Viện Đại Học Mở Hà Nội LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn tới ban giám hiệu Viện Đại học mở Hà Nội, đặc biệt thầy cô khoa Công nghệ Sinh học dạy dỗ em suốt năm học trường, trang bị cho em tảng kiến thức khoa học để học hỏi thêm nhiều điều bổ ích áp dụng vào thực tế tạo điều kiện tốt cho em làm báo cáo tốt nghiệp Em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến TS.Lê Thị Hồng Minh, Phó Trưởng phòng Công nghệSinh học– Viện Hóa sinh biển – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam NCS.Vũ Thị Quyên, người truyền cho em phương pháp học tập, nghiên cứu khoa học, tận tình hướng dẫn, bảo, giúp đỡ em suốt trình nghiên cứu vừa qua Đồng thời, em gửi lời cảm ơn tới cô chú, anh chị bạn Phòng Công nghệ Sinh học– Viện Hóa Sinh Biển nhiệt tình giúp đỡ em hoàn thành tốt đợt thực tập Sau cùng, em xin kính chúc quý thầy cô trongkhoaCông nghệ Sinh học nói chung thầy cô giáo Viện Đại học mở nói riêng thật nhiều sức khỏe, niềm tin để thực sứ mệnh cao đẹp truyền kiến thức cho hệ mai sau Trân trọng! Sinh viên Trịnh Thị Thanh Lam Trònh Thj Thanh Lam Viện Đại Học Mở Hà Nội MỤC LỤC PHẦN I: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Nội dung đề tài 1.4 Ý nghĩa đề tài PHẦN II TỔNG QUAN 2.1 Vi khuẩn 2.1.1 Vị trí vai trò vi khuẩn vi sinh vật 2.1.2 Cấu tạo vi khuẩn.[1,42] 2.1.3 Đặc điểm hình thái vi khuẩn 2.2 Chất kháng sinh 10 2.2.1 Khái niệm chất kháng sinh [13] 10 2.2.2 Lịch sử nghiên cứu chất kháng sinh [13] 11 2.2.3 Sự hình thành chất kháng sinh vi khuẩn.[7,8,9] 15 2.2.4 Các chất kháng sinh có nguồn gốc từ vi khuẩn 15 2.3 Giới thiệu vi sinh vật biển 16 2.4 Giới thiệu số vi sinh vật kiểm định gây bệnh đường ruột 18 2.4.1 Escherichia coli.[43] 18 2.4.2 Salmonella enterica.[43] 20 2.4.3 Bacillus cereus 22 PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 3.1 Vật liệu hóa chất 24 3.1.1 Vật liệu nghiên cứu 24 3.1.2 Hóa chất, thiết bị 24 3.1.3 Môi trường 25 3.2 Phương pháp nghiên cứu 28 Trònh Thj Thanh Lam Viện Đại Học Mở Hà Nội 3.2.1 Thu thập mẫu trầm tích 28 3.2.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn 28 3.2.3 Phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật khuếch tán đĩa thạch [24] 28 3.2.4 Xác định khả sinh enzyme chủng nghiên cứu 29 3.2.5 Phương pháp tách chiết ADN tổng số 32 3.2.6 Phương pháp PCR 32 3.2.7: Phương pháp giải trình tự 36 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 4.1 Kết thu thập mẫu 37 4.2 Phân lập vi khuẩn từ trầm tích 38 4.3 Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định chủng nghiên cứu 40 4.4 Khả sinh enzyme chủng nghiên cứu 42 4.4.1 Khả thủy phân tinh bột tan 42 4.4.2 Khả thủy phân protein (casein) 44 4.4.3 Khả thủy phân CMC 45 4.5 Định danh vi khuẩn sinh học phân tử 46 4.5.1 Tách chiết AND từ vi khuẩn 46 4.5.2 Thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR 46 4.5.3 Nhân gen 16S ADN riboxom 47 3.4.4 Kết giải trình tự gene 16S ba chủng vi khuẩn 48 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53 5.1 Kết luận 53 5.2 Kiến nghị 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 Trònh Thj Thanh Lam Viện Đại Học Mở Hà Nội DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chú thích ADN Axit deoxyribonucleotit ARN Axit ribonucleotit BLAST Basic Local Alignment Search Tool CKS Chất kháng sinh CMC Carboxymethyl cellulose EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid G(-) Gram âm G(+) Gram dương HTKS Hoạt tính kháng sinh KS Kháng sinh LB Lauria Betani PCR Polymerase Chain Reaction SDS Sodium dodecyl sulfate SEM Scanning Electron Microscope UV Ultraviolet VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật VSVKĐ Vi sinh vật kiểm định XK Xạ khuẩn Trònh Thj Thanh Lam Viện Đại Học Mở Hà Nội DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Các chất kháng sinh phát qua năm Bảng 3.1 Thành phần phản ứng PCR Bảng 3.2: Thành phần phản ứng để xác định trình tự Bảng 4.1 Danh sách mầu thu Vịnh Văn Phong – Khánh Hòa Bảng 4.2 Danh sách chủng vi khuẩn phân lập Bảng 4.3 Kết thử hoạt tính vi sinh vật kiểm định Bảng 4.4: Trình tự thông số cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR Trònh Thj Thanh Lam Viện Đại Học Mở Hà Nội DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1 Một số hình ảnh vi khuẩn Hình 2.2 Cấu tạo vi khuẩn Hình 2.3 Các hình dạng vi khuẩn - Cầu khuẩn: 1,2,3,4,5 - Trực khuẩn: 6,7,8,9 - Xoắn khuẩn: 10,11,12 Hình 2.4 Alexander Fleming Penicillium notatum phân lập Hình 2.5 Ba nhà khoa học nhận giải Nobel Y học Hình 2.6 Vi khuẩn E.coli Hình 2.7 Vi khuẩn Salmonella enterica Hình 2.8 Vi khuẩn Bacillus cereus Hình 4.1 Một số hình ảnh thu thập mẫu Văn Phong Hình 4.2 Một số hình ảnh phân lập vi khuẩn sau 2-7 ngày nuôi cấy Hình 4.3 Một số hình ảnh làm chủng vi khuẩn Hình 4.4 Một số hình ảnh thử hoạt tính kháng VSVKĐ Hình 4.5 Khả thủy phân tinh bột tan Hình 4.6 Khả phân giải casein Hình 4.7 Khả phân giải cellulose Hình 4.8 Kết điện di đồ ADN tổng số chủng vi khuẩn Hình 4.9 Điện di đồ sản phẩm PCRgen 16S ADN riboxom chủng Trònh Thj Thanh Lam Viện Đại Học Mở Hà Nội TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Tên đề tài Phân lập tuyển chọn số chủng vi khuẩn từ mẫu trầm tích biển thu nhập Văn Phong – Khánh Hòa có hoạt tính kháng số chủng vi sinh vật kiểm định gây bệnh đường ruột Đối tượng Các chủng vi khuẩn phân lập từ mẫu trầm tích biển thuộc khu vực biển Văn Phong – Khánh Hòa dùng để tuyển chọn, sàng lọc, định danh nghiên cứu hoạt tính sinh học Mục tiêu Tuyển chọn 2-3 chủng vi khuẩn từ mẫu trầm tích biển có hoạt tính kháng số chủng vi sinh vật kiểm định gây bệnh đường ruột định danh sinh học phân tử chủng lựa chọn Nhằm chọn chủng vi sinh vật có khả tổng hợp chất có hoạt tính sinh học tốt làm tiền đề cho ứng dụng chăm sóc sức khỏe cộng đồng Kết - Phân lập làm chủng vi khuẩn từ mẫu trầm tích biển - Kiểm tra hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định chủng nghiên cứu Các vi sinh vật kiểm định bao gồm: + chủng vi khuẩn Gram âm (-): Escherichia coli ATCC25922, Salmonella enterica ATCC13076 + chủng vi khuẩn Gram dương (+): Bacillus cereus ATCC13245 Trònh Thj Thanh Lam PHẦN I: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Ngộ độc thực phẩm vấn đề có ý nghĩa lớn đến sức khỏe cộng đồng, ảnh huởng đến hầu hết nuớc toàn giới.Theo thống kê Cục An toàn Vệ sinh Thực phẩm, năm Việt Nam có chừng 250-500 vụ ngộ độc thực phẩm với 7.000-10.000 nạn nhân 100 – 200 ca tử vong Có nhiều nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm, trong nguyên nhân thực phẩm bị nhiễm vi sinh vật (33-49%) chủ yếu Salmonella, E.coli, Clostridium perfringens, vi khuẩn Listeria Trong nghiên cứu Hà Nội công bố tập san nhiễm trùng học quốc tế, nhà nghiên cứu phân tích số liệu từ 587 trẻ em mắc bệnh tiêu chảy 249 em không mắc bệnh Trong nhóm tiêu chảy, 41% xảy trẻ em tuổi Phân tích vi sinh cho thấy rotavirut nhóm A diện 47% trường hợp, E.coli (22,5%), Shigella spp (khoảng 5%) Bacteroides fragilis (khoảng 7%).[39,40] Các bệnh đường ruột nỗi lo đáng ngại người, gây nguy hại nghiêm trọng đến sức khỏe người.Khi đường ruột gặp phải vấn đề làm đảo lộn hoạt động bình thường hệ tiêu hóa Vì xem nhẹ trước tín hiệu bất thường để phòng ngừa bệnh đường ruột Đa số vi sinh vật gây bệnh loại sống ký sinh lấy thức ăn từ vật chủ Một sốvi sinh vật gây bệnh sản sinh độc tố (khả tạo ngoại độc tố nội độc tố) vật chủ,các đốc tố vi khuẩn có tác Trònh Thj Thanh Lam Page động đặc hiệu như: làm tổn thương màng não, tổn thương quan thể thận, gan, phổi… Sau Alexander Fleming phát penicillin vào năm 1929, vi sinh vật cạn trở thành tiêu điểm cho nổ lực khám phá nhiều thuốc uống lịch sử Những khám phá penicillin sau Actinomycin (1940) dẫn đến “Kỉ nguyên kháng sinh tuyệt vời” mang lại 120 loại thuốc để điều trị bệnh truyền nhiễm ung thư, cholesterol cao, điều hòa miễn dịch bệnh khác Tuy nhiên, việc sử dụng chất kháng sinh không hợp lý làm cho tượng kháng kháng sinh xuất hiện, phát triển ngày lan rộng Việc sử dụng số chất đặc hiệu để chữa trị số loại bệnh không mang lại hiệu mong muốn Số lượng vi khuẩn đề kháng với kháng sinh ngày gia tăng Chính việc tìm kiếm chất kháng sinh thu hút quan tâm nhiều nhà khoa học[41] Đại dương chiếm khoảng 70% diện tích bề mặt trái đất, môi trường sống nhiều loài động vật, thực vật vi sinh vật, song nghiên cứu hợp chất tự nhiên từ biển không phát triển suốt kỷ 19 nửa đầu kỷ 20 Chỉ có số lượng nhỏ sinh vật từ biển thu nhận số lượng nhỏ hợp chất thứ cấp có nguồn gốc từ đại dương tách chiết phân lập Hướng nghiên cứu hợp chất từ vi sinh vật biển, từ xác định số chất có hoạt tính sinh học kháng vi sinh vật có khả ứng dụng y dược, hứa hẹn nhiều tiềm tương lai Vì vậy, lựa chọn đề Trònh Thj Thanh Lam Page tài: “Phân lập tuyển chọn số chủng vi khuẩn từ mẫu trầm tích biển thu nhập Văn Phong – Khánh Hòa có hoạt tính kháng số chủng vi sinh vật kiểm định gây bệnh đường ruột” 1.2 Mục tiêu đề tài Tuyển chọn 2-3 chủng vi khuẩn từ mẫu trầm tích biển có hoạt tính kháng số chủng vi sinh vật kiểm định gây bệnh đường ruột định danh sinh học phân tử chủng lựa chọn Nhằm chọn chủng vi sinh vật có khả tổng hợp chất có hoạt tính sinh học tốt làm tiền đề cho ứng dụng chăm sóc sức khỏe cộng đồng 1.3 Nội dung đề tài • Phân lập vi sinh vật từ mẫu trầm tích biển • Sàng lọc tuyển chọn vi khuẩn có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định gây bệnh đường ruột • Định danh chủng có hoạt tính cao 1.4 Ý nghĩa đề tài Tiến hành nghiên cứu hệ vi khuẩn từ trầm tích biển, từ tiến tới khai thác nguồn dược liệu từ vi sinh vật biển nói chung vi khuẩn từ trầm tích biển nói riêng Trònh Thj Thanh Lam Page lượt 8mm, 10mm, 18mm Trong chủng chủng GB099 có vòng phân giải rộng nhất, điều chứng tỏ khả sinh enzyme cellulase chủng GB099 tốt 4.5 Định danh vi khuẩn sinh học phân tử 4.5.1 Tách chiết AND từ vi khuẩn Từ 1,5ml dịch nuôi cấy chủng vi khuẩn chọn, qua nhiều bước xử lý thu AND genome Độ tinh sản phẩm kiểm tra phổ hấp thụ tử ngoại điện di gel agaroza 1% Hình ảnh điện di (Hình 4.9) cho thấy mẫu AND sạch, bị đứt gẫy, sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR Hình 4.8 Kết điện di đồ ADN tổng số chủng vi khuẩn (Giềng 1-3 mẫu GB082, GB094, GB099) 4.5.2 Thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR Mồi PCR thiết kế sở chọn vùng có tính bảo thủ cao Để thực điều này, tra cứu Ngân Hàng gen Quốc tế Trònh Thj Thanh Lam Page 46 dựa sở số trình tự gen 16S ARN riboxom, sử dụng số phần mềm để trợ giúp tính toán thiết kế mồi Thông số cặp mồi lựa chọn trình bày Bảng 4.4, kích thước đoạn gen thu theo tính toán lý thuyết khoảng 1500bp Bảng 4.4: Trình tự thông số cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR Mã hiệu Trình tự Tm(oC) %GC 16SF 5'AGA GTT TGA TCA TGG CTC A3' 52 44,4% 16SR 5'AAG GAG GTG ATC CAG CC3' 58 55,5% 4.5.3 Nhân gen 16S ADN riboxom Từ ADN genom chủng nghiên cứu, sử dụng cặp mồi 16SF,16SR, tiến hành PCR nhân đoạn gen 16S với chu trình nhiệt nêu phần phương pháp Với cặp mồi thiết kế dựa trình tự bảo thủ gen 16S ARN riboxom vi khuẩn khuôn ADN genom, theo lý thuyết sản phẩm PCR có độ dài xấp xỉ 1500 bp Kết điện di đồ sản phẩm PCR (Hình 4.9) cho thấy sản phẩm PCR chủng xuất băng có kích thước khoảng 1500bp Như chu trình phản ứng PCR thiết lập hoàn toàn phù hợp với mục đích nhân dòng đoạn gen 16S chủng nghiên cứu Trònh Thj Thanh Lam Page 47 Hình 4.9 Điện di đồ sản phẩm PCRgen 16S ADN riboxom chủng 1500bp Giếng 2,3,4: sản phẩm PCR chủng Giếng : thang ADN chuẩn 1Kb Invitrogen Như vậy, khuyếch đai đoạn gen 16S ARN riboxom chủng vi khuẩn có hoạt tính cao Trên sở tiến hành tinh lượng lớn sản phẩm PCR để tiến hành giải trình tự nucleotit 3.4.4 Kết giải trình tự gene 16S ba chủng vi khuẩn Trình tự gen xác định theo phương pháp Sanger&đtg Sau xử lý liệu thu qua chương trình GENE DOC, nhận trình tự hoàn chỉnh gen 16S ARN riboxom chủng • Kết trình tự đoạn gen 16S ARN riboxom chủng GB094 có độ dài 1489bp TCAACGTCAACGTGCTAGTAATGGATCTCGAGCGAGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACG GGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTT GTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCT AGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACT GAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAA CGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGG GCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGG CAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGC TCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGT GAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGA AAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGG Trònh Thj Thanh Lam Page 48 TTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCA AAGGAATTGACG GGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCC TCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGT GTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACT CTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGG CTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTC TCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCG GTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAAACCCGAAGTCGGTGAGGT AACCTTTTAGGTGCCAGCCGCCGACGGTGGGACAGATGCATGGATCACCTCGTAGAGCTAGCGTACCAA Sử dụng chương trình BLAST để so sánh trình tự đoạn gen chủng với trình tự gen 16S ARN riboxom vi khuẩn khác đăng ký Ngân hàng gen quốc tế Kết cho thấy đoạn gen có độ tương đồng cao(99%) so với gen 16S ARN riboxom chủng thuộc chi Bacillus sptrên Ngân hàng gen quốc tế • Kết trình tự đoạn gen 16S ARN riboxom chủng GB099 có độ dài 1486bp TCGGAATTGGGGCTCTATAATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGG TGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGT TTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAG TTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGA GACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACG CCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGC GGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCA Trònh Thj Thanh Lam Page 49 AGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTC AACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGA AATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAA GCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTT TCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAA GGAATTGACGGG GGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTC TGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGT CGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCT AAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCT ACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTC AGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGT GAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTA ACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGACAGATGATTGGGGGAAGTCGAACAACGTTGCTTCCCT Kết so sánh trình tự đoạn gen chủng GB099 với trình tự gen 16S ARN riboxom vi khuẩn khác đăng ký Ngân hàng gen quốc tế cho thấy, đoạn gen có độ tương đồng cao(99%) so với gen 16S ARN riboxom chủng Bacillus subtilistrên Ngân hàng gen quốc tế • Kết trình tự đoạn gen 16S ARN riboxom chủng GB090 có độ dài 1490bp GACCCATGTGCACGTACTATAATGCATGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACG GGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTT GTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCT AGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACT GAGACACGGCCCAGACTACTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAA CGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGG GCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGG Trònh Thj Thanh Lam Page 50 CAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGC TCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGT GAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGA AAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGG TTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTG GGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACG GGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCC TCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGT GTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACT CTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGG CTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTC TCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCG GTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGG TAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGACAGATGATTGGGGTGAAGTCGTAGAGTGAGCCGACCCAC Kết so sánh trình tự đoạn gen chủng GB082 với trình tự gen 16S ARN riboxom vi khuẩn khác đăng ký Ngân hàng gen quốc tế cho thấy, đoạn gen có độ tương đồng cao (99%) so với gen 16S ARN riboxom chủng Bacillus subtilis Ngân hàng gen quốc tế Từ số đặc điểm hình thái so sánh trình tự gene 16S ARN riboxom chủng phân lập Chúng kết luận chủng nghiên cứu GB094, GB099, GB082 thuộc chi Bacillus Trong thực tế, sản phẩm có chứa thành viên chi Bacillus (với liều lên đến 109 bào tử /g 109 bào tử /ml) sử dụng thương mại chế Trònh Thj Thanh Lam Page 51 phẩm sinh học, chúng cung cấp số lợi sản phẩm Lactobacillus, phổ biến chỗ chúng lưu trữ vô thời hạn hình thức đông khô (29) Probiotics thức ăn bổ sung vi sinh vật sống có lợi ảnh hưởng đến vật chủ cách cải thiện cân vi khuẩn đường ruột (21, 22) Ở số nước probiotics coi nguồn dự phòng (ví dụ, để ngăn ngừa tiêu chảy trẻ em), Đông Nam Á probiotics coi như tác nhân điều trị (29) Các nghiên cứu gần việc bổ sung bào tử B subtilis vào đường tiêu hoá, cung cấp chứng thuyết phục probiotic có tác dụng lên vật chủ với ba yếu tố tích cực sau: (i) Điều hoà miễn dịch (ii) loại trừ cạnh tranh với tác nhân gây bệnh đường tiêu hóa (iii) tiết hợp chất kháng khuẩn ngăn chặn tăng trưởng vi khuẩn có hại (21) Ngoài sản phẩm probiotic bổ sung vào thức ăn cho động vật nuôi trồng thủy sản (32, 33, 36, 37) Trònh Thj Thanh Lam Page 52 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận - Từ mẫu trầm tích biển thu Văn Phòng – Khánh Hòa, tuyển chọn 20 chủng vi khuẩn thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định - Đã chọn chủng có khả kháng chủng vi sinh vật kiểm định tốt nhất: Chủng GB082, GB094 GB099 có đường kính kháng Salmonella enterica ATCC12228 tương ứng 12mm, 15mm, 9mm;Kháng Escherichia coli ATCC25922 tương ứng với 10mm, 14mm, 6mm; Kháng Bacillus cereusATCC 13245 tương ứng với 14mm, 12mm, 15mm - Cả ba chủng có khả sinh enzyme amylase, protease cellulase với độ mạnh yếu khác nhau:Chủng GB099 có khả sinh enzyme cao với đường kính vòng phân giải với enzyme tương ứng là: 22mm, 20mm, 18mm; Chủng GB082 có khả sinh enzyme vớivòng phân giải tương ứng là: 8mm, 15mm, 8mm; Chủng GB094 có khả sinh enzyme với vòng phân giải tương ứng là: 11mm, 17mm, 10mm - Từ số đặc điểm hình thái so sánh trình tự gene 16S ARN riboxom chủng phân lập Chúng kết luậncả chủng nghiên cứu GB094, GB099, GB082 thuộc chi Bacillus 5.2 Kiến nghị - Cần có nghiên cứu thêm đặc điểm lý sinh hoá sinh để khẳng định chủng nghiên cứu GB094, GB099, GB082 thuộc loài Bacillussubtilis Trònh Thj Thanh Lam Page 53 - Tối ưu hóa điều kiện trình lên men, tách chiết chất từ dịch lên men nghiên cứu cấu trúc hoạt chất chủng: GB082, GB094, GB099 Trònh Thj Thanh Lam Page 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt BSTY - Bài giảng vi sinh vật đại cương Nguyễn Lân Dũng - Giáo trình vi sinh vật học Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượn, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty, Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Tập 1, NXBKHKT Hà Nội, 1972 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, Vi sinh vật học, NXB Giáo dục, 2007 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, Vi sinh vật học, tập II, Nhà xuất Đại học Trung học chuyên nghiệp, Hà Nội, 1977 Nguyễn Lân Dũng, Thực tập vi sinh vật học, NXB Đại học Trung học chuyên nghiệp, Hà Nội, 1993 Nguyễn Văn Cách, Công nghệ lên men chất kháng sinh, NXB Khoa học Kĩ thuật, tr.17, 2004 Nguyễn Văn Cách, Công nghệ lên men chất kháng sinh, NXB Khoa học Kĩ thuật, tr.17, 2004 Thư viện số trường đại học Sư Phạm Kĩ Thuật TP.HCM 10 Thực tập vi sinh vật chuyên ngành – PGS.TS Nguyễn Xuân Thành 11 Thực tập vi sinh vật học – Lê Quốc Tuấn - Đại Học Nông Lâm TP.HCM 12 Trần Linh Thước, Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, Thực phẩm Mỹ phẩm, NXB Giáo dục Trònh Thj Thanh Lam Page 55 13 Vi Thị Đoan Chính, Nghiên cứu khả nâng cao hoạt tính kháng sinh chủng Streptomyces rimosus R77 Streptomyces hygroscopicus 5820 kỹ thuật dung hợp tế bào trần, Luận án TS Sinh học, Viện công nghệ sinh học, HÀ Nội, 2000 14 Vi Thị Đoan Chính, Tuyển chọn nghiên cứu xạ khuẩn có khả đối kháng với số chủng vi khuẩn gây nhiễm trùng bệnh viện, Báo cáo tổng kết đề tài khoa học công nghệ cấp Bộ Mã số B2009 – TN07 – 02 Tài liệu Tiếng Anh 15 Cho JY, Williams PG, Kwon HC et al (2007) Lucentamycins A-D, cytotoxic peptides from the marine-derived actinomycete Nocardiopsis lucentensis.J Nat Prod 70:1321-1328 16 Chen M., Xiao X., Wang P., Zeng X., Wang F, Arthrobacter ardleyensis sp nov isolated from Antarctic lake sediment and deep-sea sediment, Arch Microbiol, 183, pp 301-305, 2008 17 Denora N, Potts BC, Stella VJ (2007) A mechanistic and kinetic study of the beta-lactone hydrolysis of Salinosporamide A (NPI-0052), a novel proteasome inhibitor J Pharm Sci 96:2037–2047 18 Eustaquio AS, O’Hagan D, Moore BS (2010) Engineering fluorometabolite production: fluorinase expression in Salinispora tropica yields fluorosalinosporamide J Nat Prod 73:378–382 19 Erba, E., Bergamaschi, D., Ronzoni, S., Faretta, M., Taverna, S., Bonfanti, M., Catapano, C V., Faircloth, G., Jimeno, J & D'incalci, Trònh Thj Thanh Lam Page 56 M.,Mode of action of thiocoraline, a natural marine compound with antitumour activity, British Journal of Cancer, 1999 20 Fred C Tenover, Mechanisms of antimicrobial resistance in bacteria, Amer.J Med, 119, pp.3-10, 2006 21 Fuller, R 1991 Probiotics in human medicine Gut 32:439–442 22 Fuller, R 1989 Probiotics in man and animals J Appl Bacteriol 66:365–378 23 Gontang, E A., Fenical, W & Jensen, P R., Phylogenetic diversity of Gram-positive bacteria cultured from marine sediments, Applied and Environmental Microbiology, 2007 24 Hernandez, D., Altuna, M., Cuevas, C., Aligue, R., Albericio, F & Alvarez, M.,Synthesis and antitumor activity of mechercharmycin A analogues, Journal of Medicinal Chemistry, 2008 25 Hozzein W.N., Li W.J., Ali M.I.A, Hammouda O., Mousa A.S., Xu L.H., Jiang C L., Nocardiopsis alkliphila sp nov., a novel alkaliphilic actinomycete isolated from desert soil in Egypt, Int J Syst Evol Microbial, 54, pp.247-252, 2004 26 Imada, C., Okami, Y & Hotta, K., Production of selenohomocystine as anantibiotic by a marine Bacillussp No 14 with selenomethionine resistance, Journal of Antibiotics, 2002 27 Kanoh, K., Matsuo, Y., Adachi, K., Imagawa, H., Nishizawa,M & Shizuri, Y., Mechercharmycins A and B, cytotoxic substances from marine-derived Thermoactinomycessp YM3-251, Journal of Antibiotics, 2005 Trònh Thj Thanh Lam Page 57 28 MA Elberson, F Malekzadeh, M.T Yazdi, N Kameranpour, M.R Noori – Daloii, M H Matte, M Shahamat, R.R Colwell, K.R Sower, Cellulomonas persica sp nov and Cellulomonas iranensis sp nov., mesophilic cellulose – degrading bacteria isolated from forest soils, J Syst Evol Microbiol 50, p.993, 2000 29 Mazza, P 1994 The use of Bacillus subtilis as an antidiarrhoeal microorganism Boll Chim Farm 133:3–18 30 Negri, A., Marco, E., Garcia-Hernandez, V., Domingo, A., Llamas-Saiz, A L., Porto-Sanda, S., Riguera, R., Laine, W.,David-Cordonnier, M H., Bailly, C., Garcia-Fernandez, L F., Vaquero, J J & Gago,Antitumor activity, x-ray crystal structure, and DNA binding properties of thiocoraline A, a natural bisintercalating thiodepsipeptide, Journal of Medicinal Chemistry, 2007 31 Riedlinger, J., Reicke, A., Zahner, H., Krismer, B., Bull, A T., Maldonado, L A., Ward, A C., Goodfellow, M., Bister, B., Bischoff, D., Sussmuth, R D & Fiedler, H P., Abyssomicins, inhibitors of the paraaminobenzoic acid pathway produced by the marine Verrucosisporastrain AB-18-032, Journal of Antibiotics, 2004 32 Rolfe, R D 2000 The role of probiotic cultures in the control of gastrointestinal health J Nutr 130:396S–402S 33 Rowland, I 1999 Probiotics and benefits to human health—the evidence in favour Environ Microbiol 1:375–382 Trònh Thj Thanh Lam Page 58 34 Sherif S Ebada and Peter Proksch (2012), TheChemistry of Marine Sponges Handbook of Marine Natural Products (190-294) 35 Suzumura, K., Yokoi, T., Funatsu, M., Nagai, K., Tanaka, K., Zhang, H & Suzuki, K., YM-266183 and YM-266184, novel thiopeptide antibiotics produced by Bacillus cereus isolated from a marine sponge II Structure elucidation, Journal of Antibiotics, 2003 36 Tournot, J 1989 Applications of probiotics to animal husbandry Rev Sci.Tech O.I.E (Off Int Epizoot.) 8:551–566 37 Verschuere, L., G Rombaut, P Sorgeloos, and W Verstraete 2000 Probi-otic bacteria as biological control agents in aquaculture Microbiol Mol.Biol Rev 64:655–671 38 Zhang JF, Liu JJ, Lu MQ, Cai Cj, Yang Y, Li H, Xu C, Chen GH, Rapamycin in hibits cell growth by induction of apoptosis on hepatocellular carcinomacells in vitro, Transpl Immunol, 2007 Các trang web tham khảo: 39 http://tuoitre.vn/tin/song-khoe/20071110/159-nguoi-mac-benhta/228588.html 40 http://www.ykhoa.net/binhluan/nguyenvantuan/tiemchungtieuchay_nguye nvantuan_071112.htm# 41 https://vi.wikipedia.org/wiki/Alexander_Fleming 42 http://www.visinhyhoc.net/blog/2015/06/29/hinh-the-cau-truc-va-sinh-lycua-vi-khuan/ 43 http://doc.edu.vn/tai-lieu/khoa-luan-tim-hieu-ve-vi-khuan-salmonella11369/ Trònh Thj Thanh Lam Page 59 44 http://www.vast.ac.vn/khoa-hoc-va-phat-trien/dieu-tra-co-ban/1110-dieutra-danh-gia-nguon-loi-sinh-vat-bien-viet-nam-2 45 https://voer.edu.vn/c/cau-truc-va-chuc-nang-cua-te-baoprocaryot/f65b4f19/e9cd10a0 Trònh Thj Thanh Lam Page 60