HÓA SINH THỰC PHẨM CHƯƠNG ENZYME KHÁI NIỆM CHUNG VỀ ENZYME Đònh nghóa Enzyme Enzym chất xúc tác sinh học có chất protein Enzym có tính chất protein M Enzym = 10.000 – 1.000.000 D Ngắn ribonuclease 12.700 D Dễ tan, có cấu trúc hình cầu 200 Enzym / 2000 Enzym thu dạng tinh thể KHÁI NIỆM CHUNG VỀ ENZYME Phân loại Enzym Enzym thành phần (Enzym cấu tử, Enzym đơn giản) cấu tạo từ acid amin, từ chuỗi polypeptid (protein đơn giản) Enzym thành phần (Enzym cấu tử, Enzym phức tạp) chuỗi polypeptid có phần phi protein (protein phức tạp) Chuỗi polypeptid: chất mang, Apoenzym, Apoferment Phi protein: nhóm hoạt hóa, Coenzym – cofactor, Coferment Coenzym: Cofactor: phần phi protein có liên kết lỏng lẻo với apoenzym, dễ dàng tách dùng phương pháp thẩm tích (đa số vitamin) phần phi protein gắn với apoenzym liên kết đồng hóa trò bền vững tách độc lập (ion kim loại) KHÁI NIỆM CHUNG VỀ ENZYME Cấu tạo Enzym Trung tâm hoạt động (TTHĐ) Phần cấu trúc mà nơi trực tiếp xảy phản ứng xúc tác Enzym cấu tử TTHĐ nhóm đònh chức có hoạt tính cao, không tham gia vào việc tạo thành trục chuỗi polypeptid Các nhóm xa vơí cấu trúc bậc 3,4 chúng tiến lại gần hình thành TTHĐ Nhóm –SH cystein Nhóm –OH serin, tyrosin Nhóm ε-NH2 lysin Nhóm –COOH acid glutamic, aspartic Vòng himidazol histidin Indol tryptophan Cấu tạo Enzym KHÁI NIỆM CHUNG VỀ ENZYME Trung tâm hoạt động (TTHĐ) Enzym cấu tử Cấu trúc không gian E bò biến đổi khả hoạt động TTHĐ hoạt tính E bò biến đổi Một Enzym có hay nhiều TTHĐ Các TTHĐ Enzym giống khác cấu tạo chức Enzym hai cấu tử TTHĐ gồm nhóm ngoại (coenzym) nhóm chức acid amin Coenzym đònh kiểu phản ứng hóa học trực tiếp tham gia kết hợp với chất (thủy phân, oxy hóa, tổng hợp, phân ly,…) Apoenzym chọn lọc chất (protein, glucid,…) ảnh hưởng đến cường độ phản ứng Cấu tạo Enzym KHÁI NIỆM CHUNG VỀ ENZYME Trung tâm hoạt động (TTHĐ) Cơ chế ổ khóa, chìa khóa (mô hình Fisher) TTHĐ E có cấu tạo đònh cho phép chất có cấu tạo tương ứng kết hợp vào, chìa khóa tra vào ổ khóa Không giải thích kiểu đặc hiệu nhóm Cấu tạo Enzyme KHÁI NIỆM CHUNG VỀ ENZYME Trung tâm hoạt động (TTHĐ) Cơ chế Koshland (mô hình tiếp xúc cảm ứng) TTHĐ hthành trình tiếp xúc E chất Khi chưa có chất, nhóm chức TTHĐ chưa tư sẵn sàng hoạt động Khi tiếp xúc với chất, cảm ứng không gian biến đổi hình dạng TTHĐ phù hợp với chất Giải thích thỏa đáng tính đặc hiệu nhóm KHÁI NIỆM CHUNG VỀ ENZYME Cấu tạo Enzyme Trung tâm dò lập thể (TTDLT) Có nhiệm vụ điều chỉnh hoạt tính E Gọi trung tâm điều chỉnh hay trung tâm dò lập thể TTHĐ TTDLT cấu trúc riêng biệt, có tác dụng tương hỗ TTDLT dương: kết hợp với chất dò lập thể làm tăng hoạt tính Enzyme Enzyme từ trạng thái không hoạt thành hoạt động TTDLT âm: kết hợp với chất dò lập thể, Enzyme giảm hay hoạt tính KHÁI NIỆM CHUNG VỀ ENZYME Cấu tạo Enzyme Phức hợp Enzyme Nhiều chu trình chuyển hóa thể sinh vật gồm nhiều phản ứng liên tiếp nhau, sản phẩm phản ứng lại chất phản ứng sau Mỗi phản ứng Enzym xúc tác, chu trình có nhiều loại Enzym hoạt động Các Enzym hoạt động riêng lẻ, kết hợp với thành phức hợp Enzym Phức hợp Enzym tổ hợp nhiều Enzym xúc tác cho trình sinh hóa Cấu tạo Enzyme Phức hợp Enzyme KHÁI NIỆM CHUNG VỀ ENZYME TÍNH ĐẶC HIỆU CỦA ENZYME Phân loại Enzym theo tính đặc hiệu Liase: (E xúc tác phản ứng phân cắt H 2O) Tên chất + tên nhóm bò cắt + Liase Decarboxylase: cắt CO2 Hydratase: loại bỏ kết hợp H2O Isomerase: (E xúc tác phản ứng đồng phân hóa) Glucophosphatisomerase Ligase /synthetase: (E xúc tác phản ứng tổng hợp) Asparagin synthetase: tổng hợp asparagin Glutamin synthetase: tổng hợp glutamin ỨNG DỤNG CỦA ENZYM Phản ứng thủy phân Đặc điểm phản ứng thủy phân Cơ chất: protein, glucid, lipid,… chẵn Enzym: Enzym cấu tử, có nhiều trung tâm hoạt động, cấu trúc bậc 4, số monomer ỨNG DỤNG CỦA ENZYME Phản ứng thủy phân Một số Enzym thủy phân Protease E thủy phân protein thành peptid acid amin Endoenzy: cắt từ mạch – pepsin (endopeptidase) Exoenzym: cắt từ đầu mạch – exopeptidase, carboxylpeptidase Các loại protease có nhiều ứng dụng Enzym Rennin = chimotrypsin (trong dày) Enzym Bromelin (trong dứa) Enzym Papain (trong vỏ đu đủ) Các sản phẩm dùng protease QTCN Tương: dung dòch a.amin từ protein đậu nành Nước mắm: dung dòch a.amin từ protein cá Công nghệ sữa: phomai Bánh: a.amin cho phản ứng Maillard ỨNG DỤNG CỦA ENZYME Phản ứng thủy phân Một số Enzym thủy phân Amilase Có dạng α , β γ amilase α-amilase (3.2.1.1): endoglucozidase Có nước bọt, hạt nảy mầm, tụy tạng, nấm mốc, VK Bền nhiệt: t0 > 700C, bền với acid Cắt liên kết 1,4-glucoside Không cắt liên kết 1,6-glucoside Sản phẩm thủy phân: glucose, alpha dextrin (mạch ngắn) Làm độ nhớt dòch hồ giảm nhanh nên gọi E dòch hóa ỨNG DỤNG CỦA ENZYME Phản ứng thủy phân Một số Enzym thủy phân Amilase Có dạng α , β γ amilase β-amylase (3.2.1.2) : exoglucozidase Có thực vật (hạt,củ) T0opt thấp = 50 – 600C, t0=700C hoạt tính, bền acid Cắt đứt liên kết 1,4-glucoside từ đầu không khử gốc Chỉ phân giải 40-50% tinh bột, gọi E đường hóa Sản phẩm thủy phân: maltose, beta dextrin (mạch dài) γ-amylase (3.2.1.3): glucoamylase Có vi sinh vật, gan động vật pHopt = 3.5-5.5 , t0= 60-700C Thủy phân gốc glucose, liên kết 1,4 1,6-glucoside Sản phẩm thủy phân: glucose ỨNG DỤNG CỦA ENZYME Phản ứng thủy phân Một số Enzym thủy phân Amilase Có dạng α , β γ amilase Ứng dụng E.amylase Rượu bia: đường hóa tinh bột – malt đại mạch Đường nha, siro glucose; thủy phân tinh bột Cơm rượu , bánh mì: cắt phần mạch AM AP nở xốp ỨNG DỤNG CỦA ENZYME Phản ứng thủy phân Một số Enzym thủy phân Pectinase E Thủy phân pectin E pectinase = E pectinesterase + E polygalacturonase E.pectinesterase COOCH3 O OH H H H OH H OH O COOH O H H H OH H OH H O H OH H O H OH E.polygalacturonase Ứng dụng Nước ép trái cây: giảm độ nhớt dòch ép O COOCH3 O H H H OH H OH ỨNG DỤNG CỦA ENZYME Phản ứng thủy phân Một số Enzym thủy phân Cellulase Thủy phân cellulose tạo sản phẩm đường Cellulase có bao tử ĐV nhai lại, Thu nhận từ canh trường nmốc Asp Oryzae, Asp Awamori,… Ứng dụng Bổ sung vào SP thực phẩm người động vật giúp thức ăn dễ tiêu hóa Phá hủy màng tế bào thực vật, làm tăng hiệu suất trích ly chất bên tế bào Thủy phân phế liệu gỗ làm thức ăn gia súc ỨNG DỤNG CỦA ENZYME Phản ứng oxy hóa khử Sử dụng E oxy hóa khử để tạo màu sắc, hương vò đặc trưng Trà Chocolate Rượu, bia, giấm tannin - xanh, vàng, đỏ, đen polyphenol, phản ứng Maillard alcohol, acid hữu cơ,… Các loại E oxy hóa khử E Ascorbatoxydase (oxy hóa vitamin C) E Polyphenoloxydase (oxy hóa polyphenol) Glucooxydase (oxy hóa glucose (loại oxy SP giàu protein) THU NHẬN ENZYME Nguyên liệu Tế bào động vật, Tế bào thực vật Tế bào vi sinh vật (n.mốc, VK) Quá trình Nuôi cấy lấy sinh khối hay canh trường Tách E khỏi nguyên liệu phá vỡ vỏ tế bào, trích ly Tinh E muối bão hòa, màng membrane, sắc ký cột, sắc ký điện di,… Bảo quản E điều kiện lạnh, kín THU NHẬN ENZYME Cố đònh Enzym Hấp phụ lên chất mang có phân tử lượng lớn Gắn mạng gel Gắn liên kết đồng hóa trò Encapsul hóa XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME Hoạt tính amilase theo wohlgemuth Nguyên tắc Đơn vò Wohlgemuth: lượng Enzyme thấp để thủy phân 1mg tinh bột sau 30 phút 37oC có Cl- làm chất hoạt hóa Tiến hành  Chuẩn bò dãy 10 ống nghiệm với nồng độ E giảm dần (giảm lần ống sau) có chất hoạt hóa NaCl lượng chất tinh bột 10 ống  Tiến hành phản ứng E tủ điều nhiệt 37 oC Sau 30 phút lấy ra, thêm vào ống nghiệm 1ml H 2SO4 10% (để chấm dứt hoạt tính Enzym) giọt I2/KI, lắc  Ghi nhận ống nghiệm có nồng độ enzyme nhỏ xảy thủy phân hoàn toàn tinh bột, tức ống màu vàng, sau ống có màu đỏ tím (chưa thủy phân hoàn toàn) Nw n == XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME Hoạt tính amilase theo wohlgemuth Tính kết Lượng Enzym cho vào ống nghiệm V1 – Thể tích dòch chiết E cho vào ống nghiệm V2 – Thề tích dòch chiết E, mL m – Lượng mẫu cân vật phẩm chứa Enzym [mg] m ×nV m ×V n= V2 VV1 ×2 W Một đơn vò Wohlgemuth (W) F – độ pha loãng ống nghiệm có nồng độ E nhỏ thủy phân hoàn toàn tinh bột (ống nghiệm có màu vàng) Số đơn vò Wohlgemuth 1mL dòch chiết E (Nw) n W = F ×5 n Nw = V 1×W Nw n == XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME Hoạt tính protease bromelin Nguyên tắc  m ×nV VV1 ×2 W  Tiến hành phản ứng thủy phân chất protein (hemoglobin, casein, albumin,…) E Bromelin Xác đònh lượng sản phẩm acid amin tạo thành từ phản ứng thông qua lượng Tyrosin tạo thành Đònh lượng Tyr tạo thành cách so sánh lượng Tyr với lượng Tyr chuẩn, biết trước nồng độ Dùng thuốc thử Folin, so màu máy quang phổ so màu XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME Hoạt tính protease bromelin Tính kết Hoạt tính E.Bromelin = số µg tyrosin sinh thủy phân Hb (Alb) E có 1mL ddòch hay 1mg hỗn hợp chứa Bromelin phút Nw n == m ×nV VV1 ×2 W Công thức tính hoạt tính Bromelin x1 – số ml ddòch tysosin chuẩn x2 – số ml ddòch chứa enzyme ∆ODm = ODm – Odk ∆ODt = ODt – ODk ODt–độ hấp thu tyrosin chuẩn ODm–độ hấp thu mẫu ODk–độ hấp thu ống không 450 × ∆ODm x1 × × [UI / ml ] ∆ODt 10 x [...]... lượng của nó Urease có M = 480000 Hoạt tính toàn phần Tổng số hoạt độ của toàn bộ chế phẩm Enzym Dùng để tính hiệu suất tinh chế 1kg vỏ đu đủ 30 UI/g TA = 30 000 đv 5g chế phẩm I 30 00 UI/g TA = 15000 đv 0.03g chế phẩm II 30 0000 UI/g TA = 9000 đv HOẠT TÍNH CỦA ENZYME Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính Enzym Nồng độ Enzyme Thừa cơ chất S: vận tốc phản ứng sẽ tăng tuyến tính đến khi toàn bộ E đều tham gia... trạng thái chưa hoạt động (Pepsinogen tại bao tử, Trypsinogen tại thành ruột, Protrombin gây đông tụ máu)  Tác nhân hoạt hóa tiền Enzym thường là một Enzym khác, hoặc pH Cấu tạo Enzyme KHÁI NIỆM CHUNG VỀ ENZYME Tiền Enzyme (Proenzyme, zimogen) Tên gọi Enzyme KHÁI NIỆM CHUNG VỀ ENZYME Tên thông dụng Tên gọi không theo quy ước nào, không nói lên kiểu phản ứng Pepsin, trypsin, catalase, amilase, rennin,... khối lượng hay thể tích chế phẩm Hoạt độ riêng càng cao, chế phẩm Enzym càng tinh sạch Enzym papain trong vỏ đu đủ 1 g vỏ đu đủ 1g chế phẩm I (đã loại tạp chất lần I) 1g chế phẩm II (loại tạp chất lần II) 30 UI/g 30 00 UI/g 30 0000 UI/g HOẠT TÍNH CỦA ENZYME Xác đònh hoạt tính của Enzym Hoạt tính phân tử Số đơn vò hoạt động trong 1 mol Enzym Đơn vò này chỉ dùng E đã được tinh chế đến dạng tinh khiết và...Cấu tạo Enzyme KHÁI NIỆM CHUNG VỀ ENZYME Tiền Enzyme (Proenzyme, zimogen)  Phần lớn các E được tổng hợp trong cơ thể thành những phân tử E có sẵn hoạt tính sinh học  Tiền Enzyme (zimogen hay proenzyme): E được tổng hợp ở dạng trung gian chưa có hoạt tính xúc tác  Đa số Enzym một cấu tử, nhất là Enzym của hệ tiêu hóa thường tồn tại ở trạng thái chưa... thứ hai của tên gọi một dấu ngoặc COOH R CH NH2 + COOH O2 E L-acid amin oxidoreductase R C = O + NH3 NH2 KHÁI NIỆM CHUNG VỀ ENZYME Tên gọi Enzyme Tên hệ thống Mỗi Enzym có 1 mã số 4 chữ X là 4 số E C X X X X (1) (2) (3) (4) (1): nhóm chính (lớp) (2): nhóm phụ (phân lớp) (3) : phân nhóm phụ (tổ) (4): tên Enzym, thứ tự của E trong phân nhóm phụ I : oxihóa khử oxydoreductase II : chuyển hóa dạng đồng phân,... chất, Cơ chất bò kích thích - sẵn sàng chuyển hóa tạo sản phẩm VAI TRÒ XÚC TÁC CỦA ENZYME Cơ chế tác dụng của Enzym GĐ 3: tạo sản phẩm protein Cơ chất sau khi được hoạt hóa sẽ biến đổi về chất để hình thành chất mới và phân ly khỏi Enzym tạo thành sản phẩm Enzym thủy phân thường có 2 trung tâm hoạt động VAI TRÒ XÚC TÁC CỦA ENZYME So sánh với chất xúc tác hóa học Điều kiện phản ứng Xúc tác hóa học p suất... Xác đònh vận tốc tạo thành sản phẩm: lượng sản phẩm tạo thành trong một đơn vò thời gian [3] Xác đònh nồng độ thấp nhất của E để chuyển hóa hết một lượng cơ chất xác đònh HOẠT TÍNH CỦA ENZYME Xác đònh hoạt tính của Enzym Hoạt tính của Enzym Số đơn vò hoạt động trong một đơn vò chế phẩm Enzyme Đơn vò hoạt động của Enzym (UI) Lượng E tối thiểu cần thiết để chuyển hóa 1µmol cơ chất sau 1 phút ở điều kiện... Glucose VAI TRÒ XÚC TÁC CỦA ENZYME So sánh với chất xúc tác hóa học Tính đặc hiệu Xúc tác hóa học Xúc tác Enzym Không có tính chọn lọc 1 chất xúc tác có thể xúc tác cho rất nhiều phản ứng Chọn lọc cơ chất Một Enzym chỉ xúc tác cho một vài phản ứng hay chỉ một phản ứng duy nhất VAI TRÒ XÚC TÁC CỦA ENZYME So sánh với chất xúc tác hóa học Hoạt tính xúc tác Xúc tác hóa học Xúc tác Enzym Hợp chất hóa học Chỉ... Fructose + Glucose VAI TRÒ XÚC TÁC CỦA ENZYME So sánh với chất xúc tác hóa học Cường độ phản ứng Xúc tác hóa học Xúc tác Enzym Yếu hơn Mạnh hơn 2H2O2 1 mol Fe3+ xúc tác phân ly 10-6 mol/phút 2H2O + O2 1 phân tử catalase có 1 nguyên tử Fe phân ly 5.106 mol/phút VAI TRÒ XÚC TÁC CỦA ENZYME So sánh với chất xúc tác hóa học Vận tốc phản ứng Xúc tác hóa học Xúc tác Enzym Chậm Nhanh Tinh bột Amylase, nhiệt... HOẠT TÍNH CỦA ENZYME Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính Enzym Nồng độ cơ chất S v = Vmax Km [S] Km + [S] Với Km = K-1 + K+2 K+1 hằng số ái lực của Enzym đối với cơ chất S Nếu có cùng một lúc nhiều E cùng tác động lên cơ chất, E nào có Km nhỏ nhất thì E đó sẽ tác động xúc tác chuyển hóa cơ chất đó E + S K +1 K -1 [ES] K +2 E + P HOẠT TÍNH CỦA ENZYME Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính Enzym Nhiệt độ