Đặc điểm di truyền rệp đực giống hệt rệp mẹ ngoại trừ việc nhiễm sắc thể giới tính Rệp hữu tính thiếu cánh, trí thiếu vòi chích hút [72] Khi trƣởng thành, rệp giao Luận văn Thạc sĩ Chu Hồng Quảng Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ phối với rệp đực đẻ trứng Trứng sống sót qua mùa đông khắc nghiệt nở rệp có cánh không cánh (Hình 1.2) Các rệp sinh sản vô tính rệp không cánh rệp có cánh (khi khan thức ăn) để bay đến kí chủ khác Tuy nhiên, môi trƣờng ấm áp nhƣ vùng nhiệt đới nhà kính, rệp sinh sản vô tính nhiều năm Trong vòng đời, rệp sinh 31 đến 93 rệp theo hình thức sinh sản [12], [111], [115] Đặc biệt, số loài có khả sinh sản lồng, rệp mẹ sinh rệp rệp chuẩn bị sinh hệ có sẵn thể Cách sinh sản ảnh hƣởng đến kích thƣớc rệp tốc độ sinh sản tăng lên [54], [81] Hình 1.2 Vòng đời rệp (BMC Developmental Biology) [99] Trong điều kiện thuận lợi, vòng đời trung bình cá thể rệp khoảng 30 ngày Rệp sinh phát triển khoảng đến 10 ngày để trƣởng thành bắt đầu sinh sản hệ [68] Phần lớn rệp có thân mềm nên chúng dễ dàng bị giết nhiều kẻ thù tự nhiên nhƣ bọ rùa, ong bắp cày kí sinh, ấu trùng muỗi kí sinh, nhện cua, vi khuẩn, virus, loài nấm kí sinh côn trùng nhƣ Neozygites fresenii, Entomophthorales, Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, Lecanicillium lecanii,… Luận văn Thạc sĩ Chu Hồng Quảng Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Rệp (Aphididae) có khoảng 4700 loài, chúng kí sinh nhiều loại trồng cỏ dại khác nhƣ ngô, lúa mì, khoai tây, bông, ớt, hoa hồng, cam, quýt,… thuộc họ lúa, họ dƣa, họ cà, họ có múi,… gây thiệt hại hàng tỷ đô la Mỹ năm cho ngành nông nghiệp trồng trọt [48] Các loài rệp phá hoại trồng mạnh nhƣ rệp đào Myzus persicae Sulzer, rệp Aphis gossypii Glover, rệp ngô Aphis maydis, rệp đậu đũa Aphis craccivora Koch,… chúng thƣờng ẩn phần mặt dƣới lá, thân non chích hút nhựa [106], vừa làm cạn nguồn dinh dƣỡng vừa tiết chất đƣờng mật không làm đóng khí khổng mà góp phần tăng phát triển mốc đen, làm ngăn cản ánh sáng đến mô quang hợp, ảnh hƣởng nghiêm trọng tới trao đổi chất suất trồng Ngoài ra, việc chích hút nhựa loài rệp làm lây lan virus gây bệnh từ bệnh sang khỏe mạnh [72] Loài rệp ngô Aphis maydis loại sâu hại phổ biến toàn giới, chúng kí sinh nhiều loại trồng nhƣ lúa miến (Sorghum), ngô lúa mì,… với mật độ cá thể cao làm giảm sản lƣợng hạt lây truyền virus gây bệnh Rệp chích hút nhựa, làm tổn thƣơng tất phận khác ngô nhƣng chúng phá hoại mạnh phận bắp non râu ngô gây mức độ khô cháy khác nhau, ảnh hƣởng tới trình thụ phấn, thụ tinh hình thành hạt, dẫn tới giảm suất, chất lƣợng hạt ngô [28] 1.1.2 Tình hình rệp hại trồng giới Việt Nam Tình hình rệp hại giới: Rệp loài côn trùng có tác hại nguy hiểm giới Chúng không gây hại trực tiếp, hút cạn nguồn dinh dƣỡng mà vật trung gian truyền nhiều loại virus gây bệnh cho thực vật, đồng thời khó kiểm soát chúng loại thuốc bảo vệ hóa học thực vật thông thƣờng khả kháng thuốc mạnh rệp nên số lƣợng cá thể tăng nhanh [34] Đậu tƣơng loại hạt dầu đƣợc trồng nhiều giới nhƣng suất bị đe dọa nghiêm trọng rệp đậu tƣơng (A glycines) Sản lƣợng hạt bị thiệt hại ƣớc tính khoảng 34%, theo tính toán Catangui cộng (2009), số thiệt hại Luận văn Thạc sĩ Chu Hồng Quảng Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ chí lên đến 48 – 72% Nguyên nhân rệp chích hút làm giảm 50% tốc độ quang hợp [29] Đậu đũa (Vigna unguiculata) loại đƣợc trồng nhiều châu Phi, ƣớc tính sản lƣợng hàng năm khu vực khoảng 3,36 triệu Không giống nhƣ vải bị phá hoại chủ yếu A gossypii, đậu đũa bị phá hoại nhiều loài rệp nhƣ A craccivora, A leguminosae, A labburni, A fabae, Myzus persica A gossypii Ở khu vực biện pháp bảo vệ, sản lƣợng thiệt hại lên đến 20 – 100% [83] Rệp đào (Myzus persicae Sulzer) loài rệp nguy hiểm với trồng Chúng đƣơc biết đến từ năm 1776, thể có hình lê dài mm với nhiều mầu sắc khác Rệp đào kí sinh hàng trăm loài thuộc 40 họ khác Các phân bố rộng khắp giới, nhiều phân bố vùng lạnh nhƣ Atiso, bắp cải, cà rốt, súp lơ, ngô, su hào, cải dầu, củ cải đƣờng, cà chua,…[75] chúng hút nhựa làm cho chồi non cong queo, xoăn, làm rụng hoa non gây ảnh hƣởng đến sinh trƣởng phát triển Kennedy cộng (1962) liệt kê 100 loại virus lây truyền qua loài rệp Một số bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng nhƣ virus khoai tây, cà chua, củ cải, súp lơ, dƣa hấu, dƣa chuột,…[27] Rệp đào truyền virus gây bệnh khảm làm thiệt hại 60% suất dƣa chuột [101] Chúng gây bệnh trầm trọng cải bắp từ giai đoạn – lá, chúng chích hút dịch cây, lá, bẹ lá, dẫn đến héo, thân ủ rũ chết [114] Rệp cải bắp (còn gọi rệp cải hay rệp muội) (Brevicoryne brassicae) loài rệp gây thiệt hại lớn cho ngƣời trồng rau cải sản xuất dầu hạt cải Tùy theo vùng địa lý mùa vụ mà thời điểm rệp xuất nhƣ gia tăng mật độ cá thể cao có khác Rệp thƣờng chích hút nhựa lá, cụm hoa thân đồng thời gián tiếp truyền virus gây bệnh cho cải Thiệt hại rệp cải bắp gây từ 35 – 75% suất rau cải 6% hàm lƣợng dầu hạt cải [20] Rệp ngô (Aphis maydis): Rệp ngô phân bố rộng rãi vùng nhiệt đới cận nhiệt đới, kí sinh nhiều loài khác thuộc họ lúa nhƣ đại mạch, lúa mì, lúa miến (cao lƣơng – sorghum), ngô, loại cỏ làm thức ăn gia súc,… đồng thời vật Luận văn Thạc sĩ Chu Hồng Quảng Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ trung gian truyền virus gây bệnh khảm mía, đốm ngô, Trong điều kiện thuận lợi, rệp ngô có vòng đời khoảng 15 ngày có nhiều hệ liên tiếp năm Rệp non trƣởng thành hút nhựa nõn ngô, bẹ lá, phiến lá, cờ, bi, làm cho ngô hết dinh dƣỡng, quăn giảm khả quang hợp, ngô trở nên gầy yếu, bắp bé không hạt, chất lƣợng hạt Thƣờng phát dịch ruộng khô hạn cằn cỗi vào thời kì ngô trổ cờ, kết bắp [28], [110] Theo thống kế năm 1965 – 1970 suất ngô cho thấy mức độ phá hoại rệp ngô phụ thuộc nhiều vào điều kiện nhiệt độ độ ẩm môi trƣờng Ngô bị nhiễm rệp mức độ nhẹ (mật độ khoảng 400 cá thể rệp chùm râu bắp ngô) khiến cho suất bình quân giảm tới 8,3% bị thiếu nƣớc, đủ nƣớc mức độ thiệt hại rệp gây không đáng kể Nếu mức độ nhiễm rệp mức trung bình mức độ thiệt hại lên đến 34,8% điều kiện trồng thiếu nƣớc 11,8% điều kiện đủ nƣớc Nếu mức độ nhiễm rệp nặng (mật độ rệp lên đến hàng trăm cá thể hầu hết chùm râu bắp ngô) làm suất suy giảm nghiêm trọng, trung bình dao động từ 43,2 – 91,8% ngô bị thiếu nƣớc 58,9% ngô đủ nƣớc [39] Lipaphis erysimi (rệp cải dầu) kí sinh số loài nhƣng chủ yếu loại cải cải dầu, kí sinh cà rốt, cà chua bí xanh Ở phía đông miền Trung Ấn Độ, L erysimi với M persicae Brevicoryne brassicae ba loại rệp nguy hiểm cải dầu (Brassica juncea) Trong L erysimi phá hoại nhiều nhất, riêng gây thiệt hại 35,4 – 91,3% sản lƣợng [24] Theo nghiên cứu Patel cộng (2004), biện pháp bảo vệ, L erysimi gây thiệt hại 80,6 – 97,6% [87] Trong nghiên cứu khác, Razaq cộng (2011) rằng, M persicae Brevicoryne brassicae gây thiệt hại 75,1 – 81,9% sản lƣợng cải dầu Multan, Punjab, Pakistan [94] Aphis craccivora (rệp đậu lăng) loài rệp kí sinh nhiều loại trồng khác nhƣ đậu đũa, vải, táo, cà rốt, lúa mì, đậu lăng Theo nghiên cứu Hossain cộng (2006), A craccivora gây thiệt hại tới 9% cho sản xuất đậu lăng Tuy nhiên, sản lƣợng đậu lăng tăng 0,91 – 9,89% áp dụng biện pháp Luận văn Thạc sĩ Chu Hồng Quảng Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ diệt rệp gieo trồng tránh rệp [50] A craccivora truyền virus gây bệnh rụng đậu lăng, đậu ngựa, đậu gà [56], [80] Diuraphis noxia (rệp lúa mì Nga) chuyên phá hoại lúa mì, lúa mạch đen, lúa mạch trắng, yến mạch Theo nghiên cứu Akhtar cộng (2010), suất lúa mì bị giảm 7,9 – 34,2% D noxia phá hoại [15] Tình hình rệp hại trồng Việt Nam Tại Việt Nam, theo nghiên cứu thống kê nhà khoa học, nƣớc ta chịu phá hoại 250 loài rệp khác Tại đồng sông Cửu Long, sầu riêng bị rệp sáp phá hoại Một số ăn thành phố Hồ Chí Minh vùng phụ cận bị ảnh hƣởng nhiều loài rệp làm giảm suất thiệt hại kinh tế Cây cà phê số vùng Tây Nguyên gặp phải vấn nạn rệp sáp rệp Tại tỉnh Đắc Lắc, rệp sáp kí sinh chùm hoa non gây thiệt hại từ – 25% Tại tỉnh Đắc Nông, rệp công gây hƣ hại 500 ha, gây thiệt hại nặng cho 200 [10] Trong năm gần đây, thống kê loài gây hại cho trồng nƣớc ta, rệp đào mối đe dọa cho ngành nông nghiệp với gia tăng nhanh chóng diện tích số lƣợng trồng bị hại Chúng gây hại 300 loại trồng khác nhau, thƣờng thấy nhƣ: loại rau họ cải nhƣ cải trắng, cải củ, cải xanh, cải bắp; số ăn nhƣ đào, hồng, lê, mận Trong điều kiện nƣớc ta, rệp đào xuất gây hại quanh năm, tập trung nhiều thời tiết dịu mát, độ ẩm cao vào tháng – (vụ đông xuân) tháng – 10 (vụ thu đông) Rệp ngô Việt Nam phổ biến, chúng có khắp vùng trồng ngô từ đồng đến miền núi, rệp thƣờng phát triển nhiều mùa xuân mùa thu, lúc độ ẩm không khí cao Rệp thƣờng phá hại ngô từ giai đoạn –10 ngô chín hoàn toàn Chỉ tính riêng huyện Trà Ôn, Tam Bình Vũng Liêm (Vĩnh Phúc), diện tích ngô bị nhiễm rệp từ – 7%, nhƣ tính nƣớc thiệt hại gây rệp ngô lớn [110], [116] Luận văn Thạc sĩ Chu Hồng Quảng Số hóa trung tâm học liệu 1.2 Thuốc diệt côn trùng http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 1.2.1 Tình hình sản xuất sử dụng thuốc trừ sâu * Thuốc trừ sâu hóa học Thuốc trừ sâu hóa học, trừ bệnh trừ cỏ dại loại thuốc bảo vệ thực vật Thuốc trừ sâu loại chất đƣợc sử dụng để chống côn trùng, chúng bao gồm thuốc diệt trứng thuốc diệt ấu trùng côn trùng Các loại thuốc trừ sâu đƣợc sử dụng nhiều lĩnh vực nhƣng chủ yếu đƣợc dùng nông nghiệp Việc sử dụng thuốc trừ sâu đƣợc cho yếu tố dẫn tới gia tăng sản lƣợng nông nghiệp kỷ XX [103] Gần nhƣ tất loại thuốc trừ sâu có nguy làm thay đổi lớn hệ sinh thái, nhiều loại thuốc trừ sâu độc hại với ngƣời sinh vật chúng tích tụ lại chuỗi thức ăn Từ 2000 năm trƣớc công nguyên, ngƣời biết sử dụng thuốc trừ sâu có nguồn gốc tự nhiên để bảo vệ trồng [74] nhƣng đến hóa chất đƣợc tổng hợp nhân tạo dễ dàng nhà máy hóa chất, đặc biệt sau Paul Hermann Müller phát khả diệt côn trùng mạnh mẽ DDT vào năm 1939 nhiều loại thuốc bảo vệ thực vật phòng trừ sâu, bệnh cỏ dại đƣợc nghiên cứu đƣa vào sử dụng Từ năm 1945 đến năm 1975, lƣợng thuốc bảo vệ thực vật đƣợc sản xuất Mỹ tăng 40 lần, từ 15,9 nghìn tấn/năm lên 636,3 nghìn tấn/năm Từ năm 1975 đến nay, ngƣời ý thức đƣợc mức độ nguy hại thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc hóa học nhƣng trƣớc phá hoại mạnh mẽ côn trùng dịch hại khác chƣa có biện pháp thay thực hiệu việc sản xuất sử dụng thuốc bảo vệ thực vật nguồn gốc hóa học tăng nhanh khối lƣợng giá trị thƣơng mại [21], [42], [57], [96] Ở Việt Nam, thuốc bảo vệ thực vật đƣợc sản xuất sử dụng lần miền Bắc vào năm 1956 để tiêu diệt bọ gai sâu hại lúa tỉnh Hƣng Yên Tại miền Nam, thuốc bảo vệ thực vật đƣợc sử dụng năm 1962 Từ đến nay, lƣợng thuốc bảo vệ thực vật đƣợc tiêu thụ tăng mạnh qua năm Theo Lê Kế Sơn (1993), lƣợng thuốc bảo vệ thực vật nhập vào nƣớc ta năm 1980 khoảng 20 – 24 nghìn tấn/năm nhƣng đến năm 1990 số tăng Luận văn Thạc sĩ Chu Hồng Quảng