ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH LỜI CẢM ƠN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  Để hồn thành chƣơng trình cao học luận văn này, em nhận đƣợc hƣớng dẫn, giúp đỡ góp ý nhiệt tình q thầy CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM khoa Hóa trƣờng Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Trƣớc hết, em xin chân thành cảm ơn đến q thầy khoa Hóa trƣờng Đại Học Khoa Học Tự Nhiên TpHCM, đặc biệt thầy tận tình dạy bảo cho em suốt thời gian học tập trƣờng Em xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến GS.TS Trần Kim Qui, TS Lê THU NHẬN ENZYM PAPAIN ĐỂ ỨNG DỤNG VÀO Việt Tiến dành nhiều thời gian tâm huyết hƣớng dẫn nghiên PHẢN ỨNG THỦY PHÂN PROTEIN TRONG BÁNH cứu giúp em hồn thành luận văn DẦU ĐẬU PHỘNG Nhân đây, em xin chân thành cảm ơn anh chị nghiên cứu sinh động viên giúp đỡ em nhiều q trình hồn thành luận văn CHUN NGÀNH: HĨA HỮU CƠ MÃ SỐ: 604427 Em xin chân thành cảm ơn anh Hồ Anh Vũ, anh ln động viên đồng hành em suốt thời gian học tập nhƣ thời gian em thực luận văn LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC Cuối xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến gia đình cho có đƣợc thành nhƣ ngày hơm Mặc dù có nhiều cố gắng để hồn thiện luận văn tất NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC GS.TS TRẦN KIM QUI nhiệt tình lực mình, nhiên khơng thể tránh khỏi thiếu sót, mong nhận đƣợc ý kiến đóng góp q báu q thầy bạn THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2009 Tp.HCM – Ngày 12 tháng 09 năm 2009 MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU VỀ ENZYME PAPAIN 1.1.1 Cysteine protease 1.1.2 Papain 1.1.2.1 Nguồn gốc .2 1.1.2.1.1 Giới thiệu đu đủ 1.1.2.1.2 Phân bố sinh thái đu đủ 1.1.2.1.3 Hoạt tính sinh học cơng dụng số chất có đu đủ 1.1.2.2 Tính chất papain .5 1.1.2.2.1 Tính chất vật lý 1.1.2.2.2 Tính chất hóa học .5 a) Cấu tạo hóa học b) Cấu trúc khơng gian .6 c) Cấu trúc tâm hoạt động papain .7 d) Phản ứng papain e Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác papain 1.1.2.3 Ứng dụng enzyme papain 10 1.1.2.3.1 Trong y học: .10 1.1.2.3.2 Trong cơng nghiệp thực phẩm: 10 1.1.2.3.3 Trong ngành cơng nghiệp khác: 10 1.2 THÀNH PHẦN HĨA HỌC CỦA BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG 10 1.3 PHẢN ỨNG THỦY PHÂN BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG 12 1.3.1 Khái niệm phản ứng thủy phân 12 1.3.2 Quy trình thực phản ứng thủy phân 13 1.3.3 Các thay đổi hóa sinh q trình thủy phân: .14 1.3.4 Tính chất sản phẩm sau thủy phân .14 1.3.5 Ƣu nhƣợc điểm phản ứng thủy phân: 15 1.3.5.1 Ƣu điểm: 15 1.3.5.2 Nhƣợc điểm: .15 1.4 ỨNG DỤNG ENZYME PAPAIN LÀM XÚC TÁC CHO PHẢN ỨNG THỦY PHÂN PROTEIN TRONG BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG 15 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 17 2.1 HĨA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 17 2.1.1 Hóa chất 17 2.1.2 Thiết bị 18 2.2 PHƢƠNG PHÁP THỰC HIỆN 18 2.2.1 Phƣơng pháp trích nhựa đu đủ từ trái .18 2.2.2 Phƣơng pháp thu nhận papain tinh khiết 19 2.2.2.1 Loại bỏ chất khơng tan pH 20 2.2.2.2 Q trình phân đoạn amonium sulfate 20 2.2.2.3 Q trình phân đoạn NaCl .20 2.2.2.4 Kết tinh 20 2.2.2.5 Tái kết tinh 21 2.2.2.6 Đơng khơ chân khơng 21 2.2.3 Xác định lƣợng protein theo phƣơng pháp Lowry .22 2.2.4 Xác định hoạt tính protein theo phƣơng pháp Anson 23 2.2.5 Xác định đạm tổng số theo phƣơng pháp Kjeldahl 24 2.2.5.1 Ngun tắc: 24 2.2.5.2 Cách tính: 24 2.2.6 Phƣơng pháp xác định đạm formol (phƣơng pháp Sorensen) 25 2.2.6.1 Ngun tắc 25 2.2.6.2 Tiến hành 25 2.2.6.3 Cách tính 26 2.2.7 Xác định đạm amoniac 26 2.2.7.1 Ngun tắc 26 2.2.7.2 Tiến hành 27 2.2.7.3 Cách tính 27 2.2.8 Phƣơng pháp chung tiến hành phản ứng thủy phân bánh dầu đậu phộng với xúc tác papain thơ 27 2.2.8.1 Phƣơng pháp loại béo: 27 2.2.8.2 Phƣơng pháp thực phản ứng 27 2.2.8.3 Hiệu suất thủy phân 28 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .30 3.1 KHẢO SÁT LƢỢNG NHỰA Ở QUẢ ĐU ĐỦ 30 3.2 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SƠ CHẾ NHỰA TƢƠI .30 3.3 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN THU NHẬN PAPAIN TỪ NHỰA KHƠ .31 3.4 PHƢƠNG PHÁP LOWRY XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG PROTEIN .33 3.5 PHƢƠNG PHÁP ANSON XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH PROTEASE 34 3.6 KHẢO SÁT LƢỢNG ENZYME THU ĐƢỢC SAU CÁC GIAI ĐOẠN TINH CHẾ 35 3.7 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CỦA ENZYME SAU CÁC GIAI ĐOẠN TINH CHẾ 37 3.8 KHẢO SÁT SỰ BIẾN ĐỔI LƢỢNG PROTEIN TRONG CÁC CHẾ PHẨM PROTEASE THU ĐƢỢC THEO THỜI GIAN 39 3.9 KHẢO SÁT SỰ BIẾN ĐỔI HOẠT TÍNH CỦA CÁC CHẾ PHẨM THEO THỜI GIAN .41 3.10 KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA ENZYME PAPAIN 44 3.10.1 Khảo sát ảnh hƣởng pH .44 3.10.2 Khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ .45 3.11 KHẢO SÁT HÀM LƢỢNG ĐẠM FORMOL VÀ AMONIAC THEO THỜI GIAN TRONG PHẢN ỨNG THỦY PHÂN .46 3.12 KHẢO SÁT PHẢN ỨNG THỦY PHÂN BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG VỚI XÚC TÁC PAPAIN THƠ .49 3.12.1 Khảo sát phản ứng thủy phân hàm lƣợng xúc tác 0.25% so với chất theo thời gian 50 3.12.2 Khảo sát phản ứng thủy phân hàm lƣợng xúc tác 0.50% so với chất theo thời gian 57 3.12.3 Khảo sát phản ứng thủy phân hàm lƣợng xúc tác 0.75% so với chất 65 3.12.4 Khảo sát phản ứng thủy phân hàm lƣợng xúc tác 1.00% so với chất 72 KẾT LUẬN 80 TÀI LIỆU THAM KHẢO 81 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Tính chất vật lý papain Bảng 1.2 Thành phần hóa học hạt đậu phộng 10 Bảng 1.3 Thành phần acid béo bánh dầu đậu phộng 11 Bảng 1.4 Thành phần hóa học bã đậu phộng loại béo 11 Bảng 1.5 Thành phần amino acid đậu phộng 11 Bảng 3.1 Hàm lượng phần trăm nhựa đu đủ loại khác 30 Bảng 3.2 Các phương pháp làm khơ nhựa đu đủ .30 Bảng 3.3 Mật độ quang albumin bước sóng 750nm 33 Bảng 3.4 Mật độ quang tyrosin bước sóng 720nm 34 Bảng 3.5 Lượng protein thu phân đoạn tinh chế khác .36 Bảng 3.6 Hoạt tính protease enzyme sau giai đoạn tinh chế .38 Bảng 3.7 Hàm lượng protein chế phẩm theo thời gian 40 Bảng 3.8 Hoạt tính protein chế phẩm theo thời gian 42 Bảng 3.9 Hoạt tính protein P(UI) biến đổi theo pH 44 Bảng 3.10 Hoạt tính protein P(UI) nhựa khơ biến đổi theo nhiệt độ 45 Bảng 3.11: Biến thiên hàm lượng đạm formol theo thời gian tỉ lệ enzyme 0.25% so với chất .47 Bảng 3.12: Biến thiên hàm lượng đạm formol theo thời gian tỉ lệ enzyme 0.50% so với chất .47 Bảng 3.13: Biến thiên hàm lượng đạm formol theo thời gian tỉ lệ enzyme 1.00% so với chất .47 Bảng 3.14: Biến thiên hàm lượng đạm amoniac nồng độ enzyme khác 48 Bảng 3.15 Hiệu suất phản ứng pH 6.0, 60OC hàm lượng xúc tác 0.25% .51 Bảng 3.16 Hiệu suất phản ứng pH 6.0, 70OC hàm lượng xúc tác 0.25% .51 Bảng 3.17 Hiệu suất phản ứng pH 6.0, 80OC hàm lượng xúc tác 0.25% .52 Bảng 3.18 Hiệu suất phản ứng pH 7.0, 60OC hàm lượng xúc tác 0.25% .53 Bảng 3.19 Hiệu suất phản ứng pH 7.0, 70OC hàm lượng xúc tác 0.25% 53 Bảng 3.20 Hiệu suất phản ứng pH 7.0, 80OC hàm lượng xúc tác 0.25% .54 3.11 KHẢO SÁT HÀM LƢỢNG ĐẠM FORMOL VÀ AMONIAC THEO THỜI GIAN TRONG PHẢN ỨNG THỦY PHÂN .46 3.12 KHẢO SÁT PHẢN ỨNG THỦY PHÂN BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG VỚI XÚC TÁC PAPAIN THƠ .49 3.12.1 Khảo sát phản ứng thủy phân hàm lƣợng xúc tác 0.25% so với chất theo thời gian 50 3.12.2 Khảo sát phản ứng thủy phân hàm lƣợng xúc tác 0.50% so với chất theo thời gian 57 3.12.3 Khảo sát phản ứng thủy phân hàm lƣợng xúc tác 0.75% so với chất 65 3.12.4 Khảo sát phản ứng thủy phân hàm lƣợng xúc tác 1.00% so với chất 72 KẾT LUẬN 80 TÀI LIỆU THAM KHẢO 81 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Tính chất vật lý papain Bảng 1.2 Thành phần hóa học hạt đậu phộng 10 Bảng 1.3 Thành phần acid béo bánh dầu đậu phộng 11 Bảng 1.4 Thành phần hóa học bã đậu phộng loại béo 11 Bảng 1.5 Thành phần amino acid đậu phộng 11 Bảng 3.1 Hàm lượng phần trăm nhựa đu đủ loại khác 30 Bảng 3.2 Các phương pháp làm khơ nhựa đu đủ .30 Bảng 3.3 Mật độ quang albumin bước sóng 750nm 33 Bảng 3.4 Mật độ quang tyrosin bước sóng 720nm 34 Bảng 3.5 Lượng protein thu phân đoạn tinh chế khác .36 Bảng 3.6 Hoạt tính protease enzyme sau giai đoạn tinh chế .38 Bảng 3.7 Hàm lượng protein chế phẩm theo thời gian 40 Bảng 3.8 Hoạt tính protein chế phẩm theo thời gian 42 Bảng 3.9 Hoạt tính protein P(UI) biến đổi theo pH 44 Bảng 3.10 Hoạt tính protein P(UI) nhựa khơ biến đổi theo nhiệt độ 45 Bảng 3.11: Biến thiên hàm lượng đạm formol theo thời gian tỉ lệ enzyme 0.25% so với chất .47 Bảng 3.12: Biến thiên hàm lượng đạm formol theo thời gian tỉ lệ enzyme 0.50% so với chất .47 Bảng 3.13: Biến thiên hàm lượng đạm formol theo thời gian tỉ lệ enzyme 1.00% so với chất .47 Bảng 3.14: Biến thiên hàm lượng đạm amoniac nồng độ enzyme khác 48 Bảng 3.15 Hiệu suất phản ứng pH 6.0, 60OC hàm lượng xúc tác 0.25% .51 Bảng 3.16 Hiệu suất phản ứng pH 6.0, 70OC hàm lượng xúc tác 0.25% .51 Bảng 3.17 Hiệu suất phản ứng pH 6.0, 80OC hàm lượng xúc tác 0.25% .52 Bảng 3.18 Hiệu suất phản ứng pH 7.0, 60OC hàm lượng xúc tác 0.25% .53 Bảng 3.19 Hiệu suất phản ứng pH 7.0, 70OC hàm lượng xúc tác 0.25% 53 Bảng 3.20 Hiệu suất phản ứng pH 7.0, 80OC hàm lượng xúc tác 0.25% .54 Bảng 3.21 Hiệu suất phản ứng pH 8.0, 60OC hàm lượng xúc tác 0.25% .55 Bảng 3.22 Hiệu suất phản ứng pH 8.0, 70OC hàm lượng xúc tác 0.25% .56 Bảng 3.23 Hiệu suất phản ứng pH 8.0, 80OC hàm lượng xúc tác 0.25% .56 Bảng 3.24 Hiệu suất phản ứng pH 6.0, 60OC hàm lượng xúc tác 0.50% .58 Bảng 3.25 Hiệu suất phản ứng pH 6.0, 70OC hàm lượng xúc tác 0.50% .59 Bảng 3.26 Hiệu suất phản ứng pH 6.0, 80OC hàm lượng xúc tác 0.50% .59 Bảng 3.27 Hiệu suất phản ứng pH 7.0, 60OC hàm lượng xúc tác 0.50% .60 Bảng 3.28 Hiệu suất phản ứng pH 7.0, 70OC hàm lượng xúc tác 0.50% .61 Bảng 3.29 Hiệu suất phản ứng pH 7.0, 80OC hàm lượng xúc tác 0.50% .61 Bảng 3.30 Hiệu suất phản ứng pH 8.0, 60OC hàm lượng xúc tác 0.50% .62 Bảng 3.31 Hiệu suất phản ứng pH 8.0, 70OC hàm lượng xúc tác 0.50% .63 Bảng 3.32 Hiệu suất phản ứng pH 8.0, 80OC hàm lượng xúc tác 0.50% .63 Bảng 3.33 Hiệu suất phản ứng pH 6.0, 60OC hàm lượng xúc tác 0.75% .65 Bảng 3.34 Hiệu suất phản ứng pH 6.0, 70OC hàm lượng xúc tác 0.75% .66 Bảng 3.35 Hiệu suất phản ứng pH 6.0, 80OC hàm lượng xúc tác 0.75% .66 Bảng 3.36 Hiệu suất phản ứng pH 7.0, 60OC hàm lượng xúc tác 0.75% .68 Bảng 3.37 Hiệu suất phản ứng pH 7.0, 70OC hàm lượng xúc tác 0.75% .68 Bảng 3.38 Hiệu suất phản ứng pH 7.0, 80OC hàm lượng xúc tác 0.75% .69 Bảng 3.39 Hiệu suất phản ứng pH 8.0, 60OC hàm lượng xúc tác 0.75% .70 Bảng 3.40 Hiệu suất phản ứng pH 8.0, 70OC hàm lượng xúc tác 0.75% .70 Bảng 3.41 Hiệu suất phản ứng pH 8.0, 80OC hàm lượng xúc tác 0.75% .71 Bảng 3.42 Hiệu suất phản ứng pH 6.0, 60OC hàm lượng xúc tác 1.00% .72 Bảng 3.43 Hiệu suất phản ứng pH 6.0, 70OC hàm lượng xúc tác 1.00% .73 Bảng 3.44 Hiệu suất phản ứng pH 6.0, 80OC hàm lượng xúc tác 1.00% .74 Bảng 3.45 Hiệu suất phản ứng pH 7.0, 60OC hàm lượng xúc tác 1.00% .75 Bảng 3.46 Hiệu suất phản ứng pH 7.0, 70OC hàm lượng xúc tác 1.00% .75 Bảng 3.47 Hiệu suất phản ứng pH 7.0, 80OC hàm lượng xúc tác 1.00% .76 Bảng 3.48 Hiệu suất phản ứng pH 8.0, 60OC hàm lượng xúc tác 1.00% .77 Bảng 3.49 Hiệu suất phản ứng pH 8.0, 70OC hàm lượng xúc tác 1.00% .77 Bảng 3.50 Hiệu suất phản ứng pH 8.0, 80OC hàm lượng xúc tác 1.00% .78 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 2.1 Các loại hoa trái đu đủ Hình 1.2 Cấu trúc bậc papain Hình 1.3 Cấu trúc tâm hoạt động papain Hình 1.4 Phản ứng hóa học papain Hình 1.8 Sơ đồ phản ứng thủy phân .13 Hình 2.1 Cách lấy nhựa đu đủ 19 Hình 2.2 Sơ đồ thu nhận papain từ nhựa đu đủ đơng khơ .21 Hình 3.1a Điện di đồ nhựa khơ trái non sơ chế dung mơi etanol 31 Hình 3.1 b Điện di đồ chế phẩm Merk papain tinh chế từ nhựa đu đủ đơng khơ 32 Hình 3.2 Đường chuẩn biểu diễn phụ thuộc mật độ quang vào nồng độ albumin 33 Hình 3.3 Đường chuẩn biểu diễn phụ thuộc mật độ quang vào nồng độ tyrosin 34 Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn biến thiên lượng protein sau giai đoạn tinh chế .36 Hình 3.5 Sự biến thiên hoạt tính protein sau giai đoạn tinh chế 39 Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn biến thiên hàm lượng protein theo thời gian .40 Hình 3.7 Sự biến đổi hoạt tính chế phẩm theo thời gian .42 Hình 3.8 Hoạt tính protein P(UI/ml) nhựa khơ biến đổi theo pH .44 Hình 3.9:Hoạt tính protein nhựa khơ theo nhiệt độ 46 Hình 3.10: Đồ thị biểu diễn biến thiên hàm lượng đạm formol theo thời gian phản ứng .48 Hình 3.11 Sự phụ thuộc hiệu suất vào thời gian phản ứng pH 6.0 hàm lượng xúc tác 0.25% 52 Hình 3.12 Sự phụ thuộc hiệu suất vào thời gian phản ứng pH 7.0 hàm lượng xúc tác 0.25% 55 Hình 3.13 Sự phụ thuộc hiệu suất vào thời gian phản ứng pH 8.0 hàm lượng xúc tác 0.25% 57 Hình 3.14 Sự phụ thuộc hiệu suất vào thời gian phản ứng pH 6.0 hàm lượng xúc tác 0.50% 60 Hình 3.15 Sự phụ thuộc hiệu suất vào thời gian phản ứng pH 7.0 hàm lượng xúc tác 0.50% 62 Hình 3.16 Sự phụ thuộc hiệu suất vào thời gian phản ứng pH 8.0 hàm lượng xúc tác 0.50% 64 Hình 3.17 Sự phụ thuộc hiệu suất vào thời gian phản ứng pH 6.0 hàm lượng xúc tác 0.75% 67 Tại pH 7.0, hiệu suất phản ứng nhiệt độ khác trình bày bảng 3.36 – 3.38 67 Hình 3.18 Sự phụ thuộc hiệu suất vào thời gian phản ứng pH 7.0 hàm lượng xúc tác 0.75% 69 Hình 3.19 Sự phụ thuộc hiệu suất vào thời gian phản ứng pH 8.0 hàm lượng xúc tác 0.75% 71 Hình 3.20 Sự phụ thuộc hiệu suất vào thời gian phản ứng pH 6.0 hàm lượng xúc tác 1.00% 74 Hình 3.21 Sự phụ thuộc hiệu suất vào thời gian phản ứng pH 7.0 hàm lượng xúc tác 1.00% 76 Hình 3.22 Sự phụ thuộc hiệu suất vào thời gian phản ứng pH 8.0 hàm lượng xúc tác 1.00% 78 Hình 3.23 Kết điện di dung dịch sau phản ứng hàm lượng xúc tác khác 79 MỞ ĐẦU TỔNG QUAN Chương Hiện vấn đề vệ sinh an tồn thực phẩm nhiễm mơi trường vấn đề quan tâm hàng đầu Trong q trình sản xuất nước chấm có hàm lượng đạm cao, người ta thường dùng phương pháp thủy phân protein tạo thành dung dịch amino acid Có phương pháp tiến hành phản ứng thủy phân protein: Phương pháp hóa học: thủy phân protein với xúc tác acid, thời gian tiến hành phản ứng 24 Nhược điểm phương pháp tạo thành sản phẩm phụ 3- 1.1 GIỚI THIỆU VỀ ENZYME PAPAIN 1.1.1 Cysteine protease [8, 9, 19, 34, 43] Cysteine proteases (EC.3.4.22) nhóm protein có trọng lượng phân tử khoảng 21-30 kDa, protein có khả xúc tác để thủy phân loại liên kết: peptide, amide, ester thiol Đây enzyme có nhóm –SH tâm hoạt động Người ta tìm thấy 20 họ cysteine proteases (Barrett, 1994) nhiều MCPD, chất độc gây ung thư Phương pháp dùng men vi sinh: sử dụng chủng nấm Aspergillus oryzae để xúc tác phản ứng thủy phân protein Nhược điểm phương pháp thời gian enzyme số (papain, bromelain, ficain, animal cathepsins) ứng dụng rộng rãi cơng nghiệp Có thực phản ứng dài khoảng từ – tháng Phương pháp hóa sinh: sử dụng xúc tác enzyme protease có nguồn gốc động thực vật làm xúc tác Phương pháp có thời gian phản ứng ngắn khơng tạo sản phẩm phụ có khả gây ung thư hai carboxypeptidase loại B) cysteine proteases endopeptidases exopeptidase (bromelain, (cathepsin ficain, X, cathepsin ) Exopeptidase thủy phân liên kết peptide đầu N đầu C tự endopeptidase cắt đứt liên kết peptide chuỗi polypeptide 1.1.2 Papain Các phản ứng sử dụng xúc tác enzyme ứng dụng rộng rãi lĩnh 1.1.2.1 Nguồn gốc[2,17, 19, 32 ] vực chúng khơng cho hiệu suất cao mà thời gian thực phản ứng Papain (EC 3.4.22.3) cysteine protease biết đến nhiều ngắn so với phản ứng tiến hành theo phương pháp cổ điển Hơn phân lập lần vào năm 1879 từ nhựa trái đu đủ (Carica papaya) Đây enzyme thường phân bố rộng rãi tất mơ, quan động vật enzyme xác định cấu trúc tinh thể (Drenth et al., 1968; Kamphuis thực vật, tế bào vi sinh vật nên tương đối dễ tìm et al., 1894) Trong nhựa đu đủ ngồi enzyme papain có loại protease khác Trong phạm vi luận văn chúng tơi tiến hành thu nhận enzyme papain chymopapain, caricain, glycyl endopeptidase số enzyme khác (Baines có nhựa đu đủ ứng dụng tính chất thủy phân protein enzyme papain để and Brock-lehurst, 1979) Nhựa đu đủ có hàm lượng hoạt tính papain cao làm xúc tác cho phản ứng thủy phân protein bánh dầu đậu phộng ép tập trung vùng có nắng nóng độ ẩm ổn định quanh năm lấy dầu Chúng tơi chọn enzyme papain enzyme có hoạt tính protease cao, diện nhiều nhựa trái đu đủ, loại trồng phổ biến nước ta LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM 1.1.2.1.1 Giới thiệu đu đủ.[7, 8, 41] 1.1.2.1.2 Phân bố sinh thái đu đủ.[7, 26, 33] Chi Carica L có nguồn gốc vùng nhiệt đới châu Mỹ Ở vùng núi cao (1500-3000m), từ Panama đến Bolivia, đu đủ trồng giống lai tự nhiên lồi C peltata Hook & Ann Vào khoảng kỷ 16, người Tây Ban Nha đưa đu đủ vào trồng vùng Caribê số nước Đơng Nam Á Từ địa điểm này, tiếp tục trồng rộng rãi Ấn Độ, Srilanca, châu Đại Dương châu Phi 1.1.2.1.3 Hoạt tính sinh học cơng dụng số chất có đu A: hoa B: hoa lưỡng tính C: hoa đực đủ [8,41, 45] Nhựa đu đủ gây viêm da Ở Trung Mỹ, dân gian, người ta sử dụng đu đủ để điều trị bệnh lỵ amip (Entamoeba histolytica), loại ký sinh trùng gây tiêu chảy dạng lỵ biến chứng áp- xe gan Ở Samoa, người dân dùng phần vỏ thân đu đủ để chữa chứng nhức D: trái E: trái lưỡng tính F: đực Hình 2.1 Các loại hoa trái đu đủ Tên khoa học: Carica papaya L., thuộc họ đu đủ - Caricaceae Cây đu đủ gọi thù đủ Huế, phiên mộc, cà lào, phiên qua, phan qua thụ, lơ hong phlê (Campuchia), mắc (Lào), má hống (Thái) Đu đủ thường đồng chu, đu đủ xếp thành loại phương diện giới tính: đực, lưỡng tính Vài đu đủ Nhựa đu đủ có chứa papain, hai loại men tiêu hủy protein (proteolytic enzymes) có tác dụng làm mềm thịt bắp Chính tác dụng này, dùng đu đủ hầm chung với thịt, thịt mềm Người dân vùng Ca-ri-bê, Trung Mỹ cho biết họ dùng phần với số lượng lớn thịt cá khơng ăn đu đủ xanh sau Phần cơm đu đủ thành phần loại mỹ phẩm kem (mặt), kem đánh răng, xà bơng gội đầu trổ ba loại hoa nói Ngồi có hoa khơng hẳn hồn tồn đực, Các ứng dụng quan trọng y học nhựa đu đủ chiết xuất papain hay lưỡng tính mà lại pha lẫn nhiều đặc tính ba loại hoa Khuynh hướng để dùng phẫu thuật cột sống (là loại "dao phẫu thuật tự nhiên" để mở đĩa thay đổi giới tính phần lớn thời tiết gây tỉ khơ hạn thay đổi nhiệt độ đệm) Nghiên cứu cho thấy chiết xuất papain có hoạt tính kháng sinh (antibiotic activity) với tác dụng chống vi khuẩn gram dương (gram-positive bacteria) Nó dùng để điều trị lở lt, làm tiêu giả mạc bệnh bạch hầu, chống kết dính sau phẫu thuật, làm thuốc giúp tiêu hóa Trong cơng nghiệp, papain dùng để LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM tinh chế bia; xử lý len lụa trước nhuộm; phụ gia cơng nghệ chế biến b) Cấu trúc khơng gian cao su; tinh chế dầu gan cá tuna, người ta tiêm papain vào gan trước chiết Phân tử papain có dạng hình cầu với kích thước 36x48x36Ao mạch xuất, làm cho thành phẩm giàu Vitamin A D Khoảng 1,500 đu đủ xanh bị gấp thành hai phần riêng biệt khe Trung tâm hoạt động nằm bề mặt cỡ vừa cho khoảng 650g papain khe này, nhóm -SH hoạt động cysteine 25 nằm bên trái khe nhóm 1.1.2.2 Tính chất papain[8] histidine 159 nằm bên phải khe Phần xoắn  chiếm 20% tồn amino acid có 1.1.2.2.1 Tính chất vật lý phân tử Bảng 1.1 Tính chất vật lý papain Tính chất vật lý Điểm đẳng điện Giá trị pI = 8.75 Hằng số sa lắng S20 2.42 ± 0.04 -7 Hằng số phân tán D20 (10 giây.cm ) 10.27 ± 0.13 Phân tử lượng 20,700 Độ triền quang [] D 20 -66.7o Độ xoắn 17% Vòng hiệu ứng cotton 290nm Thể tích riêng phần V(mL/g) 0.724 Trị số ma sát f/fo 1.16 Bột màu vàng hay màu nâu nhạt, tùy thuộc phương pháp sấy, khơng tan hầu hết chất hữu tan phần H2O hay glycerine Bền nhiệt 1.1.2.2.2 Tính chất hóa học[8, 34] a) Cấu tạo hóa học Theo kết phân tích tia X, phân tử papain cấu tạo 212 acid Hình 1.2 Cấu trúc bậc papain Hoạt tính papain dựa hai tâm hoạt động Cys25 His159 Khoảng amin khơng có chứa methionine Phân tử lượng khoảng 23,350 Da, phân tử pH hoạt động papain rộng (3.5 – 8.0) tùy thuộc vào chất Khi chất là mạch polypeptide với đầu N isoleucine, đầu C asparagine, có gốc casein hoạt tính tối ưu papain vùng pH từ 5.7 – 7.0 nhiệt độ thích cysteine tạo thành cầu disulfur vị trí 22-63, 56-95, 153-200 khơng có chức hợp 50 – 57OC sinh học, làm tăng tính bền vững cấu trúc nhóm –SH tự vị trí 25 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM c) Cấu trúc tâm hoạt động papain R' Tâm hoạt động papain gồm có nhóm –SH cysteine 25 nitrogen bậc histidine 159 Bên cạnh nhóm imidazole His 159 liên kết với NH2 R' Cys25 S H Asp 175 liên kết hydrogen N C Vùng tâm hoạt động papain chứa mạch polypeptide với amino acid Cys25 S C O NH O NH R His159 HN S - acyl hóa R His159 N H2O là: RCO-NHR' Lys-Asp-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Ser-Cys R'NH2 Liên kết với chất H Theo nghiên cứu Lowe, chuỗi polypeptide trung tâm hoạt động H O papain gần giống ficin hay trypsin, chúng có nguồn gốc khác Cys25 S 25 C O Cys S NH R NH Ficin: Arg-Glu-Glu-Gly-Glu-Cys-Gly-Ser-Cys N His159 HN His159 Thủy phân Trypsin: Lys-Asp-Ser-Cys-Glu-Gly-Gly-Asp-Ser RCOOH OH Cys25 S C O NH R Đề acyl hóa Papain S-S-CH3 + R- SH Không hoạt động NH2+ C NH2 NH (CH2)3 Hình 1.3 Cấu trúc tâm hoạt động papain d) Phản ứng papain [21, 22, 23, 35] Papain thủy phân protein thành polypeptide acid amin, đóng vai trò vừa endopeptidase vừa exopeptidase C HNHC C O O HN Papain His159 SH + R-S-S-CH3 Hoạt động NH2+ C NH2 Cl Cl NH2 NH Papain (CH2)3 SH NO2 C HNHC O C OH3 + O NO2 Không màu Có màu Hình 1.4 Phản ứng hóa học papain LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM 10 e Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác papain[8, 6, 38]  Nhiệt độ: Papain enzyme chịu nhiệt độ tương đối cao Ở dạng nhựa TCA 10%, guanidine hydrochloride 6M làm biến đổi bất thuận nghịch độ quay quang học hoạt tính papain khơ papain khơng bị biến tính 100oC Còn dạng dung dịch papain bị 1.1.2.3 Ứng dụng enzyme papain[7, 8, 25, 29, 46] hoạt tính sau 30 phút 82.5oC nhiệt độ tăng cao (>100oC) 1.1.2.3.1 Trong y học: bị hồn tồn hoạt tính kể thêm lượng lớn chất hoạt hóa vào dung dịch Điều dạng dung dịch tăng lên đến nhiệt độ lớn 100oC cấu trúc tâm hoạt động papain bị phá hủy hồn tồn Papain dùng làm thuốc chống giun sán, ăn khơng tiêu, chống biếng ăn,… papain dùng làm thuốc rửa ráy tai, dùng phẫu thuật Papain có tác dụng lên hệ mạch dùng trị bệnh bạch cầu, viêm họng… Điều đáng lưu ý sau tinh trạng thái tinh thể papain có độ bền nhiệt thấp papain nhựa, nhựa chứa protein 1.1.2.3.2 Trong cơng nghiệp thực phẩm: Papain dùng để làm mềm thịt, dùng để thủy phân gan cá ngừ làm thuốc bổ Papain dùng sản xuất bia giúp tiêu hóa protein hòa khác có tác dụng bảo vệ papain Papain dung dịch NaCl giữ 4oC bền nhiều tháng Trong dung dịch dẫn xuất thủy ngân, papain khơng hoạt tính nhiều tháng Trong hầu hết enzyme hoạt tính ngày 1-2% phân hủy oxy tan bia 1.1.2.3.3 Trong ngành cơng nghiệp khác: Papain dùng làm mềm da ngành cơng nghiệp thuộc da, dùng tẩy vết máu quần áo Trong cơng nghiệp mỹ phẩm, papain dùng để tẩy hóa Khi thủy phân protein khác nhau, tùy thuộc vào chất mà nhiệt độ thích hợp cho papain khác chẳng hạn chất casein nhiệt o độ tối ưu cho phản ứng 37 C Papain dạng ổn định trạng thái khơ chịu nhiệt độ sấy 115oC thời gian mà hoạt tính trì 90%  pH: Papain hoạt động khoảng pH tương đối rộng từ 4.5-8.5 lại vết nám, tàn nhang da 1.2 THÀNH PHẦN HĨA HỌC CỦA BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG Đậu phộng có hàm lượng lipid cao nên thường dùng để ép dầu Đậu phộng sau ép lấy dầu gọi bánh dầu phộng Theo tài liệu cơng bố, trung bình hạt đậu phộng có thành phần bảng 1.2: Bảng 1.2 Thành phần hóa học hạt đậu phộng Thành phần Hàm lượng (%) dễ biến tính mơi trường acid có pH < 4.5 mơi trường kiềm mạnh có pH > 12 Khi phản ứng với chất tùy thuộc vào chất chất mà pH tối ưu khác Chẳng hạn, papain phản ứng với casein pH tối ưu 7-7.5 Papain dạng ổn định tức dạng mà cấu trúc khơng gian enzyme ổn định, chịu pH = 1.5 pH = 8.5 90 phút  Dung mơi: Papain khơng thay đổi độ quay quang học dung mơi methanol 70% khơng thay đổi độ nhớt dung mơi methanol 50% Trong dung dịch dimethylsulfoxide chứa 20% dung mơi hữu urea 8M khơng làm Protein 20 – 34 Lipid 40 – 60 Hydrat carbon 6.0 – 22 Xenlulo 2.0 – 4.5 Tro 1.8 – 4.6 Trong protein đậu phộng glubumin có hàm lượng cao chiếm khoảng 97%, ngồi có số hàm lượng khơng đáng kể albumin, prolamin, giảm hoạt tính thay đổi cấu hình papain Các chất gây biến tính mạnh glutein LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HĨA HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM 11 12 Trong lipid đậu phộng có hai loại acid béo no khơng no với hàm lượng tính theo phần trăm bảng 1.3: 1.3 PHẢN ỨNG THỦY PHÂN BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG 1.3.1 Khái niệm phản ứng thủy phân[13, 14, 15] Bảng 1.3 Thành phần acid béo bánh dầu đậu phộng Tên acid béo Khơng no (%) No (%) Phản ứng thủy phân phản ứng phân hủy chất có tham gia nước Phản ứng thủy phân phản ứng quan trọng ngành cơng nghiệp, đặc biệt Oleic 50 – 70 - 11 cơng nghiệp thực phẩm Người ta ứng dụng phản ứng thủy phân cơng Linoleic 13 – 26 2–6 nghiệp thực phẩm để sản xuất hàng loạt sản phẩm khác xa với tính chất Linolenoic 13 – 26 5–7 ngun liệu ban đầu tính cảm quan, tính dinh dưỡng sản phẩm Tuy Bánh đậu phộng tách dầu có thành phần theo bảng 1.4: Bảng 1.4 Thành phần hóa học bã đậu phộng loại béo nhiên, nhiều trường hợp phản ứng thủy phân có hại cho sản phẩm thực phẩm q trình bảo quản Phương trình tổng qt phản ứng thủy phân Thành phần Hàm lượng (%) Protein 48 Acid amin 12.7 Hydrat carbon 26.5 Lipid 8.0 hay enzyme hydrolase đặc biệt ứng dụng rộng rãi enzyme Tro 4.8 có nguồn gốc vi sinh vật thực vật R1R2 + H2O (H+, HO-) R1OH + R2H Các tác nhân làm xúc tác cho phản ứng thủy phân thường acid, base Hàm lượng acid amin bao gồm acid amin theo bảng 1.5 : Bảng 1.5 Thành phần acid amin đậu phộng Tên cấu tử Hàm lượng (%) Tryptophan 0.5 Leucin 3.5 Isoleucin 1.5 Valin 1.65 Threonin 0.75 Lysin 1.5 Methionin 0.6 Phenylalanin 2.7 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HĨA HỌC Enzym CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM Trong phản ứng thủy phân có tham gia lượng nước lớn tốc độ phản ứng thủy phân tùy thuộc vào nồng độ chất Như vậy, phản ứng thủy phân xúc tác enzyme phản ứng đơn phân có thứ bậc LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM 55 56 Sự phụ thuộc hiệu suất vào thời gian phản ứng (pH 7.0, Nồng độ xúc tác 0.25%) Hiệu suất phản ứng (%) 40.00 35.00 Bảng 3.22 Hiệu suất phản ứng pH 8.0, 70OC hàm lƣợng xúc tác 0.25% Thời gian Mật độ quang Lượng thủy phân 750nm (AU) protein (giờ) (mg/g) Hiệu suất thủy phân (%) 30.00 60oC 0.1521 217.86 23.93% 25.00 70oC 0.1556 222.86 24.62% 0.1608 230.29 25.64% 0.1657 237.29 26.61% 10 0.1732 248.00 28.08% 12 0.1970 282.00 32.77% 14 0.1987 284.43 33.10% 16 0.1990 284.86 33.16% 18 0.1998 286.00 33.32% 20 0.2029 290.43 33.93% 22 0.2053 293.86 34.40% 24 0.2197 314.43 37.24% 80oC 20.00 15.00 10.00 10 12 14 16 18 20 22 24 26 Thời gian phản ứng (giờ) Hình 3.12 Sự phụ thuộc hiệu suất vào thời gian phản ứng pH 7.0 hàm lƣợng xúc tác 0.25% Hiệu suất phản ứng thủy phân pH 8.0 trình bày bảng 3.21 – 3.23 O Bảng 3.21 Hiệu suất phản ứng pH 8.0, 60 C hàm lƣợng xúc tác 0.25% Bảng 3.23 Hiệu suất phản ứng pH 8.0, 80OC hàm lƣợng xúc tác 0.25% Thời gian Mật độ quang Lượng thủy phân 750nm (AU) protein (giờ) (mg/g) Hiệu suất thủy phân (%) Thời gian thủy phân (giờ) Mật độ quang Lượng 750nm (AU) protein (mg/g) Hiệu suất thủy phân (%) 0.1355 194.14 20.66% 0.1203 172.43 17.67% 0.1434 205.43 22.22% 0.1254 179.71 18.67% 0.1473 211.00 22.98% 0.1306 187.14 19.70% 0.1511 216.43 23.73% 0.1423 203.86 22.00% 26.12% 10 0.1566 224.29 24.82% 28.79% 12 0.1676 240.00 26.98% 29.52% 14 0.1730 247.71 28.04% 16 0.1823 261.00 29.88% 18 0.1836 262.86 30.13% 20 0.1858 266.00 30.56% 22 0.1960 280.57 32.57% 24 0.2005 287.00 33.46% 10 12 14 16 0.1632 0.1768 0.1805 0.1909 233.71 253.14 258.43 273.29 31.57% 18 0.1912 273.71 31.63% 20 0.1933 276.71 32.04% 22 0.2011 287.86 33.58% 24 0.2076 297.14 34.86% LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM 57 58 Nhận xét: So với pH 6.0 pH 7.0 hiệu suất phản ứng pH 8.0 có phần 60OC, 70OC, 80OC Sau phản ứng, cân 0.1g dung dịch phản ứng định mức giảm nhẹ Hiệu suất cao 37.24% 70OC thấp 33.46% 80OC thành 100ml nước sơi để ngừng phản ứng thủy phân Rút 0.4ml dung dịch Trong khoảng từ đến 18 giờ, hiệu suất phản ứng tăng rõ rệt, đặc biệt tăng mạnh phản ứng pha lỗng để xác định hàm lượng protein hòa tan theo phương pháp khoảng từ đến 14 Lowry O O Hiệu suất phản ứng 80 C thường thấp so với 60 C Điều giải thích nhiệt độ tăng cao làm bất hoạt tâm hoạt động enzyme Thời gian Mật độ quang Lượng thủy phân 750nm (AU) protein (giờ) (mg/g) Sự phụ thuộc hiệu suất vào thời gian phản ứng (pH 8.0, Nồng độ xúc tác 0.25%) Hiệu suất phản ứng (%) Bảng 3.24 Hiệu suất phản ứng pH 6.0, 60OC hàm lƣợng xúc tác 0.50% Hiệu suất thủy phân (%) 0.0821 235.71 25.89% 40.00 0.0996 285.71 32.78% 35.00 0.1013 290.57 33.45% 0.1120 321.14 37.66% 60oC 10 0.1245 356.86 42.59% 70oC 12 0.1307 374.57 45.03% 80oC 14 0.1342 384.57 46.41% 15.00 16 0.1398 400.57 48.61% 10.00 18 0.1425 408.29 49.67% 20 0.1487 426.00 52.12% 22 0.1509 432.29 52.98% 24 0.1624 465.14 57.51% 30.00 25.00 20.00 10 12 14 16 18 20 22 24 26 Thời gian phản ứng (giờ) Hình 3.13 Sự phụ thuộc hiệu suất vào thời gian phản ứng pH 8.0 hàm lƣợng xúc tác 0.25% Qua điều kiện khảo sát, chúng tơi nhận thấy phản ứng thủy phân với hàm lượng xúc tác 0.25% có hiệu suất cao pH 7.0 nhiệt độ 70oC 70OC Nhiệt độ pH 6.0 7.0 8.0 Hiệu suất (%) 34.52 37.51 37.24 3.12.2 Khảo sát phản ứng thủy phân hàm lƣợng xúc tác 0.50% so với chất theo thời gian Ở hàm lượng xúc tác 0.50%, phản ứng thực giá trị pH khác 6, 7, Tương ứng với giá trị pH, tiến hành khảo sát giá trị nhiệt độ LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM 59 60 Bảng 3.25 Hiệu suất phản ứng pH 6.0, 70OC hàm lƣợng xúc tác 0.50% Nhận xét: so với hàm lượng xúc tác 0.25%, hàm lượng xúc tác 0.50% hiệu suất phản ứng tương đối cao khoảng 16 phản ứng hiệu suất phản Mật độ quang Lượng 750nm (AU) protein (mg/g) Hiệu suất thủy phân (%) 0.0825 236.86 26.05% 0.0999 286.57 32.90% 0.1025 294.00 33.92% 0.1131 324.29 38.10% 10 0.1256 360.00 43.02% 12 0.1320 378.29 45.54% 14 0.1349 386.57 46.68% 16 0.1410 404.00 49.08% 18 0.1439 412.29 50.23% 20 0.1498 429.14 52.55% 22 0.1523 436.29 53.53% 24 0.1659 475.14 58.89% Bảng 3.26 Hiệu suất phản ứng pH 6.0, 80OC hàm lƣợng xúc tác 0.50% Thời gian thủy phân (giờ) Mật độ quang Lượng 750nm (AU) protein (mg/g) Hiệu suất thủy phân (%) ứng tăng rõ rệt, sau hiệu suất phản ứng dao động khoảng tương đối hẹp Ở pH 6.0, hiệu suất cao 70OC, nhiên khơng có chênh lệch nhiều hiệu suất phản ứng nhiệt độ khác (60 – 80OC) Sự phụ thuộc hiệu suất vào thời gian phản ứng (pH 6.0, Nồng độ xúc tác 0.50%) Hiệu suất phản ứng (%) Thời gian thủy phân (giờ) 90.00 80.00 70.00 60.00 60oC 50.00 70oC 40.00 80oC 30.00 20.00 10.00 10 12 14 16 18 20 22 24 26 Thời gian phản ứng (giờ) Hình 3.14 Sự phụ thuộc hiệu suất vào thời gian phản ứng pH 6.0 hàm lƣợng xúc tác 0.50% Hiệu suất thủy phân pH 7.0 trình bày bảng 3.27 – 3.29 Bảng 3.27 Hiệu suất phản ứng pH 7.0, 60OC hàm lƣợng xúc tác 0.50% Thời gian thủy phân (giờ) Mật độ quang 750nm (AU) Lượng protein (mg/g) Hiệu suất thủy phân (%) 0.0768 220.57 23.80% 0.0886 254.29 28.45% 0.0945 271.14 30.77% 0.0975 279.71 31.34% 0.1032 296.00 34.20% 0.0996 285.71 32.16% 10 0.1153 330.57 38.96% 0.1037 297.43 33.78% 12 0.1275 365.43 43.77% 0.1198 343.43 40.12% 10 0.1254 359.43 42.32% 12 0.1370 392.57 46.89% 14 0.1369 392.29 47.47% 16 0.1404 402.29 48.85% 14 0.1385 396.86 47.48% 18 0.1417 406.00 49.36% 16 0.1398 400.57 47.99% 20 0.1458 417.71 50.97% 18 0.1453 416.29 50.16% 52.75% 20 0.1479 423.71 51.18% 22 0.1518 434.86 52.72% 24 0.1644 470.86 57.68% 22 24 0.1503 0.1600 LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC 430.57 458.29 56.57% CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM 61 62 Nhận xét: So với pH 6.0, giá trị pH 7.0 hiệu suất phản ứng có tăng đơi Bảng 3.28 Hiệu suất phản ứng pH 7.0, 70OC hàm lƣợng xúc tác 0.50% Thời gian Mật độ quang Lượng thủy phân 750nm (AU) protein (giờ) (mg/g) Hiệu suất thủy phân (%) chút Hiệu suất cao 59.84% 70OC thấp 55.91% 80OC Trong khoảng từ đến 18 giờ, hiệu suất phản ứng tăng rõ rệt, đặc biệt tăng mạnh khoảng từ đến 14 giờ, ta nhận thấy điều qua hình 3.15 0.0987 283.14 31.81% 0.0999 286.57 32.28% 0.1045 299.71 34.09% 0.1200 344.00 40.19% 10 0.1213 347.71 40.71% 12 0.1387 397.43 47.56% 14 0.1389 398.00 47.64% 16 0.1402 401.71 48.15% 18 0.1477 423.14 51.10% 20 0.1498 429.14 51.93% 22 0.1537 440.29 53.46% 24 0.1699 486.57 59.84% O Bảng 3.29 Hiệu suất phản ứng pH 7.0, 80 C hàm lƣợng xúc tác 0.50% Thời gian Mật độ quang Lượng thủy phân 750nm (AU) protein (giờ) (mg/g) Hiệu suất thủy phân (%) 0.0886 254.29 27.83% 0.0902 258.86 28.46% 0.1011 290.00 32.75% Sự phụ thuộc hiệu suất vào thời gian phản ứng (pH 7.0, Nồng độ xúc tác 0.50%) Hiệu suất phản ứng (%) 90.00 80.00 70.00 60.00 60oC 50.00 70oC 40.00 80oC 30.00 20.00 10.00 10 12 14 16 18 20 22 24 26 Thời gian phản ứng (giờ) Hình 3.15 Sự phụ thuộc hiệu suất vào thời gian phản ứng pH 7.0 hàm lƣợng xúc tác 0.50% Hiệu suất thủy phân pH 8.0 trình bày bảng 3.30 – 3.32 Bảng 3.30 Hiệu suất phản ứng pH 8.0, 60OC hàm lƣợng xúc tác 0.50% Thời gian thủy phân (giờ) Mật độ quang Lượng 750nm (AU) protein (mg/g) Hiệu suất thủy phân (%) 0.0802 230.29 24.52% 0.0933 267.71 29.68% 0.1001 287.14 32.36% 0.1112 318.86 36.73% 0.1133 324.86 37.56% 10 0.1227 351.71 41.26% 12 0.1300 372.57 44.13% 10 0.1220 349.71 40.98% 14 0.1332 381.71 45.39% 12 0.1298 372.00 44.05% 16 0.1369 392.29 46.85% 14 0.1307 374.57 44.41% 18 0.1430 409.71 49.25% 16 0.1365 391.14 46.69% 20 0.1498 429.14 51.93% 18 0.1408 403.43 48.39% 52.13% 20 0.1454 416.57 50.20% 22 0.1500 429.71 52.01% 24 0.1599 458.00 55.91% 22 24 0.1503 0.1599 LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC 430.57 458.00 55.91% CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM 63 64 Sự biến thiên hiệu suất phản ứng pH 8.0 trình bày hình 3.16 Bảng 3.31 Hiệu suất phản ứng pH 8.0, 70OC hàm lƣợng xúc tác 0.50% Sự phụ thuộc hiệu suất vào thời gian phản ứng (pH 8.0, Nồng độ xúc tác 0.50%) Hiệu suất thủy phân (%) 0.0833 239.14 25.74% 0.0996 285.71 32.16% 0.1010 289.71 32.71% 0.1132 324.57 37.52% 10 0.1255 359.71 42.36% 12 0.1302 373.14 44.21% 14 0.1339 383.71 45.67% 16 0.1399 400.86 48.03% 18 0.1418 406.29 48.78% 20 0.1489 426.57 51.57% 22 0.1527 437.43 53.07% 24 0.1606 460.00 56.18% Bảng 3.32 Hiệu suất phản ứng pH 8.0, 80OC hàm lƣợng xúc tác 0.50% Hiệu suất phản ứng (%) Thời gian Mật độ quang Lượng thủy phân 750nm (AU) protein (giờ) (mg/g) 90.00 80.00 70.00 60.00 60oC 50.00 70oC 40.00 80oC 30.00 20.00 10.00 Hiệu suất thủy phân (%) 0.0820 235.43 25.23% 0.0976 280.00 31.37% 0.1005 288.29 32.52% 0.1110 318.29 36.65% 10 0.1207 346.00 40.47% 12 0.1299 372.29 44.09% 14 0.1323 379.14 45.04% 16 0.1355 388.29 46.30% 18 0.1400 401.14 48.07% 20 0.1413 404.86 48.58% 22 0.1478 423.43 51.14% 24 0.1539 440.86 53.54% LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM 10 12 14 16 18 20 22 24 26 Thời gian phản ứng (giờ) Hình 3.16 Sự phụ thuộc hiệu suất vào thời gian phản ứng pH 8.0 hàm lƣợng xúc tác 0.50% Qua điều kiện khảo sát, chúng tơi nhận thấy phản ứng thủy phân với hàm lượng xúc tác 0.50% có hiệu suất cao pH 7.0 nhiệt độ 70OC 70OC Nhiệt độ pH Thời gian Mật độ quang Lượng thủy phân 750nm (AU) protein (giờ) (mg/g) 6.0 7.0 8.0 Hiệu suất (%) 66.90 68.74 64.46 LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM 65 66 3.12.3 Khảo sát phản ứng thủy phân hàm lƣợng xúc tác 0.75% so với chất Ở hàm lượng xúc tác 0.75%, phản ứng thực giá trị pH khác 6, 7, Tương ứng với giá trị pH, tiến hành khảo sát giá trị nhiệt Bảng 3.34 Hiệu suất phản ứng pH 6.0, 70OC hàm lƣợng xúc tác 0.75% Thời gian thủy phân (giờ) Mật độ quang Lượng 750nm (AU) protein (mg/g) Hiệu suất thủy phân (%) 0.2051 293.57 32.13% 0.2099 300.43 33.07% 0.2358 337.37 38.16% 0.2432 347.94 39.62% phương pháp Lowry 10 0.2539 363.29 41.73% Tại pH 6.0, hiệu suất phản ứng nhiệt độ trình bày bảng 3.33 – 3.35 12 0.2723 389.57 45.36% 14 0.2879 411.86 48.43% 16 0.3063 438.14 52.05% 18 0.3139 449.00 53.55% 20 0.3263 466.77 56.00% 22 0.3575 511.26 62.13% 24 0.3888 556.00 68.29% độ 60OC, 70OC, 80OC Sau phản ứng, cân 0.1g dung dịch phản ứng định mức thành 100ml nước sơi để ngừng phản ứng thủy phân Rút 0.4ml dung dịch phản ứng pha lỗng để xác định hàm lượng protein hòa tan theo O Bảng 3.33 Hiệu suất phản ứng pH 6.0, 60 C hàm lƣợng xúc tác 0.75% Thời gian Mật độ quang Lượng thủy phân 750nm (AU) protein (giờ) (mg/g) Hiệu suất thủy phân (%) 0.2140 306.33 33.88% 0.2375 339.84 38.50% 0.2511 359.26 41.18% 0.2610 373.40 43.13% 10 0.2711 387.84 45.12% Bảng 3.35 Hiệu suất phản ứng pH 6.0, 80OC hàm lƣợng xúc tác 0.75% Thời gian thủy phân (giờ) Mật độ quang Lượng 750nm (AU) protein (mg/g) Hiệu suất thủy phân (%) 0.2083 298.13 32.75% 0.2316 331.43 37.34% 0.2481 355.00 40.59% 0.2589 370.43 42.72% 12 0.2800 400.57 46.87% 14 0.2800 400.57 46.87% 16 0.2960 423.36 50.01% 10 0.2937 420.14 49.57% 18 0.3239 463.29 55.51% 12 0.3063 438.16 52.05% 20 0.3463 495.34 59.93% 14 0.3149 450.43 53.74% 22 0.3535 505.54 61.34% 16 0.3249 464.74 55.72% 65.28% 18 0.3265 466.93 56.02% 20 0.3356 480.00 57.82% 22 0.3374 482.54 58.17% 24 0.3482 497.99 60.30% 24 0.3735 LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC 534.14 CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM 67 68 Nhận xét: hàm lượng xúc tác tăng lên từ 0.25 – 0.75% hiệu suất phản ứng tăng lên nhanh Ở hàm lượng xúc tác 0.25% hiệu suất cao 36.67% hàm lượng xúc tác 0.75% hiệu suất cao 69.69% Tại pH 6.0, hiệu suất cao thu 68.29% thấp 60.30% Thời gian thủy phân (giờ) Mật độ quang Lượng 750nm (AU) protein (mg/g) Hiệu suất thủy phân (%) 0.2231 319.26 35.67% 0.2532 362.21 41.59% 75 0.2604 372.61 43.02% 70 0.2973 425.23 50.27% 65 10 0.3062 438.06 52.04% 12 0.3084 441.14 52.46% 14 0.3128 447.43 53.33% 16 0.3223 461.01 55.20% 18 0.3379 483.34 58.28% 20 0.3488 498.86 60.42% 22 0.3658 523.14 63.76% 24 0.3790 542.00 66.36% tương ứng với nhiệt độ 70OC 80OC Hiệu suất phản ứng (%) Bảng 3.36 Hiệu suất phản ứng pH 7.0, 60OC hàm lƣợng xúc tác 0.75% 60 60oC 55 70oC 50 80oC 45 40 35 30 10 12 14 16 18 20 22 24 Thời gian (giờ) Hình 3.17 Sự phụ thuộc hiệu suất vào thời gian phản ứng pH 6.0 hàm lƣợng xúc tác 0.75% Tại pH 7.0, hiệu suất phản ứng nhiệt độ khác trình bày bảng 3.36 – 3.38 LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM Bảng 3.37 Hiệu suất phản ứng pH 7.0, 70OC hàm lƣợng xúc tác 0.75% Thời gian Mật độ quang Lượng thủy phân 750nm (AU) protein (giờ) (mg/g) Hiệu suất thủy phân (%) 0.2331 333.54 37.63% 0.2632 376.50 43.55% 0.2904 415.47 48.93% 0.3073 439.51 52.24% 10 0.3262 466.63 55.98% 12 0.3404 486.86 58.76% 14 0.3413 488.11 58.94% 16 0.3423 489.59 59.14% 18 0.3579 511.91 62.22% 20 0.3688 527.43 64.35% 22 0.3758 537.43 65.73% 24 0.3959 566.14 69.69% LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM 69 70 Bảng 3.38 Hiệu suất phản ứng pH 7.0, 80OC hàm lƣợng xúc tác 0.75% Thời gian Mật độ quang Lượng thủy phân 750nm (AU) protein (giờ) (mg/g) Hiệu suất thủy phân (%) 0.1983 283.84 30.78% 0.2016 288.57 31.44% 0.2141 306.43 33.90% 0.2389 341.86 38.78% 10 0.2497 357.29 40.91% 12 0.2563 366.73 42.21% 14 0.2649 379.00 43.90% 16 0.2969 424.74 50.20% 18 0.3065 438.36 52.08% 20 0.3156 451.43 53.88% 22 0.3438 491.71 59.43% 24 0.3519 503.29 61.03% Nhận xét: từ hình 3.18, hiệu suất cao 70OC với hiệu suất thu 69.69% Tại pH này, hiệu suất phản ứng nhiệt độ khác có chênh lệch rõ rệt Thời gian Mật độ quang Lượng thủy phân 750nm (AU) protein (giờ) (mg/g) Hiệu suất thủy phân (%) 0.1474 211.14 20.77% 0.1751 250.67 26.21% 0.2208 316.01 35.22% 0.2478 354.59 40.53% 10 0.2529 361.86 41.54% 12 0.2575 368.43 42.44% 14 0.2868 410.29 48.21% 16 0.2970 424.86 50.22% 18 0.3058 437.43 51.95% 20 0.3132 448.00 53.41% 22 0.3276 468.57 56.24% 24 0.3438 491.71 59.43% Bảng 3.40 Hiệu suất phản ứng pH 8.0, 70OC hàm lƣợng xúc tác 0.75% Thời gian thủy phân (giờ) 80 Hiệu suất phản ứng (%) Tại pH 8.0, kết trình bày bảng 3.39 – 3.41 Bảng 3.39 Hiệu suất phản ứng pH 8.0, 60OC hàm lƣợng xúc tác 0.75% Mật độ quang Lượng 750nm (AU) protein (mg/g) Hiệu suất thủy phân (%) 70 0.2125 304.19 33.59% 60 0.2233 319.59 35.71% 0.2257 323.00 36.18% 0.2294 328.29 36.91% 10 0.2368 338.86 38.37% 30 12 0.2411 345.00 39.21% 20 14 0.2505 358.43 41.06% 16 0.2570 367.71 42.34% 18 0.3056 437.11 51.91% 20 0.3073 439.60 52.25% 22 0.3587 513.00 62.37% 24 0.3723 532.43 65.04% 60oC 50 70oC 80oC 40 10 12 14 16 18 20 22 24 Thời gian phản ứng (giờ) Hình 3.18 Sự phụ thuộc hiệu suất vào thời gian phản ứng pH 7.0 hàm lƣợng xúc tác 0.75% LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM 71 72 Qua điều kiện khảo sát, chúng tơi nhận thấy phản ứng thủy phân với Bảng 3.41 Hiệu suất phản ứng pH 8.0, 80OC hàm lƣợng xúc tác 0.75% Thời gian Mật độ quang Lượng thủy phân 750nm (AU) protein (giờ) (mg/g) Hiệu suất thủy phân (%) hàm lượng xúc tác 0.75% có hiệu suất cao pH 7.0 nhiệt độ 70oC 70OC Nhiệt độ pH 6.0 7.0 8.0 0.2016 288.54 31.43% 0.2064 295.43 32.38% 0.2092 299.43 32.93% 0.2293 328.14 36.89% 10 0.2026 290.00 31.63% Hàm lượng xúc tác cuối mà chúng tơi tiến hành khảo sát 1.00%, 12 0.2017 288.71 31.46% phản ứng thực giá trị pH khác 6, 7, Tương ứng với 14 0.2458 351.76 40.14% giá trị pH, tiến hành khảo sát giá trị nhiệt độ 60OC, 70OC, 80OC Sau 16 0.2553 365.27 42.01% phản ứng, cân 0.1g dung dịch phản ứng định mức thành 100ml nước sơi để 18 0.2783 398.17 46.54% ngừng phản ứng thủy phân Rút 0.4ml dung dịch phản ứng pha lỗng để xác định 20 0.2826 404.29 47.38% hàm lượng protein hòa tan theo phương pháp Lowry 22 0.2987 427.29 50.55% 24 0.3230 462.00 55.34% Nhận xét: hiệu suất phản ứng pH 8.0 giảm nhiều so với pH 7.0 (khoảng 10%) Hiệu suất giảm nhiều 60OC 80OC, nhiên 70OC hiệu suất phản ứng Hiệu suất (%) 68.29 69.69 65.04 3.12.4 Khảo sát phản ứng thủy phân hàm lƣợng xúc tác 1.00% so với chất Tại pH 6.0, hiệu suất phản ứng nhiệt độ khác trình bày bảng 3.42 – 3.44 Bảng 3.42 Hiệu suất phản ứng pH 6.0, 60OC hàm lƣợng xúc tác 1.00% 60% Hiệu suất phản ứng (%) 70 60 50 60oC 40 70oC 80oC 30 20 10 10 12 14 16 18 20 22 24 Thời gian phản ứng (giờ) Hình 3.19 Sự phụ thuộc hiệu suất vào thời gian phản ứng pH 8.0 hàm lƣợng xúc tác 0.75% LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM 73 74 Bảng 3.44 Hiệu suất phản ứng pH 6.0, 80OC hàm lƣợng xúc tác 1.00% Thời gian Mật độ quang Lượng thủy phân 750nm (AU) protein (giờ) (mg/g) Hiệu suất thủy phân (%) Thời gian Mật độ quang Lượng thủy phân 750nm (AU) protein (giờ) (mg/g) Hiệu suất thủy phân (%) 0.2491 356.43 39.23% 0.2498 357.43 39.37% 0.1963 281.00 28.84% 40.77% 0.2011 287.86 29.78% 41.32% 0.2124 304.00 32.01% 46.26% 0.2262 323.71 34.72% 46.77% 10 0.2484 355.43 39.09% 0.2467 353.00 38.76% 10 12 0.2569 0.2597 0.2848 0.2874 367.57 371.57 407.43 411.14 14 0.3005 429.86 49.35% 12 16 0.3233 462.43 53.84% 14 0.2612 373.71 41.61% 18 0.3458 494.57 58.27% 16 0.2821 403.57 45.73% 20 0.3512 502.29 59.33% 18 0.2822 403.71 45.75% 22 0.3515 502.71 59.39% 20 0.3476 497.14 58.63% 24 0.3657 523.00 62.19% 22 0.3502 500.86 59.14% 24 0.3511 502.14 59.31% O Bảng 3.43 Hiệu suất phản ứng pH 6.0, 70 C hàm lƣợng xúc tác 1.00% Nhận xét: với hàm lượng xúc tác 1.00%, hiệu suất phản ứng có chuyển Mật độ quang Lượng 750nm (AU) protein (mg/g) Hiệu suất thủy phân (%) 0.3023 432.43 49.71% 0.3091 442.14 51.05% 0.3220 460.57 53.59% 0.3252 465.14 54.22% 10 0.3302 472.29 55.20% 12 0.3307 473.00 55.30% 14 0.3379 483.29 56.72% 16 0.3397 485.86 57.07% 18 0.3315 474.14 55.46% 20 0.3380 483.43 56.74% 22 0.4008 573.14 69.10% 24 0.4125 589.86 71.40% hàm lượng xúc tác 0.25% Sự phụ thuộc hiệu suất vào thời gian phản ứng (pH 8.0, Nồng độ xúc tác 1.00%) Hiệu suất phản ứng (%) Thời gian thủy phân (giờ) biến rõ Hiệu suất cao thu pH 6.0 71.40% tăng 34.73% so với 90.00 80.00 70.00 60.00 60oC 50.00 70oC 40.00 80oC 30.00 20.00 10.00 10 12 14 16 18 20 22 24 26 Thời gian phản ứng (giờ) Hình 3.20 Sự phụ thuộc hiệu suất vào thời gian phản ứng pH 6.0 hàm lƣợng xúc tác 1.00% LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM 75 76 Tại pH 7.0, hiệu suất phản ứng nhiệt độ khác trình bày bảng 3.45 – 3.47 (phụ lục 21 – 23) Bảng 3.45 Hiệu suất phản ứng pH 7.0, 60OC hàm lƣợng xúc tác 1.00% Mật độ quang 750nm (AU) Thời gian Mật độ quang thủy phân 750nm (AU) (giờ) Lượng protein (mg/g) Hiệu suất thủy phân (%) Lượng protein (mg/g) Hiệu suất thủy phân (%) 0.2918 417.36 47.63% 0.2999 429.00 49.23% 0.3229 461.91 53.77% 0.3256 465.70 54.29% 10 0.3324 475.39 55.63% 12 0.3355 479.80 56.24% 14 0.3395 485.56 57.03% 16 0.3522 503.76 59.54% 18 0.3687 527.26 62.78% 20 0.3766 538.53 64.33% 22 0.3879 554.76 66.57% Nhận xét: so với pH 6.0 hiệu suất cao điều kiện 70OC đạt 71.40% 24 0.3923 560.96 67.42% pH 7.0 hiệu suất phản ứng tăng lên nhiều đạt giá trị 80.54% Đây O Bảng 3.46 Hiệu suất phản ứng pH 7.0, 70 C hàm lƣợng xúc tác 1.00% Thời gian Mật độ quang thủy phân 750nm (AU) (giờ) Lượng protein (mg/g) Hiệu suất thủy phân (%) 0.1589 227.53 21.47% 0.1732 247.94 24.28% 0.1813 259.51 25.88% 0.1820 260.54 26.02% 10 0.1992 285.13 29.41% 12 0.2039 291.81 30.33% 14 0.2079 297.56 31.12% 16 0.2093 299.60 31.40% 18 0.2242 320.90 34.34% 20 0.2381 340.70 37.06% 22 0.2453 351.00 38.48% 24 0.2642 378.00 42.21% hiệu suất cao thu thực phản ứng thủy phân protein bánh dầu đậu phộng loại béo với xúc tác enzyme papain có nhựa đu đủ đơng khơ Từ đồ thị hình 3.20 thấy nhiệt độ 80OC, hiệu suất phản ứng thấp hẳn so với hai nhiệt độ lại 0.2901 415.04 47.31% 0.2974 425.43 48.74% 0.3023 432.37 49.70% 0.3091 442.19 51.05% 10 0.3220 460.63 53.59% 12 0.3252 465.14 54.22% 14 0.3302 472.33 55.21% 16 0.3307 472.93 55.29% 18 0.3315 474.13 55.45% 20 0.3379 483.33 56.72% 22 0.3397 485.91 57.08% 24 0.4589 656.14 80.54% LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM Sự phụ thuộc hiệu suất vào thời gian phản ứng (pH 7.0, Nồng độ xúc tác 1.00%) Hiệu suất phản ứng (%) Thời gian thủy phân (giờ) Bảng 3.47 Hiệu suất phản ứng pH 7.0, 80OC hàm lƣợng xúc tác 1.00% 90.00 80.00 70.00 60.00 60oC 50.00 70oC 40.00 80oC 30.00 20.00 10.00 10 12 14 16 18 20 22 24 26 Thời gian phản ứng (giờ) Hình 3.21 Sự phụ thuộc hiệu suất vào thời gian phản ứng pH 7.0 hàm lƣợng xúc tác 1.00% LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM 77 78 Tại pH 7.0, hiệu suất phản ứng nhiệt độ khác trình bày Bảng 3.50 Hiệu suất phản ứng pH 8.0, 80OC hàm lƣợng xúc tác 1.00% bảng 3.48 – 3.50 Bảng 3.48 Hiệu suất phản ứng pH 8.0, 60OC hàm lƣợng xúc tác 1.00% Thời gian thủy phân (giờ) Mật độ quang 750nm (AU) Lượng protein (mg/g) Hiệu suất thủy phân (%) 0.1590 227.71 21.49% 0.1732 247.94 24.28% 0.1813 259.63 25.89% Thời gian thủy phân (giờ) Mật độ quang 750nm (AU) Lượng protein (mg/g) Hiệu suất thủy phân (%) 0.1963 281.00 28.84% 0.2032 290.86 30.20% 0.2146 307.14 32.44% 0.2258 323.14 34.65% 0.1822 260.86 26.06% 10 0.1929 276.14 28.17% 10 0.2476 354.29 38.94% 12 0.2041 292.14 30.37% 12 0.2498 357.43 39.37% 14 0.2087 298.71 31.28% 14 0.2574 368.29 40.87% 16 0.2099 300.43 31.51% 18 0.2240 320.57 34.29% 16 0.2645 378.43 42.26% 20 0.2380 340.57 37.05% 18 0.2800 400.57 45.32% 22 0.2453 351.00 38.48% 20 0.3494 499.71 58.98% 24 0.2789 399.00 45.10% 22 0.3523 503.86 59.55% 24 0.3577 511.57 60.61% O Thời gian thủy phân (giờ) Mật độ quang 750nm (AU) Lượng protein (mg/g) Hiệu suất thủy phân (%) 0.3045 435.57 50.14% 0.3091 442.14 51.05% 0.3226 461.43 53.70% 0.3229 461.86 53.76% 10 0.3309 473.29 55.34% 12 0.3312 473.71 55.40% 14 0.3365 481.29 56.44% 16 0.3397 485.86 57.07% 18 0.3329 476.14 55.73% 20 0.3380 483.43 56.74% 22 0.3569 510.43 60.46% 24 0.4009 573.29 69.12% LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM Hiệu suất phản ứng Bảng 3.49 Hiệu suất phản ứng pH 8.0, 70 C hàm lƣợng xúc tác 1.00% Sự phụ thuộc hiệu suất vào thời gian phản ứng (pH 8.0, nồng độ xúc tác 1.00% ) 90.00 80.00 70.00 60.00 50.00 40.00 30.00 20.00 10.00 10 12 14 16 18 20 22 24 Thời gian phản ứng 60oC 70oC 80oC Hình 3.22 Sự phụ thuộc hiệu suất vào thời gian phản ứng pH 8.0 hàm lƣợng xúc tác 1.00% LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM 79 80 Qua điều kiện khảo sát, chúng tơi nhận thấy phản ứng thủy phân với KẾT LUẬN hàm lượng xúc tác 1.00% có hiệu suất cao pH 7.0 nhiệt độ 70OC pH Từ kết thu chúng tơi có kết luận sau: 70oC Nhiệt độ 6.0 7.0 Từ 100ml dịch nhựa đu đủ, sau đơng khơ chân khơng thu 8.0 gam nhựa khơ Hiệu suất (%) 71.4 80.54 69.12 Ngồi chúng tơi tiến hành chạy điện di gel polyacrylamid với hàm lượng xúc tác khác 0.25%, 0.75% 1.00% điều kiện thực phản ứng tối ưu xúc tác Kết thu hình 3.23 Hoạt tính protease enzyme papain nhựa đu đủ đơng khơ chân xác định theo phương pháp Anson cải tiến 70.35UI/ml Nồng độ enzyme ảnh hưởng quan trọng đến hiệu suất phản ứng thủy phân Ảnh hưởng giới hạn mức độ tương quan trọng lượng nồng độ enzyme chất Khảo sát biến thiên hàm lượng đạm formol đạm amoniac theo thời gian phản ứng, chúng tơi nhận thấy hàm lượng đạm amoniac có biến đổi thấp đồng thời hàm lượng đạm formol sau 24 phản ứng khơng có thay đổi Điều chứng tỏ phản ứng thủy phân kết thúc Điều kiện thực phản ứng thủy phân tốt pH 7.0, 70oC hàm lượng xúc tác 1.00% Hiệu suất phản ứng thu 80.54% Sau 24 thủy phân, hầu hết protein có trọng lượng phân tử cao bị thủy phân thành phần dịch thủy phân thu nhận ngồi acid amin polypeptide có trọng lượng phân tử khoảng 14,4 – 25,0 kDa Hướng phát triển đề tài Đề tài đóng vai trò quan trọng q trình nghiên cứu chế biến nước chấm có hàm lượng đạm dinh dưỡng cao khơng tạo thành sản phẩm phụ ảnh Hình 3.23 Kết điện di dung dịch sau phản ứng hàm hưởng đến sức khỏe người Chính vậy, hướng phát triển chúng tơi tiến hành phân tích hàm lượng acid amin chuyển hóa có chúng lƣợng xúc tác khác để đảm bảo sản xuất nước chấm có hàm lượng dinh dưỡng cao Chú thích: Ngồi cần tiếp tục khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến biến thiên hàm – Thang protein chuẩn – Dung dịch sau phản ứng với hàm lượng xúc tác 0.25% - Dung dịch sau phản ứng với hàm lượng xúc tác 0.50% lượng axit amin đạm amoniac để từ làm tiền đề cho việc nghiên cứu sản xuất nước chấm từ phế liệu cơng nghiệp dầu thực vật - Dung dịch sau phản ứng với hàm lượng xúc tác 1.00% LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM 81 82 TÀI LIỆU THAM KHẢO [11] Trần Đình Thanh, Hồng Thanh Hương, Nguyễn Văn Việt, Trần Đình Toại (2001), Tạp chí hóa học cơng nghiệp hóa chất, 72 (7), Trang 11 – 18 [12] Đồng Thị Thanh Thu (2006), Sinh hóa bản, Tủ sách trường Đại Học Tiếng Việt: Khoa Học Tự Nhiên, Tp.HCM, Trang 43 – 61 [1] Lâm Thị Kim Châu, Văn Đức Chín, Ngơ Đại Nghiệp (2004), Thực tập lớn sinh hóa, Nxb Đại Học Quốc Gia, Tp.HCM, Trang 25 – 69 [2] Phạm Thị Trân Châu, Phan Tuấn Nghĩa (2006), Cơng nghệ sinh học (tập [13] Trần Đình Toại, Trần Trung Hiếu (2003), “Động học ức chế phản ứng thủy phân protein dự trữ, xúc tác papain từ nhựa đu đủ xanh”, Tạp chí hóa học, 41(1), Trang 14 – 18 3) – Enzyme ứng dụng, Nxb Giáo dục, Hà Nội, Trang – 28 [3] Nguyễn Thị Chung (1991), “Nghiên cứu điều kiện tối ưu sản xuất papain thơ papain thương phẩm”, Tạp chí dược học, Số 4, Trang 23, 30 [14] Trần Đình Toại, Đỗ Ngọc Lanh, Nguyễn Văn Thiết, Nguyễn Thu Hồi (1994), “Nghiên cứu khả thủy phân số loại protein papain”, Tạp chí hóa học, 32 (4), Trang 33 – 36 [4] Phạm Thị Ánh Hồng (2003), Kỹ thuật sinh hóa, Nxb Đại Học Quốc Gia, Tp.HCM, Trang 27 – 116 [15] Trần Đình Toại, Nguyễn Thu Hồi, Đỗ Ngọc Lanh, Trần Đình Thanh (1996), “ Mơ hình phản ứng thủy phân protein dự trữ xúc tác papain”, [5] Dương Thị Hương Giang, Nguyễn Thị Xn Dung, Phan Thị Bích Trâm (2006), “Nghiên cứu sử dụng enzyme papain thơ từ nhựa đu đủ để thủy phân Tạp chí hóa học, 34 (4), Trang 19 – 23 Tiếng Anh: protein bánh dầu đậu nành”, Tạp chí Nghiên cứu Khoa học, Số 5, Trang 115 – 122 [16] M Azarkan, A.E Moussaoui, D Wuytswinkel, G Dehon, Y Looze (2003), “Fractionation and purification of the enzymes stored in the latex of Carica [6] Nguyễn Đình Hun, Hà Ái Quốc, Đồng Thị Thanh Thu (2006), Sinh papaya”, Journal of Chromatography B, 790, pp 229-238 hóa - phần II, Tủ sách trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Tp.HCM, Trang 29 – 32 [17] M Azarkan, R Wintjens, Y Looze, D.B Volant (2004), “Detection of three wound – induced proteins in papaya latex”, Phytochemistry, 65, pp 525 – [7] Đỗ Tất Lợi (1986), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nxb Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, Trang 372-53 534 [18] D.E Burke, S.D Lewis, J.A Shafer (1974), “A two-step procedure for [8] Nguyễn Đức Lượng, Cao Cường, Nguyễn Ánh Tuyết, Lê Thị Thủy Tiên, Tạ Thu Hằng, Huỳnh Ngọc Oanh, Nguyễn Thúy Hương, Phan Thị Huyền (2004), Cơng nghệ enzyme, Nxb Đại Học Quốc Gia, Tp.HCM, Trang – 230 [9] Lê Thị Phú, Nguyễn Thị Thu Sang (2006), “Khảo sát tinh enzyme chymopapain nhựa trái đu đủ Việt Nam”, Tạp chí phát triển khoa học cơng nghệ, (5), Trang 59 – 62 purification of papain from extract of papaya latex”, Archives of biochemistry and biophysics, 164, pp 30 – 36 [19] Tim Bugg (2004), Introduction to enzyme and coenzyme chemistry, Blackwell, UK, pp 100 – 103 [20] S Damrongsakkul, K Ratanathammapan, K Komolpis, W Tanthapanichakoon (2008), “Enzymatic hydrolysis of rawhide using papain and [10] Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp lập hợp chất hữu cơ, neutrase”, Journal of Industrial and Engineering Chemistry, 14, pp 202 – 206 Nxb Đại Học Quốc Gia, Tp.HCM, Trang 323 – 354 LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM 83 84 [21] M Dekeyser, S.D Smelt, J Demeester, A Lauwers (1994), [31] C.E Salas, M.T.R Gomes, M Hernandez, M.T.P Lopes (2008), “Plant “Fractionation and purification of the thiol proteinases from papaya latex”, Journal cysteine proteinases: Evaluation of the pharmacological activity”, Phytochemistry, of Chromatography B, 656, pp 203-208 69, pp 2263 – 2269 [22] Hans-Hartwig Otto, T Schirmeister (1997), “Cysteine proteases and their inhibitors”, Chemical Reviews, 97(1), pp 133 – 172 [23] Martin J Harrison, Neil A Burton, and Ian H Hillier (1997), “Catalytic Mechanism of the Enzyme Papain: Predictions with a Hybrid Quantum Mechanical/Molecular Mechanical Potential”, J.Am.Chem.Soc, 119 (50), pp 12285 – 12291 [32] H.A.Sathish, P.R Kumar, V Prakash (2007), “Mechanism of solvent induced thermal stabilization of papain”, International Journal of Biological Macromolecules, 41, pp 383 – 390 [33] M.P.C Silvestre (1997), “Review of methods for the analysis of protein hydrolysates”, Food Chemistry, Vol 60, No 2, pp 263 – 271 [34] Robert Rastall (2007), Novel enzyme technology for food applications, [24] R Monti, C.A Basilio, H.C Trevisan, J Contiero (2000), “Purification of papain from fresh latex of Carica papaya”, Brazilian Archives of Biology and Technology, Vol.43, No.5, pp 501 – 507 CRC press, USA, pp 61-62 [35] S Zucker, D.J Buttle, M.J.H Nicklin, A.J Barret (1985), “The proteolytic activities of chymopapain, papain, and papaya proteinase III”, [25] A.D Neklyudov, A.N Ivankin, A.V Berdutina (2000), “Properties and uses of protein hydrolysates”, Applied Biochemistry and Microbiology, Vol.36, No.5, pp 452 – 459 Biochimica et Biophysica Acta, 828, pp 196 – 204 Trang web: [36]http://www.bio.davidson.edu/people/jowilliamson/Techniques/Protocolw [26] S Nitsawang, R Hatti-Kaul, P Kanasawud (2006), “Purification of papain from Carica papaya latex: aqueous two-phase extraction versus two-step salt precipitation”, Enzyme and Microbial Technology, 39, pp 1103 – 1107 [27] T Miyazawa (1999), “Enzymatic resolution of amino acids via ester hydrolysis”, Amino acids, 16, pp 191 – 213 eek5.html [37] http://www.cesti.gov.vn/right/stinfo/content_0/nam_2001/thg9-01/sp- dv/Document.2004-07-29.3451 [38] http://chemistry.umeche.maine.edu/CHY431/Peptidase10.html [39] http://www.cimsi.org.vn/tapchi/DUOChoc/Nam2000/bai7-5-2000.htm [28] R.A Mckee, H Smith (1986), “Purification of proteinases from Carica papaya”, Phytochemistry, Vol.25, No.10, pp 2283 – 2287 [29] J Polaina, A.P MacCabe (2007), Industrial Enzymes structure, function and application, Spinger, Spain, pp 174 – 176, 187 – 202 [30] S pitpreecha, S Damrongsakkul (2006), “Hydrolysis of raw hide using proteolytic enzyme extracted from papaya latex”, Korean J Chem Eng, Vol.23, No.6, pp 972 – 976 [40] www.ctu.edu.vn/institutes/biotech/19.pdf [41]http://www.dostbinhdinh.org.vn/MagazineNewsPage.asp?TinTS_ID=23 0&TS_ID=13 [42] www.elearning.hueuni.edu.vn/file.php/71/pdf/c5.pdf [43] http://en.wikipedia.org/wiki/Cysteine_protease [44] http://irfanchemist.wordpress.com/2009/04/19/purification-of-protein/ [45]http://www.vietlinh.com.vn/langviet/langrau/rauqualamthuoc/lt_d udu_thainghen.html [46]http://www.shantidatta.com/papain_uses.htm LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM [...]... tác enzyme xảy ra ở những điều kiện ít khắc nghiệt hơn Phản ứng thủy phân bằng enzyme có biệt tính chọn lọc lập thể cao 1.3.5.2 Nhƣợc điểm: Thời gian thủy phân với xúc tác enzyme thường kéo dài hơn so với thủy phân với xúc tác acid Dịch sau thủy phân thường khó lọc 1.4 ỨNG DỤNG ENZYME PAPAIN LÀM XÚC TÁC CHO PHẢN ỨNG THỦY PHÂN PROTEIN TRONG BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG Trong luận văn này, chúng tôi điều chế enzyme... có thể là do khi ta tăng nhiệt độ thì các protein trong nhựa khô THỜI GIAN TRONG PHẢN ỨNG THỦY PHÂN Tiến hành phản ứng thủy phân protein trong bánh dầu đậu phộng ở điều kiện nhiệt độ phản ứng là 70OC và pH của phản ứng là 7.0 với các hàm lượng xúc tác khác nhau Sau mỗi 2 giờ phản ứng, cân 10ml dung dịch thủy giải từ bình phản ứng, thêm nước sôi để ngừng phản ứng, định mức thành 100ml dung dịch đem lọc... Tương ứng với mỗi giá trị pH, tiến hành khảo sát 3 giá trị nhiệt độ là chứng tỏ phản ứng đã kết thúc Do đó chúng tôi đã ngưng tất cả các phản ứng khảo 60OC, 70OC, 80OC Sau mỗi 2 giờ phản ứng, cân 0.1g dung dịch phản ứng định mức sát sau 24 giờ thành 100ml bằng nước sôi để ngừng phản ứng thủy phân Rút 0.4ml dung dịch 3.12 KHẢO SÁT PHẢN ỨNG THỦY PHÂN BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG VỚI phản ứng đã pha loãng để xác... sau phản ứng so với hàm lượng protein ban đầu được xác định thông qua hàm lượng nitơ tổng Hiệu suất gần đúng của phản ứng thủy phân H(%) được tính theo công thức như sau: được đem sấy khô ta được bánh dầu đậu phộng đã loại béo H 2.2.8.2 Phƣơng pháp thực hiện phản ứng[ 5, 30, 31, 37] Phản ứng thủy phân được thực hiện tại tỉ lệ của bánh dầu đậu phộng với dung dịch đệm phosphate là 1:10 Cân 5g bánh dầu đậu. .. tính enzyme papain 2 Khảo sát phản ứng thủy phân bánh dầu đậu phộng  Xác định hàm lượng đạm formol và đạm amoniac theo thời gian phản 1.3.5.1 Ƣu điểm: ứng Do enzyme hydrolase có tính đặc hiệu cao nên ít hoặc hầu như không tạo thành sản phẩm phụ Dịch thủy phân thu được có độ thu n khiết cao  Khảo sát sự thay đổi hàm lượng xúc tác, pH và nhiệt độ ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng thủy phân Sử dụng enzyme... tác phản ứng có thể định hướng được phản ứng xảy ra và sản phẩm tạo thành Có thể điều chỉnh được phản ứng nhằm tạo ra sản phẩm mong muốn Hiệu suất thủy phân của enzyme khá cao, chỉ cần một lượng nhỏ enzyme cũng có thể thủy phân được một lượng rất lớn cơ chất Trong phản ứng xúc tác bởi enzyme thì yêu cầu về độ thu n khiết của cơ chất không cao Không như một số phản ứng hóa học khác, phản ứng thủy phân. .. lượng protein hòa tan theo phương pháp XÚC TÁC PAPAIN THÔ Lowry Hiệu suất gần đúng của phản ứng thủy phân H(%) được tính theo công thức Qua tham khảo các tài liệu, chúng tôi tiến hành phản ứng thủy phân bánh dầu như sau: đậu phộng sau khi đã loại béo với tỉ lệ bánh dầu đậu phộng và đệm phosphate là H 1:10 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, pH và nồng độ của xúc tác đến phản ứng G *100 P Trong đó: thủy phân. .. ĐẬU PHỘNG Trong luận văn này, chúng tôi điều chế enzyme papain để thủy phân protein trong bánh dầu đậu phộng với các nội dung sau: 1 Thu nhận enzyme papain từ nhựa trái đu đủ  Khảo sát các điều kiện thu nhận enzyme papain LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM 17 18 Bánh dầu đậu phộng lấy mẫu tại chợ Lái Thiêu 2.1.2 Thiết bị Chương... lượng và hoạt tính của enzyme papain sau mỗi giai đoạn tinh chế Việc sử dụng enzyme làm xúc tác có nhược điểm là thủy phân không triệt để, sau thủy phân còn khoảng 20% nitơ tổng số vẫn không tan, do đó người ta thường phối hợp thủy phân bằng hóa chất để nâng cao hiệu suất thủy phân 1.3.5 Ƣu và nhƣợc điểm của phản ứng thủy phân:  Khảo sát sự biến đổi lượng và hoạt tính enzyme papain theo thời gian ... thời gian Hàm lượng protein trong đậu phộng (bao gồm cả protein tan và không tan) được xác định thông qua hàm lượng nitơ tổng xác định bằng phương pháp Kjeldalh H: hiệu suất gần đúng của phản ứng thủy phân (%) G: hàm lượng protein tan của dung dịch sau thủy phân xác định theo phương pháp Lowry Kết quả thu được như sau: P: hàm lượng protein ban đầu (tan và không tan) trong bánh dầu đậu phộng V = 17.5 (ml)