CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ UREASE -1- CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ UREASE 1.1 Enzyme urease (EC 3.5.1.5): [31, 35, 44] Urease có tên hệ thống carbamine amideohydrolase, enzyme xúc tác trình thủy phân urea thành ammoniac khí cacbonic Nó thuộc nhóm enzyme hydrolase (enzyme thủy phân) [35] Trong bảng phân loại enzyme theo quy ước quốc tế, urease mang mã số EC 3.5.1.5 đó: - Số 3: nhóm chính, nhóm hydrolase - Số 5: nhóm phụ enzyme tác dụng lên liên kết C-N, khác liên kết peptid - Số 1: phân nhóm phụ cắt amid thẳng (amidohydrolase) - Số 5: số thứ tự urease phân nhóm phụ Hình 1.1: Enzyme urease Như vậy, từ tên kí hiệu quốc tế urease, ta biết enzyme thủy phân thuộc nhóm amidase, xúc tác phản ứng thủy phân liên kết C-N, liên kết peptid theo phương trình sau [44]: Urease enzyme lần J.B.Sumner tách chiết kết tinh từ đậu rựa (jack bean_Canavalia ensiformis) vào năm 1926 Và công trình nghiên cứu đạt giải Nobel vào năm 1946 đồng thời đăït tảng cho công trình nghiên cứu urease sau [31] Hình1.2: Tinh thể urease J.B.Summer chiết tách kết tinh [31] -2- CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ UREASE 1.1.1 Khối lượng phân tử: [21] Khối lượng phân tử urease nhà nghiên cứu Joseph Evelyn xác đònh phương pháp lọc gel cột Agarose A_15m so sánh với protein biết trước khối lượng phân tử Kết cho thấy urease từ đậu nành có peak ứng với phân tử lượng khác 540.000 Da 420.000 Da, urease từ jack bean xuất peak với phân tử lượng 480.000 Da Hình 1.3: Khối lượng phân tử urease qua cột lọc gel Agarose A_15m [21] Như vậy, urease từ nguồn khác có khối lượng phân tử khác nguồn đậu nành, có tới loại urease Hai loại urease khác thành phần apoenzyme chất coenzyme không thay đổi Các apoenzyme chuỗi polypeptide hình thành từ nhiều acid amin Thành phần acid amin không giống nguồn khác giải thích cho khác khối lượng phân tử nói -3- CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ UREASE Bảng 1.1: Thành phần amino acid soybean jack bean urease [21] a: Dữ liệu Joseph Evelyn khảo sát b: Dữ liệu để so sánh (do Staples Reithel khảo sát) 1.1.2 Trung tâm hoạt động: [23, 26, 30] Theo [23] trung tâm hoạt động urease có chứa nguyên tử Ni Mỗi nguyên tử Ni nối với nguyên tử N vòng imidazole nhóm carboxylate, phân tử H2O (hình 1.4) Và nguyên tử Ni đóng vai trò quan trọng việc xúc tác phản ứng urease Đó lí mà urease gọi “Nikel dependent enzyme” Hình 1.4: Trung tâm hoạt động urease (Ni: cầu màu xanh) [23] -4- CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ UREASE Tuy nhiên urease có nguồn gốc khác urease từ vi khuẩn Bacillus pasteurii trung tâm hoạt động chứa ion kim loại Zn2+ [26], Klebsiella aerogenes có cofactor Cu2+ [30] hình bên dưới: Hình 1.5: Urease từ K aerogenes [30] Hình1.6: Urease từ Bacillus pasteurii [26] 1.1.3 Cơ chế xúc tác: [42] Cơ chế trình xúc tác phản ứng urease theo phương trình [42]: -5- CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ UREASE Cụ thể xảy trung tâm hoạt động sau: Hình 1.7: Cơ chế xúc tác urease [42] Theo sơ đồ ta thấy: ban đầu phân tử urea công tạo liên kết với nguyên tử Ni đồng thời có phân tử H2O giải phóng Tiếp theo xếp lại điện tử, hình thành mối liên kết trung tâm hoạt động Cuối tái cấu trúc trung tâm hoạt động urease với tham gia phân tử nước, đẩy gốc carbamate đồng thời giải phóng phân tử NH3 Như vậy, vai trò ion kim loại Ni quan trọng việc tạo liên kết enzyme với chất giai đoạn tạo phức chất trung gian Đây cofactor urease -6- CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ UREASE 1.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng urease: [1, 10, 14, 19, 23, 44] 1.1.4.1 Ảnh hưởng nồng độ enzyme: [14] Nói chung điều kiện thừa chất, vận tốc phản ứng phụ thuộc tuyến V= k [E] tính vào nồng độ enzyme: V : vận tốc phản ứng [E] : nồng độ enzyme Cũng có trường hợp nồng độ enzyme lớn, vận tốc phản ứng tăng chậm 1.1.4.2 nh hưởng nồng độ chất, Michaelis_Menten: [14, 44] Phương trình Michaelis_Menten: v= v max × [ S ] K m + [S ] Trong đó: Km : số Michaelis, số lực enzyme chất, đặc trưng loại enzyme loại chất vmax : vận tốc phản ứng đạt cực đại [S] : nồng độ chất Từ phương trình ta xét đến trường hợp: - Nếu [S] > Km thì: v = vmax: tức vận tốc phản ứng đạt cực đại, không phụ thuộc [S] Như [S] đủ lớn đến mức đó, tiếp tục tăng [S], v không tăng theo - Nếu [S] = Km v = v max : vận tốc phản ứng nửa vận tốc cực đại Hoặc ta xác đònh Km Vmax theo phương trình viết lại từ phương trình sau: K 1 = + m × vi v max v max [ S ] Từ ta biểu diễn phụ thuộc 1 theo phương trình đường vi [S ] thẳng xác đònh Km, Vmax đồ thò bên Trên sở đó, thí nghiệm trường đại học Regensburg (Đức) việc xác đònh Km, Vmax có kết sau [44]: Kết suy từ đồ thò (hình 1.8): 400C 500C Km (mol.L-1) 2.41 * 10-2 2.41 * 10-2 Vmax (mS.min-1) 0.5118 0.7868 -8- CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ UREASE Hình 1.8: Đồ thò xác đònh Km Vmax hai nhiệt độ khác [44] (1): 400C 1.1.4.3 (2): 500C nh hưởng nhiệt độ: [14, 17, 23, 44] Giống phản ứng hóa học, nhiệt độ tăng, vận tốc chuyển động phân tử tăng, tiếp xúc phân tử tăng nên vận tốc phản ứng tăng Tuy nhiên chất enzyme protein nên nhiệt độ cao làm biến tính protein, enzyme hoạt tính Do đó, enzyme tồn nhiệt độ mà hoạt tính cao nhất, gọi là: nhiệt độ tối thích topt Theo nghiên cứu từ đậu rựa (jack bean) nhiệt độ topt vào khoảng 4550 C [17] Tuy nhiên nhiệt độ topt urease không cố đònh, mà phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: nguồn thu nhận, nồng độ enzyme, nồng độ chất, pH, thời gian phản ứng… Người ta thấy độ bền nhiệt urease tăng có mặt chất L_cystein urease dung dòch loãng chất thường bền nhiệt nhất, dạng bột khô có chất bền nhiệt [23] nhiệt độ thấp, hoạt tính urease giảm không bò biến tính -9- CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ UREASE topt Cũng thí nghiệm trường đại học Regensburg (Đức) xác đònh thực thiết bò sau [44]: Hình 1.9: Thiết bò thí nghiệm xác đònh topt urease [44] Theo sơ đồ trên, nhiệt độ đo (2) với trợ giúp tế bào bán dẫn (1) tất nối với điều kiển gọi CHEMBOX Nhiệt độ khảo sát 20, 30, 40, 50, 600C Kết thu nhà nghiên cứu topt = 500C đồ thò hình bên: Hình 1.10: Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính urease [44] - 10 - CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ™ Phương pháp 2: Bảng 3.23: Điều kiện thu nhận urease phương pháp Giai đoạn Điều kiện thực Trích ly - Dung môi trích ly: 20mM sodium phosphate, pH 7.5, 1mM EDTA, 2mM 2_mercaptoethanol - Tỉ lệ bột/dung môi = 1/9 (g/ml) - Nhiệt độ: 40 - Thời gian: 1h - Loại bỏ bã: li tâm 15.000v/ph 15ph, 40C Tủa acetone - Tỉ lệ dung môi 20% so với dòch trích - Nhiệt độ: 40C - Thời gian: 2h - Loại bỏ tủa: li tâm 5000 v/ph 15ph, 40C Thẩm tích - Túi thẩm tích: cellophane - Dung môi: 20mM sodium phosphate, pH 7.5, 1mM EDTA, 5mM 2_mercaptoethanol - Nhiệt độ: 40C - Thời gian: 12h Sắc ký lọc - Gel chạy sắc ký Sephadex G_100 gel - Kích thước cộtù: đường kính x chiều dài = 16x300mm - Dung dòch rửa giải: 20mM sodium phosphate, pH 7.5, 1mM EDTA, 5mM 2_mercaptoethanol, 300mM NaCl - 74 - CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Bảng 3.24: Kết thu nhận urease phương pháp Thể tích/ Hàm Bột Hoạt tính Hoạt Hoạt tính Hiệu Khối lượng tính toàn riêng suất lượng protein phần (IU/g (%) (g) (IU) protein) chưa 5g 1.89 59.63 IU/g 298.15 157.75 100 1.78 72.88 IU/g 298.08 167.93 99.98 tách béo Bột tách 4.09g béo Trích ly 28.6 ml 0.51 IU/ml 143.15 281.69 48.01 Tủa aceton 28.6 ml 0.30 4.04 IU/ml 125.40 385.13 42.06 Thẩm tích 26.8 ml 0.28 4.5 IU/ml 120.78 436.9 40.51 Sắc ký lọc 85 ml 0.031 1.406 IU/ml 119.51 3855.16 40.08 gel Phương pháp phức tạp cho kết vượt trội so với phương pháp Giai đoạn tinh urease sắc ký lọc gel cho hoạt tính riêng cao, nhiên lượng dòch enzyme thu qua lần sắc ký Để bảo quản tốt, chế phẩm nên tiếp tục siêu lọc hay sấy thăng hoa có chế độ bảo quản tốt Tuy nhiên điều kiện thời gian có hạn nên trình khảo sát dừng lại 3.5.2 Các tính chất chế phẩm: ™ Nhiệt độ tối thích: 800C Nhiệt độ 900C : enzyme bò biến tính giảm hoạt tính mạnh Nhiệt độ thấp 100C : enzyme có hoạt tính thấp không bò biến tính ™ pH tối thích: 7.5 pH thấp (pH 5, pH 6) hay pH cao (pH 8.7): làm biến tính enzyme, hoạt tính giảm mạnh ™ Giá trò động học: điều kiện nhiệt độ 300C, pH Vmax = 2.45 (μmol/ph/ml) Km = 0.167 (%) - 75 - CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN - 76 - CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN Việc nghiên cứu thu nhận urease từ đậu nành, rút số kết luận sau: 4.1 Trích ly urease từ nguyên liệu đậu nành tách béo thực phương pháp sau: ™ Trích ly đệm phosphate 1/15M, pH chứa 5.10-3M EDTA L_cystein với tỉ lệ dung môi 6:100 (g/ml) nhiệt độ phòng 1h cho kết sau: o Hiệu suất thu hồi : 26.4% o Hoạt tính : 1.46 IU/ml o Hoạt tính riêng : 165.72 IU/g protein ™ Trích ly dung môi: sodium phosphate 20 mM, pH 7.5 có bổ sung 1mM EDTA, 2mM 2_mercaptoethanol với tỉ lệ: 1/9 (g/ml), 40C 1h Kết thu được: 4.2 o Hiệu suất thu hồi : 48.01% o Hoạt tính : IU/ml o Hoạt tính riêng : 281.69 IU/g protein Để kết tủa thu chế phẩm thô: Sử dụng dung môi ethanol, với tỉ lệ 1/2 (v/v), 40C 30ph Kết tủa có: o Hiệu suất thu hồi : 26% o Hoạt tính : 2.88 IU/ml o Hoạt tính riêng : 223.95 IU/g protein - 77 - CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN 4.3 Tinh sắc ký lọc gel: Thực sắc ký lọc gel với: o Hạt gel : gel Sephadex G_100 o Kích thước cột : đường kính 16mm, chiều cao 300 mm o Dung dòch rửa giải : 20mM sodium phosphate, pH 7.5 chứa 1mM EDTA, 5mM 2_mercaptoethanol, 300mM NaCl Kết quả: 4.4 o Hiệu suất thu hồi : 40% o Hoạt tính : 1.41 IU/ml o Hoạt tính riêng : 3855.16 IU/g protein Đề nghò: Vì thời gian thực đề tài điều kiện kỹ thuật phòng thí nghiệm có hạn nên bước đầu giai đoạn tinh sắc ký lọc gel Để chế phẩm có hoạt tính riêng cao hơn, dòch enzyme nên tiếp tục qua bước: sắc ký trao đổi ion, sắc ký hấp phụ… phương pháp tham khảo (mục 1.3) Tuy nhiên hy vọng với kết bước đầu giúp ích cho bạn muốn nghiên cứu sâu enzyme urease - 78 - PHỤ LỤC PHơ LơC Các kết đo đạt trình thí nghiệm Hoạt tính urease bột đậu nành trước sau tách béo: Vtrắng (ml) Bột trước 9.5 tách béo Bột sau tách 9.7 béo Mẫu 14.1 Vmẫu (ml) Mẫu Mẫu 14.4 14.3 Trung bình 14.27 Hoạt tính (IU/g) 59.63 15.3 15.8 15.53 72.88 15.5 Hoạt tính urease bột sau trích ly nước dung dòch đệm A (phương pháp 1): Dung môi Nước Dung đệm A Vtrắng (ml) 1.2 dòch 2.9 Vmẫu (ml) Mẫu 2.9 7.8 Mẫu 2.4 7.7 Mẫu 2.7 7.7 Trung bình 2.67 7.73 Hoạt tính (UI/ml) 0.61 2.01 Hoạt tính urease phụ thuộc tỉ lệ dung môi trích ly (phương pháp 1): Tỉ lệ dung môi (g/ml) Vtrắng (ml) Vmẫu Mẫu (ml) Mẫu Mẫu Trung bình Hoạt tính (IU/ml) 0.5/ 20 1.9 2.8 3.0 2.7 2.83 1.16 1/20 2.3 3.3 3.5 3.5 3.43 1.41 1.6/20 2.8 4.6 4.7 4.6 4.67 2.34 2/20 3.1 5.3 5.4 5.3 5.33 2.79 2.4/20 3.8 6.1 6.0 6.2 6.1 2.88 Hoạt tính urease bã trích ly lần lần (phương pháp 1): Bã lần Bã lần Vtrắng (ml) 0.5 0.2 Vmẫu (ml) Mẫu 2.3 1.6 Mẫu 2.4 1.7 - 79 - Mẫu 2.2 1.8 Trung bình 2.3 1.7 Hoạt tính (IU/g) 22.5 18.75 PHỤ LỤC Hàm lượng protein mẫu sau kết tủa tỉ lệ dung môi khác (phương pháp 1): Tỉ lệ 1:1 Tỉ lệ 1:2 Tỉ lệ 1:3 Tỉ lệ 1:4 Độ hấp thu (A) Độ hấp thu trung bình (A) Hàm lượng Protein (μg/ml) Độ hấp thu (A) Độ hấp thu trung bình (A) Hàm lượng Protein (μg/ml) Độ hấp thu (A) Độ hấp thu trung bình (A) Hàm lượng protein (μg/ml) Độ hấp thu (A) Độ hấp thu trung bình (A) Hàm lượng protein (μg/ml) 0.778 0.921 8246.3 1.077 0.875 7807.1 0.739 0.747 6573.1 0.843 0.824 7316.7 0.894 1.090 0.808 0.741 0.751 0.750 0.826 0.804 Hoạt tính urease phụ thuộc tỉ lệ dung môi kết tủa (phương pháp 1): Tỉ lệ Vnền (ml) Vmẫu (ml) 1:1 0.7 2.4 2.3 2.2 2.3 Mẫu Mẫu Mẫu Trung bình Hoạt tính (IU/ml) 1:2 0.8 3.2 3.1 3.0 3.12 2.88 1:3 0.9 3.0 3.1 3.1 3.07 2.71 1:4 1.2 3.3 3.5 3.5 3.43 2.79 Hoạt tính urease dòch trích tỉ lệ dung môi khác (phương pháp 2): Tỉ lệ dung môi (g/ml) Vtrắng (ml) Vmẫu Mẫu (ml) Mẫu Mẫu Trung bình Hoạt tính (IU/ml) 1:6 1.6 6.3 6.5 6.3 6.37 5.96 1:8 1.6 6.2 6.1 5.7 6.0 5.5 1:10 1.1 4.8 4.4 4.6 4.6 4.38 - 80 - 1:12 0.8 4.0 3.8 3.9 3.9 3.88 1:14 1.0 3.7 4.0 4.0 3.9 3.63 1:16 0.6 3.1 3.5 3.2 3.3 3.38 PHỤ LỤC Hoạt tính urease sau trích ly (tỉ lệ 1:9) (phương pháp 2): Vtrắng (ml) Vmẫu (ml) Mẫu 6.3 Mẫu 5.8 Mẫu 5.9 Trung bình 6.0 Hoạt tính (IU/ml) 5.00 Hoạt tính urease dòch sau loại tủa acetone: Vtrắng (ml) 1.3 Vmẫu (ml) Mẫu 4.4 Mẫu 4.6 Mẫu 4.6 Trung bình 4.53 Hoạt tính (IU/ml) 4.04 Trung bình 4.9 Hoạt tính (IU/ml) 4.5 10 Hoạt tính urease dòch sau thẩm tích: Vtrắng (ml) 1.3 Vmẫu (ml) Mẫu 4.9 Mẫu 5.1 Mẫu 4.7 11 Tinh urease sắc lý lọc gel: Phân đoạn 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Độ hấp thu V trắng (ml) V mẫu (ml) Hoạt tính (IU/ml) 0.018 0.25 0.65 0.5 0.024 0.35 0.55 0.25 0.059 0.3 1.2 1.125 0.06 0.3 2.125 0.08 0.3 1.7 1.75 0.087 0.3 0.8 0.625 0.068 0.2 0.6 0.5 0.143 0.5 0.7 0.25 0.224 0.4 0.6 0.25 0.232 0.2 0.7 0.625 0.191 0.3 0.6 0.375 0.107 0.3 0.6 0.375 0.05 0.3 0.6 0.375 0.07 0.3 0.7 0.5 0.006 0.1 0.1 -0.032 0.008 0.1 0.1 -0.027 0.011 0.1 0.1 - 81 - PHỤ LỤC 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 -0.009 -0.032 0.039 0.094 -0.007 0.003 -0.013 -0.022 0.025 0.013 0.01 -0.035 -0.031 -0.047 -0.032 -0.008 0.002 -0.038 -0.034 0.009 -0.035 0.2 0.4 0.1 0.1 0.1 0.2 0.1 0.1 - 0.4 0.7 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 - 0 0.25 0.375 0 0 0 0 0 0 0 0 Các mẫu có độ hấp thu âm chứng tỏ protein nên không xác đònh hoạt tính 12 Hoạt tính urease thay đổi theo nhiệt độ: Nhiệt độ 10oC 200C 300C 400C 450C 500C 600C 700C 80oC 90oC Vtrắng (ml) Vmẫu (ml) Mẫu Mẫu Mẫu 1.6 1.6 1.6 1.6 1.6 1.6 1.6 1.6 1.6 1.6 2.3 2.5 2.3 2.9 3.2 3.1 3.1 3.6 3.8 2.4 2.4 2.6 2.9 2.9 3.3 3.2 3.2 3.7 3.9 2.5 2.3 2.5 2.8 2.8 3.2 3.3 3.2 3.7 4.0 2.4 - 82 - Trung bình 2.33 2.53 2.77 2.87 3.23 3.2 3.17 3.67 3.9 2.43 Hoạt tính (IU/ml) 0.917 1.168 1.463 1.59 2.038 2.000 1.963 2.588 2.875 1.038 Tμi liƯu tham kh¶o Nguyễn Trọng Cẩn, Công nghệ enzyme, NXB Nông Nghiệp Tp.HCM, 1998, 534 trang Nguyễn Hữu Chấn, Enzyme xúc tác sinh học, NXB Y học, Hà Nội, 1983, 465 trang Lâm Thò Kim Châu, Văn Đức Chính, Ngô Đại Nghiệp, Thực tập lớn sinh hóa, NXB Đại học Quốc gia TP.HCM, 2004, 128 trang Trònh Cương, Chế biến đậu nành, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, 1963, 48 trang Ngô Thế Dân, Cây đậu tương, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội, 1998, 143 trang Nguyễn Thò Thanh Hải, Nghiên cứu ứng dụng urease để phát urea, Luận văn tốt nghiệp, Trường Đại học Bách Khoa TP.HCM, 2003, 62 trang Lê Đô Hoàng, Cây đậu nành, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, 1977, 137 trang Nguyễn Thò Việt Hương, Tách chiết urease từ đậu nành ứng dụng để đònh lượng urea bệnh phẩm, Luận án thạc sỹ, Đại học Khoa Học Tự Nhiên, 1999, 92 trang Dương Thanh Liêm, Cây họ đậu nhiệt đới làm thức ăn gia súc, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội, 1982, 364 trang 10 Nguyễn Đức Lượng, Công nghệ enzyme, NXB Đại học Quốc Gia Tp.HCM, 2004, 534 trang 11 Tăng Bội Ngọc, Nghiên cứu thu nhận urease từ đậu nành, Luận văn tốt nghiệp, Trường Đại học Bách Khoa TP.HCM, 2003, 53 trang 12 Nguyễn Tiến Thắng cộng sự, Công nghệ sinh học số ứng dụng Việt Nam, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, 1994, 395 trang 13 Nguyễn Tiến Thắng, Giáo trình sinh hóa đại, NXB Giáo dục, Hà Nội, 1998, 437 trang - 83 - 14 Lê Ngọc Tú, Hóa Sinh Công Nghiệp, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, 2002 15 Boyer P., The Enzymes, Vol.IV, New York, 1971 16 Fishbein W., Urease Catalysis, The Journal of Biological Chemistry, Vol 244, No 5, U.S.A, 1969, pp 1188 –1193 17 Fishbein W., Nagarajan K and Scurzi W., Urease Catalysis and Structure, The Journal of Biological Chemistry, Vol 248, No 22, U.S.A, 1978, pp 7870–7877 18 Follmer C., Real_Guerra R and German E., Jackbean, soybean and Bacillus pasteurii Urease, Center of Biotechnology, Porto Alegre, Brazil, 2004, pp 1357 – 1363 19 Howell F and Sumner J.B., The Specific effects of buffers upon urease activity, Cornell University Medical College, Ithaca, 1934, pp 619 – 626 20 Icatlo C., Kuroki Jr., Kobayashi C and Kodama Y., Affinity Purification of Helicobacter pylori Urease, The Immunology Research Institute, Gifu City, Japan, 1998, pp 18120 – 18128 21 Joseph C and Evelyn A., Comparions of Soybean Urease Isolated from Seed and Tissue, The Journal of Biological Chemistry, Vol 254, No 5, U.S.A, 1979, pp 1707–1715 22 Kirk J.S., The concentration of soybean urease A new method for the purification of enzymes, Cornell University Medical College, Ithaca, 1933, pp 619 – 626 23 Manunza B., Deiana S and Pintore M., A Molecular Modeling Study of the Urease Active Site, University of Bologna, Italy, 2001, pp 49280 – 49325 24 Marshall E.K., On soybean urease: The effect of dilution, acids, alkalies and ethyl alcohol, The Laboratory of Physiological Chemistry, Johns Hopkins University, 1974, pp 351 – 361 25 Reginald M., Slyke D., Manometric, Titrimetric and Colorimetric Methods for Measurement of Urease Activity, The Hospital of Rockefeller Institute of Medical Research, New York, 1944, pp 623 – 642 - 84 - 26 Remaut H., Safarov N., Ciurli S., Structural Basis for Ni2+ Transport and Assembly of the Urease Active Site by the Methallochaperone UreE from Baciluss pasteurii, The Department of Agro_Enviromental Science and Technology, University of Bologna, Italy, 2001, pp 49365 – 49370 27 Roe S., Protein purification techniques, Oxford university Press, 2001, 262p 28 Schmidt E.G., The inactivation of urease, The Department of Biological Chemistry of the University of Maryland School of Medicine, Baltimore, 1968, pp 53 – 61 29 Sizer W., The Activation energy of urea hydrolysis catalyzed by soybean urease, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, 1939, pp 209 – 218 30 Song H.K., Scott B and Robert H., Crystal Structure of Klebsiella aerogenes UreE, a Nickel-binding Metallochaperone for Urease Activation, Michigan State University, East Michgan, 2001, pp 49359 – 49364 31 Sumner J.B., The isolation and crystallization of the enzyme urease, Corell University Medical College, Ithaca, 1932, pp 316 – 325 32 Sumner J.B., Gralen N., Britta I., The Molecular weight of urease, University of Upsala, Sweden, 1938 33 Todd J., Robert H., Competitive Inhibitors of Klebesiella aerogenes Urease, The Journal of Biological Chemistry, Vol 264, No 27, U.S.A, 1989, pp 15835 – 15842 34 www.cup.uni_muenchen.de 35 www.enzymes.co.uk 36 www.expasy.ch 37 www.google.com 38 www.jbc.org.com 39 www.ncbi.nlm.nih.gov 40 www.molbio.info.nih.gov 41 www.rcsb.org/pdb (Protein Data Bank) - 85 - 42 www.sci.ccny.cuny.edu 43 www.sigmaaldrich.com 44 www.uni-regensburg.de 45 www.Uwec.edu/Academic/Chemistry/chemistry.html 46 www.wynboer.co.za - 86 - Mơc lơc Lời mở đầu i Mục lục bảng ………………………………………………………………………………………………………………………………………… ii Mục lục hình iii Tóm tắt luận văn ……………………… ………………………………………………………………………………………………… iv Chương 1: Tổng quan urease .1 1.1 Enzyme urease 1.1.1 Khối lượng phân tử 1.1.2 Trung tâm hoạt động 1.1.3 Cơ chế xúc tác 1.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng urease 1.2 Các phương pháp thu nhận urease: 15 1.2.1 1.3 Nguồn thu nhận 15 Tách chiết tinh chế enzyme 21 1.3.1 Phương pháp 23 1.3.2 Phương pháp 24 1.3.3 Phương pháp 25 1.3.4 Phương pháp 26 1.4 Các phương pháp xác đònh hoạt tính urease 27 1.4.1 Xác đònh hoạt tính urease dựa việc đònh lượng NH3 28 1.4.2 Xác đònh hoạt tính urease cách đònh lượng CO2 30 1.5 Ứng dụng enzyme urease 31 1.5.1 Trong nông nghiệp 31 1.5.2 Trong thực phẩm 31 1.5.3 Trong y học 31 Chương 2: Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu .32 2.1 Nguyên liệu 33 2.2 Phương pháp nghiên cứu 33 2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 33 2.2.2 Phương pháp thu nhận urease 34 2.2.3 Các phương pháp tinh enzyme 36 2.2.4 Các phương pháp phân tích hóa học 38 2.2.5 Phương pháp nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến urease 46 2.2.6 Phương pháp xử lý số liệu 47 Chương 3: Kết bàn luận 48 3.1 Khảo sát nguyên liệu 49 3.1.1 Khử lipid 49 3.1.2 Thành phần protein 50 3.1.3 Hoạt tính urease bột trước sau tách béo 51 3.2 Khảo sát trình thu nhận chế phẩm urease phương pháp 52 3.2.1 Khảo sát trích ly enzyme 52 3.2.2 Khảo sát kết tủa urease 57 3.2.3 Tổng kết kết thu nhận urease phương pháp 59 3.3 Khảo sát trình thu nhận urease phương pháp 60 3.3.1 Khảo sát trích ly urease từ bột tách béo 60 3.3.2 Tủa acetone 62 3.3.3 Thẩm tích 62 3.3.4 Tinh urease sắc ký lọc gel 63 3.3.5 Tổng kết kết thu nhận urease phương pháp 67 3.4 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính urease 68 3.4.1 Ảnh hưởng nồng độ chất 68 3.4.2 Ảnh hưởng nhiệt độ 70 3.4.3 Ảnh hưởng pH 71 3.5 Tổng kết kết 72 3.5.1 Phương pháp thu nhận urease 72 3.5.2 Các tính chất chế phẩm 75 Chương 4: Kết luận 76 Phụ lục 79 Tài liệu tham khảo .83