Khóa luận tốt nghiệp 2016 LỜI CẢM ƠN Lời xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới ThS Vũ Duy Nhàn, người trực tiếp hướng dẫn, động viên giúp đỡ suốt trình thực tập nghiên cứu Tôi xin cảm ơn ban lãnh đạo Viện Hóa hoc – Vật liệu/ Viện Khoa học Công nghệ quân anh chị Phòng Hóa sinh, tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian thực tập làm đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo Viện Đại học Mở Hà Nội, thầy cô tạo điều kiện suốt trình học tập trường thực luận văn Cuối muốn gửi lời thân thương đến gia đình, bạn bè, tập thể lớp 12-02 hoa ông Nghệ Sinh ọc bên động viên, giúp đỡ trình học tập hoàn thành luận văn Tôi in chân thành cảm ơn Hà Nội, ngày 22 tháng năm 2016 Sinh viên Nguyễn Thị Thắm Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH Khóa luận tốt nghiệp 2016 MỤC LỤC MỞ ĐẦU PHẦN 1: TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu Cordycceps militaris 1.1.1 Hiện trạng vai trò Cordyceps militaris 1.1.2.Thành phần hóa học Codyceps militaris .5 1.1.2.1.Cordycepin 1.1.2.2.Adenosine 1.1.2.3 Acid cordycepic 1.1.2.4 Nucleotides 1.1.2.5 Protein axit amin .8 1.1.2.6 Acid béo nguyên tố đa, vi lượng 1.1.2.7 Polysaccharide 1.1.3 Các ứng dụng từ sinh khối nấm Cordyceps militaris 1.1.3.1 Cải thiện chức gan 10 1.1.3.2 Giải độc thận 10 1.1.3.3 Giảm đường huyết 10 1.1.3.4 Điều trị bệnh phổi 11 1.1.3.5 Điều trị bệnh tim mạch 11 1.1.3.5 Tăng cường khả miễn dịch 11 1.1.3.6 Hỗ trợ điều trị ung thư .11 1.1.3.7 Chống rối loạn tình dục 12 1.1.3.8 Tăng sức bền, chống mệt mỏi 12 1.1.3.9 Chống lão hóa 13 1.2 Polisaccharide từ sinh khối nấm Cordyceps militaris 13 1.2.1 Đặc điểm Polisaccharide sinh khối nấm Cordyceps militaris .13 1.2.2 Vai trò Polysaccharide nấm Codyceps sp 14 1.3 Tình hình nghiên cứu tách chiết polysaccharide từ Cordyceps militaris 16 Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH Khóa luận tốt nghiệp 2016 1.3.1 Tình hình nghiên cứu polysaccharide giới 16 1.3.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 18 PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Nguyên liệu thiết bị nghiên cứu 21 2.1.1 Nguyên liệu 21 2.1.2 Thiết bị hóa chất 21 2.2 Phương pháp nghiên cứu 22 2.2.1 Phương pháp tách chiết polysaccharide từ thể Codyceps militaris 22 2.2.1.1.Khảo sát phương pháp chiết .22 2.2.1.2.Khảo sát điều kiện chiết: 24 2.2.2 Xác định hàm lượng polisaccarit theo phương pháp phenol-sulfuric Michel DuBois, K A Gilles cs, 1956 24 2.2.3.Thu nhận polysaccharide phương pháp kết tủa 27 2.2.4.Phương pháp phân tích IR: 28 PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1.Nghiên cứu lựa chọn điều kiện tách chiết Polysaccharide 29 3.1.1 Nghiên cứu lựa chọn phương pháp tách chiết 29 3.1.2 Nghiên cứu lựa chọn dung môi chiết .30 3.2 Kết khảo sát ảnh hưởng yếu tố đến hiệu suất tách chiết .31 3.2.1 Nghiên cứu xác định nhiệt độ chiết 31 3.2.2 Nghiên cứu xác định thời gian chiết 31 3.2.3 Nghiên cứu xác đinh tần suất chiết 32 3.3 Bước đầu xây dựng quy trình tách chiết .33 3.4 Bước đầu xác định nhóm cấu trúc Polysaccharides tách chiết 37 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH Khóa luận tốt nghiệp 2016 DANH MỤC CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nội dung C Cordyceps C militaris Nhộng trùng thảo C.sinensis Đông trùng hạ thảo sp Species – Một loài spp Species plural – Nhiều loài ĐTHT Đông trùng hạ thảo EtOH Ethanol EPS Exopolysaccharide ( Extrancellular polysaccharide) polysaccharide ngoại bảo SOD Chất chống oxy hóa P1 Polysaccharide thu từ dịch sau chiết với nước P2 Polysaccharide sau thu từ phần bã bổ sung NaOH 4% P3 Polysaccharide sau kết tủa Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH Khóa luận tốt nghiệp 2016 DANH MỤC HÌNH ình 1.1: Đông trùng hạ thảo Codyceps militaris Hình 1.2: Cấu trúc hóa học Codycepin Hình 1.3: Cấu trúc hóa học Adenosine Hình 1.5: Công thức cấu tạo polysaccharide 13 Hình2.1 : Sản phẩm Codyceps militaris nuôi cấy Viện Quân 21 Hình2.2 : Mẫu dùng tách chiết 21 Hình 2.3: Bể ổn nhiệt dùng trình chiết 23 Hình 2.4: Máy siêu âm 24 Hình 2.5: Mẫu đo đường đường chuẩn 26 ình 2.6: Đồ thị đường glucose (µg/ml) 26 Hình 2.7: Máy ép KBr 31 ình 2.8: Máy đo phổ Impact 410 28 Hình 3.1: Kết khảo sát dung môi chiết mẫu C militaris 29 Hình 15: Kết khảo sát phương pháp chiết 30 Hình 3.4: Kết khảo sát nhiệt độ 31 Hình 3.5: Kết khảo sát thời gian chiết mẫu C militaris 32 Hình3.8: phổ hồng ngoại IR mẫu CM-jd-CPS2 chuẩn 37 Hình 3.9: Phổ hồng ngoại IR mẫu P1 38 Hình 3.10: Phổ hồng ngoại IR mẫu P2 38 Hình 3.11: Phổ hồng ngoại IR mẫu P3……………………………………… 41 Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH Khóa luận tốt nghiệp 2016 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Phân loại khoa học Bảng 1.2: Hàm lượng số loại đường có polysaccharide thể sợi nấm Codyceps militaris 14 Bảng 1.3: Khả kháng khối u số polysaccharide thu nhận từ số loại nấm 15 Bảng 2.1: Thiết bị dùng thí nghiệm 22 Bảng 2.3: Các dung môi có độ phân cực tăng dần theo tham số Snyder lực dung môi 23 Bảng 2.4: Xây dựng phương trình đường chuẩn glucose 25 Bảng 3.1: Hàm lượng polysaccharide từ Cordyceps militaris 36 Bảng 3.2: So sánh phổ IR mẫu 39 Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH Khóa luận tốt nghiệp 2016 MỞ ĐẦU Trong năm gần nhiều loài nấm quan tâm đến nguồn nguyên liệu để sản xuất thực phẩm chức phục vụ chăm sóc sức khỏe người ngày tăng lên Ngoài chúng nhà nghiên cứu y dược học ý đa dạng hợp chất sinh học có loại Đông trùng hạ thảo dạng sản phẩm cộng sinh loài nấm Codyceps sinensis ( Berk.) Codyceps militaris (L ex Fr.)Link lên ấu trùng loài côn trùng thuộc chi Hepialus Thường gặp ấu trùng loài Hepialus armoricanus Là loại nấm dược liệu quý từ lâu giới biết đến, đông trùng hạ thảo tam thất, linh chi, nhân sâm tạo thành tứ thần dược Sách y học cổ truyền Trung Quốc từ xa xưa coi Đông trùng hạ thảo vị thuốc để bồi bổ sức khỏe người hỗ trợ điều trị hàng loạt bệnh cải thiện chức phổi thận chống ung thư điều hòa miễn dịch tác dụng hạ huyết áp Mặt khác nghiên cứu y học cổ truyền đại xác định Đông trùng hạ thảo tác dụng phụ thể người Polysaccharide thành phần có hoạt tính sinh học Đông trùng hạ thảo nhiều loài nấm dược liệu khác, chứng minh chống ung thư, điều hòa miễn dịch tác dụng chống oxy hóa đáng lưu ý Việc nghiên cứu đặc tính chống oxy hóa polysaccharide từ Cordyceps militaris nghiên cứu rộng rãi Như việc tách chiết, tinh làm tăng cường tác dụng dược lý hoạt chất polysaccharide từ nguồn thể Cordyceps militaris (L ex Fr) Link quan trọng điều kiện Khi giải phần công tác chăm sóc sức khỏe cho người Từ ứng dụng để sản xuất sản phẩm thực phẩm chức từ nguồn nguyên liệu polysaccharide cần thiết Xuất phát từ thực tế đó, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu xây dựng quy trình tách chiết polysaccharide từ sinh khối nấm Cordyceps Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH Khóa luận tốt nghiệp 2016 militaris” với mục tiêu sau: Xác lập quy trình tách chiết polysaccharide từ nguồn Cordyceps militaris nuôi trồng Nội dung nghiên cứu chủ yếu cần giải quyết: Nghiên cứu xây dựng quy trình tách chiết polysaccharide từ sinh khối nấm Cordyceps militaris Bước đầu xác định số nhóm chức mẫu polysaccharide phân lập Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH Khóa luận tốt nghiệp 2016 PHẦN 1: TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu Cordycceps militaris 1.1.1 Hiện trạng vai trò Cordyceps militaris Đông trùng hạ thảo dạng sản phẩm cộng sinh loài nấm Cordyceps sinensis ( Berk.) Cordyceps militaris (L ex Fr.)Link lên ấu trùng loài côn trùng thuộc chi Hepialus Thường gặp ấu trùng loài Hepialus armoricanus Vào mùa đông bào tử nấm bắt đầu ký sinh sử dụng chất dinh dưỡng ấu trùng Hepialus armoricanus để sinh trưởng phát triển thành sợi nấm Mùa hè đến điều kiện nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng thích hợp thể nấm bắt đầu hình thành vươn khỏi thân xác ấu trùng phát triển nhanh thành thể trưởng thành Đầu thể nấm thể đệm (stroma) hình trụ thuôn nhọn Đông trùng hạ thảo tự nhiên phát vào mùa hè, phân bố tập trung cao nguyên cao mặt biển từ 3500 đến 5000m Đó vùng Tây Tạng, Tứ Xuyên, Thanh Hi, Cam Túc, Vân Nam [11,14] Bảng 1.1: Phân loại khoa học Giới Nấm Ngành Ascomycota Phân ngành Ascomycotina Lớp Ascomycetes/ Pyrenomycetes Bộ Hypocreales Chi Cordyceps Loài Cordyceps militaris Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH Khóa luận tốt nghiệp 2016 Hình 1.1: Đông trùng hạ thảo Codyceps militaris Đông trùng hạ thảo có 350 loài khác nhiên hai loài người ta sâu nghiên cứu đưa vào nuôi trồng Codyceps sinensis Codyceps militaris Loài nấm Cordyceps sinensis phân bố chủ yếu vùng núi cao thuộc dẫy núi Hymalaya có độ cao 4000m so với mực nước biển vùng Tây Tạng (Trung Quốc), số vùng thuộc Nepan Butan Loài Nấm Cordyceps militaris, phân bố vùng núi thấp có độ cao từ 2000-3000m so với mực nước biển, có hàm lượng hoạt chất có hoạt tính sinh học thể cordycepin, mannitol, cordypolysaccharide, superoxide dismutise nhiều thành phần khác tương đương, chí cao loài Cordyceps sinensis Nhờ hợp chất hóa học giá trị dược liệu loại nấm Cordyceps militaris nhà khoa học thống kê sau: kìm hãm phát triển tế bào ung thư máu (Kim et al., 2006, Lee H.et al.,2006, Park C.et al.,2005), ung thư phổi, ung thư vú (Ahn Y.J et al., 2001) Nhiều nghiên cứu chứng minh nấm có hiệu chữa trị rối loạn chức gan (Nan J.X et al 2001), lão hoá, chứng viêm tấy (Won S.Y and Park E.H., 2005) Ngoài có tác dụng kìm hãm oxy hoá lipid, lipoprotein lipoprotein tỷ trọng thấp (Klaunig J.E Kamendulis L.M., 2004, Balaban R.S et al., 2005) [14,16] Hiện giới năm sản lượng nấm dược liệu đạt lên tới 10 triệu m³, Codyceps sinensis (Berk.) Sacc Và Cordyceps militaris (L ex Fr.) Link Trong năm gần đây, Việt Nam Codyceps Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH Khóa luận tốt nghiệp 2016 PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1.Nghiên cứu lựa chọn điều kiện tách chiết Polysaccharide 3.1.1 Nghiên cứu lựa chọn phƣơng pháp tách chiết Mẫu Cordyceps militaris sau chọn phòng nuôi viện Viện Hóa học – Vật liệu,Viện Khoa học công nghệ quân - BQP Chúng tiến hành lấy phần thể Cân 10g dã nhuyễn bổ sung nước cất theo tỉ lệ : 7,5 [2 Sau tiến hành khảo sát hai phương pháp chiết: siêu âm đun hồi lưu cách thủy, cố định thông số chiết khác: thời gian chiết 60 phút, số lần chiết: lần, Hàm lƣợng (µg/ml) dung môi chiết: H2O kết thể hình sau: 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 864.5185 717.3333 Polysaccharide Siêu âm Đun hồi lưu Hình 3.1: Kết khảo sát dung môi chiết mẫu C militaris Nhận xét: Đối với mẫu Codyceps militaris, lượng polysaccharride chiết phương pháp siêu âm cao so với phương pháp đun hồi lưu Đối với phương pháp siêu âm hàm lượng polysaccharide đạt 864,5185µg/ml, phương pháp đun hồi lưu đạt 717,3333µg/ml Vì sóng siêu âm có tác dụng tăng mạnh khả khuếch tán nhờ tác dụng sóng Siêu âm làm tăng diện tích tiếp xúc hai pha cách phân tán chúng thành hạt nhỏ, tăng cường xáo trộn hỗn hợp, có tác dụng làm nóng chỗ Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH 29 Khóa luận tốt nghiệp 2016 3.1.2 Nghiên cứu lựa chọn dung môi chiết Theo thí nghiệm Fengyao Wu [8] sử dụng dung môi H2O, thí nghiệm Hui Yan [16] sử dụng dung môi EtOH Nên tiến hành dùng dung môi H2O, EtOH làm dung môi chiết, khảo sát thành phần dung môi, tỷ lệ dung môi chiết Thông số đánh giá: hàm lượng polysaccharide mẫu Các điều kiện chiết cố định: phương pháp siêu âm, thời gian chiết: 30 phút, nhiệt độ chiết: không kiểm soát, số lần chiết: lần Kết phân tích thể hình sau Hình 15: Kết khảo sát phương pháp chiết Nhận xét: Kết cho thấy mẫu tươi, sử dụng dung môi chiết H2O EtOH, lượng polysaccharide chiết sử dụng dung môi H2O cao hẳn so với EtOH, dung môi H2O đạt 652,6667µg/ml, với EtOH đạt 584,7654µg/ml Vì vậy, định sử dụng dung môi chiết H2O cho hiệu cao nước không gây độc hại, không gây ô nhiễm môi trường, không dễ cháy nổ tiết kiệm loại dung môi khác Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH 30 Khóa luận tốt nghiệp 2016 3.2 Kết khảo sát ảnh hƣởng yếu tố đến hiệu suất tách chiết 3.2.1 Nghiên cứu xác định nhiệt độ chiết Tiến hành khảo sát chiết mẫu với thông số chiết cố định: phương pháp chiết: siêu âm, thời gian: 60 phút; dung môi chiết: H2O, số lần chiết: Thông số khảo sát: nhiệt độ: 25ºC, 30ºC, 40ºC, 60ºC, 100ºC Hình 3.4: Kết khảo sát nhiệt độ Nhận xét: Khi tăng nhiệt độ chiết từ 25ºC lên 100ºC, hàm lượng polysaccharide tăng dần từ 448,4444µg/ml lên 896.2222µg/ml, nhiên tăng nhiệt độ lên 100ºC đạt hàm lượng giảm xuống 730,6667µg/ml Do lựu chọn nhiệt độ chiết siêu âm 60ºC 3.2.2 Nghiên cứu xác định thời gian chiết Tiến hành chiết mẫu theo quy trình: cố định thông số: phương pháp chiết: siêu âm, nhiêt độ chiết 40ºC, dung môi chiết: H2O Thông số khảo sát: thời gian chiết: 15 phút, 30 phút, 60 phút, 90 phút Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH 31 Khóa luận tốt nghiệp 2016 Hình 3.5: Kết khảo sát thời gian chiết mẫu C militaris Nhận xét: tăng thời gian chiết từ 15 phút đến 60 phút, hàm lượng polysaccharide tăng từ 439,4567µg/ml lên 864,5185µg/ml tăng thời gian lên 90 phút hàm lượng polysaccharide lại giảm xuống 778,963µg/ml, thời gian chiết qua dài, dịch chiết lẫn nhiều tạp chất ảnh hưởng đến trình phân tích làm giảm hàm lượng polysacchride Do vậy, lựa chọn thời gian chiết 60 phút để chiết polysaccharride khỏi mẫu 3.2.3 Nghiên cứu xác đinh tần suất chiết Tiến hành chiết lặp lại lần để khảo sát khả chiết, cố định thông số: dung môi chiết: H2O, thời gian chiết 60 phút, nhiệt độ chiết 100ºC Tiến hành chiết lần với điều kiện thu dịch tiếp tục bổ sung dung môi chiết H2O đến lần thứ Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH 32 Khóa luận tốt nghiệp 2016 Bảng 7: Kết khảo sát số lần chiết Nhận xét: Hàm lượng polysaccharide phân đoạn tách chiết Do cần tiến hành chiết nhiều lần để đảm bảo tối đa hàm lượng polysaccharide lại bã Theo nghiên cứu [2] dừng lại lần chiết để đảm bảo hiệu suất chiết hàm lượng lần thứ thấp không ảnh hưởng nhiều tới hiệu suất đồng thời đảm bảo tiết kiệm thời gian chi phí chọn tách chiết lần 3.3 Bƣớc đầu xây dựng quy trình tách chiết Từ nghiên cứu khảo sát lựa chọn phương pháp tách chiết điều kiện ảnh hưởng đến hiệu suất tách chiết như: nhiệt độ, thời gian, loại dung môi, tần suất chiết, với tham khảo tài liệu tách chiết polysaccharide từ nấm hầu thủ nhóm tác giả Trần Hồng Hà, Lê Mai Hương cộng Viện hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam [3,4] Quy trình tách chiết polysaccharide từ thể Cordyceps militaris tiến hành theo sơ đồ sau: Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH 33 Khóa luận tốt nghiệp 2016 Bột thể Siêu âm Bã Dịch Lọc Cô quay Ly tâm Dịch Bã Làm khô 50-55ºC Dịch NaOH 4% Cồn 96ºC 1:4 ủ qua đêm 4ºC Dịch Bã Dịch Ly tâm 5000v/p Ly tâm 5000v/p P1 Trung hòa CH3COOH Dịch Thu kết tuả Dịch Bã Kết tủa P3 P2 Hình 3.7: Sơ đồ tách chiết polysaccharide Cân 20g thể nấm Cordyceps militaris tươi ( dã nhuyễn cối) Được ngâm với 150ml nước nóng đưa vào siêu âm 60ºC 1h Lọc lấy phần dịch tan bã nấm tiếp tục bổ sung 150ml nước cất chiết lần 1h Tách riêng phần bã nấm dịch tan (phần dịch hai lần chiết gộp lại) Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH 34 Khóa luận tốt nghiệp 2016 Đối với phần dịch tan: làm giảm thể tích phần dịch chiết cách đun 100ºC đến 10ml, li tâm thu dịch Bổ sung 40ml cồn 96ºC vào dich ủ qua đêm 4ºC Li tâm 5000 vòng/ phút thu cặn polisaccarit (P1) Phần bã: phần bã thể thu sau chiết nước nóng làm khô Bổ sung 100ml NaOH 4% vào phần bã thể, ủ 55ºC Lọc tách phần dịch bã nấm tiếp tục bổ sung 100ml NaOH 4% ủ 55ºC giờ, tách riêng phần bã nấm Phần dịch lần chiết kiềm gộp lại, tổng thể tích khoảng 150 ml Li tâm 5000 vòng/ phút loại bỏ cặn, trung hòa axit acetic để lắng qua đêm Lọc thu riêng phần dịch kết tủa Phần dịch lọc li tâm 5000 vòng/ phút, loại bỏ cặn Bổ sung lần thể tích cồn 96ºC, để lắng qua đêm Li tâm thu kết tủa, làm khô 50ºC đến trọng lượng không đổi Phần kết tủa làm khô 50ºC đến trọng lượng không đổi [2] Một số hình ảnh trình tách chiết: Chuẩn bị mẫu Thu dịch bã Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH Nghiền nhỏ Siêu âm 35 Khóa luận tốt nghiệp 2016 với NaOH Tiếp tục xử lí phần bã Bổ sung cồn Ly tâm mẫu Mẫu sau ly tâm Polysaccharide thô Hàm lượng polysaccharide sau tách chiết phân đoạn: Bảng 3.1: Hàm lượng polysaccharide từ Cordyceps militaris Quả thể Dịch chiết nước nóng (P1) Dịch chiết với Polisaccarit thô Hiệu suất chiết (g) (%) 0,3294 1,647 0,2568 1,284 0,1364 0,682 NaOH(P2) Tủa (P3) Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH Hàm lƣợng Polysaccharide (mg/g) 7,38 5,27 2,77 36 Khóa luận tốt nghiệp 2016 Nhận xét: Theo kết bảng trên, tất phân đoạn tách chiết điều có chứa polysaccharide Ở phân đoạn khác hàm lượng polysaccharide tăng từ 2,77mg/g đến 7,38mg/g tổng lượng chất khô thu phân đoạn Hiệu suất thu P1, P2, P3 tương ứng 1,647%, 1,284%, 0,682% Hàm lượng polysaccharide thô thu phân đoạn chiết thu so sánh với nghiên cứu Guanghao (2007) thu 0,1641g polysaccharide tách chiết từ 20 g Cordyceps Militaris với hiệu suất đạt 0,82% [10] Tôi kết luận với phương pháp chiết này, tiến hành chiết lần đảm bảo hàm lượng polysaccharide chiết triệt để hàm lượng polysaccharide thu tương đối tốt 3.4 Bƣớc đầu xác định nhóm cấu trúc Polysaccharides tách chiết đƣợc Theo nghiên cứu Fengyao Wu đặc điểm cấu trúc hoạt động chống oxy hóa polysaccharide từ C militaris (2011) chiết polysaccharide có tên CM-jd-CPS2 [7] Hình3.8: Phổ hồng ngoại IR mẫu CM-jd-CPS2 chuẩn theo kết nghiên cứu Fengyao Wu [7] Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH 37 Khóa luận tốt nghiệp 2016 Trong phép đo phổ IR CM-jd-CPS2 dải hấp thụ lớn (tại 3.396 cm-1), cho xuất nhóm hydroxyl liên kết hydro phân tử Tại đỉnh 2.927 cm-1 cho đỉnh kéo dài nhóm C-H, đỉnh nằm dải sóng từ 1.400 - 1.200 cm-1 thể nhóm C-H mạch nhánh Tại dải sóng 1.651 1.541cm-1 cm thể liên kết nhóm C = O nhóm N-H mạch nhánh, có diện nhóm acetamido Hai dải hấp thụ gần 1.240 850 cm-1 thể liên kết nhóm S = O C-O-S, tương ứng, tồn nhóm -O-SO3, nhóm có đỉnh hấp thụ mạnh từ 1.200 đến 950 cm-1 mà quy cho liên kết ether (C-O-C) hydroxyl có mặt vòng pyranose Đỉnh 761 cm-1 vòng đối xứng kéo dài pyranose, thể monosaccharide CM-jd-CPS2 pyranose Kết phân tích phổ hồng ngoại IR mẫu P1, P2, P3 sau tách chiết sau: Hình 3.9: Phổ hồng ngoại IR mẫu P1 Hình 3.10: Phổ hồng ngoại IR mẫu P2 Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH 38 Khóa luận tốt nghiệp 2016 Hình 3.11: Phổ hồng ngoại IR mẫu P3 Ở Cordyceps militaris polysaccharide số tác giả nghiên cứu Các kết cho rằng, pyranose liên kết liên kết αglycosidic, loại polysaccharide có tính axit sulfate chứa nhóm acetamido[9] Bảng 3.2: So sánh phổ IR mẫu Mẫu chuẩn Mẫu kiểm tra Mẫu kiểm Mẫu kiểm (cm-1) P1(cm-1) tra P2 (cm-1) tra P3 (cm-1) C-H 2929 2955 2920 2924 C=O 1651 1645 1644 1640 N-H 1541 1517 1551 1540 S=O 1240 1257 1232 1228 C-O-S 850 820 707 749 O-H 3396 3299 3373 3362 Nhóm chức Các kết phổ IR cho thấy P1, P2, P3 có nhóm đặc trưng pyranose liên kết liên kết α-glycosidic, loại polysaccharide có tính axit sulfate chứa nhóm acetamido Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH 39 Khóa luận tốt nghiệp 2016 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Từ sinh khối thể nấm Cordyceps militaris nghiên cứu khảo sát bước đầu xác lập quy trình tách chiết polysaccharide thu nhận mẫu poysaccharides kí hiệu P1, P2, P3 với hiệu suất tách chiết hàm lượng tương ứng 1,647%, 1,284%, 0,682% Sử dụng phương pháp phân tích hồng ngoại IR, bước đầu xác định có mặt số nhóm chức mẫu polysaccharides phân lập P1, P2, P3 Kiến nghị: Các kết nghiên cứu bước đầu nghiên cứu sơ hiệu suất tách chiết polysaccharide từ Cordyceps militaris Tuy nhiên cần phải có nghiên cứu tiếp theo: Tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện quy trình tách chiết vả tinh polysaccharide để làm tăng độ tinh khiết sản phẩm đáp ứng vào sản xuất sản phẩm chức có chứa polysaccharide Tiếp tục có nghiên cứu đánh giá hoạt tính sinh học kháng khuẩn, kháng khối u ba mẫu polysaccharides P1, P2, P3 sử dụng phương pháp phân tích khác để đánh giá sâu cấu trúc phân tử P1, P2, P3 Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH 40 Khóa luận tốt nghiệp 2016 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Ts Nguyễn Minh Chơn, Ths Phan Thị Bích Trâm, Ths Nguyễn Thị Thu Thủy Giáo trình thưc tập sinh hóa (2005), nhà xuất giáo dục Trần Thị Hồng Hà, Lê Hữu Cƣờng, Trần Thị Nhƣ Hằng, Lƣu Văn Chính, Lê Mai Hƣơng Phân lập cách polisaccarit từ nấm hầu thủ lên men dịch thể đánh giá hoạt tính kháng u chúng Tạp chí khoa học công nghệ 50(3), 2012, 327-334 Trần Thị Hồng Hà, Lƣu Văn Chính, Lê Hữu Cƣờng, Trần Thị Nhƣ Hằng, Đỗ Hứu Nghị, Trƣơng Ngọc Hùng, Nguyễn Thị Nga, Lê Mai Hƣơng Đánh giá hoạt tính sinh học polysaccharide hợp chất cần tách chiết từ nấm hương ( Lentinus edodes) Tạp chí sinh học, 35(4), 2013: 445-453 Nguyễn Thị Lƣơng (2014) Nghiên cứu điều kiện lên men nấm Cordyceps để nâng khả sinh tổng hợp cordycepic acid, polysaccharide Khóa luận tốt nghiệp, Viện Đại học Mở Hà Nội Tài liệu tiếng anh Chen L.T.,Cao H.F & Huang W.F Components, pharmacological activities and application of Cordyceps militaris, modern Food Science 21(3), 2015, 192-195 Feng-Lin Hu, Zeng-Zhi Li, Ya-Qiong He, Chu-Ru Li, Bo Huang, Mei-Zhen Fan Secondary metabolistes in a soybean fermentation both of Paecilomyces militaris Journal of Food Chemistry, vol 116, 2009, 198201 Fengyao Wu, Hui Yan, Xiaoning Ma, Junqing Jia, Guozheng Zhang, Xijie Guo and Zhongzheng Gui Structural characterization and antioxidant activity of purified polysaccharide from cultured Codyceps militaris, 5(18), 2011, 2743-2751 Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH 41 Khóa luận tốt nghiệp 2016 Hui Yan, Dongjie Zhu, Dabao Xu, Jie Wu and Xuyun Bian A study on Cordyceps militaris polysaccharide purification, composition and activity analysis, 7(22), 2008, 4004-4009 K.J Patel, R.S Ingalhalli Journal of pharmacognosy and Phytochemistry Codyceps militaris (L.: Fr.) Link – An important Medicinal mushroom, 2013, ISSN 2278-4136 10 Ohta Y Lee, J B Hayashi, K F ujita A., Park D K Invivo antiinfluenza vius activity of animmun omodulatory acidicpolysaccharide isolated from Cordyceps militaris grow on germinated soybeans Journal of Agricutural and Food Chemistry, 55(25), 2007, 10194-10199 11.Shi Zhong, Huijuan Pan, Leifa Fan, Guoying Lv, Yongzhi Wu, Binod Parmeswaran, Ashock Pandey and Carlos Ricardo Soccol Advances in Research of Polysaccharides in Cordyceps Species, 47(3), 2009, 304312 12 Shih-Jeng Huang, Shu-Yao Tsai, Yu-Ling Lee, Jeng leun Mau Nonvolatile taste components of fruit bodies mycelia of Cordyceps militaris, 39(6) 577-583 13.Shonkor Kumar Das, Mina Masuda, Akihiko Sakurai, Mikio Sakakibara Medicinal uses of the mushroom Cordyceps militaris: Current state and prospects, 81, (2010), 961-968 14 Xionggang Xi, Xinlin Wei, Yuanfeng Wang, Qinjie Chu and Jianbo Xiao, Determination of tea polysaccharides in camellia sinensis by a modiffied ponol-sulfuric acid method, 62(2) 671-678 15.Yan Zeng, Ying Zhang, Lijiao Zhang, Shimao Cui, and Yuanxia Sun Structural Characterization and Antioxidant and Immunomodulation Activities of Polysaccharide from the Spent Rice Dubstrate of Cordyceps militaris, 24(5), 2015, 1591-1596 Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH 42 Khóa luận tốt nghiệp 2016 16.Shashidhara MG, Giridhare P, Udaya SK, Manohar B India Bioactive principles from Cordyceps sinensis: Apotent food supplement – A review Journal of functional foods 2013, 1013-1030 Trang web 1.http://caoduoclieu.net.vn/ky-thuat-chiet-xuat-c105.html 2.http://www.duoclieu.org/2012/07/chiet-xuat-phan-lap-cac-chat-tu-duoclieu.html Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH 43 [...]... sợi nấm, lưu trữ các chất dinh dưỡng dư thừa 1.3 Tình hình nghiên cứu tách chiết polysaccharide từ Cordyceps militaris 1.3.1 Tình hình nghiên cứu polysaccharide trên thế giới Một số nghiên cứu đã được thực hiện về tách chiết và tinh sạch các polysaccharides từ nấm sợi nấm trên thế giới như: Theo (Li et al., 2006) đã nghiên cứu về đặc điểm cấu trúc và hoạt động chống oxy hóa của polysaccharide từ C .Militaris. .. siêu âm Trung Quốc 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu Nguyên lý phân tích: Mẫu đươc chiết theo phương pháp thích hợp thông qua khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết từ đó xây dựng quy trình tách chiết thu polysaccharide thô 2.2.1 Phƣơng pháp tách chiết polysaccharide từ quả thể Codyceps militaris 2.2.1.1.Khảo sát phƣơng pháp chiết Khảo sát phương pháp chiết: chiết bằng siêu âm và đun hồi lưu... quả từ nấm Cordyceps Để đáp ứng nguồn nguyên liệu dùng cho sản xuất ngày càng nhiều, do vậy các nghiên cứu thu nhận sinh khối chủng Cordyceps trên các thiết bị lên men nhằm tạo ra một lượng lớn nguyên liệu sử dụng trong sản xuất là điều cấp thiết Đối với nghiên cứu tách chiết và tinh sạch polysaccharide từ Cordyceps militaris cũng như các loài Cordyceps khác như: Nghiên cứu điều kiện lên men nấm Cordyceps. .. lượng polysaccharide trong sinh khối khô là 0,14% [11,14] 1.3.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam Hiện nay, ở Việt Nam có một số công trình công bố liên quan đếnsinh khối nấm Cordyceps militaris như: một số nhóm nghiên cứu đã bước đầu công bố một số kết quả trong việc sản xuất chế phẩm từ các chủng nấm Cordyceps sp như: TS Nguyễn Mậu Tuấn tại Trung tâm Nghiên cứu thực nghiệm Nông lâm nghiệp Lâm Đồng, đã nghiên. .. trong quá trình giải phóng năng lượng [6,10] 1.1.3.9 hống lão hóa Nấm ĐTHT chứa nhiều chất SOD (Superoxide Dismutase) là chất chống oxy hóa cao, nên nó có tác dụng làm chậm quá trình lão hóa của cơ thể 1.2 Polysaccharide từ sinh khối nấm Cordyceps militaris 1.2.1 Đặc điểm về các Polysaccharide trong sinh khối nấm Cordyceps militaris Polysaccharides là các polyme ngưng tụ được hình thành từ một lượng... năng kháng khối u của một số polysaccharide được thu nhận từ một số loại nấm Chủng nấm Nguồn thu nhận polysaccharide Kháng khối u dạng Cordyceps militaris Sinh khối Khối u ác tính, ung thư phổi Phellinus gilvus Cơ thể nấm Ung thư phổi Ganoderma lucidum Cơ thể nấm Ung thư phổi, ung thư vú Lentinula edodes Cơ thể nấm Ung thư vú Lepista inversa Cơ thể nấm Ung thư phổi Grifola frondosa Cơ thể nấm Ung thư... sinh trưởng và phát triển của Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH 19 Khóa luận tốt nghiệp 2016 chúng trong suốt quá trình nuôi cấy để đảm bảo tổng hợp tốt các hoạt chất có hoạt tính sinh học cao Do đó sinh khối của các loại này được xem là nguồn tiềm năng cho quá trình sản xuất polysaccharide cũng như các hoạt chất khác và tôi thực hiện đề tài này mong muốn góp phần vào việc nghiên cứu từ sinh khối nấm Cordyceps. .. dụng từ sinh khối nấm Cordyceps militaris Các nhà y học cổ truyền trong và ngoài nước đã nghiên cứu sữ dụng nấm ĐTHT Cordyceps militaris để điều trị thành công các chứng bệnh như rối loạn máu, viêm phế quản mãn và hen phế quản, viêm thận mãn tính và suy thận, rối loạn nhịp tim, cao huyết áp, viêm mũi dị ứng, viêm gan B mãn tính, ung thư phổi (có tác dụng hỗ trợ) và thiểu năng sinh dục viện nghiên cứu. .. Cordyceps militaris Nguyễn Thị Thắm – 1202 - CNSH 20 Khóa luận tốt nghiệp 2016 PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu và thiết bị nghiên cứu 2.1.1 Nguyên liệu Sinh khối quả thể nấm Codyceps militaris được nuôi cấy tại phòng Hóa sinh, Viện Hóa học – Vật liệu,Viện Khoa học và công nghệ quân sự - BQP Hình 2.1 : Codyceps militaris nuôi cấy tại Viện Quân sự Hình2.2 : Mẫu dùng tách chiết. .. quả thể C .Militaris có sẵn như là nguyên liệu làm thuốc và sức khỏe sản phẩm thực phẩm ở Trung Quốc, Hàn Quốc và Đông Nam Á Hoạt tính sinh học polysaccharides là phổ biến trong các loại nấm, và hầu hết có cấu trúc ở các loài khác nhau Một số nghiên cứu đã được tiến hành để xác định chính xác các cấu trúc của những khác nhau polysaccharides Trong nghiên cứu này, CM-hs-CPS2 được chiết xuất từ C.Militaris