VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT PHẠM THỊ NINH NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC TỪ CÂY CỔ YẾM LÁ BÓNG [GYNOSTEMMA LAXUM (WALL.) COGN.] CỦA VIỆT NAM Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số : 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học GS TSKH TRẦN VĂN SUNG Hà nội, năm 2013 Số hóa Trung tâm Học liệu / LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng tôi, số liệu kết nghiên cứu nêu luận văn trung thực, đồng tác giả cho phép sử dụng chưa công bố công trình khác Tác giả luận văn Phạm Thị Ninh Số hóa Trung tâm Học liệu / LỜI CẢM ƠN Luận án thực Phòng Tổng hợp Hữu cơ, Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt nam Với lòng biết ơn sâu sắc xin chân thành cảm ơn GS.TSKH Trần Văn Sung, người thầy trực tiếp tận tình hướng dẫn giúp đỡ suốt thời gian làm việc Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể cán khoa học Phòng Tổng hợp Hữu – Viện Hoá học – Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ, hướng dẫn suốt trình thực đề tài Tôi xin cảm ơn cán phòng Hóa sinh ứng dụng, phòng phổ IR, phổ NMR phổ khối MS – Viện Hoá học thực thử hoạt tính đo loại phổ giúp Xin cảm ơn nhiệt tình giảng dạy quý thầy cô giáo suốt trình học tập Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến người thân gia đình bạn bè động viên giúp đỡ suốt trình học tập nghiên cứu Tác giả luận văn Phạm Thị Ninh Số hóa Trung tâm Học liệu / MỤC LỤC Trang Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu Phƣơng pháp nghiên cứu 4.1 Các phƣơng pháp nghiên cứu lý thuyết 4.2 Các phƣơng pháp nghiên cứu thực nghiệm .3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Bố cục luận văn CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN Họ Cucurbitaceae chi Gynostemma 1.1 Họ Cucurbitaceae 1.2 Chi Gynostemma 1.3 Cổ yếm bóng 1.3.1 Tên gọi .5 1.3.2 Môi trƣờng sống 1.3.3 Tính vị tác dụng Hoạt tính sinh học cổ yếm bóng Thành phần hóa học .8 3.1 Các carotenoid .8 3.2 Các polysaccharid 3.3 Các sterol .9 3.4 Các flavonoid 10 Số hóa Trung tâm Học liệu / 3.5 Các saponin 11 CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 XỬ LÝ MẪU THỰC VẬT VÀ CÁC PHƢƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC 19 2.1.1.Mẫu thực vật .19 2.1.2 Các phƣơng pháp sắc ký để phân lập chất 20 2.1.3 Các phƣơng pháp xác định cấu trúc hóa học .20 2.2 CÁC PHƢƠNG PHÁP THỬ HOẠT TÍNH 20 2.2.1 Thử hoạt tính chống oxy hóa .20 2.2.2 Thử hoạt tính chống ung thƣ .21 2.2.3 Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 21 CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM .22 3.1 HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ PHƢƠNG PHÁP 22 3.1.1 Hóa chất thiết bị nghiên cứu 22 3.1.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 23 3.2 CHIẾT TÁCH VÀ TINH CHẾ CÁC CHẤT TỪ CÂY CỔ YẾM LÁ BÓNG GYNOSTEMMMA LAXUM (WALL.) COGN 27 3.2.1 Xử lý mẫu thực vật .27 3.2.2 Chiết tách chất từ dịch chiết etyl acetat .28 3.2.3 Chiết tách chất từ dịch chiết n-BuOH 30 3.3 THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC 32 3.3.1.Thử hoạt tính chống oxy hóa 32 3.3.2 Thử hoạt tính gây độc tế bào 32 3.3.3 Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 33 Số hóa Trung tâm Học liệu / CHƢƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 4.1 Giới thiệu 34 4.2 Kết thử hoạt tính sinh học .34 4.2.1 Hoạt tính chống oxy hóa .34 4.2.2 Hoạt tính gây độc tế bào .35 4.2.3 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 36 4.3 Xác định cấu trúc chất phân lập đƣợc 37 4.3.1 chất 43 (GCLB17): quercetin .37 4.3.2.Chất 44 (GCL14.2): ombuim 46 4.3.3.Chất 45 (GCLB.3N): ombuosid 53 4.3.4.Chất 46 (GCL2.2): 4,7- dimethoxy kaempferol 61 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 74 - KẾT LUẬN 74 - TÀI LIỆU THAM KHẢO .76 Số hóa Trung tâm Học liệu / DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN br : Broad (NMR) d : Doublet (NMR) δ : Độ chuyển dịch hoá học (NMR) DEPT : Distortionless enhancement by polarisation transfer DMSO : Dimethyl sulfoxide D2O : Nƣớc đƣợc đơteri hoá EI : Electronic impact EtOAc : Ethyl acetate FT : Fourier transform HMBC : Heteronuclear multiple bond correlation HMQC : Heteronuclear multiple quantum coherence COSY : Correlation Spectroscopy IR : Infrared J : Hằng số tƣơng tác (NMR) m : Multiplet (NMR) Me : Methyl MeOH : Methanol MS : Mass spectrometry NMR : Nuclear magnetic resonance ppm : Parts per million Rf : Retention factor s : Singlet (NMR) t : Triplet (NMR) UV : Ultraviolet dd: double of double IC50: The half maximal inhibitory concentration LD50: Lathal dose 50% HPLC: High performance liquid chromatography Số hóa Trung tâm Học liệu / LDL: Low density lipoprotein VLDL: Very low density lipoprotein HDL: High density lipoprotein G Gynostemma Ara: α -L-arabinopyranosyl Rha: α -L-rhamnopyranosyl Glu: β-D-glucopyranosyl Xyl: β-D-xylopyranosyl Lyx: β-L-lyxopyranosyl SKBM: sắc ký mỏng DANH MỤC CÁC BẢNG Số hiệu Tên bảng bảng Trang 4.1 Kết thử hoạt tính kháng oxy hóa 33 4.2 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào 34 4.3 Kết thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 36 4.4 Số liệu phổ 1H 13C-NMRcủa chất 43; 44; 45 46 38 4.5 Các chất phân lập từ Cổ yếm bóng 72 Số hóa Trung tâm Học liệu / DANH MỤC CÁC HÌNH Số hiệu hình Tên hình Trang 1.1 Ảnh số loài thuộc chi Gynostemma 2.1 Ảnh Gynostemma laxum (Wall.) Cogn thu hái Hoà Bình 18 3.2.2 3.2.3 Sơ đồ chiết mẫu tách chất từ dịch chiết EtOAc cổ yếm bóng Sơ đồ chiết mẫu tách chất từ dịch chiết EtOAc cổ yếm bóng 28 30 4.1 Phổ IR chất 43 41 4.2 Phổ 1H-NMR chất 43 42 4.3 Phổ 1H-NMR chất 43 (giãn rộng) 43 4.4 Phổ 13C-NMR chất 43 44 4.5 Phổ DEPT 13C-NMR chất 43 45 4.6 Phổ 1H-NMR chất 44 47 4.7 Phổ 1H-NMR chất 44 (giãn rộng) 48 4.8 Phổ 13C-NMR chất 44 49 4.9 Phổ 13C-NMR chất 44 (giãn rộng) 50 4.10 Phổ DEPT 13C-NMR chất 44 51 4.11 Phổ MS chất 44 52 4.12 Phổ 1H-NMR chất 45 54 4.13 Phổ 1H-NMR chất 45 (giãn rộng) 55 4.14 Phổ 1H-NMR chất 45 (giãn rộng) 56 Số hóa Trung tâm Học liệu / 4.15 Phổ 13C-NMR chất 45 57 4.16 Phổ 13C-NMR chất 45 58 4.17 Phổ 13C-NMR chất 45 59 4.18 Phổ DEPT 13C-NMR chất 45 60 4.19 Phổ 1H-NMR chất 46 62 4.20 Phổ 1H-NMR chất 46 (giãn rộng) 63 4.21 Phổ 13C-NMR chất 46 64 4.22 Phổ 13C-NMR chất 46 65 4.23 Phổ DEPT 13C-NMR chất 46 66 4.24 Phổ HSQC chất 46 67 4.25 Phổ HSQC chất 46 68 4.26 Phổ HMBC chất 46 69 4.27 Phổ HMBC chất 46 70 4.28 Phổ HMBC chất 46 (giãn rộng) 71 Số hóa Trung tâm Học liệu / MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Việt Nam nƣớc có nguồn thực vật phong phú với khoảng 12.000 loài, điều tra đƣợc 3.850 loài đƣợc sử dụng làm thuốc thuộc 309 họ Đa phần mọc tự nhiên chƣa đƣợc nghiên cứu cách đầy đủ, có hệ thống mặt khoa học nhƣ hoạt tính sinh học Từ nhiều năm qua, thảo dƣợc giữ vai trò quan trọng việc bảo vệ sức khỏe ngƣời đƣợc Lƣơng Y Đông Y sử dụng thuốc gia truyền Ngày nay, ngƣời ta chiết xuất hợp chất từ thảo dƣợc để làm thuốc, thực phẩm chức nhằm để hỗ trợ điều trị bệnh nhƣ bệnh ung thƣ, tiểu đƣờng, giảm cân, tăng cƣờng hệ miễn dịch thể, hạ huyết áp … Ƣu điểm loại thảo dƣợc có tác dụng tốt vào nhiều phận thể Âu dƣợc, không gây nghiện không gây tác dụng phụ Trong số loài thuộc chi Gynostemma Blume (họ Bí Cucurbitaceae) có mặt Việt Nam, Giảo cổ lam dƣợc liệu quý đuợc nhóm nghiên cứu Phạm Thanh Kỳ phát lần vào năm 1997 Từ nay, nhiều nghiên cứu loài dƣợc liệu đƣợc tiến hành, làm sáng tỏ thành phần hoá học, tác dụng dƣợc lý từ đó, đƣa vào khai thác sử dụng nguồn dƣợc liệu quý phục vụ chăm sóc sức khoẻ cộng đồng Trong số loài lại, Gynostemma laxum (Wall.) Cogn (hay gọi Cổ yếm bóng) dƣợc liệu đƣợc ngƣời dân Trung Quốc sử dụng tƣơng tự nhƣ Giảo cổ lam, với tác dụng điều trị viêm khí quản mạn tính, viêm gan truyền nhiễm, viêm thận, loét dày hành tá tràng, phong thấp đau nhức khớp, bệnh tim, béo phì, điều trị chức thần kinh Tuy nhiên, nay, Việt Nam chƣa có nhiều nghiên cứu hoạt tính sinh học thành phần hoá học, tác dụng dƣợc lý nhƣ độc tính loài [...]... đuợc nhóm nghiên cứu của Phạm Thanh Kỳ phát hiện lần đầu tiên vào năm 1997 Từ đó cho tới nay, nhiều nghiên cứu trên loài dƣợc liệu này đã đƣợc tiến hành, làm sáng tỏ thành phần hoá học, tác dụng dƣợc lý và từ đó, đƣa vào khai thác và sử dụng nguồn dƣợc liệu quý hiếm này phục vụ chăm sóc sức khoẻ cộng đồng Trong số 2 loài còn lại, Gynostemma laxum (Wall. ) Cogn (hay còn gọi là cây Cổ yếm lá bóng) là dƣợc... Trung Quốc sử dụng tƣơng tự nhƣ Giảo cổ lam, với tác dụng điều trị viêm khí quản mạn tính, viêm gan truyền nhiễm, viêm thận, loét dạ dày hành tá tràng, phong thấp và đau nhức khớp, bệnh về tim, béo phì, điều trị chức năng thần kinh Tuy nhiên, cho tới nay, ở Việt Nam chƣa có nhiều nghiên cứu về hoạt tính sinh học và thành phần hoá học, tác dụng dƣợc lý cũng nhƣ độc tính của loài này ... Đặt vấn đề Việt Nam là nƣớc có nguồn thực vật phong phú với khoảng 12.000 loài, trong đó đã điều tra đƣợc 3.850 loài đƣợc sử dụng làm thuốc thuộc 309 họ Đa phần các cây mọc tự nhiên và chƣa đƣợc nghiên cứu một cách đầy đủ, có hệ thống về mặt khoa học cũng nhƣ hoạt tính sinh học Từ nhiều năm qua, thảo dƣợc luôn giữ vai trò quan trọng trong việc bảo vệ sức khỏe con ngƣời đã đƣợc các Lƣơng Y và Đông Y... chất từ thảo dƣợc để làm thuốc, thực phẩm chức năng nhằm để hỗ trợ và điều trị các bệnh nhƣ bệnh ung thƣ, tiểu đƣờng, giảm cân, tăng cƣờng hệ miễn dịch cơ thể, hạ huyết áp … Ƣu điểm của các loại thảo dƣợc là có tác dụng tốt vào nhiều bộ phận cơ thể hơn là Âu dƣợc, không gây nghiện và không gây tác dụng phụ Trong số 2 loài thuộc chi Gynostemma Blume (họ Bí Cucurbitaceae) có mặt tại Việt Nam, Giảo cổ lam