Tổng quan độc tố Mycotoxin thực phẩm GVHD: KS Huỳnh Văn Thành Chương 1: GIỚI THIỆU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ Lương thực, thực phẩm, đặc biệt nông sản thóc, gạo, ngô, khoai, sắn, đậu, đỗ lạc nguồn lượng nuôi sống loài người Vì thế, việc nghiên cứu để nâng cao chất lượng nông sản vấn đề tổ chức quốc tế quan khoa học lương thực thực phẩm giới đặc biệt quan tâm Việc nâng cao chất lượng nông sản bao gồm kĩ thuật bảo quản gìn giữ giá trị dinh dưỡng, ngăn chặn chất độc hại nhiễm nông sản đồng thời chế biến nông sản thành thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao phần cần thiết ngành nông nghiệp nước ta Nước ta nước nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm, điều kiện thuận lợi cho nấm mốc phát triển Do hoạt động mạnh mẽ vi sinh vật có hại gây tổn thất lớn cho nông sản giai đoạn sau thu hoạch, tổn thất gây nên nấm mốc chiếm phần đáng kể Ngoài việc gây tổn thất lượng cho nông sản nấm mốc sinh độc tố đặc biệt nguy hiểm với sức khoẻ người động vật Nấm mốc phát triển lương thực sử dụng chất dinh dưỡng hạt : protein, carbohydate, lipid vitamin, mà phần lớn loại độc tố nấm mốc sản sinh gây tác hại lớn cho người động vật tiêu thụ Những độc tố nấm mốc sinh phần lớn gây ung thư động vật người Chính thế, việc tìm hiểu đánh giá tác hại loại độc tố đóng vai trò quan trọng việc phòng chóng độc tố nấm mốc Với tầm quan trọng ý nghĩa thực tiễn nêu chấp nhận Khoa Môi Trường Công Nghệ Sinh Học, thực đề tài “Tổng quan độc tố Mycotoxin thực phẩm.” 1.2 MỤC ĐÍCH Tìm hiểu loại độc tố nấm mốc diện nông sản thóc, gạo, ngô, khoai, sắn, đậu đỗ… Tìm hiểu phương pháp phát độc tố mycotoxin thực phẩm SVTH: Nguyễn Văn Phước Lớp 07CSH Tổng quan độc tố Mycotoxin thực phẩm GVHD: KS Huỳnh Văn Thành 1.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Tìm hiểu số loại vi khuẩn gây bệnh thực phẩm gây ảnh hưởng đến sức khoẻ người biện pháp phòng ngừa ngăn chặn xâm nhập chúng vào thực phẩm Tìm hiểu số loại mycotoxin điển hình như: Aflatoxin, Fumonisin, Ochratoxin, Patulin biện pháp kiểm soát mycotoxin SVTH: Nguyễn Văn Phước Lớp 07CSH Tổng quan độc tố Mycotoxin thực phẩm GVHD: KS Huỳnh Văn Thành Chương 2: TỔNG QUAN VỀ ĐỘC TỐ MYCOTOXIN TRONG THỰC PHẨM 2.1 TỔNG QUAN VỀ ĐỘC TỐ VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM 2.1.1 Độc tố Staphylococcus aureus 2.1.1.1 Đặc điểm vi khuẩn Tụ cầu khuẩn (Staphylococcus) có hình cầu, đường kính khoảng từ 0,8 – 1,5 µm, Gram dương, không di động, không sinh nha bào, số chủng có giáp mô, xếp thứ tự định, thường tụ lại thành đám Vi khuẩn Staphylococcus aureus có mặt khắp nơi không khí, nước, niêm mạc mũi, họng, bàn tay Tốc độ phát triển khả sinh độc tố S aureus phụ thuộc vào điều kiện môi trường, nhiệt độ độ ẩm Đây loại vi khuẩn kỵ khí tuỳ nghi, chịu nồng độ muối đường cao Khi có cạnh tranh vi khuẩn khác tụ cầu khuẩn phát triển mà không sinh độc tố Còn môi trường cạnh tranh yếu thức ăn nấu chín kỹ tụ cầu khuẩn lại phát triển sinh độc tố mạnh Vi khuẩn S aureus bị tiêu diệt 80 – 850C sau 20 – 25 phút, độc tố tụ cầu khuẩn bền với nhiệt độ, enzyme phân giải protein chịu môi trường acid Để phá huỷ độc tố phải đun sôi 2h Hình 2.1: Vi khuẩn Staphylococcus aureus 2.1.1.2 Độc tố SVTH: Nguyễn Văn Phước Lớp 07CSH Tổng quan độc tố Mycotoxin thực phẩm GVHD: KS Huỳnh Văn Thành Trên lâm sàng việc phân biệt chủng tụ cầu có khả gây bệnh không gây bệnh thường dựa vào diện enzyme Coagulase Enzyme gắn với prothrombin huyết tương hoạt hóa trình sinh fibrin từ tiền chất fibrinogen Enzyme với yếu tố kết cụm (clumping factor), enzyme vách vi khuẩn, giúp tụ cầu vàng tạo kết tủa fibrin bề mặt Tính chất yếu tố sinh bệnh quan trọng yếu tố đóng vai trò quan trọng chẩn đoán Ngoài coagulase yếu tố kết cụm, tụ cầu sản xuất số độc tố quan trọng góp phần tạo nên độc lực mạnh mẽ chủng vi khuẩn a) Exfoliative toxin Là độc tố phá hủy lớp thượng bì Độc tố gây tổn thương da tạo bọng nước Ví dụ điển hình hội chứng Lyell tụ cầu  Cơ chế tác dụng sau: - ET gây phân ly bên lớp biểu bì lớp tế bào sống chế làm da phồng lên làm dần lớp biểu bì làm da nước tiếp tục nhiễm trùng - Những độc tố có khả esterase protease công prôtêin có chức trì nguyên vẹn tế bào biểu bì - Bệnh thường bắt đầu với nhiễm trùng da vị trí xác định sau vi khuẩn bắt đầu sinh sản độc tố ảnh hưởng đến da toàn thể - Trẻ phát sốt, phát ban phồng da Phát ban miệng lan rộng đến bụng, tay, chân Khi vết phồng bị bể phát ban kết thúc Lớp da bị tróc bề mặt trở nên đỏ, đau giống vết bỏng b) Enterotoxin Enterotoxine (A, B, C, D, E) bền với nhiệt Các độc tố ruột đóng vai trò quan trọng ngộ độc thực phẩm  Cấu trúc Là chuỗi protein đơn có trọng lượng phân tử 25.000 – 29.000 Da, chuỗi có vị trí kháng nguyên chuyên biệt SVTH: Nguyễn Văn Phước Lớp 07CSH Tổng quan độc tố Mycotoxin thực phẩm GVHD: KS Huỳnh Văn Thành Đặc điểm có vòng cystein làm ổn định cấu trúc phân tử kháng phân giải protein Có chuỗi aa, nhiều aspartic, glutamic, lysin, tyrosine  Tính chất SE protein đơn giản, hút ẩm, dễ tan nước nước muối, protein bản, độ đẳng điện pI 7-8,6, trừ SEG SEH có độ đẳng điện pI 5,6 5,7 Độ ẩm cao 277 nm, cao so với protein thông thường Dù có mức độ tương đồng SE, có khác trình tự amino acid làm cho độc tố có vị trí kháng nguyên khác (Merlin S Bergdoll, 2000) SE giàu lysine, acid aspartic, acid glutamid tyrosine Hầu hết có vòng cystine tạo cấu trúc thích hợp liên quan đến hoạt tính gây nôn Chúng có tính ổn định cao, kháng với hầu hết enzyme phân hủy protein chúng giữ hoạt tính ống tiêu hóa sau ăn vào bụng Chúng kháng với chymotrypsine, rennin papain (Yves Le Loir ctv, 2003) Đặc biệt, tính bền nhiệt tính chất quan trọng SE lĩnh vực an toàn thực phẩm Chúng không bị phân hủy 100oC 30 phút (Trần Linh Thước, 2002), chí 121oC 28 phút SE giữ đươc hoạt tính sinh học (khi thí nghiệm mèo) (Naomi Balaban Avraham Rasooly, 2000), tính kháng nhiệt SE thực phẩm cao so với môi trường nuôi cấy (Yves Le Loir ctv, 2003)  Hoạt tính SE  Hoạt tính siêu kháng nguyên Hoạt tính siêu kháng nguyên tác động trực tiếp SE với thụ thể kháng nguyên tế bào T phức hợp hòa màng tế bào nhận diện kháng nguyên (Yves Le Loir ctv, 2003) Sự nhận diện kháng nguyên bước đáp ứng miễn dịch tế bào vấn đề then chốt định mức độ chuyên biệt đáp ứng miễn dịch Một kháng nguyên thông thường nhận diện thụ thể tế bào T cách hình SVTH: Nguyễn Văn Phước Lớp 07CSH Tổng quan độc tố Mycotoxin thực phẩm GVHD: KS Huỳnh Văn Thành thành peptide gắn kết với phức hợp hòa màng MHC (Majon Histocompatibility Complex) lớp I II Chỉ vài tế bào T nhận diện kháng nguyên chuyên biệt phức hợp hòa màng tế bào nhận diện kháng nguyên (Yves Le Loir ctv, 2003) Trong đó, độc tố siêu kháng nguyên tác động trực tiếp lên nhiều tế bào T cách nhận diện chuỗi Vβ chuyên biệt thụ thể kháng nguyên tế bào T Các độc tố liên kết chéo với thụ thể kháng nguyên tế bào T phức hợp tương đồng lớp tế bào nhận diện kháng nguyên Chính liên kết chéo dẫn đến việc hoạt hóa không chuyên biệt làm tăng nhanh lượng tế bào T lượng interleukin khổng lồ yếu tố liên quan đến chế gây độc SE (hình 2.2) Do SE hoạt hóa 10% tế bào T chuột, kháng nguyên thông thường kích hoạt 1% tế bào T (Merline S Bergdoll, 2000) Hình 2.2 Hoạt tính siêu kháng nguyên c) Toxic shock syndrome toxin-1( TSST-1 ) Độc tố shock nhiễm độc thường gặp người phụ nữ có kinh dùng băng dày bẩn người bị nhiễm trùng vết thương, hay gọi nhiễm trùng huyết Độc tố khó phân biệt với enterotoxin F tụ cầu vàng SVTH: Nguyễn Văn Phước Lớp 07CSH Tổng quan độc tố Mycotoxin thực phẩm GVHD: KS Huỳnh Văn Thành Trong số trường hợp nhiễm khuẩn gram âm, nội độc tố chất polysaccharide kích thích hoạt hóa đại thực bào giải phóng TNF ( Tumor necrosis factor, yếu tố hoại tử u ) interleukin 1,2 Các cytokine tham gia vào chế sốc nhiễm khuẩn huyết, cách thức gây độc y nội độc tố LPS Trong trường hợp nhiễm độc thức ăn S.aureus hội chứng sốc nhiễm độc lượng cytokine cao gây triệu chứng định Trong hội chứng sốc nhiễm độc xuất triệu chứng nhiễm độc độc tố ruột như: - Các độc tố ruột hoạt dộng chất kích thích phân bào hoạt hóa tất tế bào T biểu họ gene Vβ (thụ thể tế bào T) - Các cytokine tế bào T giải phóng hoạt hóa siêu kháng nguyên SE gây nên nhiều triệu chứng sốt, tiêu chảy, sốc nhiễm độc thức ăn S.aureus Trong trường hợp ngoại độc tố tụ cầu gọi độc tố gây hội chứng sốc, hoạt động siêu kháng nguyên kích thích tế bào T hoạt hóa đại thực bào tiết nhiều TNF Các vi khuẩn sống bên tế bào thực bào có khả hoạt hóa tế bào T dẫn tới phá hủy mô Các cytokine tế bào T hoạt hóa tiết tập trung đại thực bào hoạt hóa chúng để hình thành khối u Các enzyme lysosom giải phóng từ khối u gây hoại tử đáng kể mô 2.1.1.3 Khả gây bệnh Các biểu ngộ độc độc tố tụ cầu khuẩn thường xuất sau khoảng từ – 6h với triệu chứng phổ biến đau bụng quặn, nôn mửa dội, tiêu chảy Có thể đau đầu, mạch nhanh bị tử vong Bệnh khỏi sau – ngày 2.1.1.4 Các thực phẩm liên quan Các thực phẩm dễ bị nhiễm tụ cầu khuẩn sữa, thịt, cá… Ở chế độ trùng chế biến tiêu diệt vi khuẩn S aureus không phá huỷ độc tố chúng SVTH: Nguyễn Văn Phước Lớp 07CSH Tổng quan độc tố Mycotoxin thực phẩm GVHD: KS Huỳnh Văn Thành 2.1.1.5 Biện pháp phòng ngừa Thực phẩm bị nhiễm tụ câu khuẩn thường biểu thay đổi tính chất cảm quan nên người sử dụng khó nhận biết.Vì biện pháp phòng ngừa quan trọng Thực nghiêm ngặt nguyên tắc đảm bảo vệ sinh khâu sản xuất chế biến phân phối thực phẩm nói chung, đặc biệt loại thực phẩm giàu protein, loại bánh nhiều cream, sữa… Kiểm tra sức khoẻ định kỳ cho người chế biến thực phẩm Những người bị bệnh da, viêm họng, viêm mũi không tiếp xúc trực tiếp với thực phẩm xác định khỏi bệnh 2.1.2 Độc tố botulin 2.1.2.1 Đặc điểm vi khuẩn Clostridium botulinum C.botulinum trực khuẩn Gram dương, kỵ khí bắt buộc, tồn đất, phân động vật, ruột cá Chúng vi khuẩn hình que sinh độc tố botulin nguyên nhân gây tê liệt Clostridium botulinum phát triển thuận lợi nhiệt độ 26-280C Tiết độc tố botulin, sinh khí hydro sulfur (H2S) sinh Clostridium botulinum phát triển pH acid thấp 4.5 Nồng độ muối 1% ngăn cản phát triển vi khuẩn Clostridium botulinum sử dụng lactose nguồn carbon Vi khuẩn Clostridium sống đất, nước, ruột gia súc, ruột cá, ruột người, thịt, rau nên thực phẩm dễ bị nhiễm trình sản xuất Đây loại vi khuẩn kị khí, chịu lạnh nhiệt độ cao Do đặc tính kị khí nên C botulinum sinh trưởng tốt đồ hộp SVTH: Nguyễn Văn Phước Lớp 07CSH Tổng quan độc tố Mycotoxin thực phẩm GVHD: KS Huỳnh Văn Thành Hình 2.3: Vi khuẩn Clostridium botulinum 2.1.2.2 Độc tố Botulin a) Cấu trúc Botulin Độc tố botulin Clostridium botulinum sinh phức hợp protein gồm có độc tố thần kinh botulin protein không độc khác Độc tố botulin chứa chuỗi nặng chuỗi nhẹ liên kết cầu nối disulfide Độc tố tổng hợp dạng chuỗi polypeptide đơn bất hoạt có trọng lượng phân tử khoảng 150 kDa Nó trở thành dạng hoạt động chuỗi polypeptide bị phân cắt thành chuỗi nặng có trọng lượng phân tử 100 kDa chuỗi nhẹ có trọng lượng phân tử 50 kDa Độc tố thần kinh botulin gồm có serotype khác tên A, B, C, D, E, F G Mặc dù tất serotype ức chế giải phóng acetylcholine điểm cuối dây thần kinh, protein đích nội bào, chế hoạt động chúng khác Trong số độc tố botulin BT-A nghiên cứu nhiều SVTH: Nguyễn Văn Phước Lớp 07CSH Tổng quan độc tố Mycotoxin thực phẩm GVHD: KS Huỳnh Văn Thành Hình 2.4: Cấu trúc phân tử botulin b) Cơ chế tác dụng độc tố Botulin Khi hoạt động dây thần kinh vận động tạo nên khử cực đầu cuối sợi trục (axon), acetylcholine phóng thích từ tế bào chất vào khe synapse Sự phóng thích acetylcholine thực chuỗi protein vận chuyển, phức hợp soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor (SNARE) (yếu tố hòa tan nhạy với N-ethylmaleimide gắn lên thể nhận protein) Khi BT xâm nhập vào mô đích, chuỗi nặng độc tố thần kinh botulin gắn chuyên biệt lên phân tử glycoprotein tìm thấy điểm cuối dây thần kinh tác động kiểu cholin Sự gắn chuyên biệt nguyên nhân cho tính chọn lọc cao độc tố botulin synapse tác động kiểu synapse Sau xâm nhập, chuỗi nhẹ độc tố thần kinh botulin gắn chuyên biệt lên phức hợp SNARE Tùy kiểu BT khác có protein đích khác BT-A tách thành SNAP-25, BT-B tách thành VAMP SVTH: Nguyễn Văn Phước 10 Lớp 07CSH Tổng quan độc tố Mycotoxin thực phẩm GVHD: KS Huỳnh Văn Thành lũy sphingoid base với tăng tỷ lệ Sa:So mô dẫn đến biểu fumonisin động vật có vú, chim cá Độc tính fumonisin B1 liên quan mật thiết tới hiệu ứng lên trao đổi chất sphingolipid, bao gồm trình sinh tổng hợp mới, tích lũy sphingolipid tự do, trình thải loại sphingolipid phức tạp, tăng cường phân giải sphingoid tự do, tăng hàm lượng lipid sphingosin Các hiệu ứng dẫn đến hàng loạt phản ưng sinh hóa gây nhiễm độc khác Hình 2.16: Tóm tắt sơ đồ biến dưỡng sphingolipid thể ức chế enzyme ceramide synthase (X) fumonisin Các fumonisin có tính đặc hiệu tới tổng hợp sphingosine, thể ức chế serin Không phát hiệu ứng tương tự fumonisin đến tổng hợp phosphatidylserin, phosphatidylcholin acid béo Vị trí hoạt động fumonisin sphingosine sphingosine N transacetylase phản ứng kết hợp thiolase với sphingosin sphingosin để tạo thành dihydroceramid ceramid SVTH: Nguyễn Văn Phước 32 Lớp 07CSH Tổng quan độc tố Mycotoxin thực phẩm GVHD: KS Huỳnh Văn Thành Do ức chế fumonisin, số lượng tế bào gan giảm xuống 25% sau 24 50% sau ngày, hoạt động fumonisin nhạy cảm với tế bào gan so với tế bào thận Sự nhiễm fumonisin lâu dài nồng độ cao gây ảnh hưởng mức tế bào hoàn toàn khác với ảnh hưởng sphingolipid Do tế bào não giàu sphingolipid nên tổn thương thần kinh nhiễm độc fumonisin B1 gây nên Hoạt tính gây ung thư fumonisin B1cũng chế ức chế tổng hợp sphingolipid gây nên độc tố kìm hãm hoạt động sphingosin thể vai trò tác nhân chống khối u nội bào 2.3.4.4 Nấm mốc tổng hợp Fumonisin Fumonisin chủ yếu nấm mốc thuộc giống Fusarium tổng hợp nên Loài điển hình số Fusarium moniliforme Các chủng nấm mốc loài này, Sheldon xác định vào năm 1904 phổ biến môi trường thường nhiễm lương thực, đặt biệt ngô Vào năm 1988, đặc tính fumonisin lần xác định sản phẩm trao đổi chất lần phát canh trường F moniliforme Trong số đó, hợp chất phát thường xuyên nồng độ cao canh trường loài thực phẩm mà đặc biệt ngô nhiễm F moniliforme Hợp chất sau đặt tên “fumonisin B1” Các nguyên cứu sau cho thấy F moniliforme tổng hợp nên fumonisin mà chủng khác thuộc Fusarium tham gia tổng hợp nên độc tố loại bao gồm F proliferatum, F subglutinans, F anthophilum, F annulatum, F succisae, F beomiforme, F dlamini, F napiforme F nygamai 2.3.4.5 Hạn chế nhiễm Fumonisin Fumonisin B1 bền với nhiệt, xử lý canh trường F moniliforme 1000C, sau để khô 600C 24h, nồng độ fumonisin B1 không bị thay đổi cấu trúc fumonisin B1 bị phá huỷ nhiệt độ 2200C Vì giải pháp thuỷ phân biện pháp khác áp dụng cho aflatoxin không hiệu fumonisin, chí làm tăng cường độc tính độc tố Các nghiên cứu SVTH: Nguyễn Văn Phước 33 Lớp 07CSH Tổng quan độc tố Mycotoxin thực phẩm GVHD: KS Huỳnh Văn Thành tiến hành để xác định ảnh hưởng kỹ thuật chế biến tới độc tố thực phẩm, đường lây nhiễm khả khử độc tố áp dụng cho sản phẩm thực phẩm cho người thức ăn gia súc 2.3.5 Tình hình nhiễm mycotoxin thực phẩm giới Việt Nam Sự nhiễm độc tố nấm mốc nông sản trở thành vấn đề toàn cầu Ví dụ: Ở Đức có 84% 1000 mẫu nông sản thực phẩm kiểm tra có nhiễm Tricothecene, 13% số mẫu lương thực lúa mì, lúa mạch, yến mạch bị nhiễm ochratoxin Ở Đan mạch 19 33 mẫu ngũ cốc kiểm tra có nhiễm ochratoxin Ở Ấn Độ có 8% số mẫu bánh dầu hướng dương kiểm tra có nhiễm đồng thời hai loại độc tố T-2 ochratoxin Ở Mỹ có nhiều mẫu bắp kiểm tra cho thấy có nhiễm vomitoxin (DON) mức 1000ppb Ở Úc kiểm tra bắp thấy có loại mycotoxin như: aflatoxin, fumonisin zearalenon Theo Tiến sĩ Bangalore (Ấn Độ) loại mycotoxin khác có ưu vùng khác giới: Ở Bắc Âu Ochratoxin Vomitoxin (DON) vấn đề quan tâm Còn Nam Mỹ mycotoxin có ưu lại Aflatoxin Fumonisin Ở Việt Nam nhiều nơi ép dầu phọng bọng thủ công, độ ẩm cao, sau xếp thành chồng Giữa lớp bánh dầu có độ ẩm cao môi trường thích hợp cho nấm phát triển Nếu kho trữ thức ăn lâu ngày không làm vệ sinh, diệt nấm không khí có nhiều bào tử nấm công nhanh nguyên liệu sinh nhiều độc tố thức ăn Nấm sinh kho dự trữ phổ biến Aspergillus Penicillium Độc tố chúng sinh chủ yếu aflatoxin, sau ochratoxin, rubratoxin citrinin Nó gây tổn hại nặng động vật, làm hư gan, thận, tạo màng bọc ống tiêu hóa tế bào niêm mạc bị chết bong giảm hấp thu dưỡng chất, gây tử vong số lớn gia cầm heo Riêng trại gà giống, độc tố nấm gây chết phôi hàng loạt, tỷ lệ ấp nở giảm thấp Theo kết kiểm tra 29 mẫu bánh dầu phọng 25 mẫu bắp mức aflatoxin bánh dầu phọng 1.200 ppb (tối đa 5.000 ppb), bắp 205ppb (tối đa 600 ppb) Các nguyên liệu lại đậu nành hạt khô bánh dầu công nghiệp nó, bánh dầu mè công nghiệp, khô dầu dừa công nghiệp, cám 50ppb SVTH: Nguyễn Văn Phước 34 Lớp 07CSH Tổng quan độc tố Mycotoxin thực phẩm GVHD: KS Huỳnh Văn Thành Chương 3: PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỘC TỐ MYCOTOXIN Việc kiểm tra mycotoxin thực phẩm dựa phương pháp phân tích vi sinh vật thực phẩm, phương pháp phân tích sinh hoá, phương pháp xét nghiệm bệnh lý động vật 3.1 Phương pháp phân tích vi sinh vật Các phương pháp vi sinh vật chủ yếu để phân tách chủng nấm mốc sinh độc tố Để phân lập nấm mốc nhiễm thực phẩm, phương pháp phân lập trực tiếp hiệu phương pháp gián tiếp sản phẩm dạng hạt Hạt ngũ cốc đặt trực tiếp lên môi trường thạch sau làm dung dịch tẩy clo 0,4% để loại bỏ chất bẩn bề mặt mà không ảnh hưởng tới nấm mốc Đối với sản phẩm dạng bột, tiến hành đồng hoá lắc mẫu dung môi thích hợp sử dụng kỹ thuật pha loãng để xác định nấm mốc nhiễm sản phẩm Vấn đề phân tách nấm mốc nhiễm sản phẩm phát triển nhanh chóng số loài nấm Mucor, Rhizopus loài Zygomycetes làm cho việc phát định lượng nấm mốc khác khó khăn Có thể sử dụng môi trường nghèo Potato Dextro agar môi trường có chứa chất ức chế số nấm mốc dicloran, sử dụng môi trường chọn lọc để ức chế số nấm mốc có khả sinh sợi nhanh chóng Rhizopus 3.2 Phương pháp phân tích lý hoá 3.2.1 Phương pháp phát nấm đèn UV Việc xác định AF phán đoán phát sáng khuẩn lạc khó khăn, không dễ phân biệt với chủng không sinh aflatoxin  nhẫm lẫn Thí nghiệm chẩn đoán diện AF khuẩn lạc nấm mốc phát lân quang AF nhiệt độ phòng sau tắt đèn UV Các chủng Aspergillus không sinh aflatoxin không phát lân quang chủng sinh AF có phát lân quang SVTH: Nguyễn Văn Phước 35 Lớp 07CSH Tổng quan độc tố Mycotoxin thực phẩm GVHD: KS Huỳnh Văn Thành Sự phát huỳnh quang lân quang AF tia UV điều để xác định AF Ở bước sóng 365 nm, AFB1 AFB2 hoạt hóa tạo thành AFB – 8,9 – epoxide Sau gắn vào vị trí N7 phân tử guanine tạo thành 8,9 – dihydro – – (N7 guanyl) – – hydroxyaflatoxin B2 Cấu trúc AF-DNA photoadduct tương đồng với AF-DNA adduct hình thành điều kiện in vivo AFB2 đường tiêu hóa cytochrome P450 gan Sự hình thành dạng kép AFDNA xem bước hình thành ung thư kích thích AF Hình 3.1: Các dòng nấm mốc sinh độc tố không sinh độc tố, (a): quan sát ánh sáng bình thường; (b) tia UV 365 nm, vòng bao xung quanh chủng sinh độc tố (dưới); (c) phát lân quang nhiệt độ phòng 2,5 giây sau tắt đèn UV 3.2.2 Xác định nấm mốc sinh mycotoxin PCR Aflatoxin có có 25 gene liên quan đến trình tổng hợp aflatoxin điều hòa Các primer liên quan đến trình tự afl-2, aflD, aflM aflP sử dụng để dò tìm phát dòng Aspergillus sinh độc tố aflatoxin A flavus A parasiticus số khuẩn lạc phân lập trình ly trích DNA từ thực phẩm thức ăn gia súc Trong thời gian ngắn, DNA Aspergillus sử dụng khuôn để khuếch đại gene liên quan đến trình sinh tổng hợp AF Trình tự đoạn được khuếch đại nhận dạng gene sinh tổng hợp AF Tuy nhiên, diện gene phản ánh khả diện nấm mốc sản sinh aflatoxin SVTH: Nguyễn Văn Phước 36 Lớp 07CSH Tổng quan độc tố Mycotoxin thực phẩm GVHD: KS Huỳnh Văn Thành Sự sản xuất AF phụ thuộc vào nhiệt độ, ẩm độ, thành phần môi trường dinh dưỡng, phase tăng trưởng thời gian nuôi cấy Gần đây, việc ứng dụng kỹ thuật RTPCR để xác định chủng Aspergillus sinh aflatoxin dựa vào diện mRNA liên quan đến gene sinh tổng hợp AF RT-PCR biểu thị diện nấm mốc sinh aflatoxin enzyme sinh tổng hợp AF Kỹ thuật Multiplex RT-PCR sử dụng – cặp mồi để phát aflD, aflO, aflP, aflQ, aflR aflS (aflJ) nhằm xác định nấm mốc sinh độc tố 3.2.3 Phương pháp ELISA Nguyên lý ELISA dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể gồm bước sau: Kháng nguyên - antigen (KN) chưa biết gắn bề mặt Kháng thể - antibody (KT) biết trước "rửa" qua bề mặt Kháng thể gắn kết với enzyme Thêm vào chất (substance); enzyme biến đổi chất tạo tín hiệu xác định Đối với ELISA phát quang, ánh sáng phát từ mẫu chứa kháng nguyên – kháng thể Sự diện phức hợp kháng nguyên – kháng thể định cường độ sáng phát Với nguyên lý trên, ELISA giúp xác định có mặt hay mặt lượng kháng nguyên mẫu nghiên cứu Để tiến hành ELISA cần phải có kháng thể đặc hiệu cho kháng nguyên chưa biết Thông thường kháng nguyên cố định giếng vi phiếm (polystyrene microtiter plate) - Phương thức cố đinh không đặc hiệu: kháng nguyên gắn trực tiếp vào bề mặt đĩa - Phương thức gắn đặc hiệu ("sandwich" ELISA): kháng nguyên gắn với kháng thể đặc hiệu cho kháng nguyên cần kiểm tra Kháng thể đặc hiệu thêm vào, phản ứng tạo phức hợp kháng thể - kháng nguyên sảy Nếu kháng thể gắn trực tiếp với enzyme, tín hiệu quang SVTH: Nguyễn Văn Phước 37 Lớp 07CSH Tổng quan độc tố Mycotoxin thực phẩm GVHD: KS Huỳnh Văn Thành học enzyme làm biến đổi chất giúp phát kháng nguyên cần kiểm tra Trong trường hợp sử dụng kháng thể thứ cấp (secondary antibody) gắn với enzyme thông qua liên kết cộng hóa trị phân tử sinh học (bioconjugation), kháng nguyên cần xác định nhận biết qua kháng thể thứ cấp Giữa bước ELISA, protein kháng thể không đặc hiệu, kháng thể không gắn với kháng nguyên lấy nhờ loại dịch có tác dụng "rửa" Sau bước "rửa" cuối cùng, kháng thể liên kết với kháng nguyên giữ lại Sau thêm vào, chất chịu tác dụng enzyme liên kết với kháng thể phức hợp kháng thể - kháng nguyên Phản ứng phát quang (biến đổi chất) sảy Trước chất tạo màu sắc sử dụng ELISA ngày chất phát quang dùng rộng rãi làm tăng tính đặc hiệu độ xác ELISA a) Phương pháp ELISA gián tiếp (indirect ELISA) gồm bước chính: Chuyển kháng nguyên biết lên bề mặt cứng ( gọi chung đĩa) Kháng nguyên cố định bề mặt Nồng độ mẫu kháng nguyên dùng để thiết lập đường chuẩn cho việc tính nồng độ kháng nguyên mẫu chưa biết Chuyển mẫu kháng nguyên chưa biết vào giếng khác Kháng nguyên chưa biết hòa tan loại dung dịch đệm giống mẫu kháng nguyên chuẩn Hình 3.2: Phương pháp ELISA gián tiếp SVTH: Nguyễn Văn Phước 38 Lớp 07CSH Tổng quan độc tố Mycotoxin thực phẩm GVHD: KS Huỳnh Văn Thành Thêm dung dịch protein không tương tác (non-interacting protein) albumin huyết bê (bovine serum albumin) hay casein vào tất mẫu (kể mẫu chuẩn) Bước gọi "blockin" protein huyết có tác dụng ngăn cản hấp phụ protein khác lên bề mặt đĩa Rửa bề mặt đĩa sau chuyển kháng thể (biết trước) vào tất giếng đĩa Kháng thể kết hợp với kháng nguyên cố định mà không kết hợp với protein huyết Thêm kháng thể thứ cấp (secondary antibody), kháng thể thứ cấp kết hợp với kháng thể dư (bước bỏ qua kháng thể dùng để phát kháng nguyên gắn với enzyme) Rửa đĩa, kháng nguyên gắn enzyme dư loại bỏ Thêm chất enzyme làm biến đổi chất làm sản sinh tín hiệu huỳnh quang hay tín hiệu điện hóa học (enzyme có tác dụng yếu tố khuyếch đại) Nhược điểm bản: Bước cố định kháng nguyên tính đặc hiệu nên protein gắn với bề mặt đĩa kháng thể (có nồng độ thấp) phải cạnh tranh với protein khác huyết gắn kết với bề mặt điwax Sandwich ELISA hạn chế nhược điểm b) Sandwich ELISA Phương pháp sử dụng để phát kháng nguyên mẫu nghiên cứu bao gồm bước sau: (1) Chuẩn bị bề mặt (microtiter) có gắn kháng thể (2) Khóa tất vị trí gắn kết không đặc hiệu bề mặt (3) Phủ mẫu chứa kháng kháng nguyên cần xác định (4) Rửa đĩa, kháng kháng nguyên không gắn kết bị rửa trôi (5) Thêm kháng thể đặc hiệu cho kháng nguyên cần chẩn đoán (6) Thêm kháng thể thứ cấp gắn với enzym (kháng thể thứ cấp đặc hiệu cho kháng thể sơ cấp bước 5) (7) Rửa đĩa, phần không gắn kết bị rửa trôi SVTH: Nguyễn Văn Phước 39 Lớp 07CSH Tổng quan độc tố Mycotoxin thực phẩm GVHD: KS Huỳnh Văn Thành (8) Thêm chất Enzym biến đổi chất tạo màu, phát quang hay tín hiệu hóa điện (9) Đo cường độ ánh sáng, tín hiệu huỳng quang, tín hiệu điện hóa qua xác định có mặt hàm lượng kháng thể Hình 3.3: Kháng nguyên gắn với kháng thể c) ELISA cạnh tranh Việc xác định định lượng mycotoxin xác định kỹ thuật ELISA cạnh tranh Các giếng kỹ thuật ELISA gắn kháng thể sơ cấp chống lại mycotoxin Các tác nhân phát phức hợp đồng hóa trị mycotoxin enzyme thường sử dụng horseradish peroxidase alkaline phosphatase Các tác nhân trộn chung với mẫu dịch chiết mycotoxin phức hợp cho vào giếng Trong giếng đối chứng (không chứa mycotoxin mẫu), phức hợp mycotoxin – enzyme gắn lên kháng thể sơ cấp sau thêm chất tạo màu, kết màu mẫu Trong giếng kiểm tra, phân tử mycotoxin tự dịch chiết cạnh tranh với phức hợp SVTH: Nguyễn Văn Phước 40 Lớp 07CSH Tổng quan độc tố Mycotoxin thực phẩm GVHD: KS Huỳnh Văn Thành gắn kháng thể sơ cấp Nồng độ mycotoxin cao, phức hợp gắn kháng thể sơ cấp tí dẫn đến màu giếng nhạt Hình 3.4: Phương pháp ELISA cạnh tranh 3.2.4 Phương pháp sắc kí lớp mỏng (Thin layer chromato graphi-TLC) Phương pháp sắc kí lớp mỏng sử dụng rộng rãi để xác định hàm lượng aflatoxin lần vào năm 1960 Người ta sử dụng mỏng tráng silicagel, để xác định aflatoxin Dung môi sử dụng cho dung dịch chạy mỏng chloroforin: methnol choloroform : aceton Việc thêm nước vào hệ thống dung môi làm tăng khả hòa tan aflatoxin Hệ dung môi gồm nước: aceton : chloroform( 1:5;12:88) đánh giá có khả hòa tan aflatoxin tốt Các mỏng chảy qua dung môi chạy đưa vào đèn tử ngoại (UV) 365 nm Các vết mẫu phân tích tạo màu huỳnh quang xanh da trời hay xanh Và có độ dài Rf so sánh với vết mẫu phân tích chuẩn Phương pháp xác định lượng từ 3-4.10-4micromet(0.3-0.4mg) Nhược điểm phương pháp phụ thuộc vào người phân tích Khi so sánh mẫu vết độc tố chuẩn có sai lệch kết từ 20-30% SVTH: Nguyễn Văn Phước 41 Lớp 07CSH Tổng quan độc tố Mycotoxin thực phẩm GVHD: KS Huỳnh Văn Thành 3.2.5 Phương pháp sắc kí lỏng cao áp (High ferformane liquid chromatorgaphy-HPLC) HPLC sắc ký cột (column chromatograph ) kèm với detector nhạy để phát chất tách trình chạy sắc ký Với tiến kỹ thuật cột, detector chuyển sắc ký cột thành phương pháp phân tích có tốc độ nhanh hiệu suất cao Loại cần phải có hệ thống bơm cao áp để đẩy pha động với áp suất cao đến khoảng 30Mpa (300 atm) nhằm tạo dòng chảy với lưu lương vài ml/ phút Số lượng mẩu phân tích HPLC cần khoảng 20microlit Phương pháp HPLC sử dụng hai pha: Pha bình thường pha phản Hệ thống dựa hấp thụ tia tím (uv) xác định cường độ huỳnh quang Mẫu phân tích tác chloroform: nước Ly tâm chất tác dụng làm qua silicagel pha bình thường sử dụng cột nhối silicagel 0.5m pha động sử dụng bezen: acetonitrit: acid formic Giới hạn xác định 0.5 micromet/kg Hình 3.5: Phương pháp sắc kí lỏng cao áp 3.2.6 Phương pháp sắc ký miễn dịch dòng chảy bên (Lateral Flow Immunochromatography) SVTH: Nguyễn Văn Phước 42 Lớp 07CSH Tổng quan độc tố Mycotoxin thực phẩm GVHD: KS Huỳnh Văn Thành Phương pháp gọi thử nghiệm bước nhanh (ROSA) để xác định mycotoxin Đây phương pháp phổ biển để xác định nhanh mycotoxin ước lượng nồng độ chúng Một phương pháp sắc ký miễn dịch dòng chảy bên điển hình gồm bước sau: miếng đệm để đưa mẫu vào; vùng chứa hạt màu (latex, vàng …) phủ với kháng thể đơn dòng chống lại mycotoxin; vùng màng nitrocellulose cho phép di chuyển hạt với mẫu mycotoxin; đường kiểm tra giữ cố định mycotoxin; đường đối chứng dương chứa kháng thể thứ cấp miếng đệm hấp phụ Một mẫu chứa mycotoxin cho vào di chuyển theo chuỗi Khi đến vị trí tiếp hợp, mycotoxin gắn vào phức hợp hạt – kháng thể đối kháng mycotoxin Bây giờ, hạt chứa mycotoxin hạt tự di chuyển vào vùng test – line Những mycotoxin cố định bị bắt giữ nên có hạt tự hình thành nên màu hạt mang mycotoxin tiếp tục di chuyển Sự diện mycotoxin mẫu cao hạt chứa mycotoxin gắn vào test line Do đó, cường độ màu test line nhạt chứng tỏ nồng độ mycotoxin mẫu cao SVTH: Nguyễn Văn Phước 43 Lớp 07CSH Tổng quan độc tố Mycotoxin thực phẩm GVHD: KS Huỳnh Văn Thành Hình 3.6: Phương pháp sắc ký miễn dịch dòng chảy bên (LTF) SVTH: Nguyễn Văn Phước 44 Lớp 07CSH Tổng quan độc tố Mycotoxin thực phẩm GVHD: KS Huỳnh Văn Thành Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN Các độc tố nấm mốc phát triển mạnh loại thực phẩm nông sản, thức ăn gia súc, gia cầm ngô, lạc, đậu… Trong trình phát triển, nấm mốc sản sinh độc tố gây bệnh cho người động vật tiêu thụ Những độc tố nấm mốc sinh có khả gây độc cấp tính mãn tính đến quan gan, thận Nhưng nguy hiểm gây triệu chứng xơ gan, ung thư tế bào gan nguyên phát gây đột biến DNA  Độc tố aflatoxin xâm nhập vào thể qua đường ăn uống liều lượng cao thời gian ngắn Gây triệu chứng cấp tính chuyên biệt bệnh bao gồm xuất huyết, hủy hoại gan cấp tính, phù, thay đổi đường tiêu hóa, hấp thu sản phẩm trao đổi chất chết Khi hấp thụ aflatoxin liều lượng tự thấp đến trung bình qua đường ăn uống thời gian kéo dài Những ảnh hưởng cận lâm sàng khó nhận biết Một số triệu chứng chuyển hóa thức ăn yếu, tỷ lệ tăng trưởng thấp có xảy số triệu chứng giống ngộ độc aflatoxin cấp tính Những triệu chứng gây ngộ độc mãn tính gan dẫn đến ung thư gan  Độc tố OTA gây đột biến, ức chế miễn dịch quái thai số loài động vật người, quan mục tiêu thận, gan Độc tố OTA gây ức chế miễn dịch thông qua tác động trình chuyển hóa tế bào gây tác hại cho ti thể  Patulin độc tố có khả gây ung thư cho người động vật Gây hoạt tính suy giảm miễn dịch liên quan tới chứng xung huyết, gây loét niêm mạc, đặc biệt niêm mạc ruột, độc tố gây thiệt hại cho DNA nhiễm sắc thể người  Fumonisin độc tố có độc tính mạnh gây triệu chứng nhũng não, suy gan, gây mù, gây triệu chứng bất bình thường tử vong ngựa (ELEM), ung thư gan chuột, bệnh gan gà, suy tim cấp khỉ SVTH: Nguyễn Văn Phước 45 Lớp 07CSH Tổng quan độc tố Mycotoxin thực phẩm GVHD: KS Huỳnh Văn Thành Do vấn đề bảo quản lương thực thực phẩm vấn đề quan trọng góp phần làm giảm tỉ lệ bệnh mà độc tố nấm mốc gây cho người vật nuôi 4.2 KIẾN NGHỊ Không nên sử dụng thực phẩm bị hư hỏng, bị nhiễm nấm mốc, nên có biện pháp ngăn chặn nấm mốc phát triển trình thu hoạch nông sản Trong trình lưu giữ nông sản cần thường xuyên kiểm tra độ ẩm, nhiệt độ, sâu mọt khử côn trùng kho để hạn chế nhiễm mốc Chúng ta cần áp dụng phương pháp phân tích đại, để phân tích độc tố mycotoxin nhiễm nông sản, kịp thời ngăn chặn lây nhiễm chúng để tránh thiệt hại nguồn nguyên liệu sản xuất thức ăn gia súc, gia cầm Góp phần thúc đẩy kinh tế phát triển SVTH: Nguyễn Văn Phước 46 Lớp 07CSH [...]... tới độc tố này trong thực phẩm, con đường lây nhiễm và các khả năng khử độc tố có thể áp dụng cho các sản phẩm thực phẩm cho người hoặc thức ăn gia súc 2.3.5 Tình hình nhiễm mycotoxin trong thực phẩm trên thế giới và Việt Nam Sự nhiễm độc tố nấm mốc trong nông sản đã trở thành vấn đề toàn cầu Ví dụ: Ở Đức có 84% trên 1000 mẫu nông sản thực phẩm kiểm tra có nhiễm Tricothecene, 13% số mẫu lương thực. .. mốc - Độc tố do Aspergillus.flavus tổng hợp - Độc tố do các Aspergillus khác - Độc tố do Penicillium - Độc tố do Fusarium - Đôc tố do Stachybotrys - Độc tố do các loài nấm khác 2.2.3.3 Theo bệnh lý - Mycotoxin gây các hội chứng ung thư, nhiễm độc gan: aflatoxin, ochratoxin, islanditoxin - Mycotoxin gây nhiễm độc thận: citrinin, ochratoxin - Mycotoxin gây hội chứng nhiễm độc tim: axit penicilic - Mycotoxin. .. của mycotoxin là chúng có thể gây hại ở nồng độ thấp SVTH: Nguyễn Văn Phước 12 Lớp 07CSH Tổng quan về độc tố Mycotoxin trong thực phẩm GVHD: KS Huỳnh Văn Thành Hình 2.6: Cấu trúc hoá học của một số loại Mycotoxin Nấm sợi tồn tại khắp nơi trong tự nhiên và luôn luôn hiện diện trong sản phẩm nông sản dù đã có các biện pháp kiểm soát 2.2.3 Phân loại SVTH: Nguyễn Văn Phước 13 Lớp 07CSH Tổng quan về độc tố. .. Lớp 07CSH Tổng quan về độc tố Mycotoxin trong thực phẩm GVHD: KS Huỳnh Văn Thành quản sản phẩm Trong điều kiện bảo quản tự nhiên, aw là yếu tố chủ đạo xác định thời gian bảo quản của một sản phẩm “nhanh chóng sấy khô sản phẩm và bảo quản sản phẩm khô ráo” trở thành phương pháp hiệu quả nhất đảm bảo sản phẩm không bị nấm mốc tấn công, vì vậy khả năng không bị nhiễm mycotoxin cũng được đảm bảo Trong nhiều... độ nước của sản phẩm, bản chất sản phẩm Các chủng sinh OTA rất khác nhau theo khu vực địa lý, khí hậu và bản chất của sản phẩm bị nhiễm Hơn thế nữa các SVTH: Nguyễn Văn Phước 25 Lớp 07CSH Tổng quan về độc tố Mycotoxin trong thực phẩm GVHD: KS Huỳnh Văn Thành chủng tổng hợp OTA cũng có thể tổng hợp đồng thời nhiều loại mycotoxin như acid penicilic hoặc citrinin 2.3.2.3 Độc tính OTA Trong số các ochratoxin,... tan trong nước và bền vững với nhiệt Trong số các fumonisin, chỉ fumonisin B1, B2 và B3 được phát hiện với hàm lượng đáng kể cả trong điều kiện tự nhiên và điều kiện phòng thí nghiệm Hình 2.15: Cấu trúc hoá học phân tử Fumonisin 2.3.4.2 Độc tính SVTH: Nguyễn Văn Phước 30 Lớp 07CSH Tổng quan về độc tố Mycotoxin trong thực phẩm GVHD: KS Huỳnh Văn Thành Fumonisin B1 là độc tố có độc tính mạnh nhất trong. .. - Mycotoxin gây nhiễm độc thần kinh: clavanin - Mycotoxin gây sảy thai, động đực: zearalenon - Mycotoxin gây xuất huyết SVTH: Nguyễn Văn Phước 14 Lớp 07CSH Tổng quan về độc tố Mycotoxin trong thực phẩm GVHD: KS Huỳnh Văn Thành Phân loại mycotoxin theo bệnh lý thường không chính xác do một độc tố có thể gây nhiều hội chứng khác nhau, ngược lại, một hội chứng có thể do nhiều độc tố cùng gây nên 2.2.4... aflatoxin trong bánh dầu phọng 1.200 ppb (tối đa 5.000 ppb), trong bắp 205ppb (tối đa 600 ppb) Các nguyên liệu còn lại như đậu nành hạt khô và bánh dầu công nghiệp của nó, bánh dầu mè công nghiệp, khô dầu dừa công nghiệp, cám 50ppb SVTH: Nguyễn Văn Phước 34 Lớp 07CSH Tổng quan về độc tố Mycotoxin trong thực phẩm GVHD: KS Huỳnh Văn Thành Chương 3: PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỘC TỐ MYCOTOXIN Việc kiểm tra mycotoxin. .. Lớp 07CSH Tổng quan về độc tố Mycotoxin trong thực phẩm GVHD: KS Huỳnh Văn Thành Độc tố OTA gây đột biến DNA sợi đơn và một số hợp chất phá vỡ DNA trong DNA của lá lách, gan và thận OTA cũng ức chế phenylalanine hydroxylase và làm giảm nồng độ của phosphoenol pyruvate cacboxykinaza Đây là sự ức chế tổng hợp protein và RNA các chất độc hại Sự ức chế tổng hợp protein và RNA được xem là một trong những... pháp kiểm soát mycotoxin Nếu điều kiện môi trường thuận lợi thì nấm sẽ phát triển, và rất khó tránh khỏi tình trạng thực liệu bị nhiễm độc tố Tuy nhiên nếu ngăn chặn sự phát triển của nấm có hiệu quả thì tất nhiên sẽ hạn chế được sự tác động của độc tố SVTH: Nguyễn Văn Phước 17 Lớp 07CSH Tổng quan về độc tố Mycotoxin trong thực phẩm GVHD: KS Huỳnh Văn Thành Việc ngăn chặn có thể được thực hiện trước